CN1075836C

CN1075836C - 修饰的胶原诱导血小板凝集抑制剂Pallidipin的制备方法

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Publication number: CN1075836C
Application number: CN95195002A
Authority: CN
Inventors: C·诺斯克朱恩格布鲁特; A·贝克; B·哈恩德勒
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1994-09-12
Filing date: 1995-09-11
Publication date: 2001-12-05
Anticipated expiration: 2015-09-11
Also published as: HU222398B1; NO971110L; BG101226A; SI9520093A; CA2199719A1; IL115272A0; RU2186110C2; WO1996008563A1; EP0781334A1; RO117971B1; NZ293261A; CZ76297A3; BR9508910A; AU701643B2; ZA957649B; AU3565795A; PL319078A1; MX9701720A; PL184617B1; HUT76972A

Abstract

本发明提供一种称为Asp-Pallidipin的重组蛋白的制备方法。Asp-Pallidipin抑制哺乳动物血小板由胶原诱导的凝集。该Asp-Pallidipin包括：(i)选自Pallidipin蛋白群的一种蛋白(Pallidipin)，和(ii)天冬氨酸，其中天冬氨酸通过肽键与Pallidipin的N-末端相连。该方法包括aa)用适当载体转染至少一种细菌，该载体包含：i)编码重组Asp-Pallidipin的DNA或cDNA，ii)适当的信号肽序列，该信号序列被切除后从Pallidipin的位置看天冬氨酸位于氨基酸序列和+1位，和iii)适当的启动子；bb)表达包括Asp-Pallidipin和信号序列的前蛋白；cc)Asp-Pallidipin从细菌胞质转运至周质，在转运过程中前蛋白被至少一种蛋白酶裂解，产生Asp-Pallidipin，dd)提取周质分离Asp-Pallidipin，和ee)纯化Asp-Pallidipin。这种蛋白用作抑制由脱原诱导的人血小板凝集或抑制有转移肿性瘤细胞之癌的药物。

Description

修饰的胶原诱导血小板凝集抑制剂Pallidipin的制备方法

本发明涉及一种修饰的抑制胶原诱导血小板凝集的抑制剂(称为Pallidipin)的制备方法，还涉及这种物质即修饰的Pallidipin。

胶原是人血小板凝集的已知最强的诱导物。例如，当血管壁损伤并接触胶原时，血小板迅速粘附并活化。(H.R.Baumgartner(1977)，《血栓形成和血停滞》(Thromb.Haemostas)37:1-16；J.Hawiger(1987)，《人类病理学》，18:11-122)。

因而人血小板的胶原诱导的血小板凝集尤其对经历血管相关过程(例如血管形成术或脓毒病)的病人、对患心肌梗塞形成的病人，对心肌梗塞形成的治愈病人构成危险因素。

在一些情况下需要抑制胶原诱导的血小板凝集。已知一些化合物抑制这种凝集。例如，合成寡肽与血小板结合抑制胶原诱导的血小板凝集，见如Bevers等(1985)，“胶原衍生的八肽抑制胶原和凝血酶联合作用引起的血小板凝固作用”，《血栓形成研究》，37:365-370；Karniguian等(1983)“胶原衍生的八肽对血小板/胶原相互作用的不同步骤的影响”，《血栓形成研究》32:593-604；Cean等(1981)“具有特异性抑制胶原诱导凝集特性的寡肽，其制备方法和含有它们的药物组合物”；及EPA 0040149。

胶原诱导血小板凝集的抑制剂的另一来源是在蛇毒中鉴定的具有未知结构的抑制剂，见Smith等“特异性抑制血小板与胶原粘附的50KD蛇毒蛋白的鉴定”，(1991)FEBS 283:307-310。

第三种抑制剂来自医用水蛭的唾液，由Munro等报道“Calin-来自医用水蛭唾液的一种血小板粘附抑制剂”，《血凝固和纤维蛋白溶解》，2:179-184。欧洲专利申请EP0480651的公开文本(Merck公司，1992年4月15日出版)中描述了一种分子量约16KD具有抑制人血小板的胶原诱导凝集之能力的蛋白，该蛋白来自水蛭HaemaenteriaOfficinalis的唾液腺。LAPP是来自水蛭Haemaenteria Officinalis的16KD蛋白，由Connlly等(1992)报道：《生物学化学杂志》，267:6893-6898。还见Moubatin，由Waxman和Connolly报道(1993)：《生物学化学杂志》，268:5445-5449。

另一类胶原诱导血小板凝集抑制剂从昆虫中分离得到，如欧洲专利公开EP0530937中所述。这些蛋白称为“Pallidipin”。

碱性磷酸酶(AP酶)是分泌在周质空间的一种大肠杆菌蛋白。AP酶被合成为一种前体蛋白，具有21个氨基酸长的引导序列，该序列在跨细菌内膜转移到周质空间的过程中被前导肽酶剪去(Y.Kikuchi等(1981)《核酸研究》，9:5671-5678)。其生物合成受培养基中的磷酸盐浓度调节，在低磷酸盐浓度下使得AP酶启动子下游外源基因的产物输出(C.Monteilhet等(1993)《基因》125:223-228)。

Pallidipin的天然来源有限。利用生物技术方法是制备Pallidipin的合理解决办法。Pallidipin在仓鼠胎肾细胞中的表达(EP0530937)，其产率有待提高以在工业量的水平上表达Pallidipin。因而需要一种改进的表达***。

