CN107567587B - 口腔微生物毒力因子的检测 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于检测和量化存在于口腔中的毒素的方法。所述方法可包括提供生物样本，提供表达一种或多种Toll样受体的报告细胞，使所述细胞暴露于生物样本，测量脂多糖对激活Toll样受体的EC50值，量化生物样本中的脂多糖。

Description

口腔微生物毒力因子的检测
技术领域
本发明涉及用于检测和量化口腔样本中的细菌毒力因子，并且鉴定用 于对口腔毒力因子解毒的试剂的方法，以及用于测定解毒试剂的效果的方 法。
背景技术
细菌细胞壁的毒素(Henkel等人，EXS.(2010)100：1-29)与健康相关 问题诸如败血性休克、发烧和不适相关联(V.Liebers等人，Am J Ind Med.(2006)49(6):474-91)。与健康问题相关的革兰氏阴性细胞壁毒素的示 例是内毒素，诸如脂多糖(LPS)、肽聚糖和菌毛，与健康问题相关的革兰 氏阳性细胞壁毒素是脂磷壁酸(LTA)和肽聚糖。存在许多其它的细菌毒 素，诸如内毒素和外毒素，如Henkel等人，EXS.2010；100:1-29中所报道 的。就口腔环境而言，LPS和LTA似乎是细菌诱导的免疫应答的主要驱动 物，或至少是最有特征性的。由身体响应于这些毒素引起的免疫应答取决 于毒素的起源和个体对所述毒素的暴露历史。LPS是革兰氏阴性菌的组 分，其在菌株与菌株之间不同，如由大肠杆菌(E.coli)的毒力差异所示的 (Raetz和Whitfield Annu.Rev.Biochem(2002)71：635-700)。LPS由脂 质A片段、核心区域组成，并且可具有O-抗原。已经示出脂质A片段的脂 肪酸组合物响应于其与Toll样4(TLR4)受体的相互作用而确定其毒力。 LTA已与各种炎性应答相关(Y.Yokoyama等人，Acta Otolaryngol Suppl. (1996)523：108-111)并且与Toll样受体2(TLR2)激活相关。普遍地 据信，仅裂解的细菌释放可引发炎症应答的LPS(CA2323630)。然而， Zhang等人示出生长的细菌以与其生长阶段呈比例的含量分泌LPS (H.Zhang等人，(1998)Infection&Immunity,66(11),5196-5201)。因此， 即使在刷牙之后在牙齿上留下小部分的菌斑也可由于从存在于菌斑中的革 兰氏阴性菌释放LPS而引起炎症级联。
检测特定细菌物种的方法已经在本领域中展示。在美国专利公布 2012/019735A1中，提出了经由分光光度计法区分致病菌的方法。尽管其能 够示出特定细菌的存在，但他们的发明不允许使用者确定特定位点的毒力 水平。此外，他们的方法需要在实验室中培养细菌以便获得足量的LTA或 LPS用于检测。因此，他们的发明缺乏检测存在不可培养物种的能力，其 也不能测量生物样本的毒力。
在美国专利5,175,089中，施用使用鲎变形细胞裂解物(LAL)的内毒 素(LPS)测定，来测定牙周袋中的内毒素量。尽管其能够示出存在的内毒 素的总量，缺乏区分患病内毒素相对于健康内毒素的能力，并且不能量化 内毒素的毒力水平。此外，他们的发明将其限制于革兰氏阴性内毒素，因 为LTA不可通过LAL试剂盒检测。
在美国专利公布2009/0047240中，伴侣蛋白10(Cpn10)用于调节具 有标记的抗体的细胞系(鼠RAW264)中Cpn10的成簇。尽管其示出了 HEK细胞系中的TLR-4、7和9报告基因，但他们的体系不允许对具有较 弱激活LPS的微生物群所需的更敏感或低水平的检测，因为那些基因仅处 于NFkB结合位点的控制下(最小启动子)。他们的体系缺乏区分具有多 种微生物物种和不存在大量生物体的生物体系所需的敏感性。此外，他们 的体系需要强NFkB激活因子以克服用于其体系中的弱启动子，因此不能 吸收较弱的TLR LPS激动剂，诸如来自牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的LPS。此外，他们的体系缺乏检测TLR3激动剂的能力，这对 表征炎性疾病如齿龈炎是不利的。
美国专利公布2007/0160544描述了用于测定口腔有害细菌的方法。他 们的方法要求齿龈细胞与细菌或细菌组分接触并测量炎性标志物。根据美 国专利公布2007/0160544，标志物的存在指示炎症和细菌标记是有害的。 相反地，认为不存在标志物指示细菌不是问题。尽管其引用了本领域已知 作为产生细胞因子的路径的一部分的Toll样受体，但其方法仅允许确定细 胞因子的存在。
