CN107625770A - Tempol在作为抑制癌细胞增殖的药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

Tempol在作为抑制癌细胞增殖的药物方面及作为促进顺铂诱导的癌细胞凋亡药物方面的应用。癌细胞为卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞。Tempol抑制卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞的增殖，通过干扰nNOS产生NO达到抑制癌细胞的糖酵解。Tempol促进DDP抑制癌细胞增殖、降低DDP诱导的癌细胞Bcl‑2/Bax的表达、促进DDP诱导的癌细胞凋亡通过增加细胞内ROS水平。本发明研究得出Tempol在作为抑制癌细胞增殖的药物方面的应用及Tempol在作为促进顺铂诱导的癌细胞凋亡药物方面的应用，能够利用Tempol的性能实现获得高效、低毒抗肿瘤药物。

Description

Tempol在作为抑制癌细胞增殖的药物方面的应用

技术领域

本发明涉及癌症药物技术领域，特别是涉及Tempol在作为抑制癌细胞增殖的药物方面的应用及Tempol在作为促进顺铂诱导的癌细胞凋亡药物方面的应用。

背景技术

癌症是目前社会难以有效治理的病症之一，目前医学界没有根治的癌症的有效途径。全球每年新增癌症患者约700万人，死亡的肿瘤患者人数约500万，平均每6秒钟就有一人死于肿瘤。

目前，化学药物治理仍是癌症患者的主要治疗手段，在癌症治疗中起着不可替代的作用。临床单药的有效率仅10-20％，联合化疗的有效率亦不足35％，且联合化疗毒副作用大大增强，极大地限制了化疗药物的临床应用效果。因此，研究高效、低毒的治疗癌症的药物，具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供Tempol在作为抑制癌细胞增殖的药物方面的应用及Tempol在作为促进顺铂诱导的癌细胞凋亡药物方面的应用，从而实现获得高效、低毒抗肿瘤药物。

本发明的目的之一通过以下技术措施实现。

Tempol在作为抑制癌细胞增殖的药物方面的应用。

上述癌细胞为卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞。

进一步的，Tempol抑制卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞的增殖。

进一步的，Tempol通过干扰nNOS产生NO达到抑制癌细胞的糖酵解。

进一步的，Tempol抑制癌细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成、抑制癌细胞ATP的产生、抑制癌细胞NADPH的产生、激活癌细胞AMPK的磷酸化、抑制癌细胞糖酵解关键酶PFK1和PKM2的亚硝化、不影响癌细胞糖酵解关键酶PFK1和PKM2的蛋白表达。

本发明的另一目的通过以下技术措施实现。

Tempol在作为促进顺铂诱导的癌细胞凋亡药物方面的应用。

进一步的，Tempol促进DDP抑制癌细胞增殖。

进一步的，Tempol降低DDP诱导的癌细胞Bcl-2/Bax的表达。

进一步的，Tempol促进DDP诱导的癌细胞凋亡通过增加细胞内ROS水平。

进一步的，Tempol通过干扰nNOS功能抑制癌细胞的糖酵解。

本发明研究得出Tempol在作为抑制癌细胞增殖的药物方面的应用及Tempol在作为促进顺铂诱导的癌细胞凋亡药物方面的应用，能够利用Tempol的性能实现获得高效、低毒抗肿瘤药物。

说明书附图

图1是Tempol的结构图；

图2是本发明实施2的3.1.1部分通过MTT实验方法检测Tempol作用于卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞的IC50的结果示意图；

图3是本发明实施2的3.1.1部分通过MTT实验方法检测Tempol对卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞增殖的作用的结果示意图；

图4是本发明实施例2的3.2.1部分不同浓度Tempol分别联合DDP作用于卵巢癌OVCAR3细胞48h，MTT技术检测Tempol对DDP抑制卵巢癌OVCAR3细胞增殖的影响的结果示意图；

图5是本发明实施例2的3.2.1部分在倒置萤光显微镜下观察Tempol联合DDP作用于卵巢癌OVCAR3细胞后，细胞形态数量的变化图；

图6是本发明实施例2中3.2.2中Tempol促进DDP诱导的卵巢癌OVCAR3细胞凋亡结果示意图；

图7是本发明实施例2中3.2.3中Tempol降低DDP诱导的卵巢癌OVCAR3细胞Bcl-2/Bax的表达的结果示意图；

图8是本发明实施例2中3.2.4中Tempol促进DDP诱导的卵巢癌OVCAR3细胞凋亡通过增加细胞内ROS水平的结果示意图；

图9是本发明实施例3的1.1中检测三种NOSs抑制剂L-NAME，NPLA和1400W对卵巢癌OVCAR3细胞葡萄糖消耗和乳酸生成的影响的结果示意图；

图10是本发明实施例3的1.2中Tempol对卵巢癌OVCAR3细胞内nNOS蛋白水平的作用结果示意图；

图11是本发明明实施3中3.2的Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞糖酵解关键酶PFK1和PKM2的亚硝化的结果示意图。

具体实施方式

结合以下实施例对本发明作进一步说明。

实施例1。

Tempol在作为抑制癌细胞增殖的药物方面的应用。癌细胞包括但不限为卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞。

具体的，Tempol能够抑制卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞的增殖。Tempol通过干扰nNOS产生NO达到抑制癌细胞的糖酵解，达到抑制癌细胞的增殖。Tempol抑制癌细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成、抑制癌细胞ATP的产生、抑制癌细胞NADPH的产生、激活癌细胞AMPK的磷酸化、抑制癌细胞糖酵解关键酶PFK1和PKM2的亚硝化、不影响癌细胞糖酵解关键酶PFK1和PKM2的蛋白表达。

从以上结果可以得出，Tempol能够抑制癌细胞的增殖，适合作为抑制癌细胞增殖的药物方面的应用。

实施例2。

Tempol在作为促进顺铂诱导的癌细胞凋亡药物方面的应用。具体的，Tempol促进DDP抑制癌细胞增殖。Tempol降低DDP诱导的癌细胞Bcl-2/Bax的表达，促进DDP诱导的癌细胞凋亡通过增加细胞内ROS水平。Tempol通过干扰nNOS功能抑制癌细胞的糖酵解。

本发明研究得出Tempol在作为促进顺铂诱导的癌细胞凋亡药物方面的应用，能够利用Tempol的性能实现获得高效、低毒抗肿瘤药物。

为了验证上述效果，以卵巢癌细胞株OVCAR3和SKOV3为对象，验证实施例2的效果，具体实验过程如下。

1.实验材料

1.1细胞株

卵巢癌细胞株OVCAR3和SKOV3为南方医科大学肿瘤研究所前期保存细胞。

1.2主要实验试剂

1.2.1细胞培养基DMEM和胰酶Tyrisin购于Gibco公司(USA)，胎牛血清购于BI公司(UT，USA)。

1.4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(Tempol,简写为：TPL)购于东京应化工业株式会社(Tokyo，Japan)。

1.2.3顺铂(Cisplatin)、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)和活性氧检测探针DCFH-DA均购于Sigma-Aldrich公司(MO，USA)。