需要一种制备重组Pallidipin(其抑制血小板凝集)的改进方法，该方法具有高收率并能以高纯度可重现地分离蛋白。这种新方法应对生成的Pallidipin蛋白的生物活性无不利影响。

现发现通过一种重组Pallidipin蛋白(Asp-Pallidipin)的制备方法可以解决上述问题，其中Asp-Pallidipin抑制哺乳动物血小板的胶原诱导凝集，该Asp-Pallidipin包含：

(ⅰ)选自Pallidipin蛋白群的一种蛋白(Pallidipin)，和

(ⅱ)天冬氨酸，

其中天冬氨酸通过肽键与Pallidipin的N-末端连接；从而Asp-Pallidipin具有下列氨基酸序列：

a)以下序列表中所示序列

aa)SEQ ID NO:1；

bb)SEQ ID NO:2或

cc)SEQ ID NO:3；

或

b)SEQ ID NO:1-3中任何序列的等位变体或修饰体、或突变蛋白，该等位变体或修饰体或突变蛋白基本不影响蛋白的活性，

或

c)进行了翻译后修饰的SEQ ID NO:1-3中任一蛋白或b)中所述其变体或突变蛋白，该修饰基本不影响成熟蛋白的活性；该方法包括以下步骤：

aa)用适当载体转染至少一种细菌，该载体包含：

(ⅰ)编码重组Asp-Pallidipin的DNA或cDNA

(ⅱ)适当的信号肽序列，该信号序列被切除后从Pallidipin的位置看天冬氨酸位于氨基酸序列和+1位，和

(ⅲ)适当的启动子；

bb)表达包括Asp-Pallidipin和信号序列的前蛋白；

cc)Asp-Pallidipin从细菌胞质转运至周质，在转运过程中前蛋白被至少一种蛋白酶裂解，产生Asp-Pallidipin，

dd)提取周质分离Asp-Pallidipin，和

ee)纯化Asp-Pallidipin。

大肠杆菌是生产外源性(如真核的)蛋白的快速表达***。大肠杆菌表达真核基因产物过程中常发生蛋白的正确折叠的问题，这能造成表达产物的活性降低。蛋白转运至大肠杆菌周质中比保留在胞质中时正确折叠的可能性高得多。蛋白向胞质中转运是由附在成熟蛋白上的信号肽序列诱导的；这些信号肽序列与成熟蛋白序列一起被称为“前蛋白”。前蛋白中信号肽序列和成熟蛋白之间的正确裂解是在大肠杆菌中表达成熟真核蛋白所必需的；信号序列的序列和成熟蛋白的序列都对正确裂解有影响。因而不是所有信号肽序列与所有编码序列都相容。

已知大肠杆菌碱性磷酸酶信号序列对前蛋白的输出有效。但人们知道一种给定信号肽序列与一种成熟蛋白序列结合不一定能造成前蛋白的良好加工。

令人惊异地发现本发明制备方法的产率比使用仓鼠胎肾细胞的表达***高15倍。这些结果示于实施例中。与真核的仓鼠胎肾表达***相比，本发明的方法对Asp-Pallidipin的功能和活性没有不利影响。另一优点是前蛋白裂解所需的蛋白酶(如前导肽酶)由大肠杆菌自身产生。

与产生并存储在细菌胞质中的表达蛋白的纯化相比，使用本发明方法成熟Asp-Pallidipin的纯化要容易的多。渗压震扰足以释放积累在周质中的Asp-Pallidipin。

在一优选方案中，编码信号肽序列的DNA编码碱性磷酸酶(优选肠杆菌AP酶)的信号序列。

本发明的一种方法中，本发明Asp-Pallidipin的载体衍生自载体pSB94(V.Boidol等(1982)，《分子基因遗传学》(Mol.Gen.Genet.)185:510-512)。

本发明的另一方面是以上提及的载体，以及适当的信号肽、适当的启动子和需要时适当的增强子。实施例中的文献对载体有详细描述，也见欧洲专利公开EP0480651；0462632和0173177。

大肠杆菌是优选的宿主，其他微生物也适用，如枯草芽胞杆菌。

另外，本发明涉及一种重组蛋白Asp-Pallidipin，它抑制哺乳动物血小板的胶原诱导凝集，该Asp-Pallidipin包含：

(ⅰ)选自Pallidipin蛋白群的一种蛋白(Pallidipin)，和

(ⅱ)天冬氨酸，

a)以下序列表中所示序列

aa)SEQ ID NO:1；

bb)SEQ ID NO:2或

cc)SEQ ID NO:3；

或

c)进行了翻译后修饰的SEQ ID NO:1-3中任一蛋白或b)中所述其变体或突变蛋白，该修饰基本不影响成熟蛋白的活性。

本发明还包括一种重组蛋白Asp-Pallidipin，它抑制哺乳动物血小板的胶原诱导凝集，该Asp-Pallidipin包含：

(ⅰ)选自Pallidipin蛋白群的一种蛋白(Pallidipin)，和

(ⅱ)天冬氨酸，

a)以下序列表中所示序列

aa)SEQ ID NO:1；

bb)SEQ ID NO:2或

cc)SEQ ID NO:3；

或

b)SEQ ID NO:1-3中任何序列的等位变体或突变蛋白，该等位变体或突变蛋白基本不影响蛋白的活性，

或

c)进行了翻译后修饰的SEQ ID NO:1-3中任一蛋白或b)中所述其变体或突变蛋白，该修饰基本不影响成熟蛋白的活性；其中该Asp-Pallidipin是由包括以下步骤的方法制得的：