因为口腔细胞包含细菌毒力因子可对其激活的一种或多种受体，所以 筛选个体受体需要使用工程化细胞，诸如包含感兴趣的受体基因的报告细 胞。使天然口腔细胞诸如齿龈细胞的使用进一步复杂化的是受体如Toll样 受体的表达和激活对于细胞功能是特异性的。齿龈细胞由于其与牙菌斑中 微生物的不断接触而不太可能对细菌毒力因子应答。因此，需要具有工程 化细胞，其中其中直接应答可经由报告体系测量。
除了量化细菌组分和副产物的毒力之外，还需要有机和无机分子的炎 症潜能的体外筛选，这可允许测定药代动力学参数。
发明内容
本发明提供了一种测定口腔中细菌毒力的方法，所述方法包括提供表 达至少一种toll样受体的报告细胞；提供口腔物质样本；将口腔物质样本和 报告细胞混合；以及测量toll样受体激活。所述方法还可包括以下附加步 骤：由在提供另一口腔物质样本之前使用口腔护理组合物的个体提供另一 口腔物质样本；将另一口腔物质样本和报告细胞混合；测量toll样受体应 答；以及将来自口腔物质样本和另一口腔物质样本的toll样受体应答进行比 较。
一种用于测定脂多糖的毒力的方法包括提供脂多糖；提供表达至少一 个Toll样受体的报告细胞；将报告细胞与脂多糖混合；测量toll样受体激 活；以及量化脂多糖。
一种用于测定脂磷壁酸的毒力的方法包括提供脂磷壁酸；提供表达至 少一个Toll样受体的报告细胞；将报告细胞与脂磷壁酸混合；测量toll样 受体激活；以及量化脂磷壁酸。
本发明包括利用结合、改变或化学改性细菌毒力因子和/或宿主应答机 制的分子、肽和蛋白质/酶改善和/或解决齿龈炎症状态的方法。所述方法提 供量化口腔组织的脂多糖含量的方式；并且利用TLR-4和TLR-2报告细胞 系与检测LPS的组合，所述检测LPS经由荧光测定(诸如BODIPY TR尸 胺)或内毒素检测测定(分配LPS效能和量化LPS的测定)来进行。本发 明还包括能够对消费者和牙科专家传达并展示利用TLR报告细胞的测定和 方案。
本发明包括用于测定脂多糖的效能的方法，所述方法包括：a)提供脂 多糖样本；b)提供表达一种或多种Toll样受体的报告细胞；c)将细胞暴 露于脂多糖样本；d)测量脂多糖对Toll样受体激活的EC50值；e)量化脂 多糖。
本发明还包括从革兰氏阴性菌的生长培养物分离脂多糖。可从生物样 本中分离脂多糖。生物样本包括但不限于口腔菌斑、唾液、齿龈刷样本。 Toll样受体报告基因测定，诸如TLR4-SEAP和/或TLR2-SEA可用于检测 并量化生物样本中的细菌毒素，包括但不限于内毒素。
BODIPY TR尸胺测定可用于检测并量化生物样本中的脂多糖。此外， LAL(鲎变形细胞裂解物测定)测定或内毒素检测测定可用于检测并量化 生物样本中的脂多糖。
本发明可涉及用于测定口腔生物膜的效能的方法，所述方法包括：a) 提供生物膜样本；b)提供表达一种或多种Toll样受体的报告细胞；c)将 细胞暴露于生物膜样本；d)测量Toll样受体的生物膜激活的EC50值；e) 量化脂多糖。生物膜可以为口腔菌斑，包括但不限于龈下菌斑、龈缘或龈 线菌斑、龈上菌斑。
本发明还可涉及用于测定口腔样本中毒力的效能的方法，所述方法包 括：a)提供口腔样本；b)提供表达一种或多种Toll样受体的报告细胞； c)将细胞暴露于口腔样本；d)测量Toll样受体的生物膜激活的EC50值； e)量化脂多糖。口腔样本可包括唾液、口腔灌洗液或齿龈沟液。
附图说明
图1A为示出培养时细菌生长期间的LPS分泌的图。
图1B为示出培养基中细菌生长的时间过程的图。
图1C为示出培养时细菌生长期间的LPS分泌图。
图1D为示出在培养24小时下细菌生长期间的LPS分泌图。苍白普雷 沃菌(P.pallens)和变黑普雷沃菌(P.nigrescens)比牙龈卟啉单胞菌(P gingivalis)释放更多的LPS到培养基中。
图1E为示出在培养24小时下细菌生长期间每个细菌的LPS量的图。 苍白普雷沃菌和变黑普雷沃菌比牙龈卟啉单胞菌包含更多的LPS。
图1F为示出Periopaper采集的齿龈菌斑样本的图片。
图2A为示出来自不同细菌的脂多糖的细胞培养物和毒力测定的图。
图2B为示出培养时TLR4报告基因的激活的图。
图2C为示出培养时TLR4报告基因的激活的图。
图3为示出氟化亚锡抑制TLR4报告基因表达的图。
