CN107569693A - 活体染料在制备用于***的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及活体染料在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。

Description

活体染料在制备用于***的药物中的应用

技术领域

本发明涉及活体染料在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。

背景技术

大量研究显示，染料对多个生物靶点、包括肿瘤有不同效用的活性。活体染料是染料中的一类。某些活体染料己经在临床上被用作肿瘤或其相关结构(例如前哨***)的染色剂。在现有技术中,活体染料作为示踪剂在肿瘤治疗中使用很多。奇怪的是,它对肿瘤的直接治疗作用的研究不多。尽管有报道浓度不大于1％的亚甲蓝对癌性胸水、癌性心包积液、等显示出明显的治疗作用,但它对实体瘤却有效性不高,只能作为其它高效抗癌药(例如阿霉素等)的增效剂使用。更加奇怪的是,尽管众所周知提高局部用药的浓度可以提高其活性,却没有有意义的浓度-活性(例如抑瘤率)研究的报道。

以亚甲蓝为例，一个流行的说法是,高浓度亚甲蓝的局部使用会造成严重的局部伤害。因而,世界上卫生当局批准的人体用亚甲蓝的最高浓度均为1％。可是,有报道将l％亚甲蓝注射于人结肠癌裸鼠移植瘤瘤体内,与阴性对照组相比肿瘤体积并无明显不同，于是将其作为光敏剂使用,通过光动力提高其活性(Orth K,Buck A,Stanescn A,etal.Intraluminal treatment of inoperable oesophageal tumours by intralesionalphotodynamic therapy with methylene blue[J].Lancet,1995,345:519.)。然而,完全依赖于光动力的应用范围较窄,且会大幅增加治疗费用。无论如何，在未确定有效、甚至是高效抗肿瘤活性的浓度前，用于治疗肿籀的活体染料药物的组成仍处于不确定状态。

目前的肿瘤治疗、犹其是实体肿瘤的治疗，主要是手术、放射线治疗和化疗。手术对身体造成伤害，对某些影响美观的分泌腺(例如乳腺和甲状腺)的伤害尤其让人沮丧。放射线治疗的副作用也非常明显。现有化疗基本上是全身用药，有很高的全身性副作用风险。例如，现有抗瘤药物在大范围内杀伤癌细胞的同时，也杀伤了大量正常细胞。一些用于局部处理的化疗剂正在发展之中。某些硬化剂(例如无水乙醇、尿素、等)的使用多了起来。然而，这些硬化剂具有很高的局部刺激性且疗效不高。

发明内容

本发明的发明目的是开发一种与现有技术相比更为安全有效的含活体染料的组合物及其在治疗哺乳动物之肿瘤中的应用。

根据本发明的一个方面，其提供活体染料在制备用于***的药物组合物中的应用。

根据本发明的再一个方面，其提高一种***的方法，其包括向有此需要的个体给药包含活体染料的药物组合物。

在本发明的一个实施方案中，所述活体染料例如包括以下之一种或多种：亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝、甲苯胺蓝、台盼蓝、碱性蓝、伊红、碱性品红、结晶紫、龙胆紫、中性红、詹纳斯绿B、番红及其衍生物，优选为选自以下之一种或多种：亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝、结晶紫、中性红及其衍生物，更优选为选自以下之一种或多种：亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝及其衍生物。

根据本发明的一个实施方案，所述药物中还可进一步任选包含金属化合物，其优选为选自以下之一种或多种的金属盐：铁盐、铜盐、锌盐、锰盐、铝盐，优选为铁盐和铜盐，更优选为选自以下之一种或多种的亚铁盐：二氯化铁、硫酸亚铁、琥珀酸亚铁、富马酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁。

根据本发明的一个实施方案，所述药物中还可进一步任选包含抗肿瘤物质，其选自有效抗肿瘤物质、低效抗肿瘤物质及其组合。

根据本发明的进一步实施方案，所述有效抗肿瘤物质为选自以下化合物之一种或多种：阿霉素、顺铂、紫杉醇、长春新碱、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶及其衍生物。

根据本发明的进一步实施方案，所述低效抗肿瘤物质为选自以下之一种或多种：非甾体抗炎化合物、喹啉类化合物、青蒿素衍生物、酚类化合物。

根据本发明的进一步实施方案，所述非甾体抗炎化合物选自以下组之一种或多种：水杨酸类化合物、丙酸类抗炎化合物、吲哚类抗炎化合物、苯胺类抗炎化合物、灭酸类抗炎化合物、吡唑酮类抗炎化合物，优选为选自水杨酸类化合物，更优选为选自水杨酸、乙酰水杨酸、二氟苯水杨酸、双水杨酸酯、双香豆素中的一种或多种。

根据本发明的进一步实施方案，所述喹啉类化合物选自以下之一种或多种：奎宁、氯喹、伯氨喹及其异构体和衍生物，优选为选自奎宁和奎宁衍生物，更优选为以下化合物之一种或多种：奎宁、一盐酸奎宁和二盐酸奎宁。

根据本发明的进一步实施方案，所述青蒿素衍生物包括青蒿素的酯类衍生物、醚类衍生物、肽类衍生物、二聚体衍生物、及多聚体衍生物等，优选青蒿琥酯(Artesunate,ATS)、双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)、蒿甲醚(artemether)、蒿***。

根据本发明的进一步实施方案，所述酚类化合物为选自以下之一种或多种：硝基酚化合物、氯酚化合物和氨基酚化合物，优选为选自硝基酚化合物和氨基酚化合物，更优选为选自以下化合物之一种或多种：2,4-二硝基苯酚、间硝基苯酚、对乙酰氨基酚及其衍生物。

在进一步的实施方案中，所述药物组合物还可包含硬化剂和/或止痛剂。

在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物为局部给药剂型，优选为靶区注射和/或灌注剂型。

在进一步的实施方案中，根据本发明的局部给药剂型为液体制剂，其中所述活体染料的浓度为1.1-8％w/v，优选为1.5-7％w/v或2-7％w/v，更优选为2-6％w/v或3-4％w/v。

在进一步的实施方案中，在局部给药剂型的根据本发明的药物组合物中，如果存在，所述有效抗肿瘤物质的浓度可以为0.1-10％w/v，而所述低效抗肿瘤物质的浓度可以为0.1-15％w/v。

在进一步的实施方案中，在局部给药剂型的根据本发明的药物组合物中，如果存在，所述非甾体抗炎化合物的浓度为1.5-15％w/v、优选3-15％w/v、更优选5-12％w/v。

在进一步的实施方案中，在局部给药剂型的根据本发明的药物组合物中，所述喹啉类化合物的浓度为1.5-10％w/v、优选2-10％w/v、更优选3-8％w/v。

在进一步的实施方案中，在局部给药剂型的根据本发明的药物组合物中，所述青蒿素衍生物的浓度为1-6％w/v、优选2-5％w/v、更优选3-5％w/v。

在进一步的实施方案中，在局部给药剂型的根据本发明的药物组合物中，如果存在，所述酚类化合物的浓度可以为0.1-10％w/v、优选0.1-8％w/v，其中所述硝基酚化合物的浓度可以为0.1-1％w/v，而所述氨基酚化合物的浓度可以为2-10％w/v。