1.2.4 AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于BD Biosciences公司(Rockville，MD)。

1.2.5蛋白裂解液RIPA、PMSF、蛋白酶抑制剂混合物、蛋白预染marker、5×loadingbuffer、20×TBS、一抗内参GAPDH、二抗HRP标记羊抗兔peroxidase Conjugated Gaotanti-Rabbit IgG(h+l)和羊抗鼠peroxidase Conjugated Gaot anti-Mouse IgG(h+l)均购于弗德生物科技有限公司(广州，中国)。

1.2.6 BCA蛋白定量试剂盒、1.5M Tris-HCL(PH 8.8)缓冲液、1M Tris-HCL(PH6.8)缓冲液、Western一抗稀释液均购于碧云天公司(China)。

1.2.7 PVDF膜(0.22um)和ECL化学发光液购于Millipore公司(USA)。

1.2.8一抗Bcl-2和Bax购于Cell Signaling Technology公司(CA,USA)。一抗HSP90和nNOS购于Abcam(CA,USA)。

1.2.9免疫共沉淀Pierce Co-Immunoprecipitation(Co-IP)Kit(Cat.No.26149)购自

Thermo Fisher公司(USA)。

1.3主要试剂的配置

1.3.1磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution，PBS)：称取8.0g Nacl，0.2gKcl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH₂PO₄，用800ml去离子水溶解，用1mol/l Hcl或1mol/l NaOH调节PH至7.4，定容至1000ml，常温保存。

注：细胞培养时所用PBS需高压灭菌后冷却至4℃保存备用。

1.3.2 10％FBS细胞培养基：450ml DMEM培养基+50ml FBS。

1.3.3细胞冻存液：胎牛血清和DMSO按9:1的体积比例提前24H配置，放入4℃冰箱备用。

1.3.4 MTT的配置：称取0.5g MTT，溶于10ml的磷酸缓冲液(PBS)中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20℃长期保存，小剂量分装，避免反复冻融。

1.3.5 10％SDS：称取100g SDS慢慢转移到约含0.9L的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解，用水定容至1L，予室温保存，半年内有效，若保存中出现沉淀，水浴溶化后仍可使用。

1.3.6 10％过硫酸铵：称取0.1g过硫酸铵，加入1ml去离子水，将固体粉末彻底溶解，贮存于4℃。

注：10％过硫酸铵最好现配现用，配好的溶液在4℃保存可使用2周左右。

1.3.7 30％丙烯酰胺：将14.5g丙烯酰胺和0.5gN，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于50ml去离子水中，充分溶解后4℃避光保存，使用时恢复至室温且无沉淀。

1.3.8 1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：称取3.03gTris，14.4g甘氨酸和1gSDS，用800ml去离子水溶解，待完全溶解后，定容至1000ml室温保存备用。

1.3.9 1×转膜缓冲液：称取3.03gTris和14.4g甘氨酸，用700ml去离子水溶解，待完全溶解后加入200ml甲醇，用去离子水定容至1000ml，4℃冰箱保存备用。

1.3.10 1×TBST缓冲液：量取25ml 20×TBS和500ul 20％Tween20，加入去离子水定容至500ml，室温保存备用。

1.3.11 5％BSA封闭液：称取牛血清白蛋白1.25g，加入25ml 1×TBST缓冲液充分溶解。

1.3.12聚丙烯酰胺浓缩胶和分离胶的配置(凝胶厚度10mm)：

1.3.13 0.01mol/l枸橼酸缓冲液的配置：0.1mol/L构椽酸9mL+0.1M构椽酸三钠41mL+双蒸水450mL，室温保存。

1.4主要实验仪器

1.4.1超净工作台购自苏净集团安泰公司(China)

1.4.2规格为lmL、200μL、100μL、20μL、l0μL、2.5μL的移液枪均购自Eppendorf公司(Germany)

1.4.3紫外分光光度仪购自AlphaSpec公司(USA)

1.4.4 CO2细胞孵育箱购自Harris公司(USA)

1.4.5低温高速离心机(Pharamcia，瑞典)

1.4.6高灵敏度化学发光成像***(Bio-RAD，美国)

1.4.7酶标仪(Bio-TEK，美国)

1.4.8倒置荧光显微镜(Nikon，日本)

1.4.9超低温冰箱(Thermo，德国)

1.4.10胶成像仪(Invitrogen，美国)

1.4.11电泳仪(Bio-RAD，美国)

1.4.12 Milli-Q纯水器(Millipore公司，美国)

2实验过程

2.1细胞培养

2.1.1细胞复苏

细胞的复苏要求快速的溶解，这样可以保证细胞外的结晶迅速溶解，避免因为缓慢溶解使水渗透到细胞内，对细胞造成损害。细胞复苏前准备实验台、培养瓶、培养基，15ml离心管等物品，并将恒温水浴锅调节至37℃。从液氮罐中取出细胞后尽快在37℃水浴中晃动直至完全融化，管壁喷酒精消毒，在超净工作台内，将细胞冻存液转移到15ml离心管中，800—1000r/min离心2min，尽量将上层冻存液吸取干净，加入1ml RPMI1640培养基将细胞沉淀充分混匀。将细胞悬液加入到预先准备好的培养瓶，再加3—5ml的RPMI1640培养基，8字摇匀法混匀。培养瓶转移到37℃，5％CO2的培养箱中培养24h，观察细胞状态是否贴壁良好，并给予细胞更换新的培养基。

2.1.2细胞培养

每日观察细胞状态，重点观察培养液的颜色和透明度的变化。一般培养液中均含有酚红作为指示成分来显示培养液的PH值：正常新鲜的培养液为桃红色，PH大约为7.2—7.4。加入细胞进行培养后由于细胞代谢产生酸性产物，使培养液pH值下降而引起颜色变浅变黄。一旦发现培养液变黄，说明培养液中代谢产物已堆积到一定量，需换液或传代处理。—般正常情况生长稳定的细胞需2—3d换液1次。日前细胞培养多采用37℃，CO2温箱，这样使PH值相对稳定，利于细胞生长。细胞传代后，经过悬浮、贴壁伸展进入潜伏期，然后开始生长进入对数生长期.细胞开始大量繁殖，逐渐相连成片而长满瓶底。贴壁生长的细胞在长满瓶底80％时就应及时传代，否则细胞可由于营养物质缺乏和代谢产物的堆积，进入平台期并衰退。培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代，部分贴壁生长但贴附不牢固的细胞也可用直接吹打传代。贴壁细胞的消化法传代：尽量吸除或倒掉瓶内旧培养液，用PBS洗1—2次，移除PBS，向瓶内加入1ml消化液(胰蛋白酶)，轻轻振动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，在37℃培养箱消化2—5min后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即终止消化。吸取1—2ml培养基于瓶内，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶内细胞，吹打过程要按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被收到。吹打时动作要轻柔不要用力过猛，同时尽可能不要出现泡沫，这些都会对细胞造成损伤。细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。收集细胞悬液至15ml离心管，800—1000r/min离心2min，尽可能去除上清，加入1ml培养基将细胞混匀成单个细胞的细胞悬液。计算细胞总数，将细胞悬液均匀的分到3或4个培养瓶中，进行1传3或1传4的培养。