aa)用适当载体转染至少一种细菌，该载体包含：

(ⅰ)编码重组Asp-Pallidipin的第一DNA或cDNA分子

(ⅱ)编码适当的信号肽序列的第二DNA分子，和

(ⅲ)适当的启动子；

从而在表达和转运至周质时，包含信号肽和Asp-Pallidipin的前蛋白被裂解，以使天冬氨酸位于成熟Asp-Pallidipin氨基酸序列的+1位，

bb)表达包括Asp-Pallidipin和信号序列的前蛋白；

cc)Asp-Pallidipin从细菌胞质转运至周质，在转运过程中前蛋白被至少一种蛋白酶裂解，产生成熟的Asp-Pallidipin，

dd)提取周质分离Asp-Pallidipin，和

ee)纯化Asp-Pallidipin。

在一更优选的方案中，Asp-Pallidipin是由包括以下步骤的方法制得的：

在适当条件下培养用适当载体转染的细菌，其中所述载体包括有效连接的：

(ⅰ)编码重组Asp-Pallidipin的第一DNA或cDNA，

(ⅱ)编码适当信号肽序列的第二DNA分子，和

(ⅲ)适当的启动子；且表达后包括信号肽和Asp-Pallidipin的前蛋白被裂解，使天冬氨酸处于成熟Asp-Pallidipin氨基酸序列的+1位，其中所述条件使

包括Asp-Pallidipin和信号肽的前蛋白表达，及

Asp-Pallidipin从细菌胞质运送到周质，在运送过程中前蛋白被至少一种蛋白酶裂解，产生成熟的Asp-Pallidipin，及

从周质中纯化Asp-Pallidipin。

优选的蛋白中信号肽序列是碱性磷酸酶(AP酶)的，优选大肠杆菌AP酶的信号序列。

本发明蛋白的工业应用是该蛋白用于药物组合物，其含有本发明的蛋白和药用稀释剂或载体。

上文提到的等位变异或修饰包括核苷酸或氨基酸序列中的改变、基因型或表型的改变。至少一个核苷酸或一个氨基酸可以被替代、缺失或***。

大部分缺失、***和替代不会对本发明蛋白的特征产生大的改变。本发明的修饰或突变蛋白可用常规方法制得，并通过突交或修饰蛋白的功能与本发明蛋白(如SEQ ID NO:1-3的蛋白)的特征功能或与天然Pallidipin比较进行筛选，以确定所述替代、缺失或***的确切影响，从而确定变异蛋白是否具有可比性活性，例如生物活性。

遗传密码具有简并性；即大部分氨基酸由一个以上的三联密码子编码。因而，核苷酸序列中的等位变异或修饰可以改变也可以不改变氨基酸序列。所以等位变异主要在DNA水平，也可以次要地存在于氨基酸序列水平上。

可用常规技术修饰编码本发明蛋白的DNA序列以在本发明的终蛋白中产生变异，但该终蛋白仍与本发明蛋白(如SEQ ID NO:1-3的Asp-Pallidipin)或与天然Pallidipin蛋白相比具有基本相同的活性。按实施例中所述方法测定活性。所以增加、替代或去除一个或多个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10…直到15个氨基酸，而基本不影响本发明蛋白的活性。当希望精细地调节本发明蛋白的氨基酸序列时，一般可以按下表1进行替代。

当选择的替代比表1中所示那些保守性较小时可使蛋白功能或免疫特征产生实质性改变，即选择的残基在对保持(a)替代区中多肽骨架的结构，如片状或螺旋形构象，(b)分子的电荷或疏水性，或(c)侧链体积的影响方面更显著地区别。

表1

蛋白质中氨基酸的正常替代

原残基替代示例

Ala Gly,Ser

Arg Lys

Asn Gln,His

Asp Glu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

Gly Ala,Pro

His Asn,Gln

Ile Leu,Val

Leu Ile,Val

Lys Arg,Gln,Glu

Met Leu,Tyr,Ile

Phe Met,Leu,Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp,Phe

Val Ile,Leu突变蛋白由两种比较蛋白间的同源性来定义。“同源性”包括两种比较序列的氨基酸相似性和序列中的间断。氨基酸的相似性例如表1中所示。本发明的突变蛋白优选包含与SEQ ID NO:1-3之一的蛋白有至少60％、更优选至少80％、特别优选至少90％、最优选至少95％同源性的氨基酸序列。

上文提及的“翻译后变异”意指在翻译过程中或之后的变异，例如形成二硫桥及氨基酸的化学修饰。

蛋白质常形成链内共价键。在折叠蛋白中或在翻译过程中折叠的蛋白中半胱氨酸-SH之间形成这些二硫键。这些键稳定了蛋白的三维结构。仍在细胞胞液中的蛋白分子中很少形成这种二硫键，因为细胞内高浓度的-SS-(二硫醚)还原剂谷胱甘肽破坏了大部分这种键。一些蛋白质离开胞质、被分泌或处在细胞表面，它们常常形成另外的链内共价键。

另外，氨基酸可以按PCT申请WO 91/10684中所述进行改变。氨基酸侧链也可能改变。

本发明的蛋白具有至少40％，优选至少60％，更优选至少80％，最优选至少90％的纯度。纯度定义为本发明蛋白的量与蛋白总量之比。使用实施例中描述的方法检测不到本发明蛋白之外的其他蛋白。