在进一步的实施方案中，所述硬化剂优选为液体硬化剂，更优选醇类液体硬化剂，例如乙醇、丙二醇、液体PEG、丙三醇、异丙醇等，优选为选自以下组之一种或多种：乙醇、丙二醇、液体PEG。此时，这些醇类化合物既作为硬化剂，也可起到溶剂的作用，其浓度可以是55-95％v/v、优选60-80％v/v。如乙醇、丙二醇、液体PEG共用时,三者之间的浓度比(v/v:v/v:v/v)优选为(0.5-1):(0.5-1):(0.5-1)。

根据本发明的实施方案与现有技术相比具有以下优点：与现有的手术和放射线治疗相比，显示出同样髙效却更加友好的“治疗-患者身体”关系(对身体扰动更小)；与现有的全身化疗用药相比，可以在最小化的毒副作用下，显著性地提高疗效；与现有的局部化疗用药、尤其是硬化剂(例如无水乙醇)治疗相比，与病变周围组织间的相容性更高，且疗效更好；与现有技术中的含活体染料的组合物相比，其通过使用最佳浓度使活体染料的药效最大化、副作用最小化。此外，该组合物制作方便、成本便宜，有助于使难以承受高额费用的广大人群也享受到有效治疗。

以下将参考附图对本发明进行更为详细的说明。

附图说明

图1给出以荷胰腺癌细胞裸鼠为模型的一个治疗实验结果，显示亚甲蓝有效抗肿瘤活性与浓度的关系。

图2给出以荷胰腺癌细胞裸鼠为模型的一个治疗实验结果，其中图2A显示二氯化铁浓度固定在0.4％和在0-4％变化亚甲蓝浓度时的抑瘤率曲线，而图2B亚甲蓝浓度固定在1％和在0-1％变化二氯化铁浓度时的抑瘤率曲线。

具体实施方式

在本发明中，除非另有说明，在室温下的液相化合物浓度以体积/体积百分比浓度(V/V％)表示，固相化合物浓度以重量/体积百分比浓度(W/V％)表示。

本发明的组合物，在以下叙述中也被简写为组分1/组分2、或组分1/组分2/组分3。组合物中各组分的浓度，也可以被冠在组分之前。例如0.4％二氯化铁/5％水扬酸是指一个二氯化铁和水扬酸的组合物，其中二氯化铁的浓度为0.4％，水扬酸的浓度为5％。其它多组分组合物的简写方式以此类推。

根据本发明的再一个方面，其提供活体染料在制备用于***的药物组合物中的应用。

根据本发明的再一个方面，其提供一种***的方法，其包括向有此需要的个体给药包含活体染料的药物组合物。

在本发明的范围中，术语“活体染料”是指能够对有机体内的结构上色、但其副作用又在药学上可以接受的范围之内的染料。所述活体染料可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如可以是包括以下之一种或多种的有机染料及其衍生物:亚甲蓝(本发明中也包括水合物)、专利蓝、异硫蓝、甲苯胺蓝、台盼蓝、碱性蓝、伊红、碱性品红、结晶紫、龙胆紫、中性红、詹纳斯绿B、番红，优选为选自以下有机染料及其衍生物之一种或多种:亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝、结晶紫、中性红，更优选为选自以下有机染料及其衍生物之一种或多种:亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝。以亚甲蓝为例，其衍生物通常也是染料，例如1,9-二甲基亚甲蓝、1-甲基亚甲蓝等。

根据本发明，所述药物组合物中还可进一步任选包含金属化合物。在本发明的范围中，术语“金属化合物”包括包含相应金属的金属盐和有机金属化合物(其不包括金属与有机酸形成的盐)，其中所述金属例如可以是铁、铜、镁、锌、锰、铝和钙中的一种或多种。该金属化合物优选为选自以下之一种或多种的金属盐：铁盐、铜盐、镁盐、锌盐、锰盐、铝盐和钙盐，优选为铁盐和铜盐。

所述盐可以是所述金属与无机酸或有机酸形成的盐。所述无机酸和有机酸例如包括硫酸、硝酸、磷酸、硼酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、乙酸、苯甲酸、苯磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、环己氨磺酸、乙磺酸盐、甲酸、琥珀酸、蛋白琥珀酸、胆酸、延胡索酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、羟乙基磺酸、乳酸、富马酸、苹果酸、顺丁烯二酸、丙二酸、甲磺酸、甲基硫酸、烟酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、焦谷氨酸、糖二酸、硬脂酸、丁二酸、单宁酸、酒石酸、甲苯磺酸和三氟乙酸等。

具体对于铁盐而言，其包括铁(III)离子盐和亚铁(II)离子盐，其总称为铁盐。铁盐包括任何药物学上可以接受的铁盐，可以是铁离子或亚铁离子与上述无机酸或有机酸形成的盐。例如，亚铁离子盐包括二氯化铁、硫酸亚铁、琥珀酸亚铁、富马酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁等。铁(III)离子盐包括例如枸橼酸铁铵、右旋糖酐铁、蛋白琥珀酸铁。在根据本发明的药物组合物中，所述金属化合物优选为亚铁离子盐，更优选为选自以下之一种或多种的亚铁盐：二氯化铁、硫酸亚铁、琥珀酸亚铁、富马酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、乳酸亚铁。

所述金属化合物还包括金属有机化合物，例如转铁蛋白、含铁血红素、氨基酸络合铁、多糖铁等。

根据本发明，所述药物组合物中还可进一步任选包含抗肿瘤物质，其选自有效抗肿瘤物质、低效抗肿瘤物质及其组合。

在本发明的范围中，“有效抗肿瘤物质”是指在安全剂量内全身用药时可显示出有效抗肿瘤活性(例如动物实验中的抑瘤率在40％以上)的物质，其可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如包括以下之一种或多种：阿霉素、顺铂、紫衫醇、长春新碱、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶及其衍生物。

术语“低效抗肿瘤物质”是指在安全剂量内全身用药时未显示出有效抗肿瘤活性、但仍有一定活性(例如动物实验中的抑瘤率在5-40％)的物质。在本发明的一个实施方案中，该低效抗肿瘤物质为选自以下组之一种或多种物质：非甾体抗炎化合物、喹啉类化合物、青蒿素衍生物和酚类化合物。

在本发明的范围中，术语“非甾体抗炎化合物”是指不含有甾体结构、但具有抗炎作用的化合物及其衍生物。非甾体抗炎药(Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs，NSAIDs)为具有临床竞争力的非甾体抗炎化合物。所述非甾体抗炎化合物可以是本领域技术人员已知的任意合适者，其可以是包括例如水杨酸类化合物、丙酸类抗炎化合物(例如布洛芬、芬必得、萘普生等)、吲哚类抗炎化合物(例如吲哚美辛、舒林酸等)、苯胺类抗炎化合物(例如非那西丁、N-(4-羟基苯基)乙酰苯胺(对乙酰氨基酚))、灭酸类抗炎化合物(例如甲灭酸、氯灭酸、双氯灭酸和氟灭酸等)、乙酸类抗炎化合物(例如双氯芬酸钠等)、喜康类抗炎化合物(例如炎痛喜康等)、吡唑酮类抗炎化合物(例如保泰松，羟基保泰松等)。在本发明的实施方案中，该非甾体抗炎化合物优选为水杨酸类化合物。

