CN107607713A - 一种检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测试剂盒及其应用,尤其涉及一种包被复合抗体的检测试剂盒及其在类风湿关节炎检测试剂上的应用,所述试剂盒包括固相载体,所述固相载体包被有复合抗体,所述复合抗体为抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体的组合。本申请试剂盒的检测抗体为抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体的组合,能够一次检测多种RA自身抗原,克服了单一自身抗原检测灵敏和特异性不足,以及多种自身抗原单次逐一检测在操作上的繁琐,大大提高了检测效率和结果判断的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物免疫检测技术领域,具体涉及一种检测试剂盒及其应用,尤其涉及一种包被复合抗体的检测试剂盒及其在类风湿关节炎检测试剂上的应用。
背景技术
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的且难以治愈的疾病,引起关节不可逆的损伤,发病后期往往导致患者残疾,影响生活质量,丧失工作能力。其特征是持续的滑膜炎、全身性的炎症和存在自身抗体。目前RA的病因和发病机制仍知之甚少,及时诊断、及早治疗对于疾病的控制具有重要的意义。目前临床上用于诊断RA的方法很多,我国采用1987年美国风湿病学会(ACR)修订的RA分类标准,其特异性为89%,灵敏度为91%-94%,但该标准容易漏诊一些早期或不典型的患者。
RF(类风湿因子)是血清学指标中一种,较少受到病程等因素的影响,可在疾病早期出现,检测方便、敏感性高,但是特异性较低,在正常人中RF阳性可达到5%。此外抗CCP抗体可在关节炎早期出现,并与骨关节的破坏相关,但其灵敏度60%,特异性90%。临床实验目前检测RA疾病最常用检测指标除了抗环瓜氨酸抗体(抗-CCP抗体)和类风湿因子(RF),还有抗角蛋白抗体(AKA)、抗聚角蛋白微丝蛋白抗体(AFA)、抗细胞核周围因子(APF)、抗波形蛋白(AVA)抗体等的发现为临床早期诊断RA、指导治疗、预测预后提供重要依据。
RA患者的体内最先出现RA自身抗原,经过自身抗原的积累到达一定的反应程度,自身抗原经过刺激患者机体内的T细胞及记忆细胞产生相应的自身抗体。
CN 101074951 A公开了一种早期诊断类风湿关节炎的免疫球蛋白G糖基化检测试剂及检测方法,该方法用与糖链特异性结合的凝集素及标记的IgG抗体对IgG的糖基化进行凝集素-亲和免疫检测。CN 1712964 A公开了一种类风湿关节炎特异性抗原性标志物——瓜氨酸化纤维连接蛋白,通过检测瓜氨酸化纤维连接蛋白从而检测类风湿关节炎。上述方法都采用单一的抗体进行检测,检测灵敏度不够高,特异性不强,检测结果不够准确。
但目前仍然有一部分的早期患者不能被确诊,国际公认的CCP2法检测RA,灵敏度最多才能到70%,而且无法诊断早期患者,因此,RA诊断需要开发新的更具诊断意义的方法,以提高诊断结果的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合检测抗体及其应用,所述检测抗体为抗瓜氨酸化蛋白抗体与抗氨甲酰化蛋白抗体的组合,能够一次检测多种RA自身抗体,克服了单一自身抗体检测灵敏和特异性不足、以及多种自身抗体单次逐一检测在操作上的繁琐,大大提高了检测效率和结果判断的准确性。
为达到此发明的目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种检测抗体,所述检测抗体为抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体的组合抗体。
本发明中,发明人发现通过采用抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体进行组合来检测,相比于采用单一的抗瓜氨酸化蛋白抗体或单一的抗氨甲酰化蛋白抗体检测的检测灵敏度明显提高,两种蛋白协同作用,共同检测多种自身免疫性抗体,相比于采用其中一种蛋白作为检测抗体,提高了检测的效率和结果的准确性。
