CN107603941A

CN107603941A - 一种高效能血清添加剂及其制备方法和使用方法

Info

Publication number: CN107603941A
Application number: CN201710824815.5A
Authority: CN
Inventors: 陈文均; 陈真真; 冯子彬
Original assignee: Nanjing Bingshen Network Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Bingshen Network Technology Co Ltd
Priority date: 2017-09-14
Filing date: 2017-09-14
Publication date: 2018-01-19

Abstract

本发明涉及血液制品技术领域，尤其是一种高效能血清添加剂及其制备方法和使用方法，其组分包括0.5g/L碳水化合物、61.5g/L氨基酸、0.3g/L无机盐、0.01‑0.lg/L维生素、2‑3g/L的酵母提取物以及0.1‑5mL/L的化学限定混合物。本发明的高效能血清添加剂可提高血清品质，把正常血清使用量从10％降低到3％‑5％，将血清在应用中的弊端降低到最小。

Description

一种高效能血清添加剂及其制备方法和使用方法

技术领域

本发明涉及血液制品技术领域，具体领域为一种血清添加剂。

背景技术

动物血清不管是在生物实验室里或者临床以及生物医药工业中都起了很大的作用。其主要作用有五点：

第一、血清可以提供基本的营养物质，如氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核算衍生物等，是细胞生长必须的物质。

第二、血清可以提供激素和各种生长因子，如胰岛素、肾上腺皮质激素(氢化可的松、***)、类固醇激素(***、睾酮、孕酮)等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。

第三、提供结合蛋白，结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。

第四、伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。

第五、血清对培养中的细胞也起到某些保护作用，有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。这种作用是偶然发现的，现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。

第六、血清还含有一些微量元素和离子，在代谢解毒中起重要作用。

因此，血清现在已经成为生物学和医学研究领域中不可缺少的原辅材料，广泛的运用在细胞培养等基础研究和应用生物医学领域。

研究人员在长期使用过程中，逐步认识到血清应用于细胞培养中的作用，血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。

血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异.血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。对血清的成分和作用的研究虽有很大进展，但仍存在一些问题。比如：成分不明确，血清保存期短，至多一年；不能排除血清中含有易变物质，使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态；血清可能促进某些细胞的生长(成纤维细胞)同时抑制另一类细胞生长(表皮细胞)；血清含一些对细胞产生毒性的物质，影响细胞生长，甚至造成细胞死亡；取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响可能导致实验失败或实验结果不可靠性；血清制备过程复杂、批间差异大、成分不能保持一致，使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成；质量不稳定；价格昂贵；受原料来源及进出口管制影响盈利，使用不方便。

因此，逐步减少血清在科学实验和工业生产中的用量已成为业内长期以来的研究方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效能血清添加剂及其制备方法和使用方法，提高血清品质，把正常血清使用量从10％降低到3％-5％，以解决现有技术中血清应用实验结果不可靠、制备过程复杂等种种弊端。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种高效能血清添加剂，其组分包括0.5g/L碳水化合物、61.5g/L氨基酸、0.3g/L无机盐、0.01-0.lg/L维生素、2-3g/L的酵母提取物以及0.1-5mL/L的化学限定混合物。

本发明所述的高效能血清添加剂，其中，所述的氨基酸不含半胱氨酸。

本发明所述的高效能血清添加剂，其中，所述的氨基酸包括0.45-0.6g/L的谷氨酰胺。

本发明所述的高效能血清添加剂，其中，所述的碳水化合物不包含蔗糖。

本发明所述的高效能血清添加剂，其中，所述的化学限定混合物包括硫代甘油、软脂酸、丙酮酸钠、亚油酸、α-乳糖、柠檬酸铁、七水硫酸锌、乙二胺四乙酸、乙醇胺、***钠、十八烯酸和偏钒酸钠中的至少一种。

一种高效能血清添加剂的制备方法，包括以下步骤(以1L为例)：

(1)称取配方所列等量的碳水化物、氨基酸、无机盐、维生素及酵母提取物备用；

(2)按设计步骤配置化学限定脂质混合物；

(3)将步骤(1)的组份常温下溶于600ml纯水中，搅拌至溶质完全溶解，溶液无色透明无沉淀，加热至70℃备用；

(4)将步骤(2)的组份常温下溶于380ml纯水中常温，搅拌至完全溶解，澄清无沉淀；

(5)将步骤(3)和步骤(4)的溶液混合搅拌，定容至1L，控温70℃搅拌1h，至沉淀完全溶解70℃烘干，得到棕色固体。

一种高效能血清添加剂的使用方法，具体为，将血清与高效能血清添加剂配制成混合物；其中，高效能血清添加剂的添加量为质量比0.5～3％。

优选的，高效能血清添加剂的添加量为质量比1％。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明通过大量实验证明，使用了本发明的高效能血清添加剂以后，血清用量得到了显著的降低，细胞培养效果明显好于传统的血清培养。

(2)使用本发明的高效能血清添加剂配制的血清与“商用基础培养基+10％血清”相比，可达到相近的细胞密度和蛋白表达产量。

(3)本添加剂所含成分种类少，含量低，配制简单，且能够达到和传统血清同样的效果。本添加剂所含成分均为简单易得试剂，购买方便，成本低廉，生产配制更加方便，使得血清成本大约降低约50-70％，具有良好的商业化前景。

