CN107574198B - 一种采用醇沉分级制备螺旋糊精包结络合载体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用醇沉分级制备螺旋糊精包结络合载体的方法;属于化工、食品、药品复合物载体材料领域。该方法先将原淀粉酶解脱支完全,制得脱支淀粉溶液;然后将脱支淀粉溶液通过旋转蒸发进行浓缩,在螺旋糊精的浓缩液中缓慢滴加无水乙醇至乙醇浓度为40‑60%(v/v),于4℃冰箱静置12~24h,离心,取沉淀干燥,粉碎后得螺旋糊精产品。本发明操作方法简单,条件温和,产品组分分布窄。采用本发明方法能有效提高对一些客体分子的包埋率,扩大淀粉在运输载体方面的应用范围。
Description
技术领域
本发明涉及螺旋糊精载体,特别是涉及一种醇沉分级制备螺旋糊精包结络合载体的方法,具体是指利用生物技术和化学方法相结合制备螺旋糊精的方法;属于化工、食品、药品包埋材料的生产方法领域。
背景技术
螺旋糊精是葡萄糖单元通过α-1,4糖苷键连接而成,具有柔性构象,且其空间结构具有柔性螺旋结构。螺旋糊精具有空腔结构,与直链淀粉和环糊精结构类似。螺旋糊精可作为主体分子,疏水性空腔可以通过包合多种无机或有机小分子物质形成包结络合物。客体分子被包结络合后,其微环境,包括物理、化学、生物活性(溶解性、稳定性、氧化性等)会发生显著变化。因此,螺旋糊精作为一种营养物质的保护载体及药物输送载体等在医学、食品、环保以及酶模拟化学和超分子化学理论研究等领域中得到广泛的应用。
螺旋糊精与直链淀粉最大的区别在于直链淀粉分子量大于105,螺旋糊精的分子量为103~105。与直链淀粉相比,螺旋糊精可以提高V型复合物的包埋率,并且改善复合物的晶型结构。直链淀粉分子量大,链长过长,较多的链并未与客体分子相互作用形成包埋物,而是直链淀粉链之间容易相互作用形成老化淀粉,降低了V型结晶复合物的含量,也就降低了与客体分子形成包埋物的效率。
发明内容
本发明目的在于制备一种生产成本低、负载率高的螺旋糊精载体材料,以改善螺旋糊精复合物在化工、食品及药品领域的应用。
醇沉是多糖提取和生产中成药的常用分离技术,现有技术多用于粗多糖的分级和中药浓缩液处理过程中,具有除杂能力强、溶剂安全和操作简单等优点。本发明开发醇沉法对酶解后的脱支淀粉进行分级,制备分子量分布更为集中的螺旋糊精片段,得到包埋率最高的螺旋糊精载体。本发明发现,经过醇沉分级后的螺旋糊精,分子量分布较窄,链长适合客体分子包埋,因此得到的复合物中客体分子含量较高。
本发明的目的通过如下技术方案实现:
一种采用醇沉分级制备螺旋糊精包结络合载体的方法,包括如下步骤:
(1)淀粉原料用乙酸-乙酸钠缓冲溶液配成质量百分比浓度为5%~10%的淀粉乳,并调节pH至5.5~6.5,置于密闭容器中在95~99℃下搅拌糊化60~80min;糊化完成后,将糊化液冷却,加入脱支酶,用量为每克干淀粉加入脱支酶7.5~25U,在45~55℃下搅拌反应10~12h;100℃灭酶10min,迅速冷却得脱支淀粉溶液;
(2)将(1)中得到的脱支淀粉溶液冷却并置于旋转蒸发仪中进行浓缩,在浓缩液中缓慢滴加无水乙醇调节到一定体积浓度,置于4℃冰箱中储存12~24h,然后离心,洗涤,干燥,粉碎得到白色粉末状螺旋糊精片段。
步骤(1)所述淀粉溶液中的支链淀粉脱支完全。
步骤(1)所述脱支酶为普鲁兰酶或异淀粉酶。
步骤(2)所述醇沉最终的体积浓度选择40-60%。
步骤(2)所述螺旋糊精的分子量采用凝胶色谱仪进行检测。
关于产品螺旋糊精的应用,可作为复合物的主体分子,用于一些活性成分或者药物的包埋。
本发明与现有技术相比,具有如下优点和有益效果:
(1)本发明制备的产品螺旋糊精,分子量分布集中,可用于活性成分的包埋和药物的输送。现阶段关于药物载体材料已有人研究,但是以特定分子量区间的螺旋糊精为主体分子进行包埋的研究还未见报道。本发明通过采用醇沉技术,并结合凝胶色谱检测技术,制备特定分子量区间螺旋糊精。
(2)本发明制备的螺旋糊精的包埋能力与螺旋糊精的分子量相关,链长过短不能形成络合物,链长过长会影响包合物中客体分子的含量。经过醇沉技术得到合适分子量区间,并且链长合适的螺旋糊精不仅可以提高对客体分子的包埋率,而且螺旋糊精的制备工艺简单,副产物少。
附图说明
图1为实施例1中未经过醇沉处理的脱支淀粉相对分子量图。
图2为实施例1中梯度醇沉处理得到的螺旋糊精的相对分子量图。a.乙醇体积分数40%,b.乙醇体积分数50%,c.乙醇体积分数60%。
具体实施方式
为更好理解本发明,下面结合实施例对本发明做进一步地说明。本发明有许多成功的实施例,下面列举6个具体的实施例,但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
采用如下方法测定螺旋糊精的脱支率:将得到的螺旋糊精样品取出1mg,加0.5mL氘代DMSO,使样品充分溶解,放入核磁管中进行测定。其中测定温度70℃,扫描次数128次。计算方法如下:
α-1,4糖苷键对应的化学位移为5.11ppm,α-1,6糖苷键对应的化学位移为4.75ppm,α-1,6糖苷键含量就是淀粉的分支度(DB)。式中:DB为淀粉分支度(%);Iα-1,6为α-1,6糖苷键化学位移处对应的峰面积;Iα-1,4为α-1,4糖苷键化学位移处对应的峰面积。
凝胶渗透色谱是测定分子量的常用方法,具体测定方法为:称取样品1.5mg,用流动相溶解并稀释制成浓度为3mg/mL的溶液,使用漩涡振荡仪振荡5s,用0.45μm的水相过滤膜过滤后,于常温下静置2-3h,作为样品溶液待测。测定的具体色谱条件为:TSK 3000色谱柱和TSK 5000色谱柱;流动相为超纯水(超声20min后待用);示差折光检测器温度为45℃;柱温为45℃;流速为0.6mL/min;进样量为20μL。分别精确称取上述葡聚糖系列标准品溶液于凝胶色谱仪,记录洗脱峰的保留时间,采用GPC软件绘制标准曲线。根据上述绘制的葡聚糖标准曲线计算出样品的分子量,进而分析螺旋糊精样品中的分子量分布情况(如图1,图2)。
实施例1螺旋糊精的制备
第一步玉米原淀粉用乙酸-乙酸钠缓冲溶液配成质量百分比浓度为5%的淀粉乳,并调节pH至6.5,置于密闭容器中在99℃下搅拌糊化60min;糊化完成后,将糊化液冷却至45℃,加入异淀粉酶,用量为每克干淀粉加入异淀粉酶7.5U(200000U/g,湖北鸿运隆生物科技有限公司),在55℃下搅拌反应12h,之后加热到100℃灭酶10min,迅速冷却即可得到脱支淀粉溶液。采用上述测定脱支淀粉脱支率的方法确定淀粉已经脱支完全,得到的脱支淀粉全部都是由α-1,4糖苷键进行连接,没有分支部分。
第二步将步骤(1)得到的脱支淀粉溶液冷却并置于旋转蒸发仪中进行浓缩,之后在浓缩液中缓慢加入无水乙醇调节乙醇体积分数为40%,置于4℃冰箱中储存24h,然后离心(3500r/min 10min),取沉淀干燥,粉碎得到白色粉末状螺旋糊精片段a。倾倒出上清液继续用无水乙醇滴加至乙醇体积分数为50%,同样置于4℃冰箱中储存24h,离心(3500r/min10min),取沉淀干燥,粉碎得到白色粉末状螺旋糊精片段b。上清液采用与上述分级醇沉相同步骤用无水乙醇滴加体积分数为60%,得到螺旋糊精片段c。通过上述凝胶色谱法测定脱支淀粉及螺旋糊精片段的相对分子量分布。
