CN107596341A - L型电压门控钙通道特异性多肽类激动剂和抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提出了多肽在制备药物中的用途和筛选药物的方法。所述药物用于调控L型电压门控钙通道，所述多肽具有SEQ ID NO：1～8任一项所示的氨基酸序列。本发明的多肽能够特异性调控LTCC通道，从而影响神经元兴奋‑转录耦联，进一步起到调控神经元发育的效果。

Description

L型电压门控钙通道特异性多肽类激动剂和抑制剂

技术领域

本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及L型电压门控钙通道特异性多肽类激动剂和抑制剂。

背景技术

L型电压门控钙通道(L-type calcium channel，LTCC，也称为Ca_V1通道)是一类广泛表达在神经***、心脏等重要冠能器官的钙通道。作为体内电兴奋性重要的转化器，LTCC能够将细胞膜上由动作电位产生的电信号转换成细胞内的钙信号。钙离子通过Ca_V1通道进入细胞中，作为电信号的第二信使，能够起始很多不同的细胞活动。特别是在神经元中，Ca_V1通道和突触传递、基因调控等兴奋-转录耦联过程密切相关。兴奋-转录耦联过程是神经元功能和发育调节的一个重要生化过程，目前主流观点认为，由Ca_V1通道流入的钙信号可高度特异有效地引起兴奋-转录耦联过程，具体过程如下：神经元受电刺激或化学刺激后引起膜电位上升(神经元兴奋)，进而打开Ca_V1通道，钙信号通过Ca_V1通道流入神经元中，激活与Ca_V1通道预结合的钙调素(Calmodulin，简称CaM)，并在通道口附近特异性激活CaMKII，激活后的CaMKII进入细胞核中引起基因转录因子CREB的磷酸化(称为CaMKII-pCREB信号通路)，激活CREB并影响基因转录水平的调控，进而影响神经元发育和功能的可塑性。这一个过程是神经元自身调控的重要过程，该过程若发生病变可引起诸多精神疾病。

目前，Ca_V1通道已发现与五种主要精神疾病存在高度的遗传关联，包括自闭症、注意缺陷多动障碍、双向情感障碍、重性抑郁障碍和精神***。同时Ca_V1通道也发现了多种点突变造成了精神疾病，例如蒂莫西综合征等。与精神疾病的高度关联也使得LTCC成为重要的药物靶点。主流观点认为通过调节LTCC的钙信号是改善精神类疾病的可行途径，现有LTCC钙信号的干预方法集中于抑制/增强钙通道的活动，进而调控钙内流，针对LTCC设计的特异性抑制剂和激动剂成为潜在的精神类药物。这一类药物的开发已有多年历史，诸多药物已经成为临床使用常用药物，例如尼莫地平nimodipine、伊拉地平isradipine等抑制剂广泛应用于心脑血管疾病等，BayK8644等激动剂应用于加强心肌收缩等。但由于神经***的复杂性，这些药物对神经***的影响，特别是对兴奋-转录耦联的影响，还存在一定争议。例如有报道称激动剂BayK8644虽然可增强Ca_V1打开后的电流大小，但未在神经元中检测到CaMKII介导的发育过程；而另外有报道称抑制剂isradipine可以帮助减轻神经元退化过程。利用现有的Ca_V1通道激动剂和抑制剂尚无法可控的调节兴奋-转录耦联过程。至今也尚未有针对于兴奋-转录耦联的特异性调控药物的报道。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

现有方案主要基于通过LTCC的特异性激动剂和激动剂调控通道钙内流，进而期望调控兴奋-转录耦联。但实际应用中，这些药物表现出复杂的药理作用(尤其是药物长期作用下)，未必能有效调控兴奋-转录耦联作用。

目前市面上在售的LTCC激动剂和抑制剂通常通过大规模药物筛选获得，再验证其药物靶点特异性。通常而言，抑制剂的获取较容易实现，小分子类抑制剂通常直接作用于通道口附近。相比之下，LTCC激动剂的工作原理尚未完全理解，其数量远远低于抑制剂数量，广泛使用的激动剂包括BayK8644和FPL-64176两种，获取具有极大的偶然性，例如BayK8644就是在筛选抑制剂的时候，偶然发现的一类激动剂。