图4为示出氟化亚锡抑制牙龈卟啉单胞菌激活TLR2报告基因表达的 图。
图5为示出通过氟化亚锡减少牙龈卟啉单胞菌LPS对TLR-4的激活的 百分比的图。
图6为示出激活TLR4-SEAP信号转导的龈下菌斑的EC50测定的图。 来自不健康位点的牙菌斑比来自健康位点的那些具有更小的EC50，这表明 来自不健康位点的牙菌斑包含更多毒力因子。
图7A为示出人龈下菌斑(健康相对于齿龈炎)的TLR4评价的图。
图7B为示出人口腔灌洗液(健康相对于齿龈炎)的TLR4评价的图。 并且
图8A为示出来自不同细菌的LTA的细胞培养和毒力测定的图。
图8B为示出来自不同细菌的LPS的细胞培养和毒力测定的图。
图8C为示出来自不同细菌的LPS的细胞培养和毒力测定的图。
图8D为示出来自不同细菌的LPS的细胞培养和毒力测定的图。
图9为示出测定激活TLR2-SEAP信号转导的龈下菌斑的EC50图。
图10A为示出人龈下菌斑(健康相对于齿龈炎)的TLR2评价的图。
图10B为示出人口腔灌洗液(健康相对于齿龈炎)的TLR2评价的 图。
图11为示出来自不同细菌的鞭毛蛋白的细胞培养和毒力测定的图。
图12A为示出人单核细胞THP-1中的LPS刺激的TLR活性的图。
图12B为示出使用THP-1细胞中的IRF-Luc报告基因评价人口腔灌洗 液(健康相对于齿龈炎)的图。
图12C为示出使用NFkB报告基因评价THP-1细胞中的人龈下菌斑 (健康相对于齿龈炎)的图。
图13为示出在THP1双报告细胞中检测不同细菌的LTA的图。
图14为示出临床测量的图。
图15为示出在六周方案治疗期间龈上菌斑中细菌丰度减小的图。
图16为示出经过六周方案治疗，颊面-刷样本中瓜氨酸浓度的图。
图17为示出治疗期间，颊面刷样本中蛋白质结合鸟氨酸的图。
图18为示出鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸循环中的酶的图表。
图19为示出6周治疗期间鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸基因的表达的图。
图20为示出在实验性齿龈炎中，颊面-刷样本中瓜氨酸浓度增加的 图。
图21为示出在实验诱导的齿龈炎中，颊面刷样本中蛋白质结合瓜氨酸 的图。
图22为示出在实验诱导的齿龈炎中，颊面刷样本中蛋白质结合鸟氨酸 的浓度的图。
图23为示出在实验诱导的齿龈炎中，颊面刷样本中总鸟氨酸的浓度的 图。
图24为示出在实验诱导的齿龈炎中，颊面刷样本中蛋白质结合精氨酸 的浓度的图。
图25为示出在实验诱导的齿龈炎中，颊面刷样本中总精氨酸的浓度的 图。
图26为示出瓜氨酸抑制THP-1细胞中由牙龈卟啉单胞菌LPS 1690刺 激的细胞因子产生的图。
图27为示出细菌LTA以剂量依赖方式降低BC的荧光强度的图。
图28为示出LPS以剂量依赖方式降低BC的荧光强度的图。
图29为示出细菌培养物的上清液以剂量依赖方式降低BC的荧光强度 的图。
图30为示出细菌以剂量依赖方式降低BC的荧光强度的图。
图31为示出EC50值的图。
具体实施方式
如本文所公开的，令人惊奇地发现，一种或多种方法可用于检测并量 化龈下菌斑和龈上菌斑中的毒力，因此区分健康齿龈与患有齿龈炎症状的 发炎位点。齿龈的健康状态可与口腔中存在的细菌毒素(例如内毒素)的 含量直接相关，并且因此如本文所讨论的，这些毒素的减少(如通过筛选 非齿龈工程化细胞来测定)将改善整体口腔健康。另外，个体对毒力因子 的应答方式可利用个体的代谢途径来量化，诸如通过量化尿素循环的产 物。
齿龈炎根据FDA专著(12CFR第356章，第68卷，第103期 (2003))定义为“最常由牙菌斑引发的齿龈的炎性损伤。齿龈炎的特征 在于组织肿胀和发红、点彩(其中健康的齿龈表面由小叶组成的正常状 态)损失、光泽表面和升高的组织温度。齿龈还在温和刺激时，诸如刷牙 时出血，或可自发出血。齿龈炎通常不疼。”在该专著中，菌斑被定义为 由多种细菌物种组成。这些物种对宿主组织实施恒定的炎性压力。
当炎症进展到齿龈炎状态时，需要量化齿龈炎的严重程度以及口腔卫 生产品的治疗在减少炎症应答方面的有效程度。由于齿龈细胞上的膜结合 受体激活引起的炎症应答减少被称为解毒；并且需要测量解毒水平(这是 本领域中缺少的)以教育消费者其口腔卫生的功效。