在本发明的范围中，术语“水杨酸类化合物”是指水杨酸及其衍生物。所述水杨酸(Salicylic acid)的化学名为2-羟基苯甲酸。所述水杨酸衍生物可以是本领域技术人员已知的任意合适者，其可以是包括例如含金属盐的水杨酸衍生物和不含金属盐的水杨酸衍生物。前者可以是包括例如水杨酸钠、水杨酸镁、水杨酸锌、金属元素络合物(例如阿斯匹林铜)等，后者可以是包括例如乙酰水杨酸(Aspirin阿斯匹林)、赖氨匹林、二氟苯水杨酸、氨基水杨酸、对氨基水杨酸、N-苯基邻氨基苯甲酸、水杨酰苯胺、邻乙氧基苯酰胺、水杨酸苯酯、水杨酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、双水杨酸酯、双香豆素和它们的药物学上可接受的衍生物。以其中的阿斯匹林为例，水杨酸衍生物可以是包括例如其单一衍生物(例如一氧化氮阿司匹林、硫化氢阿司匹林等)、两种衍生物形成的衍生物(例如一氧化氮阿司匹林和硫化氢阿司匹林形成的一氧化氮硫化氢(NOSH)阿司匹林)。在根据本发明的药物组合物中，所述水杨酸类化合物更优选为选自水杨酸和以下化合物及其衍生物之一种或多种：乙酰水杨酸、二氟苯水杨酸、双水杨酸酯、双香豆素。

在本发明的范围中，术语“喹啉类化合物”是指药学上可以接受的含有喹啉环的喹啉衍生物，例如包括氯喹(chloroquine)、羟氯喹啉、氨甲喹、氨酚喹、奎宁、硝喹、哌喹、伯氨喹(primaquine)、扑疟喹、戊烷喹及其异构体和药物学上可接受的盐，其中优选为奎宁、氯喹、伯氨喹及其异构体和药物学上可接受的盐，尤其是奎宁及其异构体和药物学上可接受的盐。

喹啉类化合物的药物学上可接受的盐包括酸加成盐，如无机酸加成盐和有机酸加成盐。无机酸加成盐的例子包括但不限于：氢卤酸盐(如盐酸盐，例如盐酸奎宁)、氢溴酸盐、氢碘酸盐、二盐酸盐(例如二盐酸奎宁)、二氢溴酸盐、二氢碘酸盐)、硫酸氢盐、硫酸盐、磷酸盐(例如磷酸氯喹、磷酸哌喹、磷酸伯氨喹)等。有机酸加成盐的例子包括但不限于：碳酸氢盐或碳酸盐、乙基碳酸盐、甲酸盐、乙酸盐、枸缘酸盐或单宁酸盐。

对于奎宁而言，其异构体例如可以是奎尼丁、辛可宁及辛可尼丁，其盐例如可以是盐酸奎宁、二盐酸奎宁、硫酸奎宁等。

上述喹啉类化合物可单独使用，也可组合使用，例如盐酸奎宁和其它喹啉衍生物的组合、二盐酸奎宁和其它喹啉衍生物的组合物、伯氨喹和其它喹啉衍生物的组合物、氯喹和其它喹啉衍生物的组合物。

根据本发明，所述喹啉类化合物选自以下之一种或多种：奎宁、氯喹、伯氨喹及其异构体和衍生物，优选为选自奎宁和奎宁衍生物，更优选为以下化合物之一种或多种：奎宁、一盐酸奎宁和二盐酸奎宁。

在本发明的范围中，术语“青蒿素衍生物”是指青蒿素的衍生物。青蒿素(artemisinin，ART)是从菊科植物黄花蒿中提取的一种含内过氧化基团的倍半萜内酯化合物，其分子式为C₁₅H₂₂O₅。所述青蒿素衍生物可以是本领域技术人员已知的任意合适者，其可以是包括青蒿素的酯类衍生物、醚类衍生物、肽类衍生物、二聚体衍生物、及多聚体衍生物等，优选青蒿琥酯(Artesμnate，ATS)、双氢青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)、蒿甲醚(artemether)、蒿***等。

在本发明的范围中，术语“酚类化合物”是指其化学结构中含有酚基团的化合物。所述酚类化合物可以是本领域技术人员已知的任意合适者，优选具有解偶联作用者，其可以是包括例如硝基酚化合物、氯酚化合物和氨基酚化合物。

所述硝基酚化合物可以包括例如2,4-二硝基苯酚(dinitrophenol，本发明中简记作DNP)、间硝基苯酚、邻硝基苯酚等和它们的衍生物。DNP衍生物可以包括例如2,4-二硝基-1-萘酚(玛蒂乌斯黄)、4,6-二硝基-邻甲酚(维多利亚黄)、酚类氟姜黄色素衍生物等。所述氯酚化合物可以包括例如2,4,5-三氯苯酚、3,3’,4’,5-四氯水杨酰苯胺(TCS)等和它们的衍生物。所述氨基酚化合物可以包括例如对乙酰氨基酚及其衍生物。

在根据本发明的药物组合物中，所述酚类化合物优选为选自硝基酚化合物和氨基酚化合物，更优选为选自以下化合物之一种或多种：2,4-二硝基苯酚、间硝基苯酚、对乙酰氨基酚及其衍生物。

在进一步的实施方案中，根据本发明的药物组合物还可包含硬化剂和/或止痛剂。

在本发明的范围中，术语“硬化剂”是指可引起局部组织产生无菌性炎症，致炎组织在生理修复的过程中不断被纤维化，最终使局部病变组织坏死、缩小和纤维化的化学制剂。其例如可以是液体硬化剂和固体硬化剂,后者例如包括以下之一种或多种：聚桂醇、鱼肝油酸钠、乙醇胺油酸酯、聚多卡醇、尿素、硫酸钠、平阳霉素、博来霉素等。

在本发明的范围内，术语“醇类液体硬化剂”是指在常温下处于液态的具有硬化剂性质的醇类化合物。众所周知,很多醇类物质都具有硬化剂的性质。醇类液体硬化剂可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如包括以下之一种或多种：乙醇、丙二醇、丙三醇、异丙醇、液体聚乙二醇(本发明中简称PEG)，优选为选自以下組之一种或多种：乙醇、丙二醇、液体聚乙二醇。醇类液体硬化剂在很多情况下可以起到溶剂的作用，但在局部给药和高浓度的条件下，其硬化剂作用对药理的影响更大。例如，乙醇正在成为肿瘤、尤其是非恶性肿瘤治疗中最常用的硬化剂之一。

在根据本发明的药物组合物中，醇类液体硬化剂的含量例如可以是55-95％v/v，优选60-80％v/v，而聚桂醇、鱼肝油酸钠、乙醇胺油酸酯、聚多卡醇、平阳霉素和博来霉素的浓度可以分别为0.5-3.0％，硫酸钠的浓度为5-30％，尿素的浓度为10-40％。