作为小分子类药物，发明人以最有代表性的两种药物：抑制剂isradipine(中文名伊拉地平)和激动剂BayK8644为例，分别对药物药效及神经毒性做了相关测试(图1，图2)。

通常认为，增强神经元L型钙通道的活动性，例如高钾刺激、电刺激等手段是有利于启动兴奋-转录耦联，进而促进神经元发育。但在一些特殊情况下，如在病变的神经***诸如阿兹海默综合征、帕金森综合征等诸多神经疾病中，增加活动性反而使得神经元退化加剧，加入抑制剂后反而有利于治疗效果。为弄清这类小分子类激动剂和抑制剂对常态神经元的影响，发明人分离了新生小鼠的皮层神经元并进行为期1周左右的离体培养，在培养的第5天转染YFP以方便后续为神经元形态进行观测，培养的第7天使用免疫荧光手段观测兴奋-转录耦联中的标志性信号通路——pCREB信号，或直接观测神经元发育形态。在第5天和第7天之间分别加入1μM BayK8644和5μM isradipine刺激1小时、1天或2天(图1.a，图2.a)，以观测药物不同刺激时长下，对pCREB信号及下游发育形态的影响。实验发现，与对照组相比，激动剂BayK8644在短时程刺激下(1小时)，对神经元pCREB信号具有显著的提升效果，但长时程刺激下(1天或2天)，BayK8644失去了对pCREB信号提升的效果(图1.b)；从神经元发育形态来看，短时程BayK8644刺激表现出对神经元突起总长度轻微的增大效果，但长时程BayK8644刺激反而造成了皮层神经元发育受损(图1.c)，表现出显著的神经毒性。抑制剂isradipine在短时程(1小时)刺激下，对pCREB信号具有显著性的抑制效果，但长时程(1天或2天)刺激下，神经元pCREB信号呈现出逐渐恢复的过程，在2天的刺激时长下，神经元已经恢复到与对照组相当的水平(图2.c)；从神经元发育形态来看，短时程到长时程的刺激亦同样呈现出逐渐恢复的过程，但全过程下均没有对神经元发育造成显著性破坏(图2.b)。

综上可知，目前已有的Ca_V1激动剂和抑制剂对神经元兴奋-转录耦联及发育影响表现出复杂的药理作用，其调控结果与通常理解时常不一致，且更重要的是，尚无一类针对LTCC的药物可长时有效地促进神经元兴奋-转录耦联及发育过程。

有鉴于此，为避免大规模药物筛选带来的不确定性，发明人构思从另一种不同于现有激动剂(如BayK8644)和抑制剂(如isradipine)的作用机制出发，设计能够特异性调控LTCC通道，且调控后的LTCC通道能够长时高效且可控地调控神经元兴奋-转录耦联及发育。发明人经过深入研究，从LTCC通道动力学调控的分子机制出发设计特异性调控多肽。LTCC存在一类特殊的动力学调控过程，称为钙依赖失活调控(Calcium dependentinactivation，缩写CDI)，其调控结果会影响LTCC的进钙能力。目前有文章表明，钙依赖失活的本质为由钙调素(Calmodulin，缩写CaM)介导的通道功能增强，钙调素是一类与LTCC有直接结合通道的内源性蛋白，当钙调素与通道结合时，LTCC电流呈现大电流、强失活的增强状态。但通常状态下，LTCC通道碳末端(C-terminal)具有与钙调素竞争结合通道的能力，导致通道无法充分与钙调素结合，因此无法展现大电流强失活的增强状态。基于上述竞争性结合理论，发明人分别设计了激动剂和抑制剂。具体来说，当设计的药物可特异性与通道碳末端特异性结合时，可使得通道碳末端失效，通道更多地与钙调素结合，从而呈现大电流强失活的增强状态(称之为C-termial Mediated enhanced-mode，CME模式)，这种药物药效对应于激动剂效果。相对应的，当设计的药物为通道碳末端本身的有效域时，药物则可行使通道碳末端能力，使得钙调素失去与通道结合的能力，从而使得通道呈现小电流弱失活的抑制状态(称为C-terminal Mediated Inhibition-mode,CMI模式)，药效对应抑制剂效果(图3.a)。进一步地，LTCC通道的调控，能够影响神经元兴奋-转录耦联，例如标志性的pCREB信号通路，进而起到调控神经元发育的效果。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了多肽在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于调控L型电压门控钙通道，所述多肽具有SEQ ID NO：1～8任一项所示的氨基酸序列。发明人发现，本发明的多肽能够特异性调控LTCC通道，从而影响神经元兴奋-转录耦联，例如标志性的pCREB信号通路，进一步起到调控神经元发育的效果。