优选地,所述抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体的质量比为(2-4):(1-3),例如可以是2:1、2:2、2:3、3:1、3:2、3:3、4:1、4:2或4:3,优选为3:2。
发明人发现,采用上述比例的抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体,可以最大限度的发挥抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体的协同作用,提高了检测效率和结果的准确性。
优选地,所述组合抗体的工作浓度为0.1-20μg/mL,例如可以是0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.8μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、16μg/mL、17μg/mL、18μg/mL、19μg/mL或20μg/mL,优选为0.1-10μg/mL。
根据本发明,所述抗瓜氨酸化蛋白抗体选自但不限于抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化II型胶原抗体、抗瓜氨酸化核周因子抗体、抗瓜氨酸化丝聚蛋白抗体、抗瓜氨酸化牛白蛋白抗体、抗瓜氨酸化组胺受体抗体、抗瓜氨酸化α-抗胰蛋白酶抗体、抗瓜氨酸化动力蛋白重链3抗体、抗瓜氨酸化纤维蛋白原β链抗体、抗瓜氨酸化角蛋白抗体、抗瓜氨酸化微管蛋白β链抗体、抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化纤维粘连蛋白抗体、抗瓜氨酸化可溶性人白细胞抗原I抗体、抗瓜氨酸化α-烯醇化酶抗体、抗瓜氨酸化无孢蛋白抗体、抗瓜氨酸化组织蛋白酶D抗体、抗瓜氨酸化β-肌动蛋白抗体、抗瓜氨酸化CapZa-1抗体、抗瓜氨酸化蛋白质二硫键异构酶ER60前体抗体、抗瓜氨酸化线粒体乙醛脱氢酶抗体或抗瓜氨酸化Spα受体抗体中的任意一种或至少两种的组合,优选为抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯醇化酶抗体或抗瓜氨酸化丝聚蛋白抗体中的任意一种或两种的组合。
本发明中,所述抗氨甲酰化蛋白抗体选自但不限于抗氨甲酰化牛白蛋白抗体、抗氨甲酰化纤维蛋白抗体、抗氨甲酰化波形蛋白抗体、抗氨甲酰化胶原蛋白抗体或抗氨甲酰化烯醇酶抗体中的任意一种或至少两种的组合,优选为抗氨甲酰化牛白蛋白抗体、抗氨甲酰化纤维蛋白抗体或抗氨甲酰化烯醇酶抗体中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中,若组合抗体中有至少2种的抗瓜氨酸化蛋白抗体,则具体的抗瓜氨酸化蛋白抗体的质量比相同,例如所述抗瓜氨酸化蛋白抗体为抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体和抗瓜氨酸化波形蛋白抗体,则抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体和抗瓜氨酸化波形蛋白抗体的质量比为1:1;同理若组合抗体中有至少2中的抗氨甲酰化蛋白抗体,则具体的抗氨甲酰化蛋白抗体的质量比为1:1。
根据本发明,所述包被包括直接包被。
根据本发明,所述固相载体为酶标板、磁珠、亲和膜或液相芯片中的任意一种或至少两种的组合。
根据本发明,所述检测试剂盒还包括第一抗体,所述第一抗体选自但不限于纤维蛋白原抗体、波形蛋白抗体、II型胶原抗体、核周因子抗体、丝聚蛋白抗体、组胺受体抗体、α-抗胰蛋白酶抗体、动力蛋白重链3抗体、纤维蛋白原β链抗体、抗角蛋白抗体、微管蛋白β链抗体、纤维蛋白抗体、纤维粘连蛋白抗体、α-烯醇化酶抗体、组织蛋白酶D抗体、β-肌动蛋白抗体、CapZa-1抗体、人IgG抗体、蛋白质二硫键异构酶ER60前体抗体、线粒体乙醛脱氢酶抗体或Spα受体抗体中的任意一种或至少两种的组合,优选为纤维蛋白原抗体、波形蛋白抗体、II型胶原抗体、α-烯醇化酶抗体或抗人IgG抗体中的任意一种或至少两种的组合;