图1是实施例1中所得脱支淀粉的分子量分布图,由图1可知,未经过醇沉分级的脱支淀粉出峰时间为25~42min,分子量分布范围较广,含有分子量很小的不具备包埋能力的物质。图2是经过分级醇沉过后的螺旋糊精片段分子量分布图。由图2可知,经过醇沉分级之后,螺旋体糊精出峰时间变得集中,峰型变窄,说明经过醇沉处理得到了包结络合能力不同且分子量分布集中的螺旋糊精片段。各醇沉分级后螺旋糊精片段的分子量分布范围为3.35~20.9kDa,螺旋糊精片段a,b,c的DP分别为128,71和41。说明醇沉技术对螺旋糊精作为客体分子进行包埋的有效片段的优选提供原料与技术,并进一步有效地提高了螺旋糊精的包埋率。
实施例2螺旋糊精的制备
第一步蜡质玉米原淀粉用乙酸-乙酸钠缓冲溶液配成质量百分比浓度为10%的淀粉乳,并调节pH至5.5,置于密闭容器中在95℃下搅拌糊化80min;糊化完成后,将糊化液冷却至55℃,加入普鲁兰酶,用量为每克干淀粉加入普鲁兰酶25U(OPTIMAX L-1000,杰能科生物工程有限公司),在45℃下搅拌反应10h,之后加热到100℃灭酶10min,迅速冷却即可得到螺旋糊精溶液。采用上述测定螺旋糊精脱支率的方法确定淀粉已经脱支完全,得到的螺旋糊精全部都是由α-1,4糖苷键进行连接,没有分支部分。
第二步将(1)中的螺旋糊精溶液冷却并置于旋转蒸发仪中进行浓缩,之后在浓缩液中缓慢加入无水乙醇调节乙醇体积分数为40%,置于4℃冰箱中储存12h,然后离心(3500r/min 10min),取沉淀干燥,粉碎得到白色粉末状螺旋糊精片段a,倾倒出上清液继续用无水乙醇滴加至体积分数为50%,同样置于4℃冰箱中储存12h,离心(3500r/min10min),取沉淀干燥,粉碎得到白色粉末状螺旋糊精片段b,上清液采用与上述分级醇沉相同步骤用无水乙醇滴加体积分数为60%,得到螺旋糊精片段c。通过上述凝胶色谱法测定螺旋糊精及其片段的相对分子量分布。各醇沉分级后螺旋糊精片段的分子量分布范围为2.75~20.2kDa,螺旋糊精片段a,b,c,d,e的DP分别为123,69和40。
实施例3螺旋糊精的制备
第一步马铃薯原淀粉用乙酸-乙酸钠缓冲溶液配成质量百分比浓度为10%的淀粉乳,并调节pH至6.0,置于密闭容器中在98℃下搅拌糊化70min;糊化完成后,将糊化液冷却至45℃,加入异淀粉酶,用量为每克干淀粉加入普鲁兰酶10U(200 000U/g,湖北鸿运隆生物科技有限公司),在50℃下搅拌反应11h,之后加热到100℃灭酶10min,迅速冷却即可得到螺旋糊精溶液。采用上述测定螺旋糊精脱支率的方法确定淀粉已经脱支完全,得到的螺旋糊精全部都是由α-1,4糖苷键进行连接,没有分支部分。
第二步将(1)中的螺旋糊精溶液冷却并置于旋转蒸发仪中进行浓缩,之后在浓缩液中缓慢加入无水乙醇调节乙醇体积分数为40%,置于4℃冰箱中储存18h,然后离心(3500r/min 10min),取沉淀干燥,粉碎得到白色粉末状螺旋糊精片段a,倾倒出上清液继续用无水乙醇滴加至体积分数为50%,同样置于4℃冰箱中储存18h,离心(3500r/min10min),取沉淀干燥,粉碎得到白色粉末状螺旋糊精片段b,上清液采用与上述分级醇沉相同步骤用无水乙醇滴加体积分数为60%,得到螺旋糊精片段c。通过上述凝胶色谱法测定螺旋糊精及其片段的相对分子量分布。各醇沉分级后螺旋糊精片段的分子量分布范围为3.56~21.4kDa,螺旋糊精片段a,b,c,d,e的DP分别为131,75和43。
实施例4螺旋糊精片段与碘液显色
精确称取实施例1中分级醇沉后的螺旋糊精片段样品各0.0005g(干基),加1mL水,并滴加1mol/L NaOH溶液0.5mL,沸水浴3min,冷却后,加入1mol/L HCl溶液0.5mL进行中和,随后加入0.07~0.1g酒石酸氢钾,加水至约45mL,然后加入0.5mL碘液,定容至50mL容量瓶混匀,在室温下放置20min后,在680nm下测其吸光度。蓝值计算公式如下:
式中:
Aλmax—680nm波长下测得的吸光度值;
C—样品的浓度(mg/100mL)。
根据上述方法测定的螺旋糊精片段a,b,c的蓝值分别为0.89,0.75,0.50。蓝值可用来表征螺旋糊精的包结络合能力,不同醇浓度下处理的样品蓝值及DP值分布有所不同,这说明随着醇浓度的增加,得到的样品片段分子量在降低,蓝值在变小,进一步表明螺旋糊精片段的包埋能力在降低。说明40%醇浓度得到的螺旋糊精片段具有最强的包埋能力,是最有益用于包埋的客体分子。但是相对于脱支淀粉来说,螺旋糊精片段a,b,c都具备更强的包合能力,更加适合作为包结络合能力载体。
实施例5螺旋糊精与维生素E的包埋
第一步将实施例1中脱支淀粉溶液与醇沉分级过后的螺旋糊精片段(10g,干基)配置10%螺旋糊精溶液,调温度至45℃,将溶有质量百分比为10%的维生素E乙醇溶液10g滴加入上述溶液中,保温搅拌反应4小时;缓慢冷却至室温后,放入4℃冰箱中冷藏24h;
第二步将步骤(1)的产品离心,取沉淀物用50%的乙醇(v/v)进行多次洗涤,直到上清液中再无维生素E时取出沉淀物进行冷冻干燥,粉碎后得淡黄色粉末状产品。
第三步维生素E标准曲线的绘制:精确称取维生素E标准样品12.50g,用无水乙醇溶解并定容至25mL的容量瓶中,然后分别取0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL的溶液至50mL容量瓶中(0.001mg/mL 0.002mg/mL 0.003mg/mL 0.004mg/mL 0.005mg/mL),并用无水乙醇定容至刻度并摇匀。以乙醇为空白在270nm波长处测吸光度,平行测定三次。
第四步取步骤(2)中的产品称取0.20g置于棕色容量瓶中,加入5mL混合酶液(猪胰α-淀粉酶200U/mL;糖化酶160U/mL;CaCl2 0.01mol/L pH 5.2),在37℃恒温水浴下振荡酶解反应24h。加入10mL无水乙醇振荡提取1h,4500r/min离心10min,过滤,取上清液在270nm波长下测吸光度,以同样方法制备但不加样品的溶液为空白对照,平行测定三次。
根据标准曲线和测得的吸光度计算含量,计算公式为:
式中:
X—样品维生素E的含量(mg/g);
C—从标准曲线上确定的样品液中的维生素E浓度(mg/mL);
V—样品定容的总体积(mL);
N—样品定容后的稀释倍数;
m—样品质量(g)。
结果表明,脱支淀粉与螺旋糊精片段a,b,c分别对维生素E的包埋率为45.18%和64.67%,53.91%,47.72%。说明经过醇沉后的螺旋糊精片段,与没有经过处理的粗螺旋糊精相比,对维生素E具有较大的包结络合能力。其中经过40%酒精浓度醇沉得到的螺旋糊精片段为最有利于包结络合维生素E的片段,大幅提高了螺旋糊精作为包埋维生素E的客体分子的包埋率和利用率。
实施例6螺旋糊精与大豆异黄酮的包埋
第一步将实施例1中粗的螺旋糊精和醇沉分级过后的螺旋糊精片段(10g,干基)配置10%螺旋糊精溶液,调温度至60℃,将溶有质量百分比为10%的大豆异黄酮二甲基亚砜溶液10g滴加入上述溶液中,保温搅拌反应4小时;缓慢冷却至室温后,放入4℃冰箱中冷藏24h;
第二步将步骤(1)的产品离心,取沉淀物用50%的乙醇(v/v)进行洗涤多次,直到上清液中再无大豆异黄酮时取出沉淀物进行冷冻干燥,粉碎后得淡黄色粉末状产品。
第三步大豆异黄酮标准曲线的绘制:称取干燥至恒重的大豆异黄酮标准品0.0100g于100mL棕色容量瓶中,加DMSO溶解并定容至100mL,摇匀,静置20min。精确量取该稀释液2.0,2.5,3.0,3.5,4.0mL,分别置于25mL棕色容量瓶中,用DMSO定容至刻度,以DMSO为空白对照,于270nm波长处测定吸光度。