附图说明

图1为细胞计数结果曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

其中，氨基酸不含半胱氨酸；氨基酸包括0.45-0.6g/L的谷氨酰胺；碳水化合物不包含蔗糖。化学限定混合物包括硫代甘油、软脂酸、丙酮酸钠、亚油酸、α-乳糖、柠檬酸铁、七水硫酸锌、乙二胺四乙酸、乙醇胺、***钠、十八烯酸和偏钒酸钠中的至少一种。

其具体制备方法为：

(2)按设计步骤配置化学限定混合物；

实施例2

血清中加入实施例1的高效能血清添加剂的优化试验

一、实验目的

对目前正在使用的血清加入高效能血清添加剂进行优化，以期在培养细胞时能达到更好的效果。

二、实验用品与方法

实验分组：(12孔板)

A组：DMEM(gibco)+3％TS

B组：DMEM(gibco)+5％TS

C组：DMEM(gibco)+10％FBS

注：TS是血清(FBS)+质量比1％高效能血清添加剂配制的混合物。DMEM(gibco)为商用基础培养基。

2.1实验用品

2.1.1实验试剂与细胞

血清(国产某品牌20160122)、PBS、0.25％-EDTA胰酶(gibco)、DMEM(gibco)

细胞：Marc145，实验室细胞库

2.1.2实验仪器耗材

50ml离心管、离心机、恒温水浴锅、血球计数板、显微镜、12孔板、二氧化碳培养箱、超净工作台

2.2实验方法

(1)用DMEM+10％血清培养Marc145细胞，待细胞生长至对数期，胰酶消化后离心收集，用无血清无替代物培养基重悬制备成单细胞悬液，计数，调整细胞密度。

(2)分别以1.0×105/孔接种至对应培养基组的12孔板中(A、B、C三组)，每组接种12个孔(设二个平行实验)。

(3)放入培养箱中培养，每天观察并记录细胞生长情况。每天每组各取12孔板两个孔酶解计数。

注：实验过程中每天观察细胞形态变化，取样计数并记录细胞数量。

三、实验结果

(1)三组细胞状态良好，无显著差别；B组细胞增殖略快，A组和C组生长速度相当。

(2)细胞计数结果如表1及图1所示。

表1(*10⁴)

分组/时间h	0	24	48	72	96	120	144
								3％TS	10.00	9.69	29.43	44.67	54.75	62.75	86.50
5％TS	10.00	11.50	35.44	48.00	59.50	88.75	93.75
								对照组10％FBS	10.00	11.00	21.69	43.00	48.25	67.00	84.25

*注：TS是血清(FBS)+1％高效能血清添加剂配制的混合物，细胞为Marc145。

由图1可以看出3％TS组比对照组细胞浓度率高，但差别不明显；5％TS组细胞浓度明显高于3％TS组和对照组。

四、实验结论

实验结果显示，在血清中加入质量比1％浓度高效能血清添加剂配制成混合物TS，在培养Marc145细胞时添加3％TS可以与原始血清10％浓度效果相当，当添加到5％时，效果明显比原始血清10％浓度好。在实际应用中，高效能血清添加剂的加入量可根据实际需要在质量比0.5％～3％之间任意调整。

通过实验证明，使用了本发明的高效能血清添加剂以后，血清用量得到了显著的降低，细胞培养效果明显好于传统的血清培养。

本发明的高效能血清添加剂配制的血清较目前的商用血清具有更低的成本。以商用血清添加量10％为例，使用了高效能血清添加剂配制的血清的添加量仅需3％，成本降低了约70％。

实验表明，使用本发明的高效能血清添加剂配制的血清与“商用基础培养基+10％血清”可达到相近的细胞密度和蛋白表达量。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种高效能血清添加剂，其特征在于：组分包括0.5g/L碳水化合物、61.5g/L氨基酸、0.3g/L无机盐、0.01-0.lg/L维生素、2-3g/L的酵母提取物以及0.1-5mL/L的化学限定混合物。

2.根据权利要求1所述的高效能血清添加剂，其特征在于：所述的氨基酸不含半胱氨酸。

3.根据权利要求2所述的高效能血清添加剂，其特征在于：所述的氨基酸包括0.45-0.6g/L的谷氨酰胺。

4.根据权利要求3所述的高效能血清添加剂，其特征在于：所述的碳水化合物不包含蔗糖。

5.根据权利要求4所述的高效能血清添加剂，其特征在于：所述的化学限定混合物包括硫代甘油、软脂酸、丙酮酸钠、亚油酸、α-乳糖、柠檬酸铁、七水硫酸锌、乙二胺四乙酸、乙醇胺、***钠、十八烯酸和偏钒酸钠中的至少一种。

6.权利要求1-5任一种高效能血清添加剂的制备方法，其特征在于，以制备1L高效能血清添加剂为例，包括以下步骤：

(2)按设计步骤配置化学限定混合物；

7.权利要求1-5任一种高效能血清添加剂的使用方法，其特征在于：将血清与高效能血清添加剂配制成混合物；其中，高效能血清添加剂的添加量为质量比0.5～3％。

8.根据权利要求7所述的高效能血清添加剂的使用方法，其特征在于：高效能血清添加剂的添加量为质量比1％。