齿龈炎的发病机制涉及细菌和宿主应答。本发明公开了体外测量牙菌 斑中的毒力因子的方法，并且还公开了体内测量毒力因子对齿龈组织的影 响的方法。这些方法允许理解牙菌斑中存在哪些毒力因子类型，以及宿主 如何应答。重要的是，毒力因子的测量根据牙菌斑中微生物的毒力因子和 宿主健康状况提供了对齿龈炎严重性的详细评估。此外，这些方法有助于 评价技术在预防和治疗齿龈炎方面的效果。
本发明包括一种方法，所述方法包括以下步骤中的一个或多个：(1) 使用内毒素检测试剂盒或BODIPY-TR尸胺法量化存在于生物样本中的总 LPS和LTA并且检测抑制内毒素检测测定的技术；(2)使用Toll样受体 测定来确定经纯化毒力和口腔牙菌斑的效能，并测量中和毒力因子的毒性 的技术的功效；(3)使用元测序来鉴定并量化龈上菌斑中的细菌，(4) 测量齿龈拭子样本中的鸟氨酸和瓜氨酸以确定齿龈组织的健康状况，(5) 测量蛋白质和mRNA含量以确定宿主应答水平，并且测定在抑制LPS诱导 产生促炎细胞因子方面的瓜氨酸活性。
上述方法和化学物质可以条形式施用到牙齿和龈线的外表面。所述条 可包含着色试剂或荧光试剂以与存在的毒力因子相互作用，从而允许半定 量测定存在的毒力。这将允许快速评估齿龈炎和/或牙周炎疾病的严重程度 或确定口服产品的效果。本文所述方法的这种实施允许消费者在家中确定 其牙齿健康的状态或允许专业人员诸如牙医快速测量患者的口腔健康状 态。
上述方法可用于确定有机和无机分子的细胞影响，只要分子与靶受体 之间存在相互作用即可。另外，所述方法可用于确定分子是否可导致刺激 或炎症应答。如本文所述，所讨论的受体将用于报告体系，并且确定所讨 论的分子的分子影响。可使用与生物学应答相关的受体测定所讨论的分子 的EC50值，因此减少或消除了进行动物测试的需要。
除非另外指明，下文中所用的所有百分比和比率均按总组合物的重量 计。除非另外指明，本文提及的所有成分的百分比、比率和含量均基于该 成分的实际含量，并且不包括在市售产品中可与这些成分一起使用的溶 剂、填料或其它物质。
除非另外指明，本文提及的所有测量均在约25℃(即室温)下进行。
如本文所用，词语“包括/包含”及其变体旨在是非限制性的，使得列 表中条目的叙述不排除其它也可能在本发明的材料、组合物、装置和方法 中有用的类似条目。
如本文所用，词语“或”在用作两个或更多个元素的连词时，是指包 括单独的所述元素或所述元素的组合；例如X或Y是指X或Y或二者。
所谓“个人护理组合物”是指在常规使用过程中被施用至身体表面或 与身体表面接触以提供有益效果的产品。身体表面包括皮肤，例如表皮或 粘膜；身体表面还包括与身体表面相关联的结构，例如毛发、牙齿、或指/ 趾甲。个人护理组合物的示例包括被施用于人体以改善外观、清洁、和气 味控制或整体美观的产品。个人护理组合物的非限制性示例包括毛发着色 组合物、口腔护理组合物、剃须后凝胶和霜膏、剃须前制剂、剃刮凝胶、 霜膏或泡沫、保湿剂和洗剂、咳嗽和感冒组合物、免洗型皮肤洗剂和霜 膏、洗发剂、调理剂、沐浴凝胶、条皂、盥洗室条皂、止汗剂、除臭剂、 脱毛剂、口红、粉底、睫毛膏、防晒美黑霜和防晒乳液。
如本文所用，所谓“口腔护理组合物”是指在一般使用过程中不是被 故意吞咽以用于特定治疗剂的全身给药的目的，而是在口腔中保留足够长 的时间以接触牙齿表面或口腔组织的产品。口腔护理组合物的示例包括洁 齿剂、漱口水、摩丝、泡沫、口喷剂、锭剂、咀嚼片、口香糖、牙齿美白 条、牙线及牙线涂层、口气清新可溶解条带、或义齿护理或粘合剂产品。 所述口腔护理组合物还可掺入到条或膜上，用于直接施用或粘附到口腔表 面。
如本文所用，术语“洁齿剂”包括牙齿或龈下糊剂、凝胶、或液体制 剂，除非另外指明。洁齿剂组合物可以是单相组合物，或可以是两种或更 多种单独洁齿剂组合物的组合。洁齿剂组合物可呈任何期望的形式，如深 条纹的、浅条纹的、多层的、糊剂周围有凝胶的、或它们的任意组合。在 包括两种或更多种单独洁齿剂组合物的洁齿剂中，每种洁齿剂组合物均可 被包含于物理上独立的分配器隔室中，并且并排分配。
如本文所用，术语“牙齿”是指自然牙齿以及人造牙齿或假牙。
毒力因子是由致病微生物产生的分子，所述致病微生物对生物体的致 病性有贡献，并使其能够侵入宿主中并在宿主中增殖，并逃避宿主免疫监 视。毒力因子包括但不限于以下：革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞壁组分， 诸如脂多糖和脂磷壁酸、细菌DNA、鞭毛蛋白、肽聚糖、粘附素、侵袭素 和抗吞噬因子、溶血素、细菌代谢物、菌毛、外膜囊泡、细菌蛋白或细菌 酶。基于Toll样受体的活性降低，毒力减少或“解毒”可用于测量各种治 疗物的效果。