本发明中,若第一抗体中有至少2种的抗体,则具体的抗体的质量比本领域技术人员可以根据需要进行调整,本申请采用的是抗体质量比相同,例如所述抗体的组合为纤维蛋白原抗体、波形蛋白抗体、II型胶原抗体、α-烯醇化酶抗体和抗人IgG抗体的组合,则以纤维蛋白原抗体、波形蛋白抗体、II型胶原抗体、α-烯醇化酶抗体和抗人IgG抗体的质量比1:1:1:1:1进行混合,形成复合第一抗体。
根据本发明,所述第一抗体采用生物素进行标记,所述生物素(biontin,B)广泛分布于动、植物组织中,常从含量较高的卵黄和肝组织中提取,分子量244.31kD,生物素分子有两个环状结构,其中Ⅰ环为咪唑酮环,是与亲和素结合的主要郎部位;II环为噻吩环,C2上有一戊酸侧链,其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的惟一结构,经化学修饰后,生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素:①标记蛋白质氨基的活化生物素②标记蛋白质醛基的活化生物素③标记蛋白质巯基的活化生物素。活化的生物素一般采用摩尔比5到10比1的比例交联到抗体上。
本发明中,采用生物素标记的复合第一抗体可避免多种抗体用HRP等酶标记的困难,也避免采用多个HRP标记的二抗的困难(不同来源的抗体需要用多种二抗,多种酶标二抗会加大检测的非特异性及种间交叉非特异识别,也会加大实验的投入与误差)。
根据本发明,所述检测试剂盒还包括酶标记的链霉亲和素。
根据本发明,所述酶为辣根过氧化物酶和/或磷酸酯酶(AP酶)。
根据本发明,所述酶标记的链霉亲和素的稀释倍数为1000-40000,所述酶标记的链霉亲和素的工作质量浓度为0.1-1μg/mL,所述酶标抗体的浓度根据抗体的批次,浓度,纯度,亲合力高低而有所不同。
所述酶标记的链霉亲和素的稀释倍数例如可以是1000、1200、1500、1800、2000、2500、3000、3500、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、13000、15000、18000、20000、23000、25000、28000、30000、33000、35000、38000或40000,优选为10000。
所述酶标记的链霉亲和素的质量浓度例如可以是0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL或1μg/mL。
作为试剂盒,抗体和酶标检测抗体是其核心成分,只要有这两种成分就能实现基本的抗体-抗体结合反应,至于辅助成分,比如样品稀释液、洗涤液、底物溶液、终止液、临界对照品、阳性对照和阴性对照,可以与上述两种成分配套组装在一个试剂盒中,也可以单独提供,因此本发明中试剂盒可以包括这些辅助成分,也可以不包括,本发明优选包括这些辅助成分,以方便使用。
根据本发明,所述试剂盒还包括阴性对照品、阳性对照品、临界对照品、样品稀释液、封闭液、洗涤液、显色液、底物溶液和终止液。
在本发明的一个具体实施例中,所述试剂盒中的具体组分如下:
(1)包被缓冲液:0.01M-0.5M PBS缓冲液,0.01%-0.5%ProClin300,pH 6.9-9.4;
(2)封闭液:0.5-10%BSA,0.01M-0.5M PBS缓冲液,0.01%-0.5%ProClin300,pH6.9-9.4;
(3)样本稀释液:0.5-10%BSA,0.01M-0.5M Tri-HCL缓冲液,0.01%-0.5%ProClin300,pH 6.9-9.4;
(4)阴阳性对照品稀释液:0.5-10%BSA,0.01M-0.5M PBS缓冲液,0.01%-0.5%ProClin300,pH 6.9-9.4;
(5)洗涤液:0.01%-0.5%Tween-20,0.01M-0.5M PBS缓冲液,0.01%-0.5%ProClin300,pH 6.9-9.4;
(6)酶标抗体稀释液:0.5-10%BSA,0.01M-0.5M PBS缓冲液,0.01%-0.5%ProClin300,pH 6.9-9.4;
(7)显色缓冲液:0.01M-1M磷酸盐-柠檬酸缓冲液,pH 3.0-5.0;
(8)显色液:TMB;
(9)终止液:硫酸。
第二方面,本发明提供如第一方面所述的检测试剂盒的使用方法,包括如下步骤:
(1)试剂盒在室温平衡0.5-1h,用样品稀释液将待测样品进行稀释;
(2)在酶标板相对应的孔中加入已稀释好的待测样品、阴性对照品和阳性对照品,封板,进行孵育、洗涤;