2.1.3细胞冻存

冻存细胞时要缓慢梯度冷冻。因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。在细胞冻存时要尽可能的均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。目前多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂。这两种物质在低温冷冻后对细胞无明显毒性，且分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使胞内冰点下降，提高胞膜对水的通进性；加上缓慢冷冻方法可使细胞内的水分渗出细胞外，在胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成所造成的细胞损伤。

从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好选择对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存复苏后生存率会比较低，因此在冻存前一天最好换1次培养液。用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心1000r/min，2min。去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液(含10％DMSO或甘油)，冻存液中细胞的最终密度为(5—10)*l06个/ml。用枪头轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。每只冻存管加液1—1.5ml。冻存管必须旋紧确保密封。冻存管上写明细胞的名称、冻存时间等信息。之后转移到冻存盒中-80℃过夜，第二天取出转移到液氮中长期保存。

2.2 MTT检测细胞活性

2.2.1准备细胞：实验前先摸索细胞在特定时间长满需种板的最适细胞数。将生长状态良好的对数期细胞消化，离心，取4000个细胞每孔接种至96孔板中，十字摇匀法使细胞铺板均匀，置于37℃，5％CO2培养箱培养24h，加入指点浓度的药物作用特定的时间。

2.2.2 MTT孵育：去除培养基，并用PBS洗一遍。按每孔低血清培养基100μl+MTT(5mg/ml)10μL的比例配置MTT混合液，加入有细胞培养孔及3个无细胞的空白对照孔中，37℃避光孵育2-4小时，可见孔内紫色结晶沉淀甲瓒蓝形成。小心吸尽孔内液体，并加入100μlDMSO每孔以溶解紫色结晶，避光置于摇床上15min并通过Bio-tek酶标仪检测490nM激发光下的OD值。

2.2.3计算细胞活性：通过公式：细胞活性(％)＝(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)*100％。

2.3倒置荧光显微镜观察细胞形态

2.3.1准备细胞：将生长状态良好的对数期细胞消化，离心，取20*104/孔细胞每孔接种至6孔板中，十字摇匀法使细胞铺板均匀，置于37℃，5％CO2培养箱培养24h，分别加入终浓度为1.5mM Tempol、3μM DDP、1.5mM Tempol+3μM DDP处理48h。

2.3.2倒置荧光显微镜观察细胞形态：分别在倒置荧光显微镜下观察不同组药物作用后细胞形态及数目的变化，并拍照。

2.4 Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡及死亡

2.4.1消化细胞：按要求铺板，药物作用细胞一定时间后，去除培养基，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量不含EDTA的胰酶消化细胞3-5min，加入培养基2-3倍胰酶体积中和，吹打，转移到离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞。

2.4.2洗涤细胞：PBS混匀清洗细胞，离心，去上清，计数细胞。

2.4.3染色标记：取5-10*104重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入试剂盒内bindingbuffer 500μl重悬细胞。加入5μlAnnexin V-FITC，轻轻混匀。加入10μl碘化丙啶染色液(PI)，轻轻混匀。使用铝箔纸进行避光，室温孵育5—15分钟，随后置于冰浴中。孵育过程中重悬细胞2—3次以改善染色效果。2.4.4检测：随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶(PI)为红色荧光，检测仪输出图像，并得出两种染色标记的细胞染色率，最后计算出凋亡和死亡率。

2.5 Western Blot检测蛋白表达水平

2.5.1试剂准备

(1)10％SDS:l.0g SDS+10mL去离子水，60℃水浴下溶解，予室温保存，半年内有效，如在保存中出现沉淀，水浴溶化后仍可使用；1.3.510％过硫酸胺：0.1g过硫酸胺(AP)+l.0mL去离子水，完全溶解后4℃保存，1-2周内有效；

(2)30％丙烯酰胺：14.5g丙稀酞胺(Acr)+0.5g甲叉双丙稀酞胺(Bic)+50mL去离子水，充分溶解后4℃避光保存，使用时恢复至室温且无沉淀；

(3)5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(母液)：15.15g Tris+93.85g甘氨酸+5.0g SDS+600mL去离子水，完全溶解后，定容至1000ml室温保存；

(4)10×转膜缓冲液(母液)：58g Tris+29g甘氨酸+3.7g SDS+700ml去离子水充分溶解后，定容至1000ml后室温保存。

(5)转膜缓冲液：100ml10×转膜缓冲液+700ml去离子水+200m1甲醇，4度冰箱保存，可回收重复利用2-3次；

(6)TBST缓冲液：20×TBS 25ml+20％Tween20 500ul+去离子水475ml；

(7)5％BSA：牛血清白蛋白1.25g+TBST缓冲液25ml；

2.5.2蛋白浓度提取

卵巢癌OVCAR3细胞按20*104/孔接种到6孔板中，37℃，5％CO2的培养箱中培养24h，次日观察细胞状态是否贴壁完全，状态良好。向培养基中加入终浓度为1.5mM Tempol、3μM DDP、1.5mM Tempol+3μM DDP处理48h后，收集细胞。准备提取细胞内总蛋白，并测蛋白浓度。

从培养箱中取出6孔板，置于冰上。预先配置含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，以990ulRIPA裂解液加10μl蛋白酶抑制剂PMSF和10μl蛋白磷酸酶抑制剂混合物的比例配制，每孔加50—150μl的裂解液，冰上裂解30min。准备1.5ml离心管预冷，打开4℃离心机预冷机器。期间每隔5min震荡6孔板，使裂解液完全覆盖皿底部细胞。用细胞刮刮下细胞，尽可能完全的收集细胞裂解物到1.5ml离心管中，4℃离心15min。取出样品，收集上清到预先预冷的1.5ml离心管中。按BCA蛋白浓度测定试剂盒的方法测蛋白浓度，并记录。按4:1的比例加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，在金属浴煮沸5—10min，置于冰上冷却，可储存于-80℃冰箱保存。

2.5.3 BCA测定蛋白浓度

(1)标准品的稀释：用PBS缓冲液稀释BSA标准品；

(2)配制BCA混合液：根据待测蛋白样品数量，将试剂A和试剂B按50:1的体积比配制BCA混合液，充分混匀。

(3)微管测定方法：

1)分别取2μlBSA标准液和待测样品，加入到96孔板中，然后每孔中加入18μl PBS缓冲液，轻轻振荡混匀。

2)每孔中加入新鲜配置好的BCA工作液200μl，于摇床上轻轻摇摆充分混匀。

3)37℃孵箱中孵育30min，于酶标仪562nm处检测其吸光度值。

5)根据标准曲线计算出待测样品蛋白浓度

2.5.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.5.4.1清洗：清洗玻璃制胶板，置于烤箱晾干；

2.5.4.2测漏：组装好制胶器，将其放在水平的桌面上，向制胶板间加满清水，静置10min，观察液面是否下降；

2.5.4.3制胶：按制胶比例制备8％-12％分离胶10ml，5％浓缩胶6ml(均不加TEMED)；

2.5.4.4灌分离胶：在分离胶中加入TEMED后颠倒摇匀20次左右，注意不能产生大量气泡，立即灌入分离胶，灌入后立刻小心加入清水覆盖分离胶，以压平分离胶液面，并阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用；