使用本发明的纯化蛋白，按照熟知的Koehler-Milstein方法可产生单克隆抗体，该方法特别包括用本发明的纯化蛋白作为免疫原常规免疫小鼠或兔子，然后从小鼠或兔子的产抗体细胞产生杂交瘤。

本发明的优选方案是在大肠杆菌株E15中表达的SEQ ID NO:1中所述蛋白。

Asp-Pallidipin显示药理活性并因此可用作药物。Asp-Pallidipin可用于包含Asp-Pallidipin及与其结合的药用稀释剂或载体的药物组合物中。另外，本发明包括含药理活性的本发明Asp-Pallidipin和一种药用盐或药用载体的药物组合物。

具体讲，Asp-Pallidipin抑制由胶原诱导的血小板凝集，抑制肿瘤细胞(优选转移性肿瘤细胞)与胶原的粘附。

Asp-Pallidipin抑制血小板凝集。试验***在实施例中描述。Asp-Pallidipin以0.5-50μg蛋白的浓度显著抑制血小板凝集。按照实施例，最优选的Asp-Pallidipin即SEQ ID NO:1蛋白的IC50为50nmol/L高度纯化蛋白。Asp-Pallidipin在5nmol/L到约1,000nmol/L浓度下抑制血小板凝集。

体外试验***的结果表明本发明蛋白可用作药物或可用于医学治疗。该体外***的试验结果可与体内***相关，因为它是本领域中确立的***。R.J.Shebuski等(1990)，《血栓形成和血停滞》，64:576-581。

Asp-Pallidipin可经腹膜内注射给药，可每天给药或每周2-3次。当动物每天接受注射达血浓度100nmol/L时，它们的血小板凝集降低。在这些条件下没有观察到严重的付作用。以取得约10nmol/L到1,000nmol/L血浓度的日剂量，Asp-Pallidipin在小鼠中造成血小板凝集的抑制。

因此，Asp-Pallidipin可用于治疗动脉粥样硬化或血栓形成疾病损伤或用于预防心肌梗塞形成治疗后的再闭塞。Asp-Pallidipin可用作哺乳动物(包括人)的抗动脉粥样硬化和抗血栓形成药，例如用于治疗如由动脉粥样硬化斑破裂造成的或由如脓毒症或移植中表皮紊乱或去除所造成的动脉粥样硬化/血栓形成损伤，或用于治疗不稳定性绞痛。它还可用于防止心肌梗塞形成经纤维蛋白溶解或血管形成术(PTCA)治疗后的再闭塞。如果用纤维蛋白溶解疗法(用链激酶、t-PA或其他纤维蛋白溶酶原活化剂)治疗心肌梗塞形成，Asp-Pallidipin可用作辅助药物以防止血管再闭塞。用气球导管(PTCA)治疗心肌梗塞形成也损伤血管壁，这可能导致新血栓的形成。这可以通在操作过程中或之后使用Asp-Pallidipin来防止。Asp-Pallidipin可以用于冠状血管形成术以及其他血管形成术中。

本发明提供：

a)本发明蛋白在制备治疗动脉粥样硬化或血栓形成疾病或预防心肌梗塞形成治疗后再闭塞的药物中的应用(因而该蛋白可用作已知有患这种病症危险的病人的预防性药物)；

b)治疗动脉粥样硬化或血栓形成疾病或防止心肌梗塞形成治疗后再闭塞的方法，该方法包括给予需要这种治疗的患者制病有效量的本发明蛋白；

c)包含本发明蛋白和药用载体或稀释剂的药物组合物，用于治疗动脉粥样硬化或血栓形成疾病或用于防止心肌梗塞形成治疗后的再闭塞。

当然对这些适应症的适当剂量将根据如所用的本发明的化合物、宿主、给药方法和待治疗病状的严重性而变化。但一般以达到10-1,000nmol/L(优选30-300nmol/L)血浓度的日剂量在动物中能取得满意的结果。

本发明蛋白可以任何常规途径给药，特别是胃肠或非胃肠途径，例如以可注射溶液或悬液的形式。优选腹膜内注射。

SEQ ID NO:1的蛋白是优选的化合物。

本发明提供包含本发明化合物和与其结合的至少一种药物载体或稀释剂的药物组合物。这种组合物可以常规方法制备。见《Remington药物科学》，第15版，Mack出版公司，宾夕法尼亚Easton(1980)。

本发明蛋白还抑制转移性肿瘤细胞与胶原的粘附。试验***在实施例中描述。本发明的蛋白在1-100μg蛋白的浓度下显著抑制转移肿瘤细胞与胶原的粘附。

最优选的蛋白即SEQ ID NO:1的蛋白的试验表明：根据实施例2和5，其IC₅₀值为100nmol/L高度纯化蛋白。本发明蛋白在10-2,000nmol/L的浓度下抑制转移性肿瘤细胞与胶原的粘附。

体外试验***的结果表明本发明的蛋白可用作药物或所用于医学治疗。可以将该体外***的试验结果转移到体内***，因为它是本领域内已确立的***。Chan等(1990)，《科学》，2:1600-1602。

可以在原发肿瘤的手术治疗中或之后给予本发明的蛋白，以防止剥离的肿瘤细胞(在手术中所能进入血流)形成转移。这些抗转移效果的说明见Chan等(1990)，《科学》，2:1600-1602中描述的“试验”和“自发”动物模型。

本发明蛋白可经腹膜内注射给药，每天一次或每周2到3次。当动物接受每天一次的注射达到200nmol/L血浓度时，通过对转移细胞移居点计数测得其转移肿瘤细胞的粘附性减小。在这些条件下没有观察到严重的付作用。