(3)将第一抗体加入酶标板中,封板,孵育、洗涤;
(4)将酶标抗体加入酶标板中,封板,孵育、洗涤、显色,检测所述待测样品的光吸收值和所述阴性对照品的光吸收值,待测样品的光吸收值减去阴性对照的光吸收值,为所述待测样品的结果。
本发明中所述孵育和洗涤都是本领域的常规技术,本领域技术人员可以根据需要选择孵育的温度、孵育的时间、洗涤的次数,在此不作特殊限定。
根据本发明,步骤(3)所述检测的波长为450nm和630nm双波长检测。
根据本发明,步骤(3)所述获得抗体值=所述待测样品的光吸收值-所述阴性对照品的光吸收值。
根据本发明,所述检测后的结果判定为:
所述待测样品的光吸收值/所述临界对照品的光吸收值≥1时,判为阳性;
所述待测样品的光吸收值/所述临界对照品的光吸收值<1时,判为阴性。
在本发明的一个具体实施例中,所述检测试剂盒的使用方法,包括如下步骤:
(1’)预处理:将试剂盒各组分置于室温平衡0.5-1h,用样本稀释液进行3-100倍稀释;
(2’)加样:在酶标板相对应的孔中加入已稀释好的待测样品、阴阳性对照各100μl/孔,用封板膜封板,将已加样的酶标板置200rpm振荡器室温孵育30-60min,将孵育好的酶标板,弃液拍干,用洗涤液洗涤4-6次;
(3’)加生物素标记复合一抗:将酶标抗体按照100μl/孔加入酶标板中,用封板膜封板,将已加样的酶标板置200rpm振荡器室温孵育30-60min,将孵育好的酶标板,弃液拍干,用洗涤液洗涤4-6次;
(4’)加酶标链酶亲和素(HRP和/或AP酶):将稀释好的酶标链酶亲和素按100μl/孔加入酶标板中,用封板膜封板,将已加样的酶标板置200rpm振荡器室温孵育30-60min,将孵育好的酶标板,弃液拍干,用洗涤液洗涤4-6次;
(5’)显色:底物A与底物B按照1:10进行稀释混合均匀,按照100μl/孔加入酶标板中,置400rpm振荡器室温孵育10-15min;
(6’)测值:将终止液按照100μl/孔加入酶标板中,轻拍混匀,设定酶标仪波长450nm和630nm进行双波长测定各孔的OD值。
本发明试剂盒的检测分析原理:
本产品采用的是酶联免疫诊断技术,包被在酶标板上的两种抗体复合物:抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体,可以特异性结合血清中RA的自身抗原,再通过生物素标记的第一抗体特异性的捕捉血清中能与第一抗体结合的自身抗原,没有结合的其他成分在洗涤后会被洗掉,结合的自身抗原在加入HRP和/或AP标记的链霉亲和素后再次洗涤,经HRP和/或AP催化显色剂A、显色剂B,发生氧化还原反应产生特异波长的光波,经含450nm/630nm波长的酶标仪读数后即可进行定性判断。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本申请试剂盒的检测抗体为抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体的组合,能够一次检测多种RA自身抗原,克服了单一自身抗原检测灵敏和特异性不足,以及多种自身抗原单次逐一检测在操作上的繁琐,大大提高了检测效率和结果判断的准确性;
(2)本申请试剂盒中的两种抗体:抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体能够协同作用,互相配合,使得本申请试剂盒的灵敏度为90.0%,特异性为97.3%,敏感性和特异性均高于现有的其他抗体的试剂盒;
(3)本发明试剂盒还可用于类风湿关节炎的临床检验以及治疗后的疗效考核,具有广阔的市场前景和巨大的经济效益。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案,但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1:试剂盒的组装
1、主要试剂:
(1)包被缓冲液:0.01M-0.5M PBS缓冲液,0.01%-0.5%ProClin300,pH 6.9-9.4;
(2)封闭液:0.5-10%BSA,0.01M-0.5M PBS缓冲液,0.01%-0.5%ProClin300,pH6.9-9.4;