2.5.4.5灌浓缩胶：水平静置30min，待分离胶凝固后，倒出上层的水，将残留水分吸干，观察分离胶平面是否水平，随后浓缩胶中加入TEMED摇匀灌胶，

加满后水平***梳子；

2.5.4.6待浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出，将电泳槽内槽加满新鲜电泳液，电泳槽外槽可加入回收电泳液；

2.5.4.7上样：根据测定的浓度计算样本上样量加入样品(1mm厚度胶每孔的总蛋白体积一般不超过30μl，1.5mm厚度胶不超过40μl)，第一孔留空，在左侧第二孔加入Marker2-3μl；

2.5.4.8电泳：恒压80V缓慢电泳使每孔蛋白聚集于同一水平线上(约30min)，待Marker分开，蛋白进入分离胶改为恒压100-120V(约40-60min)，至溴酚兰刚跑出胶底部即可终止电泳。

2.5.5转膜

2.5.5.1制作转膜夹：戴PE手套剪取大小合适的干净滤纸4张、海绵垫2张，专用转膜垫纸4张。取一干净托盘，盘内倒入转膜液。将转膜夹子放入托盘，黑色面放在下层，依次垫一张海绵垫，转膜垫纸，干净滤纸。一手固定，一手用滚筒来回擀几遍以赶走里面的气泡，夹子另一面亦是如此；

2.5.5.2切胶：电泳结束后，取下夹板，撬开玻璃暴露凝胶，根据目的蛋白和内参蛋白的分子量大小，将目的蛋白所在条带和内参蛋白所在条带分别切开，胶置于夹子黑面滤纸上，注意保持胶的湿润；

2.5.5.3戴干净手套，按所切凝胶带的尺寸将PVDF膜剪成相应大小，剪去一角并做好标记，置于甲醇浸泡10秒，放入转膜液中清洗浸泡2—3min，再将PVDF膜覆盖于胶带上，依次盖上另一面的滤纸和海绵垫，夹好并固定；

2.5.5.4转膜：将夹子放入转移槽中(务必使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的透明面对槽的红面)，倒入转膜液。将转膜仪置于冰上转膜，恒流300mA，约1.5-2h(根据蛋白分子量大小决定)；

2.5.6封闭、一抗及二抗免疫反应、扫描显影

2.5.6.1封闭：TBST洗脱1次，5分钟/次，将转膜后的PVDF膜放入5％BSA中，置于摇床上封闭1—2h，TBST洗脱1次，5分钟/次；

2.5.6.2孵育一抗：取干净的15mL离心管，按抗体说明书的建议，用一抗稀释液将一抗分别稀释至相应浓度，每管约6mL，将PVDF膜置入，密封好放入4℃冰箱过夜(12—15h)。将PVDF膜取出，置于摇床上用TBST洗脱4次，5分钟/次；

2.5.6.3孵育二抗：取干净的15mL离心管，按二抗说明书建议将二抗稀释至相应浓度(1:5000—8000)，将目的PVDF膜放入二抗，室温下置于摇床孵育1小时；将PVDF膜取出，用TBST洗脱4次，5分钟/次。

2.5.6.4显影(ECL法)：ECL A液：B液＝1:1，高灵敏度化学发光成像***下成像拍照。

2.6活性氧ROS探针DCFH-DA：

2.6.1配置探针：按照1:2000用无血清培养液稀释DCFH-DA(20mM)，使终浓度为10微摩尔/升。

2.6.2收集细胞：去除细胞培养液，PBS洗涤两到三次，消化，离心，去上清，收集细胞，并用无血清培养基洗两遍。

2.6.3装载探针：加入适当体积稀释好的DCFH-DA，通常对于六孔板加入稀释好的DCFH-DA不少于1ml/孔，37℃细胞培养箱内孵育30分钟，每隔3—5min颠倒混匀一次，使探针和细胞充分接触。

2.6.4检测：用无血清细胞培养液洗涤细胞2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。收集细胞后装载探针的样品用流式细胞仪检测。参数设置：使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。

2.5蛋白质巯基亚硝化修饰的检测

2.5.1待细胞生长状态良好时收集细胞，小心去除细胞中的培养基，用预冷的洗涤缓冲液洗涤细胞三次，最后一次刮取细胞于EP管中，1000×g、5min。

2.5.2小心去除上清，每管加入500μL Buffer A containing Blocking Reagent，4℃摇床孵育30min。

2.5.3将EP管转移到高速冷冻离心机中，12000×g、4℃离心10分钟以沉淀细胞碎片。

2.5.4将上清转移到一个新的微量离心管中，加入4倍体积(2mL)的丙酮，混匀，-20℃放置1h。

2.5.5将EP管转移到高速冷冻离心机中，3000×g、4℃离心10分钟。

2.5.6去除上清，加入500μL Buffer B containing Reducing and LabelingReagent，室温放置1h。

2.5.7加入4倍体积(2mL)的丙酮，混匀，-20℃放置1h。

2.5.8将EP管转移到高速冷冻离心机中，3000×g、4℃离心10分钟。

2.5.9去除上清，加入100μL预冷的洗涤缓冲液，重悬蛋白进行蛋白浓度测定和SDS-PAGE电泳。

2.6蛋白质免疫共沉淀Co-IP

2.6.1抗体固定化

注意：以下操作流程适用于交联10–65μg的亲和纯化抗体，溶液中不能含有其他胺基分子(如Tris，甘氨酸)或者载体蛋白。

2.6.1.1将加强型AminoLink偶联树脂和试剂平衡至室温。

2.6.1.2用超纯水稀释20×交联缓冲液至1×，每个IP反应准备2毫升1×交联缓冲液。

2.6.1.3轻旋加强型AminoLink偶联树脂的瓶子，以获得均一的悬浮液。使用大口径或截短枪头将20μL树脂浆液加入Pierce离心柱中。将柱子置于一个微量离心管中，1000×g离心1分钟，弃掉流穿液体。

2.6.1.4用200μl的1×交联缓冲液洗涤树脂，离心并且弃掉流穿液体。

2.6.1.5在纸巾上轻拍离心柱的底部以去除剩余的液体，***底盖。

2.6.1.6用足量的超纯水和20×交联缓冲液，将抗体(10-75μg)溶液体积调整

至200μl，缓冲液浓度为1×。例如，对于10μl浓度为1μg/μl的抗体，添加10μl 20×交联缓冲液和180μl的超纯水。直接将超纯水、20×交联缓冲液和亲和纯化的抗体添加到含有树脂的离心柱中。