表1 氨基酸序列

根据本发明的实施例，上述多肽在制备药物中的用途还可以进一步具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述药物用于激活所述L型电压门控钙通道，所述多肽具有SEQ ID NO：1～4任一项所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列为eCaMp(enhance of CaM pre-association)的有效序列，来自于Ca_V1.3通道IQ域。发明人发现，该多肽可使神经元受电刺激或化学刺激后引起膜电位上升(神经元兴奋)，进而打开LTCC通道，钙信号通过LTCC通道流入神经元中，激活与LTCC通道预结合的钙调素，并在通道口附近特异性激活CaMKII，激活后的CaMKII进入细胞核中引起基因转录因子CREB的磷酸化(称为CaMKII-pCREB信号通路)，激活CREB并影响基因转录水平的调控，进而促进神经元发育。

进一步地，发明人发现，SEQ ID NO：2～4与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有高度同源性，且具有相似的功能，均可以激活LTCC通道，从而促进神经元兴奋-转录耦联，进一步起到促进神经元发育的效果。

根据本发明的实施例，所述多肽的半效浓度为6.6μM。发明人对不同浓度下多肽对LTCC通路的起效程度进行研究，得到多肽的半效浓度为6.6μM，即产生50％最大效应的药物浓度为6.6μM。

根据本发明的实施例，所述药物通过促进磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白的表达，激活pCREB信号通路。发明人发现，该药物能够上调磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(pCREB)的表达，从而激活pCREB信号通路，进而促进神经元发育。

根据本发明的实施例，所述药物用于抑制所述L型电压门控钙通道，所述多肽具有SEQ ID NO：5～8任一项所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列为iCaMp(inhibit of CaM pre-association)的有效序列，来自于Ca_V1.4通道的DCRD域。该多肽可行使通道碳末端能力，使得钙调素失去与通道结合的能力，从而使得通道呈现小电流弱失活的抑制状态，从而抑制神经元兴奋-转录耦联，进而抑制神经元发育。

进一步地，发明人发现，SEQ ID NO：6～8与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有高度同源性，且具有相似的功能，均可以抑制LTCC通道，从而抑制神经元兴奋-转录耦联，进一步起到抑制神经元发育的效果。

根据本发明的实施例，所述药物通过抑制磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白的表达，抑制pCREB信号通路。发明人发现，该药物能够下调磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(pCREB)的表达，从而抑制pCREB信号通路，进而抑制神经元发育。

根据本发明的实施例，所述多肽进一步含有荧光标记序列和辅助跨膜序列。荧光标记序列的存在便于对药物进行观察和研究。辅助跨膜序列能够实现药物的跨膜作用，使其高效地发挥药效。

根据本发明的实施例，所述荧光标记序列为编码异硫氰酸荧光素的序列；所述辅助跨膜序列具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，具体如下：

RKKRRQRRR(SEQ ID NO：9)

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗神经疾病以及心脑血管疾病。发明人发现，本发明的多肽能够特异性调控LTCC通道，从而影响神经元兴奋-转录耦联，例如标志性的pCREB信号通路，进一步起到调控神经元发育的效果，可有效地治疗神经疾病以及心脑血管疾病。

需要说明的是，术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防神经疾病以及心脑血管疾病)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文的药物给予有需要的个体。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种筛选药物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将候选药剂与细胞接触，并检测细胞接触前后L型电压门控钙通道是否被调控；以及在所述接触后，所述L型电压门控钙通道被调控是所述候选药剂作为所述药物的指示。由此，利用根据本发明实施例的筛选药物的方法所获得的药物能够有效得调控L型电压门控钙通道。