在达到20-2,000nmol/L(优选60-600nmol/L)血浓度的日剂量下，本发明蛋白在小鼠中显示对移移肿瘤细胞与胶原的粘附性的抑制作用。

因而本发明蛋白可用于治疗癌，尤其是有转移性肿瘤细胞的癌，最优选具有高度转移性肿瘤细胞的癌。

本发明从而提供：

a)本发明蛋白在制备治疗有转移性肿瘤细胞之癌的药物中的用途(该蛋白因而可用作如手术去除肿瘤之前给药的预防性药物)；

b)具有转移性肿瘤细胞的癌症的一种治疗方法，其包括给予需要这种冶疗的患者制病有效量的本发明蛋白；

c)包含本发明蛋白和药用载体或稀释剂的治疗有转移性肿瘤细胞之癌的药物组合物。

当然对这些适应症的适当剂量将根据如所用的本发明的化合物、宿主、给药方法和待治疗病状的产重性而变化。但一般以达到20-2,000nmol/L(优选60-600nmol/L)血浓度的日剂量在动物中能取得满意的结果。

本发明蛋白所以任何常规途径给药，特别是胃肠或非胃肠途径，例如以可注射溶液或悬液的形式。

SEQ ID NO:1的蛋白是优选的化合物。

本发明的另一方面是提供DNA序列、含有这些序列的载体、含有所述载体的细胞、产生蛋白的重组方法和对本发明蛋白的抗体。还提供供编码一种抑制人血小板的胶原诱导凝集的蛋白的分离的和/或重组DNA序列(如基因组的或cDNA)。还有，本发明提供例如具有本发明所公开序列的重组产生的本发明蛋白。

术语“分离的”意指本发明抑制剂或其他物质以与伴随其重组或合成生产而来的其他成分分离的形式存在(纯化形式)。一般包括所有程度的这种分离或纯化。优选的分离或纯化程度是使抑制剂可用于药物目的。这种分离程度(如活性或纯度)例如可通过色谱技术(如实施例中所用的那些)按常规方法达到。进一步的纯化(例如至均一)可用常规方法进行，例如下列文献中所述方法：《酶学方法》，182卷，蛋白质纯化指南，Murray P.Deutscher编，学术出版社，1990；《蛋白纯化应用-实用方法》，E.L.V Harris和S.Angel编，IRL出版社，1990；《蛋白质纯化，原理和实践》，Robert Scopes,Springer-Verlag,1982；和《蛋白质纯化，原理，高分辨方法和应用》，J-C.Janson和L.Ryden编，VCH出版社，1989。

可由任何一种常规方法测定纯度，例如SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、分析型HPLC等。纯化的抑制剂可用于测定蛋白的氨基酸序列，方法对本领域技术人员完全是常规的。Hewick,R.M．等，(1981)，《生物学化学杂志》，256,7990-7997。

本发明抑制剂的氨基酸序列可用于确定适当DNA探针的序列，这种探针可用于如在其他种系中发现新抑制剂。这种探针可以按常规方法合成，例如用自动DNA合成仪，筛选基因组成cDNA文库对本领域普通技术人员也是常规的(见国际申请WO90/07861,1990年7月26日)。

因而本发明还包括相应于(编码)从天然环境分离的(如在溶液中或载体中)Asp-Pallidipin及其突变蛋白DNA序列的DNA序列。突变蛋白的制备方法对本领域普通技术人员是常规的，测试这种新蛋白效力的筛选方法也是如此，例如本文中描述的方法。

适合的突变蛋白应具有本文所述抑制剂的部分生物活性，如抑制胶原诱导的血小板凝集，例如至少5％，优选至少50％，最优选至少90％的生物活性。

本发明还包括一种纯化方法，其中包括以下连续步骤：

(ⅰ)经阳离子交换色谱纯化；

(ⅱ)经阴离子交换纯化，和

(ⅲ)经大小排阻纯化。

相信本领域技术人员利用以上描述无需进一步努力可以完全实施本发明。因此下列优选的具体实施方案仅仅用于说明而不以任何方式限制本发明公开的其余部分。

在上文和以下实施例中，所有温度是未矫正的摄氏度；除非另有说明，所有份和百分数以重量计。

上文和下文(如有的话)中引用的所有申请、专利和出版物(包括1994年9月2日申请的EP94250224.6)的整个公开内容都并入本文作为参考。

实施例

实施例1：表达载体的构建

为构建编码Asp-Pallidipin的本发明载体，使用了下列正义和反义引物：

p3：

5＇-GCGATATCGCGACGAAGAATGCGAACTCATG-3＇(NruⅠ)

(SEQ ID NO:4)；和

p4：

5＇-GCGATAGGATCCAAGCTTATTACTTCATGTTATC-3＇(BamHⅠ)

(SEQ ID NO:5)

用P3和P4作为引物对和1μg模板DNA进行PCR:94℃2分钟、42℃1分30秒和72℃2分30秒，8个循环。凝胶纯化及用NruⅠ和BanH1消化后，将片段亚克隆到pSB/pho中。通过XmaⅠ消化，然后用绿豆核酸酶处理钝化5’凸出部分再用BamH1消化制备该质粒。

利用二脱氧链终止法(F.Sanger等(1977),《Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA》74:5463-5467)和有[35S]dATP的测序试剂盒对***片段进行完全DNA测序，以验证上述结构。按标准方法(J.Sambrook(1989)，《分子克隆实验室手册》，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)，用Pallidipin表达结构或空质粒(模拟转化)转化感受态大肠杆菌E15。