(3)样本稀释液:0.5-10%BSA,0.01M-0.5M Tri-HCL缓冲液,0.01%-0.5%ProClin300,pH 6.9-9.4;
(4)阴阳性对照品稀释液:0.5-10%BSA,0.01M-0.5M PBS缓冲液,0.01%-0.5%ProClin300,pH 6.9-9.4;
(5)洗涤液:0.01%-0.5%Tween-20,0.01M-0.5M PBS缓冲液,0.01%-0.5%ProClin300,pH 6.9-9.4;
(6)酶标抗体稀释液:0.5-10%BSA,0.01M-0.5M PBS缓冲液,0.01%-0.5%ProClin300,pH 6.9-9.4;
(7)显色缓冲液:0.01M-1M磷酸盐-柠檬酸缓冲液,pH 3.0-5.0;
(8)显色液:TMB;
(9)终止液:硫酸。
2、反应板工作液配制
采用两类翻译后修饰的蛋白抗体包被:将抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体与抗瓜氨酸化波形蛋白抗体按质量比1:1混合,将抗氨甲酰化牛白蛋白抗体与抗氨甲酰化纤维蛋白抗体按质量比1:1混合,将抗瓜氨酸化蛋白抗体与抗氨甲酰化蛋白抗体按照最适比例3:2进行混合均匀,然后用包被液将组合抗体按照最佳工作浓度5μg/mL进行稀释,配制成反应板工作液。将配制好的反应板工作液按100μl/孔加入96孔酶标板中,室温震荡15min,置4℃过夜(16-20h)后弃废液拍干反应板。将洗涤液按250μl/孔加入96孔反应板中,室温静置2min,弃废液拍干反应板,洗板3次,将配制好的封闭液按200μl/孔加入96孔反应板中,室温震荡孵育2-4h后倒掉拍干反应板。拍干后的反应板,放入37℃温箱干燥3h后将反应板放入带有干燥剂的用铝箔袋密封包装。
3、生物素标记复合第一抗体的制备:
选取纯化过的纤维蛋白原抗体、波形蛋白抗体、II型胶原抗体、α-烯醇化酶抗体,抗人IgG抗体各1mg,分别进行生物素化标记,长链活化生物素按浓度1mg/ml溶解于二甲基亚砜中;将待偶联而已经纯化的抗体按浓度1mg/ml溶解于0.1mol/L pH9.0的碳酸氢纳溶液中;将活化生物素液与待偶联的抗体溶液按1:8混合,在室温下温育4h;在4℃下对0.05mol/L pH7.2的PBS透析24h,其中换液4次,以除去未结合的游离生物素,标记好的抗体按1:1:1:1:1的比例混合好,形成复合一抗。
4、酶标链酶亲和素的制备
采用酶结合物稀释液将辣根过氧化物酶(HRP)标记的链酶亲和素进行稀释10000倍配制成酶标链酶亲和素,其工作质量浓度为0.6μg/mL。
5、阴阳性对照配制
采用从医院收集确诊为类风湿性关节炎患者的血清和正常人血清,经过处理后用阴阳性对照品稀释液按照适当比例进行稀释。
组建的试剂盒包括以下几个方面:96孔酶标板、阴性对照、阳性对照、临界对照,样本稀释液、洗涤液、酶标抗体、显色液、终止液、封板膜及说明书。
对比例1:CCP诊断试剂盒
以人工合成的瓜氨酸化多肽包被酶标板,样品血清经稀释后按每孔100μl加入反应板样品空中,选取其余孔加入标准品或参考品,室温反应1h,经洗涤后加入HRP标记的抗人IgG抗体,室温反应30min,经洗涤后加入TMB底物,室温反应15min,加入终止液终止反应,用分光光度计在450nm和630nm下检测光吸收值,与标准品或参考品比较计算结果。
对比例2:
以抗瓜氨酸抗体包被酶标板,样品血清经稀释后按每孔100μl加入反应板样品空中,选取其余孔加入标准品或参考品,室温反应1h,经洗涤后加入生物素标记的复合一抗,室温反应1h,经洗涤后加入稀释好的酶标链酶亲和素,室温反应30min,经洗涤后加入TMB底物,室温反应15min,加入终止液终止反应,用分光光度计在450nm和630nm下检测光吸收值,与标准品或参考品比较计算结果。
对比例3:
以抗氨甲酰胺抗体包被酶标板,样品血清经稀释后按每孔100μl加入反应板样品空中,选取其余孔加入标准品或参考品,室温反应1h,经洗涤后加入生物素标记的复合一抗,室温反应1h,经洗涤后加入稀释好的酶标链酶亲和素,室温反应30min,经洗涤后加入TMB底物,室温反应15min,加入终止液终止反应,用分光光度计在450nm和630nm下检测光吸收值,与标准品或参考品比较计算结果。
试剂盒的使用方法
(1)预处理:将试剂盒各组分置于室温平衡0.5-1h,用样本稀释液将样本进行稀释;