根据本发明的实施例，所述药物是如前面所描述的多肽在制备药物中的用途中所限定的。

根据本发明的实施例，所述接触后，细胞的J_Ca值、S_Ca值和G_Ca值均变大，是所述候选药剂作为激活所述L型电压门控钙通道的药物的指示，所述接触后，细胞的J_Ca值、S_Ca值和G_Ca值均变小，是所述候选药剂作为抑制所述L型电压门控钙通道的药物的指示。

发明人发现，SEQ ID NO：1～4任一项所示的氨基酸序列能够特异性激活LTCC通道，使得通道具有大而迅速的钙流入，体现为J_Ca值、S_Ca值和G_Ca值均变大。由此，通过测定候选药剂与细胞接触前后，J_Ca值、S_Ca值和G_Ca值的变化，若J_Ca值、S_Ca值和G_Ca值均变大，则表明候选药剂可以作为激活所述L型电压门控钙通道的药物，从而调控兴奋-转录耦联，进一步促进神经元发育。

SEQ ID NO：5～8任一项所示的氨基酸序列能够特异性抑制LTCC通道，使得通道钙流入量减少，体现为J_Ca值、S_Ca值和G_Ca值均变小。由此，通过测定候选药剂与细胞接触前后，J_Ca值、S_Ca值和G_Ca值的变化，若J_Ca值、S_Ca值和G_Ca值均变小，则表明候选药剂可以作为抑制所述L型电压门控钙通道的药物，从而调控兴奋-转录耦联，进一步抑制神经元发育。

需要说明的是，“J_Ca值”是指钙电流密度(单位为pA/pF)，为钙峰值电流(单位为pA)与细胞大小(单位为pF)的比值，值越大代表钙峰值电流越大；“S_Ca值”是指钙依赖失活强度，S_Ca＝1-I₅₀/I_peak，其中I₅₀为50毫秒钙电流大小，I_peak为峰值钙电流大小，S_Ca值越大代表钙依赖失活强度越强；“G_Ca值”是指峰值电流与300毫秒平衡态电流的比值，值越大代表通道峰值电流对平衡态电流的放大能力越强。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了激动剂BayK8644对小鼠皮层神经元发育形态及pCREB信号通路的影响，其中，a：BayK8644刺激的试验流程；b：1μM BayK8644在不同时长刺激下对皮层神经元发育形态的影响；c：BayK8644在不同刺激时长下对皮层神经元pCREB的影响；

图2显示了抑制剂isradipine对小鼠皮层神经元发育形态及pCREB信号通路的影响，其中，a：isradipine刺激的试验流程；b：5μM isradipine在不同时长刺激下对皮层神经元发育形态的影响；c：isradipine在不同刺激时长下对皮层神经元pCREB的影响；

图3显示了eCaMp和iCaMp的设计原理和在HEK293细胞中对Ca_V1.3通道的门控特性的影响，其中，a：iCaMp和eCaMp的设计原理及有效区域展示；b：iCaMp和eCaMp在HEK293细胞中对Ca_V1.3电流门控特性的影响及G_Ca统计图，其中上半部分为各组通道在-10mV下的钙电流示意图，打开时长为300ms；下半部分为各组通道G_Ca曲线；c：利用FRET技术检测iCaMp及对应突变体(V41A)与通道的结合能力；d：利用FRET技术检测eCaMp原始形态([-IQ-]_V)及对应突变体(F13A)与通道碳末端的结合能力；

图4显示了eCaMp和iCaMp在HEK293细胞中对Ca_V1.3通道门控特性影响的参数统计，其中，a：eCaMp和iCaMp影响下Ca_V1.3通道在-10mV，300ms打开时长的平均钙电流图；b：iCaMp_mut、iCaMp、对照、CaMp及eCaMp_mut影响下Ca_V1.3通道电流示意图及S_Ca、J_Ca、J_Ba、J₃₀₀的统计图，第一行为各组通道电流示意图，其中通道钙电流按照peak值一致的视觉效果显示，各电流图右侧小柱为比例尺，比例尺大小为5pA/pF，通道钡电流如箭头指向所示，峰值按照对应组钙电流峰值做归一化处理；第二行S_Ca为通道钙依赖失活的统计参数；第三行和第四行为通道钙电流和通道钡电流的峰值电流统计图；第五行是通道平衡态电流(对应通道打开300ms时的电流，J₃₀₀)统计图；