如本文所用，术语“解毒”或“去毒”或“排毒”是指中和、减少或 除去微生物毒力因子，如通过受体激活的减少所测量的，已知所述受体与 工程化细胞如报告细胞系中的毒力因子应答。在某些实施方案中，基于 Toll样受体中的一种或多种的激活来指定毒力的测定。
本发明包括获得口腔物质样本。口腔物质可包括龈线菌斑、龈下菌 斑、龈上菌斑、间质菌斑、齿龈沟液(GCF)、齿龈活检、唾液或舌拭 子。口腔物质可通过本领域中已知的任何方法获得，例如，龈下菌斑样本 可通过刮擦或通过使用纸尖来物理收集。菌斑可从牙槽离开牙齿下龈、形 成的牙周炎袋、或在龈线处收集。例如，可将每个纸尖置于牙齿和齿龈之间的袋中10秒。在10秒之后，可移除纸尖并且置于具有700μl磷酸盐缓冲 盐水的预标记的1.5ml管中。可用三个以上的纸尖重复取样程序。在收集全 部四个纸尖之后，将1.5ml管密封，涡旋30秒并置于干冰上直至样本储存 在-80℃冷冻机中。收集的另一种方法可包括有助于从牙齿表面释放菌斑的 机械装置，诸如声波除垢器。口腔物质可在治疗从其中获得口腔物质的口 腔位点之前和之后获得。从其中获得口腔物质的口腔位点包括宿主组织和 细菌物质。口腔位点的进一步治疗可多于一次，并且可包括多次不同的治 疗，例如方案，诸如刷牙之后漱口。除了在完全治疗之前和之后获得口腔 物质之外，口腔物质还可在独立治疗之间获得，例如在刷牙之后利用漱口 水之间获得。
口腔物质样本与报告细胞中的Toll样受体混合。可用于本发明的Toll 样受体的示例包括TLR 2、TLR 4、TLR 5和TLR 9。人TLR cDNA(TLR1、2、3、4和5)首先在1998年被克隆并且其序列被公开(Rock FL,Hardiman G,Timans JC,Kastelein RA,Bazan JF.A familyof human receptors structurally related to Drosophila Toll.Proc Natl Acad SciU S A.1998 年1月20日；95:588-93)。Rock等人发现果蝇Toll和人白细胞介素1受 体的细胞质结构域共享高序列同源性，并且假设两个分子都触发相关信号 通路，这些信号通路与Rel-type转录因子的核移位相关。其克隆了一类假 定人受体，所述假定人受体具有在细胞内区段和细胞外区段均类似于果蝇 Toll的蛋白质结构。他们假设五个人Toll样受体(命名为TLR 1-5)可能是 蝇分子的直接同系物，并且因此可构成人先天免疫的重要且未被识别的组 分。公布了TLR1至TLR5的DNA序列之后不久，也发现了其它TLR DNA序列。例如，在1999年报道了TLR6 cDNA序列(Takeuchi O1, Kawai T,Sanjo H,Copeland NG,Gilbert DJ,Jenkins NA,Takeda K,Akira S.A novel member of an expanding toll-like receptorfamily.Gene.1999年4月29 日；29；231(1-2):59-65)。在2000年报道了人TLR7、TLR8和TLR9的cDNA序列(Chuang TH1,Ulevitch RJ.Cloning and characterization of a sub-family of human toll-like receptors:hTLR7,hTLR8 and hTLR9.Eur CytokineNetw.2000年9月；11(3):372-8)。
SEQ ID NO 序列
1 人Toll样受体1氨基酸序列
2 人Toll样受体2氨基酸序列
3 人Toll样受体3氨基酸序列
4 人Toll样受体4氨基酸序列
5 人Toll样受体5氨基酸序列
6 人Toll样受体6氨基酸序列
7 人Toll样受体7氨基酸序列
8 人Toll样受体8氨基酸序列
9 人Toll样受体9氨基酸序列
本文中示出SEQ ID NO:1至9的氨基酸序列的序列表以名称为 “13837M_AA_Sequence_Listing_ST25”的ASCII本文文件形式与本申请同 时提交。该ASCII文本文件于2016年3月29日创建并且大小为68Kb。根 据MPEP§605.08和37CFR§1.52(e)，该ASCII文本文件的主题以引用 方式并入本文。