(2)加样:在酶标板相对应的孔中加入已稀释好的待测样品、阴阳性对照各100μl/孔,用封板膜封板;
(3)孵育:将已加样的酶标板置200rpm振荡器室温孵育30-60min;
(4)洗涤:将孵育好的酶标板,弃液拍干,用洗涤液洗涤4-6次;
(5)加生物素标记复合一抗:将酶标抗体按照100μl/孔加入酶标板中,用封板膜封板;
(6)孵育:将已加样的酶标板置200rpm振荡器室温孵育30-60min;
(7)洗涤:将孵育好的酶标板,弃液拍干,用洗涤液洗涤4-6次;
(8)加HRP酶标链酶亲和素:将稀释好的酶标链酶亲和素按100μl/孔加入酶标板中,用封板膜封板;
(9)孵育:将已加样的酶标板置200rpm振荡器室温孵育30-60min;
(10)洗涤:将孵育好的酶标板,弃液拍干,用洗涤液洗涤4-6次;
(11)显色:底物A与底物B按照1:10进行稀释混合均匀,按照100μl/孔加入酶标板中,置400rpm振荡器室温孵育10-15min;
(12)测值:将终止液按照100μl/孔加入酶标板中,轻拍混匀,设定酶标仪波长450nm和630nm进行双波长测定各孔的OD值。
通过用本发明试剂盒(实施例1)与对比例1-3中的试剂盒进行检测灵敏度和特异性:
样本数量及类型:共计210例临床血清,其中正常人110例,RA患者60例,***性红斑性狼疮患者血清40例。实验结果如下表:
表1实施例1试剂盒临床诊断结果统计表
阳性符合率=54/(54+6)×100%=90.0%;
阴性符合率=146/(150)×100%=97.3%;
粗一致性=(54+146)/210×100%=95.2%;
约登指数=54/(54+6)+146/(146+4)-1=0.97;
表2 CCP试剂盒(对比例1)与临床诊断结果统计表
阳性符合率=43/(43+17)×100%=71.7%;
阴性符合率=136/(136+14)×100%=90.7%;
粗一致性=(43+136)/210×100%=85.2%;
约登指数=43/(43+17)+136/(136+14)-1=0.624;
表3对比例2中的试剂盒临床诊断结果统计表
阳性符合率=42/(42+18)×100%=70%;
阴性符合率=130/(130+20)×100%=86.7%;
粗一致性=(42+130)/210×100%=81.9%;
约登指数=42/(42+18)+130/(130+20)-1=0.567;
表4对比例3中的试剂盒临床诊断结果统计表
阳性符合率=41/(41+19)×100%=68.3%;
阴性符合率=136/(136+14)×100%=90.7%;
粗一致性=(41+136)/210×100%=84.2%;
从表1-表4的结果可以看出,本申请采用多种RA特异型抗原检测法制备的试剂盒无论是灵敏度还是特异性均优于其他采用检测试剂盒。本申请试剂盒灵敏度为90.0%,特异性为97.3%。本实验结果表明,采用采用新型RA特异型抗原检测法制备的试剂盒具有特异性强,灵敏度高等特点。
实施例2
与实施例1相比,除抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体和抗氨甲酰化牛白蛋白抗体的质量比为3:2之外,其它与实施例1相同。
实施例3
与实施例1相比,除抗瓜氨酸化α-抗胰蛋白酶抗体和抗氨甲酰化胶原蛋白抗体的质量比为3:2之外,其它与实施例1相同。
实施例4
与实施例1相比,除抗瓜氨酸化波形蛋白抗体和抗氨甲酰化纤维蛋白抗体的质量比为1:1,所述组合抗体的工作质量浓度为10μg/mL,第一抗体为纤维蛋白原抗体、波形蛋白抗体和II型胶原抗体,质量比为1:1:1之外,其它与实施例1相同。
实施例5
与实施例1相比,除抗瓜氨酸化α-烯醇化酶抗体和抗氨甲酰化烯醇酶抗体的质量比为2:1,所述组合抗体的工作质量浓度为3μg/mL,第一抗体为组胺受体抗体、α-抗胰蛋白酶抗体和动力蛋白重链3抗体,质量比为1:1:1之外,其它与实施例1相同。
实施例6
与实施例1相比,除抗瓜氨酸化丝聚蛋白抗体和抗氨甲酰化烯醇酶抗体的质量比为4:1,所述组合抗体的工作质量浓度为0.1μg/mL,第一抗体为丝聚蛋白抗体,其工作质量浓度为1μg/mL之外,其它与实施例1相同。
实施例7