图5显示了激动剂BayK8644和抑制剂isradipine在HEK293细胞中对Ca_V1.3电流门控特性的影响，其中，a：1μM BayK8644对Ca_V1.3通道的影响；b：5μM isradipine对Ca_V1.3通道的影响；

图6显示了化学合成的eCaMp对HEK293细胞中Ca_V1.3钙电流门控特性的的影响，其中，a：不同浓度下eCaMp和eCaMp_mut对Ca_V1.3在-10mV下钙电流的影响的示意图，各组钙电流示意图按照平衡态一致做归一化处理；b：eCaMp合成多肽的G_Ca、J_Ca、S_Ca剂量-效应曲线；c：300nM和10μM下eCaMp和eCaMp_mut的G_Ca、J_Ca、S_Ca统计图；

图7显示了iCaMp和eCaMp在HEK293细胞中对Ca_V1.2通道门控特性的影响，其中，a：iCaMp和eCaMp对Ca_V1.2通道(+10mV电流)起效的示意图和G_Ca统计图；b-c：Ca_V1.2通道受iCaMp和eCaMp调控后的S_Ca(b)、J_Ca和J_Ba(c)统计图；

图8显示了iCaMp和eCaMp对Ca_V2.1通道的影响，其中，a：iCaMp和eCaMp对Ca_V1.3、Ca_V2.1、Ca_V2.2和Ca_V2.3的S_Ca影响；b：iCaMp和eCaMp对Ca_V2.1通道影响的电流示意图(+10mV)、钙依赖失活S_Ca统计图及钙电流大小J_Ca统计图；

图9显示了iCaMp和eCaMp对Ca_V2.2通道的影响，其中，a：电流示意图(+10mV)；b：钙依赖失活S_Ca统计图；c：钙电流大小J_Ca统计图；

图10显示了iCaMp和eCaMp对Ca_V2.3通道的影响，其中，a：电流示意图(+10mV)；b：钙依赖失活S_Ca统计图；c：钙电流大小J_Ca统计图；

图11显示了iCaMp和eCaMp对小鼠皮层神经元Ca_V1.3电流的调控作用；

图12显示了iCaMp和eCaMp对皮层神经元pCREB信号的调节作用；其中，a：iCaMp_mut、iCaMp、对照、eCaMp和eCaMp_mut对皮层神经元基态pCREB信号的影响，左图上方为实验流程图，左图下方依次为YFP标记的神经元轮廓及pCREB特异性抗体显现出的pCREB水平，右图为五组神经元的统计数据，按照对照组的平均值做均一化处理；b：iCaMp和iCaMp_mut在40mM钾刺激下pCREB信号的调节作用；c：eCaMp和eCaMp_mut在20mM钾刺激下pCREB信号的调节作用；

图13显示了eCaMp和iCaMp对皮层神经元发育的影响，其中上图为五组神经元在YFP通道下的原始图片及手工描绘出的神经元形态示意图；下图左侧为神经元总突起长度统计图；下图右侧为神经元sholl分析统计图，sholl分析为分析神经元突起复杂性分析，画半径为10m递增的同心圆，计算同心圆与突起的交叉数绘制得到的图形；

图14显示了eCaMp对Aβ25-35处理过的神经元具有一定的治疗效果，其中，Aβ25-35为阴性对照组，对神经元无明显损害作用，Aβ25-35为阳性对照组，对神经元具有显著性损害效果，Aβ25-35和eCaMp为治疗组，神经元树突总长度得到一定程度的恢复，上图为三组神经元原始图及人工描绘的形态图，下图为突起总长度统计图和sholl分析统计图；以及

图15显示了与eCaMp同族的多肽IQ_S、IQ_C和IQ_F以及与iCaMp同族的多肽DCRD_S、DCRD_C和DCRD_D对LTCC通道的作用效果，其中，a：eCaMp同族的多肽IQ_S、IQ_C和IQ_F的效果；b：iCaMp同族的多肽DCRD_S、DCRD_C和DCRD_D的效果；c：G_Ca统计图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