所述止痛剂可以是本领域技术人员已知的任意合适者，以减轻患者的疼痛感，例如苯甲醇、盐酸普鲁卡因、三氯叔丁醇、盐酸利多卡等。如果存在，止痛剂的浓度例如可以是0.1-3％(重量)。例如苯甲醇的浓度可以为0.1-3％，盐酸普鲁卡因、三氯叔丁醇、盐酸利多卡的浓度可以分别为0.1-2％。

在进一步的实施方案中，根据本发明的药物组合物还可任选包含用以增加药物活性成分药效的免疫佐剂。所述免疫佐剂可以是本领域技术人员已知的任意合适者，加入它以促进患病区内相关的有益于***的抗原的活动，其例如可以是无机佐剂，如氢氧化铝、明矾等；微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；油剂，如费氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等；免疫刺激剂(卡介苗、棒状杆菌、内毒素、海藻糖、胸腺肽、OK432等)；细胞因子，如干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、转化生长因子、集落刺激因子、趋化因子、胸腺素等；异种抗原，如灭活链球菌、人红细胞膜抗原、肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤疫苗等。如果存在，免疫佐剂的浓度例如为0.01-1％(重量)。

本发明的组合物，还可以任选包含其他治疗药物。所述其他治疗药物可以是本领域技术人员已知的任意合适者，加入它有利于进一步提高人或动物患者的治疗水平，例如提高药效、或者改善这些其他治疗药物的抗药性等。

在根据本发明的药物组合物中，其包含药物学上可接受的载体或赋形剂。所述载体或赋形剂可以是本领域技术人员已知的任意合适者，其可例如包括以下之一种或多种：分散介质、防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、增粘剂、用于调节渗透压的盐和缓冲剂。所述增粘剂例如为羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯毗咯烷酮或明胶。所述增溶剂例如为葡甲胺、二甲基亚砜、甲酰胺、Tween80。所述防腐剂是例如抗氧化剂例(如抗坏血酸)或杀微生物剂(如山梨酸或苯甲酸)。

根据本发明的药物组合物可以是固体制剂、半固体制剂、液体制剂和气态制剂的剂型。所述制剂或剂型包括但不限于粉末剂、喷雾剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、混悬剂、溶液剂、酏剂、糖浆剂。本领域技术人员会理解，根据所需剂量和药代动力学参数，可将本发明的化合物制成不同的制剂。更具体而言，本发明的药物组合物可以是注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂、滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂、粘贴片、贴膜剂、栓剂、气雾剂、泡腾片、滴剂、滴丸剂。

根据本发明的药物组合物优选为局部给药剂型，优选为通过靶区注射给药的剂型。其可以是溶液剂、混悬剂或者乳剂(如水包油或者油包水型乳剂)。

在进一步的实施方案中，根据本发明的局部给药剂型为液体制剂，其中所述活体染料的浓度为1.1-8％w/v，优选为1.5-7％w/v或2-7％w/v，更优选为2-6％w/v或3-4％w/v。

在进一步的实施方案中，在局部给药剂型的根据本发明的药物组合物中，如果存在，所述金属化合物(例如铁盐或铜盐，尤其是亚铁盐)的浓度为0.02-2％w/v，其优选为0.05-1.5％w/v，更优选为0.1-1.2％w/v或0.1-1.6％w/v。

在进一步的实施方案中，在局部给药剂型的根据本发明的药物组合物中，如果存在，所述有效抗肿瘤物质的浓度可以为0.1-10％w/v，而所述低效抗肿瘤物质的浓度可以为0.1-15％w/v。

在进一步的实施方案中，在局部给药剂型的根据本发明的药物组合物中，如果存在，所述非甾体抗炎化合物的浓度为1.5-15％w/v、优选3-15％w/v、更优选5-12％w/v。

在进一步的实施方案中，在局部给药剂型的根据本发明的药物组合物中，所述喹啉类化合物的浓度为1.5-10％w/v、优选2-10％w/v、更优选3-8％w/v。

在进一步的实施方案中，在局部给药剂型的根据本发明的药物组合物中，所述青蒿素衍生物的浓度为1-6％w/v、优选2-5％w/v、更优选3-5％w/v。

在进一步的实施方案中，在局部给药剂型的根据本发明的药物组合物中，如果存在，所述酚类化合物的浓度可以为0.1-10％w/v、优选0.1-8％w/v，其中所述硝基酚化合物的浓度可以为0.1-1％w/v，而所述氨基酚化合物的浓度可以为2-10％w/v。

在进一步的实施方案中，所述硬化剂优选为液体硬化剂，更优选醇类液体硬化剂，例如乙醇、丙二醇、液体PEG、丙三醇、异丙醇等，优选为选自以下组之一种或多种：乙醇、丙二醇、液体PEG。此时，这些醇类化合物既作为硬化剂，也可起到溶剂的作用，其浓度可以是55-95％v/v、优选60-80％v/v。如乙醇、丙二醇、液体PEG共用时，三者之间的浓度比(v/v:v/v:v/v)优选为(0.5-1):(0.5-1):(0.5-1)。

根据本发明的一个实施方案，本发明的组合物为溶液剂。该溶液剂可以是通过将组合物成分溶解在分散介质中而形成的，也可以是单独地将上述成分溶解在分散介质、然后混合而形成的。所述溶液的分散介质包括溶媒，优选在药学上适宜的亲水溶媒。术语“亲水溶媒”是指具有亲水性的溶媒，其包括例如水、水可混溶性有机溶剂、或者包含水和水可混溶性有机溶剂的溶媒***。

根据本发明的一个实施方案，本发明的组合物为混悬剂。该混悬剂可以是通过将组合物成分悬浮于分散介质中而形成的混悬剂，也可以是单独地将上述成分悬浮于分散介质中、然后混合而形成的。所述悬浮液的分散介质可以本领域技术人员已知的任意合适者，例如常用于注射目的植物油、合成油或半合成油作为油组。植物油可以是例如棉籽油、杏仁油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、大豆油和花生油。

以组合物溶液剂(例如注射剂)为例，其可按照以下方法来制备。

方法一：如果组合物中所含活体染料、以及任选存在的其他添加剂(例如抗肿瘤物质、金属盐、其它治疗药物、其它增效剂、止痛剂、赋形剂、等等)的所需浓度均在水溶浓度范围内时，则将这些原料直接加入注射用水即可获得相应的注射剂。

方法二：如果组合物中所含活体染料、以及任选存在的其他添加剂(例如抗肿瘤物质、金属盐、硬化剂、其它治疗药物、其它增效剂、止痛剂、赋形剂、等等)的所需浓度有不在水溶浓度范围内者，则将这些原料溶于所有组合物组分均可在所需浓度下溶解的溶媒(例如含水可混溶有机溶剂的水溶液)中。

方法三：首先制备(例如通过上述方法)含全部组份的溶液，再将其制备(例如通过冻干工艺)为干粉，使用前将该干粉与不含任何组份的溶媒(例如注射用水或含水可混溶有机溶剂的溶媒)混合形成组合物溶液。