2.6.1.7在通风橱中，向每200μl的反应体系中加入3μl的氰基硼氢化钠溶液。

2.6.1.8.盖上螺旋盖，在室温条件下于旋转器或混匀器上孵育90-120分钟，确保浆液在孵育过程中处于悬浮状态。

2.6.1.9.卸下并保留底塞，拧松螺旋帽。将离心柱放置与收集管中并离心。保存流穿液体以验证抗体结合效率。

2.6.1.10.取下螺旋盖，在柱中加200μl的1×交联缓冲液，离心并且弃掉流穿液。重复上述操作一次。

2.6.1.11.加200μl淬灭缓冲液至离心柱，离心并且弃掉流穿液。

2.6.1.12.在纸巾上轻拍离心柱底部以去除剩余的液体，***底盖。向树脂中加入200μl淬灭缓冲液。

2.6.1.13.在通风橱中，向离心柱中加入3μl氰基硼氢化钠溶液并盖上螺旋帽。轻轻摇动或上下颠倒混匀，孵育15分钟。

2.6.1.14.卸下底塞，拧松螺旋帽。将离心柱放回收集管中，离心并弃掉流穿液体。

2.6.1.15.取下螺旋盖，用200μl 1×交联缓冲液洗涤树脂两次，每次洗涤之后均需离心。

2.6.1.16.用150μl洗涤缓冲液洗涤树脂六次，每次洗涤之后均需离心。

2.6.2.贴壁细胞裂解

2.6.2.1.小心去除细胞中的培养基。

2.6.2.2.用改良型杜氏PBS清洗细胞一次。

2.6.2.3.将冰上预冷的500μl IP裂解/洗涤缓冲液加入细胞中。冰上孵育5分钟并定期混匀。

2.6.2.4.将细胞裂解液转移到微量离心管中，13000g、4℃、10min以沉淀细胞碎片。

1.2.7统计分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。两样本均数的比较釆用两独立样本的t检验(Independent-Sample T Test)或单样本t检验，两组以上样本均数比较采用完全随机设计资料的方差分析(One-wayANOVA)，方差齐性检验釆用Levene'sTest。P值<0.05认为有统计学意义。

3.实验结果

3.1 Tempol促进顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡

3.1.1 Tempol抑制卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞的增殖

为检测Tempol对卵巢癌细胞增殖的作用，我们分别用不同浓度的Tempol作用于卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞，并通过MTT实验方法计算Tempol对卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞增殖抑制率50％时的药物浓度(IC50)。随后依据IC50选择合适的Tempol作用浓度，通过MTT实验方法检测Tempol对卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞增殖的作用。首先用不同浓度Tempol(2、4、6、8、10mM)处理卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞48h，MTT实验方法检测Tempol作用于卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞的IC50。实验结果如图2所示：在卵巢癌OVCAR3细胞中Tempol的IC50约为3.72mM，在卵巢癌SKOV3细胞中约为2.32mM。为检测Tempol对卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞增殖的影响，我们用1.5mM Tempol处理OVCAR3细胞和1mM Tempol处理SKOV3细胞，作用时间均为5天，通过MTT实验方法检测Tempol对卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞增殖的作用。实验结果如图3所示：当Tempol处理OVCAR3和SKOV3细胞至第三天时，相对于对照组，Tempol组显著抑制卵巢癌OVCAR3细胞(P<0.0097)和SKOV3细胞(P<0.0286)的增殖。此部分实验结果表明Tempol抑制卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞增殖，提示Tempol可能具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。

3.2 Tempol促进顺铂诱导的卵巢癌OVCAR3细胞凋亡

3.2.1 Tempol促进顺铂对卵巢癌OVCAR3细胞增殖的抑制作用

顺铂(DDP)是临床上常用的卵巢癌化疗药物，但其副作用不可被忽略，因此探究更加合理合适的联合用药方法是肿瘤治疗途径中一直需要努力的方向。为研究Tempol对DDP抑制卵巢癌OVCAR3细胞增殖的影响，故首先用MTT实验方法检测DDP作用于卵巢癌OVCAR3细胞的IC50。不同浓度DDP处理OVCAR3细胞48h，随后用MTT检测DDP作用于OVCAR3细胞的IC50。在卵巢癌OVCAR3细胞中DDP的IC50约为4.71μM。再用不同浓度Tempol联合DDP作用于卵巢癌OVCAR3细胞，并通过MTT技术检测Tempol对DDP抑制卵巢癌OVCAR3细胞增殖的影响。首先不同浓度Tempol(Tempol-1 1.5mM和Tempol-2 2mM)分别联合DDP(3μM)作用于卵巢癌OVCAR3细胞48h，MTT技术检测Tempol对DDP抑制卵巢癌OVCAR3细胞增殖的影响。实验结果如图4所示：相对于DDP组，Tempol-1(1.5mM)联合DDP组(P<0.0139)和Tempol-2(2mM)联合DDP组(P<0.0136)均使卵巢癌OVCAR3细胞存活率降低，且Tempol-2(2mM)联合DDP组相对于Tempol-1(1.5mM)联合DDP组细胞存活率进一步降低，P<0.0136，具有统计学差异。为进一步证明Tempol对DDP抑制卵巢癌OVCAR3细胞增殖的增强作用，我们用倒置萤光显微镜观察联合用药后细胞形态数量的变化。在倒置萤光显微镜下观察Tempol联合DDP作用于卵巢癌OVCAR3细胞后，细胞形态数量的变化。实验结果如图5所示：Tempol(1.5mM)联合DDP(3μM)组作用于卵巢癌OVCAR3细胞48h后，相对于DDP组，细胞数量明显减少，细胞形态变圆，且不再紧贴于培养皿表面。此部分实验结果表明，Tempol促进DDP对卵巢癌OVCAR3细胞增殖的抑制作用，且随着Tempol浓度的增加，其对促进DDP抑制卵巢癌OVCAR3细胞增殖作用更强。

3.2.2 Tempol促进DDP诱导的卵巢癌OVCAR3细胞凋亡

予以Tempol(1.5mM)、DDP(3μM)及Tempol联合DDP处理卵巢癌OVCAR3细胞48h，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒进行标记，Annexin V-FITC(+)为凋亡细胞，PI(+)为死亡细胞，流式细胞检测仪计数标记的阳性细胞并计算出阳性率，检测结果如图6A和图6B所示：Tempol联合DDP组诱导卵巢癌OVCAR3细胞早期凋亡率(Annexin+/PI－)为74.1±2.9％，相比于DDP组的59.52±1.58％，有显著增加(P<0.0121)；Tempol联合DDP组诱导卵巢癌OVCAR3细胞死亡率(Annexin+/PI+)为5.43±0.58％，与DDP组的7.29±2.3％相接近。此部分实验结果表明，Tempol促进DDP诱导的卵巢癌OVCAR3细胞凋亡，且以增加早期凋亡为主。

3.2.3 Tempol降低DDP诱导的卵巢癌OVCAR3细胞Bcl-2/Bax的表达

用Western blot技术检测Tempol联合DDP作用于卵巢癌OVCAR3细胞后，OVCAR3细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax及Bcl-2/Bax表达。予以Tempol(1.5mM)、DDP(3μM)及Tempol联合DDP处理卵巢癌OVCAR3细胞24h，用Western blot技术检测各组细胞内Bcl-2及Bax的表达。实验结果如图7所示：相对于DDP组，Tempol联合DDP组OVCAR3细胞Bcl-2及Bax表达均有所下降，且Bcl-2/Bax表达比例显著降低(P<0.0228)。此部分实验结果表明，Tempol降低DDP诱导的卵巢癌OVCAR3细胞Bcl-2/Bax表达。