将eCaMp和iCaMp的N端嵌合黄色荧光蛋白YFP以便于观测在细胞中的表达，以eCaMp_mut(eCaMp_F13A，即eCaMp的单点突变)和iCaMp_mut(iCaMp_V41A，即iCaMp的单点突变)作为阴性对照，突变位点如图3.a所示。再与LTCC的一种亚型Ca_V1.3型钙通道一起转染到HEK293细胞中，HEK293细胞本身不具有可探测的电压门控钙通道，因此可作为良好的测试载体。通过电生理手段测试HEK293细胞中Ca_V1.3通道的电生理特性可得知多肽是否有效。

从实验结果来看，激动剂多肽eCaMp对Ca_V1.3峰值电流大小有2.5倍左右的增强效果，而阴性对照组则无增强效果(图4.b)。eCaMp组电流在达到峰值电流后迅速失活，进入平衡态电流，通过对多个电生理数据的平均后，发现eCaMp平衡态电流的大小与对照组大小相当(图4.a)。因此，选用了一个新的常数G_Ca(gain factor in calcium current)值(峰值电流与300毫秒平衡态电流的比值，值越大代表通道峰值电流对平衡态电流的放大能力越强)来描述eCaMp对峰值电流的放大比例。

可以看出，eCaMp组表现出对钙内流的显著性提升而iCaMp组表现组对钙内流的显著性抑制，各自的阴性对照组则对通道无显著影响。eCaMp组G_Ca较对照组G_Ca有明显提升，(图3.b)；与之相对，抑制剂多肽iCaMp对Ca_V1.3峰值电流抑制了接近50％，而阴性对照组则无抑制效果(图4.b)，iCaMp使得通道一直处于小电流状态，通道G_Ca值明显减弱(图3.b)。

发明人同时应用荧光共振能量转移技术(FRET)检测了eCaMp和iCaMp的工作机制，iCaMp结合能力Kd(类似于化学平衡的平衡常数，越小代表结合能力越强)为2979，对比阴性对照组iCaMp_V41A的Kd值8015，表明iCaMp可以有效的结合通道IQv域，而对应的突变体结合能力明显较弱(图3.c)；eCaMp采用原始形态IQv域(图3.d)作为FRET对，eCaMp原始形态对应的Kd为4538，对比阴性对照组eCaMp_F13A的Kd为10104，表明其与通道C端DCRD有良好的结合能力，而对应的突变体结合能力明显不足，印证了利用竞争性结合的原理。

由此可得出结论，eCaMp可增加钙通道进钙能力，使通道具备短时程流入大量钙信号的能力；iCaMp可减弱钙通道进钙能力，使通道持续处于小电流状态。

实施例2

在该实施例中，验证传统的激动剂BayK8644和抑制剂isradipine对通道钙电流门控特性的影响。通过胞外加药的方式分别测试了文献中采用的两种药物浓度，分别为1μMBayK8644和5μM isradipine。结果显示1μM BayK8644对Ca_V1.3通道-10mV下钙电流峰值有3倍的提升效果，但显著性抑制通道S_Ca，对通道G_Ca无提升效果。5μM isradipine对Ca_V1.3通道-10mV下钙电流峰值有74％的抑制效果，但显著性提升通道G_Ca，对通道S_Ca无抑制效果，小分子类药物显现出足够的药效。但同时发明人也注意到，对于BayK8644激动剂，在改变电流大小的同时，对通道钙依赖失活的重要参数——S_Ca也造成了一定程度的削弱；而对于isradipine抑制剂，在抑制电流大小的同时，对G_Ca也造成了影响，引起G_Ca的增大(图5)。对于LTCC而言，CDI强弱可能直接影响到其对神经元的发育，目前已有相关疾病如蒂莫西综合征(Timothy Syndrome)等出现类似的电流增大但失活减慢并最终引起神经元发育受损的状况，从侧面说明了BayK8644和isradipine对神经元的影响还存在一定的复杂性。