实施例2：Asp-Pallidipin的表达和提取

对于质粒pSB/pho(衍生自pSB94；见J.Daum等(1989)，《欧洲生物化学杂志》，185:347-354),E15过夜培养物(S.J.Hayashi等(1964)，《生物学化学杂志》，239:3091-3106)在低磷酸盐培养基中稀释至8％(v/v)，于37℃生长6小时。(A.Bvecker等(1994)，《蛋白质表达和纯化》，5:50-56)。培养后离心收集细菌，重悬于1/10体积的50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)/100mmol/LNaCl中。将制得的悬液冷冻、融化并离心，从而得到第一上清液部分(SN1)。重悬细菌层，离心前在0.5mol/L蔗糖中室温平衡10分钟。上清液(SN2)留作分析，将沉淀重悬于补有1mmol/L PMSF(苯甲磺酰氟)的冰冷水中，在冰上保温10分钟。在此渗压震扰后，离心出细胞，收集上清液(SN3)。含有胞质部分(CF)的沉淀重悬在50mmol/LTris-HCl(pH8.0)/100mmol/L NaCl中。

实施例3：重组Asp-Pallidipin的纯化

含有大部分重组Asp-Pallidipin的上清液部分(SN1)用醋酸调至pH4.0，用FPLC***上样于阳离子交换柱(Mono S,Pharmacia)。用pH4.0醋酸钠中0-500mmol/L NaCl的梯度洗涤，用20mmol/L NaPi(pH7.0)得Asp-Pallidipin洗脱液。合并含Asp-Pallidipin的洗脱部分(用SPS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和免疫印迹判断)，调至pH8.0，上样于阴离交换柱(Fractogel-EMD-TMAE650,Merck)。用20mmol/L醋酸钠(pH8.4)中0-1mol/L NaCl梯度洗脱Asp-Pallidipin。为进行最终纯化，合并含Asp-Pallidipin的洗脱部分，在Seed-Vac(Bachofer)中浓缩，用Superose 12(Pharmacia)进行大小排阻色谱。

实施例4：血小板凝集试验

基本按文献中所述进行该试验(C.Noeske-Jungblut(1994)，《生物学化学杂志》，269:5050-5053)。简单讲，将人血液采集在1/6体积的71mmol/L柠檬酸/85mmol/L柠檬酸三钠/111mmol/L葡萄糖中，135g离心20分钟得到富含血小板的血浆。Asp-Pallidipin与500μl富血小板血浆于37℃保温1分钟，然后加入胶原(2μg/ml)。用Micron集合度计监测凝集，确定最大值。IC₅₀值为约50nM。在第一位有或无Asp的化合物间未显著差别。

测定从大肠杆菌周质空间纯化的Asp-Pallidipin的生物活性和产率。富血小板血浆与Asp-Pallidipin及对照一起保温，加入胶原诱导凝集，以从唾液中纯化的野生型Pallidipin作为阳性对照。还有其他一些结构用作对照，以显示本发明Asp-Pallidipin的优点。本发明蛋白和对照表现不同的产率。表2

菌株	产率
菌株	产率	重组Pallidipin重组精氨酰-Pallidipin重组天冬氨酰-Pallidipin	461μg298μg864μg

实施例5：在本发明蛋白存在下肿瘤细胞与胶原的粘附性减小

本发明的蛋白抑制肿瘤细胞与胶原基质的粘附。因此，当本发明的蛋白处于患者血液或血浆中时，能够部分地或完全阻止迁移的肿瘤细胞停居在器官或血管中。

MTLn3细胞(大鼠乳腺肿瘤细胞)用⁵¹Cr标记。一微孔板用胶原(Ⅲ型)于4℃包被过夜。500μl DMEM F12培养基、20mmol/LHepes、1mmol/L碳酸氢盐、1％BSA中的2×10⁴标记细胞先与0、2、5或10μl本发明蛋白(“Superose Pool”,0.5mg蛋白/ml)于37℃分别保温10分钟。然后该悬液转移到胶原包被的孔中，37℃保温2小时。然后洗涤各孔，用1mol/L NaOH去除粘附的细胞。计数测定粘附细胞的放射活性。

表3

抑制剂的加入量(μl)	细胞粘附(cpm)
抑制剂的加入量(μl)	细胞粘附(cpm)	0	2215
2	2071	0	2215
2	2071	5	1608
10	1081	5	1608

实施例6：抗体的产生

将100μg按实施例纯化的抑制剂加入到0.5ml福氏完全佐剂中，将此悬液皮下注射给兔子。2周后进行第二次注射，给予约80μg纯化抑制剂和0.5ml福氏不完全佐剂。注射后采集12个血清样品以检查特异抗体的产生。在Western印迹试验中分析样品。将20ng纯化抑制剂上样于12.5％SPS-聚丙烯酰胺凝胶上，按E.Harlowe,D.Lane(1988)在《抗体：实试室手册》(冷泉港实验室)中指述的标准方法进行电泳、印迹和检测(试验血清稀释度1∶500，与过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG作为第二抗体，用英国Amersham的Amersham国际公司的ECL试验盒检测)。