3.2.4 Tempol促进DDP诱导的卵巢癌OVCAR3细胞凋亡通过增加细胞内ROS水平

用ROS探针标记实验检测Tempol联合DDP作用后对卵巢癌OVCAR3细胞内ROS水平的影响。首先用Tempol(1.5mM)、DDP(3μM)及Tempol联合DDP处理卵巢癌OVCAR3细胞12h，然后用ROS探针DCFH-DA标记细胞内的ROS，随后用流式细胞检测仪检测卵巢癌OVCAR3细胞内ROS水平。实验结果如图8所示：相比于DDP组，Tempol联合DDP组卵巢癌OVCAR3细胞内ROS水平明显增加(P<0.0035)。此实验表明Tempol促进DDP诱导的卵巢癌OVCAR3细胞凋亡通过增加细胞内ROS水平。

实施例3。

为了验证上述效果，以卵巢癌细胞株OVCAR3和SKOV3为对象，验证实施例1的效果，具体实验过程如下。

1实验材料

1.1主要实验试剂

L-NAME、N-PLA、1400W、DETA-NONO均购自sigma公司；ATP试剂购于promega公司；XTT/PMS购于sigma公司；胎牛血清购于BI；DMEM培养基、胰酶购于Gibco公司；96孔细胞培养板、培养板为洁特公司产品；Nitrate/Nitrite Fluorometric Assay Kit试剂盒购于Cayman公司；葡萄糖检测试剂盒和乳酸检测试剂盒均为Biovision公司产品。

2实验方法

2.1 NO浓度检测

采用Cayman公司的Nitrate/Nitrite FluorometricAssay Kit检测NO。第一步，先将硝酸盐离子用硝酸盐还原酶转化成亚硝酸盐离子；第二步，将亚硝酸盐与荧光探针DAN(2，3-二氨基萘)结合，同时NaOH能增强荧光的产率，最终测得的荧光密度与总NO产量成正相关。

2.1.1试剂准备

(1)NO2-/NO3-Aassay buffer配制：用100μl的超纯水溶解1体积的Aassaybuffer；

(2)NO3-还原酶：用1.2ml Aassay buffer溶解，操作时放冰上，最好现用现配；

(3)辅酶因子：用1.2ml Aassay buffer溶解，操作时放冰上，最好现用现配；

(4)NO3-标准品：小心移除盖子后，避免样品损失，加入1ml Aassay buffer溶解，涡旋样品至完全溶解；

(5)NO2-标准品：小心移除盖子后，避免样品损失，加入1ml Aassay buffer溶解，涡旋样品至完全溶解；

(6)荧光试剂DAN和NaOH。

2.1.2实验步骤；

(1)NO2-标准曲线：

1)在一个干净的1.5ml离心管中加入0.9ml的Aassay buffer，再加入0.1ml的NO2-的标准品，充分混匀，即配成200μM的储存液；另取7个1.5ml离心管，分别吸取950μl的Aassay buffer到管1中，取500μl的Aassay buffer到管2—7中，取50μl的储存液到管1中，充分混匀，再从管1中取500μl到管2中，充分混匀，依次到管7中，即配成浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156μM的NO2-溶液。

2)取一个透光的96孔板，加80μl Aassay buffer到空白孔，再加30μl到其余标准曲线孔中，加50μl的标准品；

3)样品检测，加10-20样μl品到样品孔中，加Aassay buffer调节体积至80μl；

4)每孔加入10μl的辅酶因子；

5)每孔加入10μlNO3-还原酶；

6)避光室温孵育1h；

7)孵育结束后加10μl DAN，再孵育10min；

8)加20μl NaOH；

9)在多功能酶标仪上以375nm激发波长，417nm发射波长检测吸光度。

(2)Griess法检测卵巢癌OVCAR3细胞培养基上清中NO的含量

取处于对数生长期的卵巢癌OVCAR3细胞，以5×103个/孔细胞接种于96孔板，每个实验组设置三个副孔进行细胞接种，待细胞贴壁后分别加入Tempol(1.5mM)、L-NAME(1mmol/l)、NPLA(100μmol/l)和1400W(100μmol/l)进行干预处理，同时设立不加药物和抑制剂的对照组，将OVCAR3细胞继续培养24h后，留96孔板中细胞培养液上清备用：

(1)取一新的96孔板，每组每孔取20μl培养液上清加入96孔板，同时每组每孔加入60μl Assay Buffer。

(2)每组每孔加入10μl Enzyme Cofactor Mixture。

(3)每组每孔加入10μl Nitrate Reductase Mixture。

(4)将96孔板内液体均匀混合，室温孵育1h。

(5)每组每孔加入10μl DAN Reagent，将96孔板内液体均匀混合，室温孵育10min。

(6)每组每孔加入20μl NAOH，将96孔板内液体均匀混合，多功能酶标仪365/430nm处测定荧光值，根据标准曲线计算出样品中NO的含量。

2.2葡萄糖消耗

采用的是BioVision的葡萄糖比色法检测试剂盒。2.2.1试剂准备

(1)葡萄糖底物混合物：用220μl的葡萄糖Assay Buffer溶解，避光保存；

(2)葡萄糖酶混合物：用220μl的纯水溶解，用时放冰上。

2.2.2实验步骤

(1)标准曲线准备

取10ul的葡萄糖标准品加入到990ul的葡萄糖Assay Buffer，配制出1nmol/μl的溶液，混合均匀；分别向96孔板的标准曲线孔一次加入0、2、4、6、8、10μl的标准品，用葡萄糖Assay Buffer调节体积至50μl。

(2)样品准备

根据实验要求，用96孔板铺细胞，次日加Tempol处理48h后，取上清检测葡萄糖浓度。葡萄糖的检测体系为50μl；

(3)葡萄糖反应体系

准备50μl的反应体系包含：46μl葡萄糖Assay Buffer、2μl葡萄糖酶混合物、2μl葡萄糖底物混合物；

(4)加μl2的培养基上清液，再加入48μl的反应体系，混合均匀；

(5)避光反应30min；

(6)用450nm波长检测吸光度

(7)计算出葡萄糖的标准曲线，并根据样本组吸光度，计算出样品中葡萄糖的含量，对照组减去实验组葡萄糖浓度就是消耗的葡萄糖的量。

2.3乳酸产生

采用的是BioVision的乳酸比色法检测试剂盒，乳酸被乳酸脱氢酶氧化后可与一个探针结合产生颜色，通过测量吸光度来比较乳酸的含量。

2.3.1试剂准备

(1)乳酸底物混合物：用220μl的乳酸Assay Buffer溶解，避光保存；

(2)乳酸酶混合物：用220μl的纯水溶解，用时放冰上。

2.3.2实验步骤

(1)标准曲线准备

取10μl的乳酸标准品加入到990μl的乳酸Assay Buffer，配制出1mM的溶液，混合均匀；分别向96孔板的标准曲线孔一次加入0、2、4、6、8、10μl的标准品，用葡萄糖AssayBuffer调节体积至50μl。