TLR蛋白质可形成异源二聚体或同源二聚体。人类中鉴定出10种 TLR基因。其基因产物形成细胞膜中的同源二聚体或异源二聚体。例如， TLR1可与TLR形成异源二聚体。类似地，TLR6还可与TLR2组装异源二 聚体。另一方面，TLR4形成同源二聚体。Toll样受体(TLR)是在先天免 疫体系以及消化体系中起到关键作用的一类蛋白质。它们是跨膜的非催化 性受体，所述受体通常在识别源自微生物的结构保守分子的细胞如巨噬细 胞、枝状体细胞和齿龈上皮细胞中表达。一旦这些微生物破坏了物理屏障 诸如皮肤或肠道粘膜或口腔上皮细胞，其就被激活免疫细胞应答的TLR来 识别。Toll样受体是靶向的，因为它们是由牙菌斑中微生物产生的毒力因 子的主传感器。TLR 1、2、4、5和6在细胞质膜中表达，从而为毒力因子 被宿主受体感测提供了便利途径。TLR 3、7、8和9位于核内体的膜上；并 且随着毒力因子被吞噬入细胞中，其也可获得进入TLR 3、7、8和9的途 径。
报告细胞是指真核细胞，诸如但不限于HEK 293T、人单核细胞 (THP1)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、鼠细胞或猴肾上皮(Vero)细 胞，其被工程化以表达预定数的TLR受体，例如单个TLR受体；这与表达 多个功能性TLR受体的齿龈细胞相反。因此，一种类型的工程化报告细胞 仅响应于牙菌斑中的一种类型的毒力因子。与之相比，齿龈细胞表达多种 类型的功能性TLR，并且不能用于鉴定牙菌斑中的单一类型的毒力因子。 齿龈细胞的排出物是牙菌斑中各种毒力因子的总和。HEK 293T细胞可用作 报告因子，因为其容易维持并且具有与口腔上皮细胞类似的基因表达谱， 使其与齿龈细胞的基因表达更密切匹配，从而使得结果将反映体内结果。 与天然存在的齿龈细胞相反，本发明的报告细胞容易在实验室中保持并且 表型稳定。另外，报告细胞使毒力因子的检测更简单，更加可重复，增加 精确性，提供更高通量、更具特异性并且更可量化。
独立的TLR受体基因稳定转染到HEK 293细胞，如由Invivogen所述 (/PDF/HEK_Blue_htlr4_TDS.pdf)。HEK-BlueTMhTLR4细胞被设计用于通 过监测NF-kB的激活来研究人TLR4(hTLR4)的刺激。HEK-BlueTMhTLR4 细胞通过hTLR4基因、MD-2/CD14辅助受体基因和分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)受体基因共转染到HEK293细胞中来获得。将SEAP报告基因置于与五个NF-kB和AP-1-结合位点融合的IL-12p40最小启动子的控制下 (附件1.表达人TLR4基因的HEK-BlueTMhTLR4细胞SEAP报告293细 胞，目录号hkb-htlr4，版本号15C04-MM(/PDF/HEK_Blue_htlr4_TDS.pdf)。与测量免疫应答相比，本发明的报告 基因允许快速、特异性和可再现的测量毒力因子。
受体激活的水平可以通过本领域已知用于所用报告基因类型的任何方 法来测定。例如如果使用NFkB-SEAP报告基因，则可测量培养基中SEAP 的产生。报告细胞可利用在治疗之前或之后收集的毒力因子或牙菌斑物质 处理。报告基因的表达将受刺激并且当受毒力因子刺激时，SEAP被分泌到 培养基中。报告基因产物SEAP的含量可用商业试剂盒容易地测量，并且 将与特定类型的毒力因子量成比例。类似地，如果使用NFkB荧光素酶、 NFkB-β-内酰胺、或其它报告基因，则可用的试剂盒可用于测量报告基因产 物。
然后可基于参数如EC50和刺激倍数来测定效能。EC50提供了关于引 起炎症应答所需的毒力因子的量的量度，并且刺激的倍数指示毒力因子引 起的炎性应答的严重性。EC50用于测定效能；其中如由Merck Manual所 定义的，“效能”是指如由分级剂量-应答曲线所描绘的，产生50％化学最 大效应所需的化合物浓度(EC50)。当占用和应答之间存在线性关系时， EC50等于Kd(解离常数，其为50％的与所述受体结合的所考虑物质的量 度)。通常，在受体占用和应答之间存在信号放大，这致使应答的EC50大 幅小于(即位于对数剂量-应答曲线横坐标的左边)受体占用的Kd。效能取 决于化合物对其受体的亲和力，以及化合物-受体交互作用与应答相关联的 效率。产生效能所需的化合物的剂量与效能负相关。一般来讲，仅在造成 施用不可行的大剂量化合物的需要时，低效能才是重要的。量子剂量-应答 曲线提供化合物效能信息，所述信息不同于由分级剂量-应答曲线导出的信 息。在量子剂量-应答关系中，EC50为50％个体表现出指定量子效应的剂 量。