第四步称取0.20g样品置于棕色容量瓶中,加入5.0000mL混合酶液(猪胰α-淀粉酶200U/mL;糖化酶160U/mL;CaCl2 0.01mol/L pH5.2),于37℃恒温水浴下振荡酶解24h。加入10mL DMSO振荡提取1h,4500r/min离心10min,过滤,取上清液在270nm波长下测吸光度,以相同方法制备但不加样品的溶液为空白对照,平行测定三次。
根据标准曲线和测得的吸光度计算含量,计算公式为:
式中:
X—每克样品中大豆异黄酮的含量(mg/g);
C—从标准曲线上确定的样品液中的大豆异黄酮浓度(mg/mL);
V—样品定容的总体积(mL);
N—样品定容后的稀释倍数;
m—样品质量(g)。
结果表明,粗螺旋糊精和螺旋糊精片段a,b,c分别对大豆异黄酮的包埋率为30.92%和68.77%,50.67%,31.26%。说明经过醇沉后的螺旋糊精片段,与没有经过处理的粗螺旋糊精相比,对大豆异黄酮具有较大的包结络合能力。其中经过40%酒精浓度醇沉得到的螺旋糊精片段为最有利于包结络合大豆异黄酮的片段,大幅提高了螺旋糊精作为包埋大豆异黄酮的客体分子的包埋率和利用率。
如上所述,即可较好地实现本发明。
Claims (7)
1.一种采用醇沉分级制备螺旋糊精包结络合载体的方法,其特征在于步骤为:
(1)淀粉原料用乙酸-乙酸钠缓冲溶液配成质量百分比浓度为5%~10%的淀粉乳,并调节pH至5.5~6.5,置于密闭容器中在95~99℃下搅拌糊化60~80 min;糊化完成后,将糊化液冷却,加入脱支酶,用量为每克干淀粉加入脱支酶7.5~25 U,在45~60℃下搅拌反应10~12 h;灭酶,迅速冷却得脱支淀粉溶液;
(2)将步骤(1)得到的脱支淀粉溶液冷却并置于旋转蒸发仪中进行浓缩,在浓缩液中缓慢滴加无水乙醇调节到乙醇体积浓度为40%,4℃以下温度储存12 h以上,然后离心,洗涤,干燥,粉碎得到白色粉末状螺旋糊精片段。
2.根据权利要求1所述采用醇沉分级制备螺旋糊精包结络合载体载体的方法,其特征在于:步骤(1)所述的淀粉原料是玉米淀粉、小麦淀粉、木薯淀粉和马铃薯淀粉中一种。
3.根据权利要求2所述采用醇沉分级制备高螺旋糊精包结络合载体载体的方法,其特征在于:所述的玉米淀粉为蜡质玉米淀粉;所述的小麦淀粉为蜡质小麦淀粉。
4.根据权利要求1所述采用醇沉分级制备螺旋糊精包结络合载体载体的方法,其特征在于:步骤(1)所述的脱支酶是普鲁兰酶或异淀粉酶。
5.根据权利要求1所述采用醇沉分级制备螺旋糊精包结络合载体载体的方法,其特征在于:所述的灭酶的温度为100℃,灭酶的时间为10 min。
6.根据权利要求1所述采用醇沉分级制备螺旋糊精包结络合载体载体的方法,其特征在于:所述4℃以下储存是在冰箱中进行。
7.根据权利要求1所述采用醇沉分级制备螺旋糊精包结络合载体载体的方法,其特征在于:所述4℃以下储存的时间为12~24 h。
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酶促螺旋体糊精的形成及其应用研究;邹金凤;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技1辑》;20170215(第02期);摘要,正文第11页第2.3.1节,第14页第2.3.5节 * |
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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