(2)样品准备

根据实验要求，用96孔板铺细胞，次日加Tempol处理48h后，取上清检测乳酸浓度。乳酸的检测体系为50μl；

(3)乳酸反应体系

准备50μl的反应体系包含：46μl乳酸Assay Buffer、2μl乳酸酶混合物、2μl乳酸底物混合物；

(4)加5μl的培养基上清液，再加入45μl的反应体系，混合均匀；

(5)避光反应30min；

(6)用450nm波长检测吸光度

(7)计算出乳酸的标准曲线，并根据样本组吸光度，计算出样品中乳酸的含量。

2.4 ATP检测实验

取对数生长期的OVCAR3细胞，以1.5×104个/孔细胞接种于96孔细胞培养板中，于5％CO2、37℃饱和湿度培养箱中进行培养。待细胞生长至70％汇合时，进行如下处理：细胞分两组，分别为对照组和Tempol组。细胞继续培养6h后，每孔加入100μlATP检测试剂，室温避光孵育10min,多功能酶标仪发光模块处检测各孔的光子数。每组三个复孔，实验重复三次。

2.5 NADPH检测实验

取对数生长期的OVCAR3细胞，以1.0×104个/孔细胞接种于96孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中进行培养。待细胞生长至50％汇合时，进行如下处理：细胞分2组，分别为对照组和Tempol组。细胞继续培养24h后，每孔加入100μl新鲜配制好的XTT(0.625mM)/PMS(0.025mM)反应体系溶液，37℃避光孵育3h，多功能酶标仪波长450nm、参比波长650nm处检测各孔的OD值。每组三个复孔，实验重复三次。

2.5蛋白质巯基亚硝化修饰的检测

2.5.1待细胞生长状态良好时收集细胞，小心去除细胞中的培养基，用预冷的洗涤缓冲液洗涤细胞三次，最后一次刮取细胞于EP管中，1000×g，5min。

2.5.2小心去除上清，每管加入500μl Buffer A containing Blocking Reagent，4℃摇床孵育30min。

2.5.3将EP管转移到高速冷冻离心机中，12000×g，4℃离心10分钟以沉淀细胞碎片。

2.5.4将上清转移到一个新的微量离心管中，加入4倍体积(2ml)的丙酮，混匀，-20℃放置1h。

2.5.5将EP管转移到高速冷冻离心机中，3000×g、4℃离心10分钟。

2.5.6去除上清，加入500μl Buffer B containing Reducing and LabelingReagent，室温放置1h。

2.5.7加入4倍体积(2ml)的丙酮，混匀，-20℃放置1h。

2.5.8将EP管转移到高速冷冻离心机中，3000×g，4℃离心10分钟。

2.5.9去除上清，加入100μl预冷的洗涤缓冲液，重悬蛋白进行蛋白浓度测定和SDS-PAGE电泳。

3.实验结果

1 Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞nNOS产生NO的功能

1.1 nNOS促进卵巢癌OVCAR3细胞的糖酵解

肿瘤细胞中的NOSs以硫醇盐结合亚铁血红素(HEME)为活性中心转移电子催化L-精氨酸胍基末端上的氮基团发生氧化，产生NO。用GlucoseAssay试剂盒和LactateAssay试剂盒检测NOSs抑制剂对卵巢癌OVCAR3细胞糖酵解的影响。首先分别用三种NOSs抑制剂(NOS广谱性抑制剂L-NAME，nNOS抑制剂NPLA，iNOS抑制剂1400W)处理卵巢癌OVCAR3细胞48h，三种抑制剂的作用浓度分别为L-NAME(1mmol/l)，NPLA(100μmol/l)，1400W(100μmol/l)，随后用Glucose Assay试剂盒和Lactate Assay试剂盒检测三种NOSs抑制剂L-NAME，NPLA和1400W对卵巢癌OVCAR3细胞葡萄糖消耗和乳酸生成的影响。实验结果如图9所示：相对于对照组，L-NAME、NPLA和1400W组均降低卵巢癌OVCAR3细胞葡萄糖的消耗量，其中L-NAME与NPLA具有统计学差异(P＝0.002和P＝0.048)，而1400W不具有统计学差异(P＝0.395)，由此可见，L-NAME的抑制作用最强，NPLA次之，而1400W的抑制作用最弱。相对于对照组，L-NAME组与NPLA组均降低卵巢癌OVCAR3细胞乳酸的分泌量，且具有统计学差异(P＝0.000和P＝0.038)，而1400W组不具有统计学差异(P＝0.762)，其中L-NAME的抑制作用最强，NPLA抑制作用较弱。由此说明NOSs能够促进卵巢癌糖酵解，并提示nNOS能促进糖酵解的重要作用。

1.2 Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞nNOS的功能和表达

Tempol带有单一电子，既可以发生氧化反应又可以发生还原反应，从而干扰物质的电子传递过程。因此我们想要探讨Tempol是否干扰nNOS的功能和表达。为了探讨Tempol对卵巢癌OVCAR3细胞nNOS的功能和表达的影响，我们首先用Griess法检测Tempol作用后培养基上清中卵巢癌OVCAR3细胞生成NO的浓度。用1.5mM Tempol处理卵巢癌OVCAR3细胞24h，检测细胞培养基上清NO的浓度。Griess法实验结果显示，与对照组相比，Tempol组卵巢癌OVCAR3细胞产生的NO浓度明显降低(P<0.0291)，实验结果表明Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞NO的产生。用Western blot实验技术检测了Tempol对卵巢癌OVCAR3细胞内nNOS蛋白水平的影响。首先用1.5mM Tempol作用于卵巢癌OVCAR3细胞48h，而后冰上裂解细胞提取胞内总蛋白，进行Western blot实验检测Tempol对卵巢癌OVCAR3细胞内nNOS蛋白水平的作用。实验结果如图10所示：相比于对照组，Tempol组能降低卵巢癌OVCAR3细胞内nNOS蛋白水平。此部分实验共同表明Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞内nNOS的

功能和表达。

2 Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞的糖酵解

2.1 Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成

有文献指出NO是卵巢癌糖酵解的正性调控因素之一，我们前期实验亦表明NOS能够促进卵巢癌OVCAR3细胞的糖酵解。因为Tempol影响卵巢癌OVCAR3细胞nNOS产生NO，故我们想要探讨Tempol对卵巢癌OVCAR3细胞糖酵解的影响。用Glucose Assay试剂盒和LactateAssay试剂盒检测Tempol对卵巢癌OVCAR3细胞葡萄糖消耗和乳酸生成的影响。首先我们予以1.5mM Tempol处理卵巢癌OVCAR3细胞48h，而后用Glucose Assay试剂盒和LactateAssay试剂盒检测培养基上清葡萄糖剩余浓度和乳酸生成浓度。葡萄糖消耗和乳酸生成实验结果表明，相比与对照组，Tempol组卵巢癌OVCAR3细胞葡萄糖的消耗量有所减少(P<0.0068)，乳酸的生成量亦有所减少(P<0.0445)。此实验结果表明Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成。