替换以上概括地或具体地描述的反应物和/或上述实施例中所用的本发明操作条件，可以相似成功地重复上述实施例。

根据以上描述，本领域技术人员易于确定本发明的实质特征，而且在不背离本发明精神和范围的前提下可以对本发明进行各种改变和修饰以适应各种用途和条件。

序列表(1)一般信息：

(ⅰ)申请人：

(A)名称：Schering Aktiengesellschaft

(B)街道：Muellerstrasse 172-178

(C)城市：柏林

(E)国家：德国

(F)邮编：13353

(G)电话：(030)-468-2085

(H)传真：(030)-468-2085

(ⅱ)发明名称：修饰的胶原诱导血小板凝集抑制剂Pallidipin的制备方法

(ⅲ)序列数：5

(ⅳ)计算机可读形式：

(A)媒介类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release^#1.0,^#1.3版(EPO)

(ⅴ)本申请数据：

申请号：EP94250224.6(2)SEQ ID NO:1的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：172个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅲ)假拟：否

(ⅴ)片段类型：N-末端(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1Asp Glu Glu Cys Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu Glu1 5 10 15Lys Tyr Phe Ser Ile Pro His Val Tyr Val Thr His Ser Arg Asn Gly

20 25 30Pro Lys Glu Gln Val Cys Arg Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Asn Ser Asp

35 40 45Gly Thr Thr Thr Thr Thr Leu Val Thr Ser Asp Tyr Lys Thr Gly Gly

50 55 60Lys Pro Tyr His Ser Glu Leu Lys Cys Thr Asn Thr Pro Lys Ser Gly65 70 75 80Gly Lys Gly Gln Phe Ser Val Glu Cys Glu Val Pro Asn Gly Asn Gly

85 90 95Gly Lys Lys Lys Ile His Val Glu Thr Ser Val Ile Ala Thr Asp Tyr

100 105 110Lys Asn Tyr Ala Leu Leu Gln Ser Cys Thr Lys Thr Glu Ser Gly Ile

115 120 125Ala Asp Asp Val Leu Leu Leu Gln Thr Lys Lys Glu Gly Val Asp Pro

130 135 140Gly Val Thr Ser Val Leu Lys Ser Val Asn Trp Ser Leu Asp Asp Trp145 150 155 160Phe Ser Arg Ser Lys Val Asn Cys Asp Asn Met Lys

165 170(2)SEQ ID NO:2的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：171氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅲ)假拟：否

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2Asp Glu Glu Cys Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu Glu1 5 10 15Lys Tyr Phe Ser Ile Pro His Val Tyr Val Thr His Ser Arg Asn Gly

20 25 30Pro Lys Glu Gln Val Cys Arg Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Asn Ser Asp

35 40 45Gly Thr Thr Thr Thr Leu Val Thr Ser Asp Tyr Lys Thr Gly Gly Lys

50 55 60Pro Tyr His Ser Glu Leu Lys Cys Thr Asn Thr Pro Lys Ser Gly Val65 70 75 80Lys Gly Gln Phe ser Val Glu Cys Glu Val Pro Asn Gly Asn Gly Gly

85 90 95Lys Lys Lys Ile His Val Glu Thr Ser Val Ile Ala Thr Asp Tyr Lys

100 105 110Asn Tyr Ala Leu Leu Gln Ser Cys Thr Lys Thr Glu Ser Gly Ile Ala

115 120 125Asp Asp Val Leu Leu Leu Gln Thr Lys Lys Glu Gly Val Asp Pro Gly

130 135 140Val Thr Ser Val Leu Lys Ser Val Asn Trp Ser Leu Asp Asp Trp Phe145 150 155 160Ser Arg Ser Lys Val Asn Cys Asp Asn Met Lys

165 170(2)SEQ ID NO:3的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：172氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅲ)假拟：否

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3Asp Glu Glu Cys Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu Glu1 5 10 15Lys Tyr Phe Ser Ile Pro His Val Tyr Val Thr His Ser Arg Asn Gly

20 25 30Pro Lys Glu Gln Val Cys Arg Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Asn Ser Asp

35 40 45Gly Thr Thr Thr Thr Thr Leu Val Thr Ser Asp Tyr Lys Thr Gly Gly

50 55 60Lys Pro Tyr His Ser Glu Leu Lys Cys Thr Asn Thr Gln Lys Ser Gly65 70 75 80Gly Lys Gly Gln Phe Ser Val Glu Cys Glu Val Pro Asn Gly Asn Gly

85 90 95Gly Lys Lys Lys Ile His Val Glu Thr Ser Val Ile Ala Thr Asp Tyr

100 105 110Lys Asn Tyr Ala Leu Leu Gln Ser Cys Thr Lys Thr Glu Ser Gly Ile

115 120 125Ala Asp Asp Val Leu Leu Leu Gln Thr Lys Lys Glu Gly Val Asp Pro

165 170(2)SEQ ID NO:4的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：31碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc=“正义引物”

(ⅲ)假拟：否

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4GCGATATCGC GACGAAGAAT GCGAACTCAT G(2)SEQ ID NO:5的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：34碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他核酸

(A)描述：/desc=“反义引物”

(ⅲ)假拟：否

(ⅳ)反义：是

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5GCGATAGGAT CCAAGCTTAT TACTTCATGT TATC

Claims

1．一种重组Asp-Pallidipin的制备方法，其中该Asp-Pallidipin抑制哺乳动物血小板的胶原诱导凝集，该Asp-Pallidipin包含：

(ⅰ)选自Pallidipin蛋白群的一种蛋白，和

(ⅱ)天冬氨酸，

a)以下序列表中所示序列

aa)SEQ ID NO:1；

bb)SEQ ID NO:2或

(c)SEQ ID NO:3；

或

b)SEQ ID NO:1-3中任何序列的等位变体或突变蛋白，该等位变体或突变蛋白具有成熟Asp-Pallidipin的活性，但排除那些在Pallidipin N-末端没有肽键连接的天冬氨酸的序列，