在本发明中，内毒素或脂多糖的活性可使用内毒素检测测定或LAL测 定来测量。鲎变形细胞裂解物(LAL)测试已经用于检测LPS。LAL源于 鲎(Limulus polyphemus)的血细胞、或变形细胞。目前，一些主要内毒素 检测试剂源于重组蛋白质。下文中，内毒素检测测定和LAL测定互换使 用。
A.一种测定口腔中细菌毒力的方法，所述方法包括：
a.提供表达至少一种toll样受体的报告细胞；
b.提供口腔物质样本；
c.将口腔物质样本和报告细胞混合；
d.测量toll样受体激活。
B.根据段A所述的方法，其中所述toll样受体为TLR1至TLR9中的 至少一种。
C.根据段A或B所述的方法，其中所述报告细胞表达TLR2或TLR4 中的至少一种。
D.根据段A至C中任一项所述的方法，其中所述toll样受体激活报 告基因，优选地其中所述报告基因为分泌型胚胎碱性磷酸酶 (SEAP)报告基因。
E.根据段A至D中任一项所述的方法，其中所述口腔物质样本为下 列中的至少一种：龈线菌斑、龈下菌斑、龈上菌斑、间质菌斑、 龈沟液(GCF)、齿龈活检、唾液或舌拭子，优选地其中所述口 腔物质样本包含毒力因子，所述毒力因子为下列中的至少一种： 革兰氏阳性细胞壁组分、革兰氏阴性细胞壁组分、细菌DNA、鞭 毛蛋白、肽聚糖、细菌代谢物、菌毛、外膜囊泡细菌蛋白或细菌 酶。
F.根据段E所述的方法，其中所述口腔物质样本包含毒力因子，所 述毒力因子为脂多糖或脂磷壁酸中的至少一种。
G.根据段A至F中任一项所述的方法，所述方法包括以下附加步 骤：
e.由在提供另一口腔物质样本之前使用口腔护理组合物的个体提 供另一口腔物质样本；
f.将另一口腔物质样本和报告细胞混合；
g.测量toll样受体应答；
h.将来自口腔物质样本和另一口腔物质样本的toll样受体应答进 行比较。
H.根据段G所述的方法，其中所述口腔物质样本和另一口腔物质样 本来自同一个体。
I.一种用于测定脂多糖的毒力的方法，所述方法包括：
a.提供脂多糖；
b.提供表达至少一种Toll样受体的报告细胞；
c.将所述报告细胞与脂多糖混合；
d.测量toll样受体激活；
e.量化所述脂多糖。
J.根据段I所述的方法，其中所述Toll样受体激活通过测量EC50或 刺激倍数中的至少一个来测定。
K.根据段I或J所述的方法，其中所述Toll样受体为TLR1至TLR9 中的至少一种。
L.根据段I至K中任一项所述的方法，其中所述报告细胞表达TLR2 或TLR4中的至少一种。
M.根据段I至L中任一项所述的方法，其中所述Toll样受体激活报 告基因。
N.根据段M所述的方法，其中所述报告基因为分泌型胚胎碱性磷酸 酶(SEAP)报告基因。
O.根据段I至N中任一项所述的方法，其中使用鲎变形细胞溶解物 测定或BODIPYTR尸胺测定中的至少一种来量化所述脂多糖。
实施例
实施例1—测定由细菌分泌的脂多糖
细菌的生长：将大肠杆菌ATCC 8739的24小时培养物的1ml等分试 样用于接种250ml带导流板的烧瓶中的100ml Luria-Bertani(LB)液体培养 基。然后在37℃与搅拌(220rpm)下温育该培养基并且以30分钟时间间隔 取样。在SpectraMax盘式分析仪M3(Molecular Devices，Sunnydale， CA)中评估样本的浊度(OD600)，这是监测微生物生长状态和生理状态的 一种方法。然后记录样本浊度并且将样本在室温下以5000RPM离心10min。随后，使用如下文所述的程序，分析下文中被称为“细菌培养物的 上清液”的上清液的LPS含量。
用牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277、苍白普雷沃菌ATCC 700821或变黑 普雷沃菌ATCC25261接种20ml等分试样的MTGE液体培养基(Anaerobe Systems,Morgan Hill,CA)。这些培养物在Whitely A45厌氧工作站(Don Whitley Scientific，Frederick，MD)中在37℃下以85:10:5N2:CO2:H2气体 比率温育过夜。然后，这些起始培养物的1ml等分试样用于接种250ml带 导流板烧瓶中的99ml膜-胰蛋白胨葡萄糖提取物(m-TGE)液体培养基。 然后如先前所述，在搅拌(200rpm)下温育这些培养物，并且以规则的时 间间隔取样。在TecanInfinite m200Pro(Tecan Trading AG，Switzerland) 中评估样本的浊度(OD600)，然后在室温下以16,100×g离心10min。在 分析LPS含量之前，将上清液滗析并通过0.22μM过滤器。