方法四:首先制备(例如通过上述方法)含部份组份的溶液，再将其制备(例如通过冻干工艺)为干粉，使用前将该干粉与含有另外部份组份的溶液(例如水溶液或含水可混溶有机溶剂的溶液)混合形成组合物溶液。

以呼吸道给药剂型(例如喷雾剂)为例，其可在活体染料之外加入以下一种或多种赋形剂来制备其液体原液：甘油、聚山梨酯-80、苯扎氯铵、微晶纤维素-羧甲基纤维素钠、等等。其制备方法可参考上述组合物溶液制备方法。

以腔道给药剂型(例如栓剂)为例，其可在活体染料之外加入以下一种或多种赋形剂来制备：棉籽油、杏仁油、橄榄油、青篙油、薄荷脑、冰片、增溶乳化剂、甘油、等等。其制备方法可参考上述组合物溶液制备方法。

按上述这些方法的原则，本领域技术人员可以采用任意合适的具体方法制备多种包含本发明组合物的局部给药制剂。例如，本发明的医用制剂中的变化包括：含不同种类和浓度的活体染料、含不同种类和浓度的物质，含不同种类和浓度的金属盐，含不同种类和浓度的其他添加剂(例如其它有效药物、止痛剂、增活剂等)。

在本发明的范围内，为增加本发明药物组合物在给药处的有效作用时间、提高其生物利用度，其例如可以以缓释剂型用药。本领域技术人员可以采用任意合适的具体方法制备多种包含本发明组合物的缓释剂型制剂。例如，本发明药物组合物的缓释剂型,可以通过在活体染料(及任选的物质)之外加入作为缓释载体或基质的微米粒子、纳米粒子、胶束和原位凝胶基质来制备。

众所周知,缓释制剂的初始释放量为20-50％。因而，本领域技术人员应当知道，缓释剂型通常以常规剂型的2-5倍剂量或浓度给药。例如，在本发明组合物的缓释剂型中，所述活体染料的浓度可以为2-30％w/v，优选为3-20％w/v、更优选为4-15％w/v。

在本发明中，所述肿瘤包括在以下一种或多种器官或组织中的肿瘤:乳腺、胰腺、胰岛、甲状腺、甲状旁腺、***、肝、肺、肠、胃、睾丸、***、子宫、输卵管、卵巢、口腔、口咽、食道、头颈、鼻腔、鼻咽、喉、气管、支气管、汗腺、头发、皮肤、肛肠。

在本发明的范围内，术语“肿瘤”包括恶性肿瘤和非恶性肿瘤。所述恶性肿瘤包括例如乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、***癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、食道癌、胃癌、头颈癌、喉癌、睾丸癌、***癌、子宫癌、卵巢癌、等等。所述非恶性瘤包括例如乳腺瘤、胰腺瘤、甲状腺瘤、***瘤、肝瘤、肺瘤、肠瘤、口腔瘤、食道瘤、胃瘤、鼻咽瘤、喉瘤、睾丸瘤、***瘤、子宫瘤、输卵管瘤、卵巢瘤、等等。所述肿瘤除以上实体瘤以外，还包括血管瘤。

本发明的组合物以及该组合物的医用制剂还可与其它介入疗法、全身化疗、免疫疗法、光动力疗法、声动力疗法、手术干预或此类疗法的组合相组合施用以进一步提高疗效。

基于在下文中更详细描述的研究，尽管具体机理尚待进一步研究，本发明的组合物显示出促进哺乳动物肿瘤中的相关结构(例如病变组织、病变细胞及参与构成它们的任一结构)的有效破坏(例如有效促进病变细胞凋亡、坏死、自噬等有利于其消失的活性)、从而达到治疗疾病的药学性质。

实施例

通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。在以下实施例中，所有的实验均依照相关规定在细胞或实验动物上进行。如无特殊说明，所有实验均按常规方法进行。

以下具体实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所用的部分试剂列于表1中。

表1

名称	CAS号
		一盐酸奎宁(盐酸奎宁)	6119-47-7
二盐酸奎宁	60-93-5
		磷酸哌喹	4085-31-8
伯氨喹	90-34-6
		乙酰水杨酸	50-78-2
水杨酸	69-72-7
		氟苯水杨酸	22494-42-4
布洛芬	15687-27-1
		蒿甲醚	71963-77-4
青蒿琥酯	88495-63-0
		2,4-二硝基苯酚(DNP)	51-28-5
硫酸亚铁	7782-63-0
		氯化亚铁(四水)	231-843-4
葡萄糖酸亚铁	299-29-6
		氯化铜	10125-13-0
亚甲基蓝(碱性蓝9)	61-73-4
		亚甲基蓝(水合物)	7220-79-3
结晶紫	548-62-9
		中性红	553-24-2
专利蓝V	3536-49-0
		番红花红T	477-73-6
伊红Y	17372-87-1

在以下实施例中，受试肿瘤细胞包括：人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(MDA-MB231)、人肺癌细胞(A549)、人甲状腺癌细胞(SW579)、人***癌细胞(LNCaP/AR)、人胰腺癌细胞(PANC-1)、人结肠癌细胞(COLO205)、人头颈癌细胞(Fμda)、人鼻咽癌细胞(CNE1)、人胃癌细胞(BGC823)、卵巢癌(PA1)、皮肤癌细胞(A341)等。本发明的实施例的研究方法和结果也适用于其它肿瘤细胞。

在以下实施例中，除非另有说明，皮下移植瘤动物试验按药管当局颁发的试验指南进行。动物为6～8周龄、体重17.5-20.5g的雌性裸鼠(BALB/C-Nμde)。将上述受试肿瘤细胞皮下接种于裸鼠，待肿瘤长至所需体积(例如70-100mm³左右)，采用PEMS 3.2软件(四川大学华西公共卫生学院编制)随机区组为阴性对照组、阳性对照组和若干个研究组，每组8只裸鼠。

分组当日开始给药。试验设阴性对照组、阳性对照组和若干个研究组，分别加入阴性对照物、阳性对照物和若干个研究药物。阴性对照物为组合物溶媒，其给药方式和体积均与研究组相同。阳性对照物选自上述现有抗瘤药物，其给药方式为腹腔注射给药，其日给药剂量均按所选药物的惯例进行(例如5-氟嘧啶25mg/kg)。除另有说明，研究组均为瘤区注射研究药物，注射量由剂量和浓度确定。试验观察、测量和分析的项目，包括一般状态、体重、摄食量、肿瘤体积、瘤重等。

肿瘤体积计算公式如下：

TV＝l/2×a×b²，式中a表示肿瘤长度，b表示肿瘤宽度。

相对肿瘤体积计算公式如下：

RTV＝Vt/V₀，式中V₀为分组给药当天(即第一天)测量所得的肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。