与实施例1相比,除瓜氨酸化纤维粘连蛋白和氨甲酰化烯醇酶的质量比为2:3,所述组合抗体的工作质量浓度为20μg/mL,第一抗体为线粒体乙醛脱氢酶抗体,其工作质量浓度为0.1μg/mL之外,其它与实施例1相同。
对比例4
与实施例1相比,除抗瓜氨酸化蛋白抗体与抗氨甲酰化蛋白抗体的质量比为5:1之外,其它与实施例1相同。
对比例5
与实施例1相比,除抗瓜氨酸化蛋白抗体与抗氨甲酰化蛋白抗体的质量比为1:2之外,其它与实施例1相同。
对比例6
与实施例1相比,除所述组合抗体的工作质量浓度为23μg/mL之外,其它与实施例1相同。
对比例7
与实施例1相比,除不采用生物素标记的第一抗体之外,其它与实施例1相同。
试剂盒的灵敏度和特异性检测
将实施例2-7和对比例4-7进行灵敏度和特异性的检测,结果如下表5所示:
表5
阳性符合率 | 阴性符合率 | 粗一致性 | |
实施例1 | 90.0% | 97.3% | 97.1% |
实施例2 | 89.5% | 94.1% | 92.4% |
实施例3 | 88.2% | 94.4% | 91.6% |
实施例4 | 89.4% | 89.4% | 90.4% |
实施例5 | 87.8% | 90.7% | 88.2% |
实施例6 | 85.9% | 86.7% | 89.6% |
实施例7 | 84.3% | 88.5% | 90.2% |
对比例1 | 71.7% | 90.7% | 85.2% |
对比例2 | 75% | 86.7% | 83.3% |
对比例3 | 68.3% | 90.7% | 84.2% |
对比例4 | 80.1% | 86.7% | 85.4% |
对比例5 | 79% | 89.2% | 85.6% |
对比例6 | 81.5% | 90.3% | 88.7% |
对比例7 | 70.4% | 83.1% | 86.8% |
从表5可以看出,从实施例可以看出,当抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体的质量比3:2,且抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体为混合抗体时检测效果最好,随着抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体的质量比的改变,其检测效果随之下降。
通过实施例1与对比例1-3对比可以看出,但包被抗体为单一的抗体时,其检测效果不如本发明;通过实施例1与对比例4-5对比,抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体的质量比的改变使得检测精准度和特异性下降,尤其是瓜氨酸化波型蛋白和氨甲酰化纤维蛋白原白的质量比不在(2-4):(1-3)范围内,检测精准度和特异性与在(2-4):(1-3)范围内相差甚大,可见抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体的组合抗体通过特定的质量比取得了精准度和特异性提高的效果;通过实施例与对比例6-7对比可以看出,当改变组合抗体的工作质量浓度或是不采用生物素标记的第一抗体都会影响检测结果。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括固相载体,所述固相载体包被有复合抗体,所述复合抗体为抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体的组合。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述抗瓜氨酸化蛋白抗体和抗氨甲酰化蛋白抗体的质量比为(2-4):(1-3),优选为3:2;