2.2 Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞ATP的产生

三磷酸腺苷(ATP)是细胞中的能量通货，它是一种高能磷酸化合物，与二磷酸腺苷(ADP)的相互转化实现了储能和放能。正常细胞中产生ATP主要通过胞液中进行的糖酵解和线粒体中进行的氧化磷酸化两种途径产生。肿瘤细胞常处于营养缺乏状态，为了满足自身快速增长繁殖的需求，肿瘤细胞常常需要进行代谢重编程产生更多的ATP，故肿瘤细胞的能量代谢常常以糖酵解为主。因为Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成，干扰了卵巢癌OVCAR3细胞的糖酵解，所以我们想要进一步探讨Tempol对糖酵解ATP产生的影响。我们用ATP检测试剂检测Tempol对卵巢癌OVCAR3细胞ATP产生的影响。首先我们予以1.5mM Tempol处理卵巢癌OVCAR3细胞6h，而后用多功能酶标仪检测各孔的OD值。实验结果表明：与对照组相比，Tempol组卵巢癌OVCAR3细胞ATP产生量有所减少，且差异具有统计学意义(P<0.034)。此部分实验结果表明Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞ATP的产生。

2.3 Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞NADPH的产生

烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)，又叫还原型辅酶Ⅱ，在很多生物体内的化学反应中起递氢体的作用，参与多种大分子物质的合成代谢反应，如脂类、脂肪酸和核苷酸的合成。这些反应中需要NADPH作为还原剂、氢负离子的供体，NADPH是NADP+的还原形式。肿瘤细胞常处于营养缺乏状态，为了满足自身快速增长繁殖的需求，肿瘤细胞常常需要进行代谢重编程产生更多的NADPH。为了进一步明确Tempol对卵巢癌OVCAR3细胞糖酵解的影响，我们检测了Tempol对卵巢癌OVCAR3细胞产生NADPH的作用。用NADPH检测实验检测Tempol对卵巢癌OVCAR3细胞NADPH产生的影响。我们首先用1.5mM Tempol处理卵巢癌OVCAR3细胞24h，继而用多功能酶标仪检测各孔的OD值。实验结果显示：与对照组相比，Tempol组卵巢癌OVCAR3细胞NADPH的产生量有所降低，且差异具有统计学意义(P<0.0244)。此实验结果表明Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞NADPH的产生。

2.4 Tempol激活卵巢癌OVCAR3细胞AMPK的磷酸化

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是细胞内能量的开关，对细胞而言，要求细胞内保持相当高的ATP：AMP比率才能存活，而细胞内ATP：AMP比率反应了细胞内能量的状态。AMP：ATP比率的上升可以启动AMPK激活的下游瀑布似的蛋白激酶反应。当细胞内能量利用受到阻碍时，AMPK会即刻接收到应急信号的提醒，激活自身磷酸化的表达，进而激活下游各种信号通路的转导，进行促进能力合成的各种反应。为了明确Tempol对卵巢癌OVCAR3细胞内能量开关AMPK的影响，我们检测了Tempol对卵巢癌OVCAR3细胞AMPK磷酸化的表达作用。首先1.5mMTempol处理卵巢癌OVCAR3细胞48h，之后冰上裂解细胞提取胞内总蛋白，进行Westernblot实验检测Tempol对卵巢癌OVCAR3细胞内磷酸化AMPK(P-AMPK)蛋白水平表达的影响。Westernblot实验结果显示：与对照组相比，Tempol组卵巢癌OVCAR3细胞内P-AMPK蛋白水平表达明显增高。此实验表明Tempol会激活卵巢癌OVCAR3细胞内P-AMPK，可能与Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞ATP的产生有关。

3. Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞糖酵解关键酶PFK1和PKM2的亚硝化

3.1 Tempol不影响卵巢癌OVCAR3细胞糖酵解关键酶PFK1和PKM2的蛋白表达

课题组前期已经证明nNOS促进糖酵解两个关键酶磷酸果糖激酶1(PFK1)和丙酮酸激酶M2(PKM2)的亚硝化，进而促进糖酵解。因此我们想要探讨Tempol对nNOS作用的两个糖酵解关键酶的影响。首先1.5mM Tempol处理卵巢癌OVCAR3细胞48h，之后冰上裂解细胞提取胞内总蛋白，进行Westernblot实验检测Tempol对卵巢癌OVCAR3细胞内糖酵解关键酶PFK1和PKM2的蛋白表达。实验结果显示Tempol不会影响糖酵解关键酶PFK1和PKM2在蛋白水平的表达。

3.2 Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞糖酵解关键酶PFK1和PKM2的亚硝化

课题组前期实验已经证明nNOS通过产生NO，亚硝化修饰糖酵解关键酶PFK1和PKM2的功能，进而促进卵巢癌糖酵解。Tempol抑制nNOS产生NO，因此我们想要探讨Tempol会否通过抑制nNOS的作用进而对两个糖酵解关键酶产生影响。首先1.5mM Tempol处理卵巢癌OVCAR3细胞48h，随后按照亚硝化试剂盒的实验步骤进行亚硝化检测。实验结果如图11所示，Tempol抑制卵巢癌OVCAR3细胞糖酵解关键酶PFK1和PKM2的亚硝化水平。由此提示，Tempol可能通过抑制nNOS产生NO，进而抑制NO亚硝化修饰糖酵解关键酶PFK1和PKM2，抑制卵巢癌的糖酵解。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.Tempol在作为抑制癌细胞增殖的药物方面的应用。

2.根据权利要求1所述的Tempol作为抑制癌细胞增殖的药物的应用，其特征在于：所述癌细胞为卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞。

3.根据权利要求1所述的Tempol作为抑制癌细胞增殖的药物的应用，其特征在于：Tempol抑制卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞的增殖。

4.根据权利要求1所述的Tempol作为抑制癌细胞增殖的药物的应用，其特征在于：Tempol通过干扰nNOS产生NO达到抑制癌细胞的糖酵解。

5.根据权利要求4所述的Tempol作为抑制癌细胞增殖的药物的应用，其特征在于：Tempol抑制癌细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成、抑制癌细胞ATP的产生、抑制癌细胞NADPH的产生、激活癌细胞AMPK的磷酸化、抑制癌细胞糖酵解关键酶PFK1和PKM2的亚硝化、不影响癌细胞糖酵解关键酶PFK1和PKM2的蛋白表达。

6.Tempol在作为促进顺铂诱导的癌细胞凋亡药物方面的应用。

7.根据权利要求6所述的Tempol作为促进顺铂诱导的癌细胞凋亡药物的应用，其特征在于：Tempol促进DDP抑制癌细胞增殖。

8.根据权利要求7所述的Tempol作为促进顺铂诱导的癌细胞凋亡药物的应用，其特征在于：Tempol降低DDP诱导的癌细胞Bcl-2/Bax的表达。

9.根据权利要求8所述的Tempol作为促进顺铂诱导的癌细胞凋亡药物的应用，其特征在于：Tempol促进DDP诱导的癌细胞凋亡通过增加细胞内ROS水平。

10.根据权利要求9所述的Tempol作为促进顺铂诱导的癌细胞凋亡药物的应用，其特征在于：Tempol通过干扰nNOS功能抑制癌细胞的糖酵解。