相对肿瘤增殖率计算公式如下：

T/C(％)＝TRTV/CRTV×100，式中TRTV为阳性对照组或研究组的RTV，CRTV为阴性对照组的RTV。

肿瘤生长抑制率(本发明中简记为抑瘤率)计算公式如下：

抑瘤率(％)＝(TW-CW)/CW×100％，其中TW为阳性对照组或研究组的平均瘤重；CW为阴性对照组的平均瘤重。

研究组的基于相对肿瘤增殖率的药效评价标准为：T/C(％)>40为无效活性，T/C(％)≤40(但是>15％)并经方差分析与阴性对照组相比P<0.05为有效活性(无优选药学活性)，T/C(％)≤20并经方差分析与阴性对照组相比P<0.05为优选活性。

研究组的基于抑瘤率的药效评价标准为：抑瘤率<40％为无效活性，抑瘤率≥40％(但是<75％)并经方差分析与阴性对照组相比P<0.05为有效活性，抑瘤率≥75％并经方差分析与阴性对照组相比P<0.05为优选活性。

在以下实施例中，实验均采用重复测量方差分析(Repeated Measμres ANOVA)分别对指标均数的组别差异进行统计学检验。组别差异有统计学意义时(P≤0.05)，采用最小显著差异法对各组与阴性对照组间差异进行比较。定量指标采用均数±标准误(X±SEM)描述。当LEVENE方差齐性检验提示方差不齐时(P≤0.05)，采用Mann-WhitneyΜ秩和检验(M-W法)比较组间差异。所有的统计分析，均在SPSS for Windows 13.0软件下完成。

实施例1：组合物的制备

使用前述制备方法，本实施例制备的部分组合物溶液列于表2。表中所列的百分数是指相应成分在组合物溶液中的浓度。

表2

^*:在本发明所有实施例中，除非另有说明，所用醇类液体硬化剂为乙醇、PEG300和丙二醇的共用，它们的浓度比(％浓度:％浓度:％浓度)为1:1:1。例如，一个含75％醇类液体硬化剂的溶液中，乙醇、PEG300和丙二醇的浓度可以分别是25％、25％和25％，等等。

具体而言，例如，以最终10ml组合物溶液体积计，在室温下，按照表2所示的量量取相应的活体染料干粉以及任选存在的其他成分(如水杨酸类化合物)的干粉加入8ml适当溶媒(如含醇类液体硬化剂的溶媒)溶解，再加入其它液态添加剂(例如苯甲醇，0.2ml)和溶媒使总体积达到10ml，混合均匀后分装为2ml/瓶备用，制得组合物溶液。

了保证组合物的组成稳定性，除可以加入相关稳定剂以外，还可将活体染料干粉、以及任选存在的其他成分(如水杨酸类化合物)以固态(例如冻干粉)或/和液态形式分别储放，在应用前混合均匀使用。

实施例2：活体染料的有效浓度研究

针对荷肝癌细胞裸鼠(瘤体95-165mm³)的实验，阳性对照组(A组)腹腔注射给药5-氟尿嘧啶水溶液(25mg/kg/次)，每天注射一次，给药10次。阴性对照组瘤内注射生理盐水，研究组瘤内注射药物水溶液(50-100μl),给药1次。停药后3日，对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。

一个实验中，各药物研究组(B、C、D、E、F、G组)的注射剂含有不同浓度亚甲蓝(0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、4.0％)。图1显示了亚甲蓝水溶液的靶区注射浓度-抑瘤率关系曲线。

在图1中，横坐标X为瘤区注射浓度，纵坐标Y为动物实验中测出的抑瘤率(Y％)。在用药浓度1％及以内，观察不到与此浓度变化相应的明显药效变化，抑瘤率一直小于40％，属于抗瘤无效。而在1.5％处，抑瘤率突变上升到41％，然后在一个相对较窄的用药浓度范围内迅速达到81％。

在整个试验期内，阴性对照组肿瘤体积呈增长趋势。在1.5％-4.0％的注射浓度范围内的药物研究组与阴性对照组相比，抑瘤率差异有统计学意义(P<0.05)。阳性对照物的抑瘤率为75％，与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

总而言之，唯有其瘤体注射浓度超过某一临界值(大于1％、优选大于1.5％)时，亚甲蓝才显示出药效对浓度的高度敏感，然后又重新变得不那么敏感。

通常的看法是，亚甲蓝由于其局部副作用而不适于高浓度局部给药。出乎意料的是，其在大于1％、甚至在1.5-4％的高浓度条件下瘤内用药并未出现预期的安全性问题。

在上述实验期间，亚甲蓝注射剂的各研究组均未见裸鼠死亡，平均体重与阴性对照组体重变化接近(差别小于10％)，表示药物在实验条件下无明显的毒性反应。研究组与阳性对照组相比较，一般状况类似。但阳性对照组平均体重下降更大(大于20％)，提示一个较强的毒性反应。

在瘤区用药期间，与阴性对照组相比较，研究组中、尤其是高浓度亚甲蓝(>1.5％)组中注射部位均有明显的色泽变化、甚至伴有肌肉变性。这提示该应用条件确实引起了肌细胞的部分损伤，注射部位有炎性细胞浸润，但不影响正常功能。在给药停止后，研究组裸鼠注射部位的肌肉组织外观逐步实现正常化。对给药停止后30天剖杀的裸鼠的注射部位进行了病理切片检查，结果显示研究组与阴性对照组的差别明显缩小，趋于正常。

另一组试验显示，本发明的药物组合物在同样浓度下，一个较大的注射量显示出更好的药物学效果。如果瘤区体积太大，为控制给药剂量，可以对瘤区进行分部处理。注射剂的每次给药体积必须为欲处理部份体积的50％以上、优选70％以上。当肿瘤个体足够小时，欲处理部份体积即为单个瘤体体积。

此外，我们还研究了在本发明的组合物用于抗不同发育的肿瘤。在本发明的实施例中，除非另有说明，抗不同发育的肿瘤实验的研究方法如下。

裸鼠分为先接种鼠群和后接种鼠群。先接种鼠群先于后接种鼠群7天接种人肝癌细胞。在后接种鼠群接种后7天，进行裸鼠分组(每组8只)。先接种鼠群(瘤体体积8-125mm³)分为阴性对照组(A组)和研究组(B组)，后接种鼠群(瘤体体积35-65mm³)分为阴性对照组(C组)和研究组(D组)。A、B组瘤内注射给药70-100μl，C、D组瘤内注射给药30-70μl。

本实施例中，阴性对照物为生理盐水，研究药物为2％亚甲蓝水溶液。给药1次，停药后次日解剖，D组和B组的抑瘤率分别为81％和68％。本发明的组合物不仅可应用于恶性肿瘤治疗，甚至于可用于完全去除有一定致癌风险的肿瘤，以防止其发展为恶性肿瘤。

在其它荷瘤动物试验、以及使用本发明的其它类似组合物(例如实施例1制备的组合物1-6)实验时，也可以观察到类似有效性和安全性结果。

实施例3:活体染料与金属盐的组合物研究

针对荷肝癌细胞裸鼠(瘤体95-165mm³)的实验，阳性对照组(A组)腹腔注射给药5-氟尿嘧啶水溶液(25mg/kg/次)，每天注射一次，给药10次。阴性对照组瘤内注射生理盐水，研究组瘤内注射药物水溶液(50-100μl),给药1次。停药后3日对动物进行安乐死和解剖，测定抑瘤率。