或

c)进行了翻译后修饰的SEQ ID NO:1-3中任一蛋白或b)中所述其变体或突变蛋白，该修饰不影响成熟蛋白的活性；该方法包括以下步骤：

aa)用适当载体转染至少一种细菌，该载体包含有效连接的：

(ⅰ)编码重组Asp-Pallidipin的第一DNA或cDNA分子，

(ⅱ)编码适当的信号肽序列的第二DNA分子，和

(ⅲ)适当的启动子；

且表达并转运至周质时包括信号肽和Asp-Pallidipin的前蛋白被裂解，使天冬氨酸处于成熟Asp-Pallidipin氨基酸序列的+1位，

bb)表达包括Asp-Pallidipin和信号肽序列的前蛋白；

dd)提取周质分离Asp-Pallidipin，和

ee)纯化Asp-Pallidipin。

2．权利要求1的方法，其中在适当条件下培养用适当载体转染的细菌，其中所述载体包括有效连接的：

(ⅰ)编码重组Asp-Pallidipin的第一DNA或cDNA分子，

(ⅱ)编码适当信号肽序列的第二DNA分子，和

(ⅲ)适当的启动子；且表达和转运至周质时包括信号肽和Asp-Pallidipin的前蛋白被裂解，使天冬氨酸处于成熟Asp-Pallidipin氨基酸序列的+1位，其中所述条件使

(A)包括Asp-Pallidipin和信号肽序列的前蛋白表达，及

(B)Asp-Pallidipin从细菌胞质转运到周质，在转运过程中前蛋白被至少一种蛋白酶裂解，产生成熟的Asp-Pallidipin，并从周质中纯化Asp-Pallidipin。

3．根据权利要求1或2的方法，其中编码信号序列的DNA编码碱性磷酸酶的信号序列。

4．根据权利要求3的方法，其中细菌是大肠杆菌。

5．一种重组蛋白Asp-Pallidipin，它抑制哺乳动物血小板的胶原诱导凝集，该Asp-Pallidipin包含：

(ⅰ)选自Pallidipin蛋白群的一种蛋白，和

(ⅱ)天冬氨酸，

a)以下序列表中所示序列

aa)SEQ ID NO:1；

bb)SEQ ID NO:2或

cc)SEQ ID NO:3；

或

c)进行了翻译后修饰的SEQ ID NO:1-3中任一蛋白或b)中所述其变体或突变蛋白，该修饰不影响成熟蛋白的活性。

6．根据权利要求5的重组蛋白，其中该Asp-Pallidipin是通过包括以下步骤的方法制得的：

aa)用适当载体转染至少一种细菌，该载体包含有效连接的：

(ⅰ)编码重组Asp-Pallidipin的第一DNA或cDNA分子，

(ⅱ)编码适当的信号肽序列的第二DNA分子，和

(ⅲ)适当的启动子；

bb)表达包括Asp-Pallidipin和信号肽序列的前蛋白；

dd)提取周质分离Asp-Pallidipin，和

ee)纯化Asp-Pallidipin。

7．根据权利要求5的重组蛋白，其中该Asp-Pallidipin由包括以下步骤的方法制得：

(ⅰ)编码重组Asp-Pallidipin的第一DNA或cDNA分子，

(ⅱ)编码适当信号肽序列的第二DNA分子，和

(A)包括Asp-Pallidipin和信号肽序列的前蛋白表达，及

(B)Asp-Pallidipin从细菌胞质转运到周质，在转运过程中前蛋白被至少一种蛋白酶裂解，产生成熟的Asp-Pallidipin，及

从周质中纯化Asp-Pallidipin。

8．根据权利要求6或7的Asp-Pallidipin，其中编码信号肽序列的DNA编码碱性磷酸酶的信号序列。

9．含有权利要求5-8任一项的Asp-Pallidipin及与其结合的药用稀释剂或载体的药物组合物。

10．权利要求5-8任一项的Asp-Pallidipin在制备治疗动脉粥样硬化或血栓形成疾病或预防心肌梗塞形成治疗后再闭塞的药物中的用途。

11．权利要求5-8任一项的Asp-Pallidipin在制备治疗带转移性肿瘤细胞的癌的药物中的用途。

12．Asp-Pallidipin的纯化方法，其中纯化包括下列连续步骤：

(ⅰ)通过阳离子交换色谱纯化；

(ⅱ)通过阴离子交换纯化；和

(ⅲ)通过大小排阻纯化。

13．包含有效连接的以下元件的重组载体：

(ⅰ)编码重组Asp-Pallidipin的第一DNA或cDNA分子，该Asp-Pallidipin具有选自下组的氨基酸序列：

a)以下序列表中所示序列

aa)SEQ ID NO:1；

bb)SEQ ID NO:2或

cc)SEQ ID NO:3；

或

(ⅱ)编码适当信号肽序列的第二DNA分子，和

(ⅲ)适当的启动子；且在适当细菌宿主中表达后包括信号肽和Asp-Pallidipin的前蛋白被裂解，使天冬氨酸处于成熟Asp-Pallidipin氨基酸序列的+1位。

14．用权利要求13的载体转化的细菌宿主。

15．根据权利要求14的细菌，它是一种大肠杆菌。