实施例3

为方便使用eCaMp和iCaMp这一类LTCC特异性调控多肽，特别是激动剂多肽eCaMp，发明人使用化学合成的方案合成了该段多肽，合成后的多肽组成为FITC-TAT-eCaMp，其中FITC(异硫氰酸荧光素)为荧光标记，TAT为辅助跨膜序列，eCaMp为起效的20个氨基酸。使用转染了Ca_V1.3通道的HEK293作为测试对象，为保证多肽能充分起效，将多肽直接加入玻璃电极内液中，当玻璃电极与细胞形成高阻封接并进一步破膜形成电路回路时，多肽直接进入胞浆内，不会造成浓度的损失。基于上述实验，测试了不同浓度下多肽对Ca_V1.3的起效程度，以G_Ca值变化、S_Ca变化和J_Ca变化分别绘制了IC50曲线。eCaMp在低浓度(300nM)下，未能显现出调控效果，而在高浓度(10μM)下，则显现出良好的调控效果，eCaMp_mut在低浓度和高浓度下均不能显现出调控效果，最终确定半效浓度分别为6.6μM(图6)。

实施例4

为验证eCaMp和iCaMp对LTCC起效的广谱性，同时验证了另外一种在神经、心脏等多***中高表达的亚型Ca_V1.2。在HEK293细胞中验证可知eCaMp和iCaMp对Ca_V1.2亚型同样起效。具体地，由图7所示，eCaMp有效增加通道钙内流，增大通道G_Ca值，增大区域灰色区域所示；iCaMp有效减弱通道钙内流，减小通道G_Ca值，减小区域如灰色区域所示。

为研究eCaMp和iCaMp对LTCC起效的特异性，发明人验证了另外一种在神经***中大量表达，且常起到相似作用的另外一大类电压门控钙通道——Ca_V2通道。Ca_V2通道共有三种亚型，分别为N型、P/Q型和R型，分别对应Ca_V2.1、Ca_V2.2和Ca_V2.3。发明人在HEK293细胞中检验了eCaMp和iCaMp对这三种亚型的门控特性的影响，发现iCaMp和eCaMp对Ca_V1.3起到双向调控作用，而对所有Ca_V2亚型均没有显著的调控效果，并不能改变Ca_V2通道钙电流大小(J_Ca)和失活强弱(S_Ca)(图8、图9和图10)，因此可说明eCaMp和iCaMp对LTCC的作用具有较高的特异性。

实施例5

在HEK293异源***中检测了eCaMp和iCaMp对Ca_V1的调控作用后，发明人进一步检测了eCaMp和iCaMp在源生Ca_V1***——神经元中起效能力，取用新生ICR小鼠皮层神经元培养至第9天，分别转染eCaMp和iCaMp并继续培养至第11天，运用电生理对皮层神经元中Ca_V1.3通道电生理特性进行记录，为保证记录的电流为Ca_V1.3钙电流电流，发明人配置了特殊的记录溶液(包含Ca_V2的抑制剂MVIIC及GVIA，和一定浓度的LTCC抑制剂1μMNimodipine，在该溶度下可彻底抑制Ca_V1.2通道且保留较大成分的Ca_V1.3)。在该记录溶液下记录到eCaMp和iCaMp对神经元Ca_V1.3钙电流也具有与HEK293细胞中Ca_V1.3钙电流一致的调控效果(图11)。eCaMp有效地增大了通道钙内流水平，对通道G_Ca、J_Ca和S_Ca三个重要的门控参数均有显著性地上调作用，而iCaMp起到了相反的调控作用，同时三组数据还可以保持平衡态电流的一致性。