在3个研究药物系列中，第一系列为5个亚甲蓝组，浓度分别为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、3.0％。第二系列为5个二氯化铁/亚甲蓝组，二氯化铁浓度均为0.4％，而亚甲蓝浓度分别为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、3.0％。第三系列也是5个二氯化铁/亚甲蓝组，亚甲蓝浓度均为1％，而二氯化铁浓度分别为0.02％、0.05％、0.1％、0.4％、1％。结果如图2所示，其中图2A显示的第二系列的抑瘤率曲线，而图2B显示的是第三系列的抑瘤率曲线。

图2A和2B中，最低浓度的组合物组(0.4％二氯化铁/0.5％亚甲蓝组和0.02％二氯化铁/1％亚甲蓝组)的抑瘤率为28％和41％，分别115％以上高于0.5％亚甲蓝组和1％亚甲蓝组的疗效(抑瘤率分别为15％和27％)，显示出协同增效作用。这两个协同增效组合物的疗效却仍然明显低于阳性对照物(抑瘤率72％)。然而，当组合物中的二氯化铁和亚甲蓝的瘤体注射浓度达到某一临界值(分别为0.1％和1％)以后，显示出药效对浓度的高度敏感，其抑瘤率迅速提高直至大于阳性对照物，出现优选疗效。

更多的实验显示，在金属盐的局部给药浓度为0.2-2％时，亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝的安全且被优选增效的浓度均为1-4％、优选1.5-3％。

在上述实验中，还观察了本发明的金属盐/活体染料组合物中高浓度(例如亚甲蓝1％以上)活体染料与安全性的关系。在安全剂量范围内，局部给药特别要关注局部刺激性。在瘤体注射时，上述高浓度组合物组均在注射部位出现明显的色泽变化和轻度的肌肉变性。在另一个相同的验证实验中，对给药停止后30天剖杀的裸鼠的注射部位进行了病理切片检查，结果显示阴性对照组和研究组的注射部位与正常的未注射部位的差别以经不明显。

此外，另一组试验显示，通过靶区给药时，本发明的药物组合物在同样组合浓度下，一个较大的给药体积显示出更好的药学效果。如果靶区体积太大，为控制给药剂量，可以对其进行分部处理。注射剂的每次给药体积必须为欲处理部份体积的50％以上。当肿瘤足够小时，欲处理部份体积即为单个肿瘤体积。

此外，我们还研究了金属盐/活体染料组合物用于抗不同发育的肿瘤。研究方法如前所述。本实施例中，阴性对照物为生理盐水，研究药物为0.5％二氯化铁/2％亚甲蓝水溶液。给药1次，停药后次日解剖，D组和B组的抑瘤率分别为91％和78％。

使用实施例一制备的其它金属盐/活体染料组合物(例如表2中的组合物7-17)，也可以观察到类似有效性和安全性结果。

实施例4：活体染料与其它抗肿瘤物质的组合物研究

针对荷肝癌细胞裸鼠(瘤体95-165mm³)的实验，阳性对照组(A组)腹腔注射给药5-氟尿嘧啶水溶液(25mg/kg/次)，每天注射一次，给药10次。阴性对照组瘤内注射生理盐水，研究组瘤内注射药物水溶液(50-100μl),给药1次。停药后3日，对动物进行安乐死，解剖后测定抑瘤率。

一个实验中，3个系列的研究药物溶液均含75％醇类液体硬化剂，故以75％醇类液体硬化剂水溶液为阴性对照物。

当固定组合物中的二氯化铁和乙酰水杨酸浓度(分别为0.7％和3％)、而在0.5-3％变化亚甲蓝浓度(0.5％、1％、1.5％、2％、3％)时，二氯化铁/乙酰水杨酸/亚甲蓝与相同组分浓度的二氯化铁/亚甲蓝、二氯化铁/乙酰水杨酸和亚甲蓝/乙酰水杨酸相比较，抑瘤率高出115％以上。

当固定组合物中的二氯化铁和亚甲蓝浓度(分别为0.7％和1％)、而在1.5-12％变化乙酰水杨酸浓度(1.5％、3％、5％、8％、12％)时，二氯化铁/乙酰水杨酸/亚甲蓝与相同组分浓度的二氯化铁/亚甲蓝、二氯化铁/乙酰水杨酸和亚甲蓝/乙酰水杨酸相比较，抑瘤率高出115％以上。

当固定组合物中的亚甲蓝和乙酰水杨酸浓度浓度(分别为1％和3％)、而在0.02-2％变化二氯化铁浓度(0.02％、0.05％、0.1％、1％、2％)时，二氯化铁/乙酰水杨酸/亚甲蓝与相同组分浓度的二氯化铁/亚甲蓝、二氯化铁/二盐酸奎宁和亚甲蓝/二盐酸奎宁相比较，抑瘤率高出115％以上。

以以下组为例，0.7％二氯化铁/3％乙酰水杨酸/1％亚甲蓝、0.7％二氯化铁/3％乙酰水杨酸、1％亚甲蓝/3％乙酰水杨酸、0.7％二氯化铁/1％亚甲蓝的抑瘤率分别为89％、46％、67％、73％。

在另一个实验中，阴性对照组注射生理盐水，3个系列的研究组注射药物水溶液。

当固定组合物中的二氯化铁和二盐酸奎宁浓度(分别为0.7％和3％)、而在0.5-3％变化亚甲蓝浓度(0.5％、1％、1.5％、2％、3％)时，二氯化铁/二盐酸奎宁/亚甲蓝与相同组分浓度的二氯化铁/亚甲蓝、二氯化铁/二盐酸奎宁和亚甲蓝/二盐酸奎宁相比较，抑瘤率高出115％以上。

当固定组合物中的二氯化铁和亚甲蓝浓度(分别为0.7％和1％)、而在1-8％变化二盐酸奎宁浓度(1％、2％、4％、6％、8％)时，二氯化铁/二盐酸奎宁/亚甲蓝与相同组分浓度的二氯化铁/亚甲蓝、二氯化铁/二盐酸奎宁和亚甲蓝/二盐酸奎宁相比较，抑瘤率高出115％以上。

当固定组合物中的亚甲蓝和二盐酸奎宁浓度(分别为1％和3％)、而在0.02-2％变化二氯化铁浓度(0.02％、0.05％、0.1％、1％、2％)，二氯化铁/二盐酸奎宁/亚甲蓝与相同组分浓度的二氯化铁/亚甲蓝、二氯化铁/二盐酸奎宁和亚甲蓝/二盐酸奎宁相比较，抑瘤率高出115％以上。

以以下组为例，0.7％二氯化铁/3％二盐酸奎宁/1％亚甲蓝、0.7％二氯化铁/3％二盐酸奎宁、1％亚甲蓝/3％二盐酸奎宁、0.7％二氯化铁/1％亚甲蓝的抑瘤率分别为82％、61％、62％、68％。