优选地,所述组合抗体的工作质量浓度为0.1-20μg/mL,优选为0.1-10μg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒,其特征在于,所述抗瓜氨酸化蛋白抗体为抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化II型胶原抗体、抗瓜氨酸化核周因子抗体、抗瓜氨酸化丝聚蛋白抗体、抗瓜氨酸化牛白蛋白抗体、抗瓜氨酸化组胺受体抗体、抗瓜氨酸化α-抗胰蛋白酶抗体、抗瓜氨酸化动力蛋白重链3抗体、抗瓜氨酸化纤维蛋白原β链抗体、抗瓜氨酸化角蛋白抗体、抗瓜氨酸化微管蛋白β链抗体、抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化纤维粘连蛋白抗体、抗瓜氨酸化可溶性人白细胞抗原I抗体、抗瓜氨酸化α-烯醇化酶抗体、抗瓜氨酸化无孢蛋白抗体、抗瓜氨酸化组织蛋白酶D抗体、抗瓜氨酸化β-肌动蛋白抗体、抗瓜氨酸化CapZa-1抗体、抗瓜氨酸化蛋白质二硫键异构酶ER60前体抗体、抗瓜氨酸化线粒体乙醛脱氢酶抗体或抗瓜氨酸化Spα受体抗体中的任意一种或至少两种的组合,优选为抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯醇化酶抗体或抗瓜氨酸化丝聚蛋白抗体中的任意一种或两种的组合;
优选地,所述抗氨甲酰化蛋白抗体为抗氨甲酰化牛白蛋白抗体、抗氨甲酰化纤维蛋白抗体、抗氨甲酰化波形蛋白抗体、抗氨甲酰化胶原蛋白抗体或抗氨甲酰化烯醇酶抗体中的任意一种或至少两种的组合,优选为抗氨甲酰化牛白蛋白抗体、抗氨甲酰化纤维蛋白抗体或抗氨甲酰化烯醇酶抗体中的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测试剂盒,其特征在于,所述包被包括直接包被;
优选地,所述固相载体为酶标板、磁珠、亲和膜或液相芯片中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒还包括第一抗体;
优选地,所述第一抗体包括纤维蛋白原抗体、波形蛋白抗体、II型胶原抗体、核周因子抗体、丝聚蛋白抗体、组胺受体抗体、α-抗胰蛋白酶抗体、动力蛋白重链3抗体、纤维蛋白原β链抗体、抗角蛋白抗体、微管蛋白β链抗体、纤维蛋白抗体、纤维粘连蛋白抗体、α-烯醇化酶抗体、组织蛋白酶D抗体、β-肌动蛋白抗体、CapZa-1抗体、人IgG抗体、蛋白质二硫键异构酶ER60前体抗体、线粒体乙醛脱氢酶抗体或Spα受体抗体中的任意一种或至少两种的组合,优选为纤维蛋白原抗体、波形蛋白抗体、II型胶原抗体、α-烯醇化酶抗体或抗人IgG抗体中的任意一种或至少两种的组合;
优选地,所述第一抗体采用生物素进行标记。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒还包括亲和素,优选为酶标记的链霉亲和素;
优选地,所述酶为辣根过氧化物酶和/或磷酸酯酶;
优选地,所述酶标记的链霉亲和素的稀释倍数为1000-40000,优选为10000;
优选地,所述酶标记的链霉亲和素的工作质量浓度为0.1-1μg/mL;
优选地,所述检测试剂盒还包括阴性对照品、阳性对照品、临界对照品、样品稀释液、封闭液、洗涤液、显色液、底物溶液和终止液。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的检测试剂盒的使用方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)试剂盒在室温平衡0.5-1h,用样品稀释液将待测样品进行稀释;
(2)在酶标板相对应的孔中加入已稀释好的待测样品、阴性对照品和阳性对照品,封板,进行孵育、洗涤;
(3)将第一抗体加入酶标板中,封板,孵育、洗涤;
(4)将酶标抗体加入酶标板中,封板,孵育、洗涤、显色,检测所述待测样品的光吸收值和所述阴性对照品的光吸收值,待测样品的光吸收值减去阴性对照的光吸收值,为所述待测样品的结果。
8.根据权利要求7所述的使用方法,其特征在于,步骤(1)所述的稀释的倍数为3-100,优选为20;
优选地,步骤(4)所述检测的波长为450nm和630nm双波长检测;
优选地,步骤(4)所述待测样品的光吸收值减去所述阴性对照品的光吸收值。
9.根据权利要求7或8所述的使用方法,其特征在于,所述待测样品的结果判定为:
所述待测样品的光吸收值/所述临界对照品的光吸收值≥1时,判为阳性;
所述待测样品的光吸收值/所述临界对照品的光吸收值<1时,判为阴性。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的检测试剂盒在制备类风湿关节炎的检测试剂和/或检测药物中的应用。
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