实施例6

基于上述电生理数据可知，eCaMp和iCaMp对LTCC电流的调控，其作用机制和调控结果与传统的激动剂(BayK8644)和抑制剂(isradipine)存在极大差异。发明人设计的eCaMp，调节钙通道后使得通道具有大而迅速的钙流入(eCaMp表现为J_Ca变大，S_Ca变大和G_Ca变大，而BayK8644表现为J_Ca变大，S_Ca变小，G_Ca不变)，更有利于启动神经元发育性信号通路(CaMKII-pCREB信号通路)，有望成为促进神经元发育的药物。iCaMp将通道调节小而平的进钙方式(iCaMp表现为J_Ca变小，S_Ca变小和G_Ca变小，而isradipine表现为J_Ca变小，S_Ca不变，G_Ca变大)，不利于启动发育性信号通路，有望成为抑制神经元发育的药物。为验证发明人设计的药物的药效，发明人选用了新生ICR小鼠皮层神经元作为研究对象，将eCaMp和iCaMp分别转染进入培养了5天小鼠皮层神经元中，继续培养两天后观测神经元pCREB信号通路强弱及神经元形态。研究结果发现，转染了eCaMp组的神经元比对照组神经元pCREB信号强度高出约一半，而阴性对照组基本无差异。与之相对应，iCaMp组神经元比对照组神经元pCREB信号强度弱约一半，而阴性对照组基本无差异。在高钾刺激下，eCaMp较之对照组对pCREB具有更强的放大效果，而iCaMp较之对照组基本无法引起较大的pCREB信号。因此发明人可以得知，eCaMp对神经元pCREB信号通路具有良好的促进效果，而iCaMp对神经元pCREB信号通路具有良好的抑制效果(图12)。

进一步，发明人对神经元形态也进行了检测，结果表明，eCaMp组神经元使神经元发育更快，树突长度更长，阴性对照组与对照组无差异。iCaMp组神经元则抑制了神经元发育，树突长度变短，而阴性对照组与对照组无差异(图13)。因此发明人可得出结论，eCaMp可促进皮层神经元发育，iCaMp可抑制神经元发育。

实施例7

在该实施例中，测试了eCaMp对于病理条件下神经元的治疗作用，在一些神经疾病诸如阿兹海默症(也称为老年痴呆症)中，神经元会呈现退化和凋亡的病理状态，其病理现象之一则是Aβ异常剪切和聚集，故医学上常使用Aβ25-35处理神经元以模拟阿兹海默症下的神经元，采用这一方法并转染eCaMp进入神经元中以观测eCaMp对这一类病理条件下的神经元具有治疗效果，Aβ35-25为阴性对照组，对神经元无明显损害作用，Aβ25-35为阳性对照组，对神经元具有显著性损害效果，Aβ25-35和eCaMp为治疗组，神经元树突总长度得到一定程度的恢复(图14)。结果表明，转染了eCaMp组的神经元的确可以有效的抑制神经元损伤，可期待eCaMp有望在治疗神经损伤或神经疾病中发挥一定的治疗效果。

实施例8

图15显示了与eCaMp同族的多肽IQ_S、IQ_C和IQ_F以及与iCaMp同族的多肽DCRD_S、DCRD_C和DCRD_D对LTCC通道的作用效果。iCaMp有效域为DCRD_F，同族的扩展包括DCRD_S、DCRD_C和DCRD_D均有高度的保守性，且四种DCRD均具有抑制通道钙内流的效果，表现为减小通道G_Ca。eCaMp有效域为IQ_D，同族扩展包括IQ_S、IQ_C和IQ_F，也具有高度保守性，且均具有促进通道开放的效果，表现为增大通道G_Ca。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.多肽在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于调控L型电压门控钙通道，所述多肽具有SEQ ID NO：1～8任一项所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物用于激活所述L型电压门控钙通道，所述多肽具有SEQ ID NO：1～4任一项所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述多肽的半效浓度为6.6μM。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物通过促进磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白的表达，激活pCREB信号通路。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物用于抑制所述L型电压门控钙通道，所述多肽具有SEQ ID NO：5～8任一项所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述药物通过抑制磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白的表达，抑制pCREB信号通路。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多肽进一步含有荧光标记序列和辅助跨膜序列，

优选地，所述荧光标记序列为编码异硫氰酸荧光素的序列；

所述辅助跨膜序列具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗神经疾病以及心脑血管疾病。

9.一种筛选药物的方法，其特征在于，包括：

将候选药剂与细胞接触，并检测所述细胞接触前后L型电压门控钙通道是否被调控；以及

在所述接触后，所述L型电压门控钙通道被调控是所述候选药剂作为所述药物的指示。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述接触后，细胞的J_Ca值、S_Ca值和G_Ca值均变大，是所述候选药剂作为激活所述L型电压门控钙通道的药物的指示，

所述接触后，细胞的J_Ca值、S_Ca值和G_Ca值均变小，是所述候选药剂作为抑制所述L型电压门控钙通道的药物的指示。