此外，我们还研究了金属盐/其它增效剂/活体染料组合物用于抗不同发育的肿瘤。研究方法如前所述。本实施例中，阴性对照物为含70％醇类液体硬化剂的水溶液，研究药物为含70％醇类液体硬化剂的0.7％二氯化铁/5％乙酰水杨酸/2％亚甲蓝水溶液。给药1次，停药后20日解剖，D组和B组的抑瘤率分别为95％和81％。

在其它荷瘤动物试验、以及使用实施例1制备的其它类似组合物(例如表2中的组合物18-26)实验时，也可以观察到类似长效性和安全性结果。

实施例5：其它抗瘤研究

针对多种荷癌细胞裸鼠(癌细胞如前所述,瘤体85-165mm³)的实验，阳性对照组(A组)腹腔注射给药5-氟嘧啶水溶液(25mg/kg/次)，每天一次，给药10次。阴性对照物为生理盐水。研究药物分别为按前述方法配制的药物:2％亚甲蓝水溶液(B组)、0.7％二氯化铁/2％亚甲蓝组合物水溶液(C组)、和0.7％二氯化铁/2％亚甲蓝/5％乙酰水杨酸溶液(含70％液体醇类硬化剂)(D组)。阴性对照组和研究组瘤内注射75-100μl，一共1次。停药后20日对动物进行安乐死和解剖，测定抑瘤率。结果如下。

针对荷甲状腺癌细胞裸鼠进行的一个实验，从试验第5天起，与阴性对照组相比，阳性对照组和研究组的肿瘤体积都降低，差异有统计学意义(P<0.05)。解剖结果显示，A、B、C、D组的抑瘤率分别为71％、63％、76％和93％。

针对荷乳腺癌细胞裸鼠进行的一个实验，从试验第5天起，与阴性对照组相比，阳性对照组和研究组的肿瘤体积都降低，差异有统计学意义(P<0.05)。解剖结果显示，A、B、C、D组的抑瘤率分别为68％、63％、75％和95％。

针对荷鼻咽癌细胞裸鼠进行的一个实验，从试验第5天起，与阴性对照组相比，阳性对照组和研究组的肿瘤体积都降低，差异有统计学意义(P<0.05)。解剖结果显示，A、B、C、D组的抑瘤率分别为73％、70％、82％和96％。

针对荷皮肤癌细胞裸鼠进行的一个实验，从试验第5天起，与阴性对照组相比，阳性对照组和研究组的肿瘤体积都降低，差异有统计学意义(P<0.05)。解剖结果显示，A、B、C、D组的抑瘤率分别为78％、68％、81％和94％。

在另一个系列的荷癌细胞裸鼠(瘤体100-150mm³)实验中，阳性对照物、阴性对照物与上相同。研究药物分别为按前述方法配制的以下药物:2％亚甲蓝水溶液(B组)、0.7％二氯化铁/2％亚甲蓝组合物水溶液(C组)、和0.7％二氯化铁/2％亚甲蓝/3％二盐酸奎宁水溶液(D组)。所获结果与上述结果类似。

在其它荷瘤裸鼠(接种肿瘤细胞分别为人肺癌细胞(A549)、人***癌细胞(LNCaP/AR)、卵巢癌细胞(PA1)、头颈癌细胞(FADΜ))实验中，以及在使用实施1制备的其它组合物(例如表2)时，也可以观察到类似的结果。

Claims (10)

1.活体染料在制备用于***的药物组合物中的应用。

2.根据权利要求1的应用，其中所述活体染料包括以下之一种或多种：亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝、甲苯胺蓝、台盼蓝、碱性蓝、伊红、碱性品红、结晶紫、龙胆紫、中性红、詹纳斯绿B、番红其衍生物，优选为选自以下之一种或多种：亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝、结晶紫、中性红及其衍生物，更优选为选自以下之一种或多种：亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝及其衍生物。

3.根据权利要求1或2的应用，其中所述药物组合物任选进一步包含金属化合物、有效抗肿瘤物质、低效抗肿瘤物质、硬化剂、止痛剂或其组合。

4.根据权利要求1-3之一的应用，其中所述低效抗肿瘤物质选自以下一种或多种：非甾体抗炎化合物、喹啉类化合物、青蒿素衍生物、酚类化合物；

其中所述非甾体抗炎化合物选自以下组之一种或多种：水杨酸类化合物、丙酸类抗炎化合物、吲哚类抗炎化合物、苯胺类抗炎化合物、灭酸类抗炎化合物、吡唑酮类抗炎化合物，优选为选自水杨酸类化合物，更优选为选自水杨酸、乙酰水杨酸、二氟苯水杨酸、双水杨酸酯、双香豆素中的一种或多种；

所述喹啉类化合物选自以下之一种或多种：奎宁、氯喹、伯氨喹及其异构体和衍生物，优选为选自奎宁和奎宁衍生物，更优选为以下化合物之一种或多种：奎宁、一盐酸奎宁和二盐酸奎宁；

所述青蒿素衍生物包括青蒿素的酯类衍生物、醚类衍生物、肽类衍生物、二聚体衍生物、及多聚体衍生物等，优选青蒿琥酯、双氢青蒿素、蒿甲醚、蒿***；

所述酚类化合物为选自以下之一种或多种：硝基酚化合物、氯酚化合物和氨基酚化合物，优选为选自硝基酚化合物和氨基酚化合物，更优选为选自以下化合物之一种或多种：2,4-二硝基苯酚、间硝基苯酚、对乙酰氨基酚及其衍生物。

5.根据权利要求1-4之一的应用，其中所述药物组合物为局部给药剂型，优选为靶区注射和/或灌注剂型。

6.根据权利要求1-5之一的应用，其中所述局部给药剂型为液体制剂，其中所述活体染料的浓度为1.1-8％w/v，优选为1.5-7％w/v或2-7％w/v，更优选为2-6％w/v或3-4％w/v。

7.根据权利要求1-6之一的应用，其中所述有效抗肿瘤物质的浓度可以为0.1-10％w/v，而所述低效抗肿瘤物质的浓度可以为0.1-15％w/v。

8.根据权利要求1-7之一的应用，其中所述非甾体抗炎化合物的浓度为1.5-15％w/v、优选3-15％w/v、更优选5-12％w/v；和/或

所述喹啉类化合物的浓度为1.5-10％w/v、优选2-10％w/v、更优选3-8％w/v；和/或

所述青蒿素衍生物的浓度为1-6％w/v、优选2-5％w/v、更优选3-5％w/v；和/或

所述酚类化合物的浓度可以为0.1-10％w/v、优选0.1-8％w/v，其中所述硝基酚化合物的浓度可以为0.1-1％w/v，而所述氨基酚化合物的浓度可以为2-10％w/v。

9.根据权利要求1-8之一的应用，其中所述硬化剂优选为液体硬化剂，更优选醇类液体硬化剂，例如乙醇、丙二醇、液体PEG、丙三醇、异丙醇等，优选为选自以下组之一种或多种：乙醇、丙二醇、液体PEG，其浓度可以是55-95％v/v、优选60-80％v/v。

10.根据权利要求1-9之一的应用，其中所述金属化合物的浓度为0.02-2％w/v，其优选为0.05-1.5％w/v，更优选为0.1-1.2％w/v或0.1-1.6％w/v。