在实验时，仅测量OD600。为了以下实验的一致性，将OD600读数转 换成细菌数，尽管对于每种细菌，OD600读数和细菌数之间的关系不同。 细菌数基于OD600下的分光光度计读数来评价(1.0的OD600＝8×108个细胞 /ml)。
鲎变形细胞裂解物测定(LAL)是测定被测试样本中脂多糖(LPS)的 总量的测定(Pierce LAL显色内毒素量化试剂盒，ThermoFischer Scientific，Waltham，MA)。按照制造商的说明进行所述测定。首先在 37℃下将九十六孔微板在热块中平衡10min。将各自55μl的标准品或样本 分配到微板孔中并且在37℃下将覆盖的板温育5min。然后将50μl LAL加入每个孔中。将所述板轻轻振摇并且在37℃下温育10min。加入100μl的 显色底物并在37℃下温育6min。最后，加入50μl的终止剂，并且在 Spectramax M3盘式分析仪(MolecularDevice，Sunnyvale，CA)上在405- 410nm下测量吸光度。
图1A、1C和1D示出作为其正常生长周期的一部分，微生物脱落LPS 的能力。该数据示出需要将化学物质递送到龈下菌斑以有效减轻LPS，因 为刷牙通常不去除龈下菌斑。
由细菌(大肠杆菌K12)脱落的LPS(如通过LAL试剂盒测量，以每 ml内毒素单位计(EU/ml))如图1A所描绘的。在120分钟左右，生长培 养基开始耗尽复合糖，如以图1B中的细菌生长曲线所应答的，其中LPS脱 落开始下降。该数据给出了认为如果存在食物来源，则成熟的生物膜/菌斑 可向宿主细胞提供恒量LPS的理由。然后LPS可具有从宿主细胞诱导炎性应答的能力。
重要的是，LPS分泌到细菌培养物的上清液中(图1D)。LPS也存在 于细菌壁中(图1E)。另外，该数据还强迫需要将化学物质递送到龈下菌 斑以有效减轻LPS，因为刷牙通常不去除龈下菌斑。
实施例2—量化牙菌斑中的毒力因子的LAL测定
具有至少三个出血位点的七名专门小组成员参加该测试。具有执照的 牙科保健师收集龈下菌斑样本。然后在牙齿/齿龈界面处采集样本(仅颊 面)，小心避免与口腔软组织接触。从每个专门小组成员取样六个龈下菌 斑位点(3个健康位点和3个不健康位点)。不健康牙齿具有出血位点，其 具有大于3mm的袋，并且健康位点未出血且袋深度小于2mm。在取样之 前，指示专门小组成员放弃口腔卫生12小时并且避免进食、口香糖、饮水 (除了小口水)。接着，在取样位点处用刮匙收集专门小组成员的龈缘菌 斑。然后，从相同位点，用3个连续纸尖收集龈下菌斑样本，如图1F所 示。用棉棒分离取样位点并且轻轻吹干。将纸尖(PROFLOW incorporated，Amityville，New York)轻轻置于袋中并持续10秒直至感到 最小阻力。10秒之后，取出纸尖并且置于预标记的1.5ml管中。利用另外2 个纸尖重复相同取样程序(纸尖进入单独管中)。所有专门小组成员的健 康位点的第一、第二和第三样本纸尖分别汇集到三个管中，并分别标记为 纸尖1、2和3。类似地，同样汇集不健康位点的样本。
表1示出不健康牙菌斑比健康牙菌斑包含更多内毒素。将1Ml PBS加 入1.5ml管中的每个汇集样本中。将细菌在MolBio Fast Prep珠磨器(MP Biomedicals，Santa Ana，CA)中裂解。将样本在4℃下以10,000RPM离 心10min，收集上清液并且按照制造商的说明利用LAL测定试剂盒分析， 如实施例1中所述。
Figure GDA0001491126810000171
预期在相同受试者中，在不健康位点中的龈缘菌斑比健康位点中的那 些龈缘菌斑具有更多的内毒素(表1)。随后，利用名称为纸尖1、2和3 的三个纸尖从龈下袋获得三个样本。同样，由纸尖1获得的龈下菌斑在不 健康位点中比健康位点中具有更多内毒素(表1)。对于由纸尖2和3获得 样本同样如此。重要的是，不健康龈下袋中的牙菌斑比健康袋的菌斑具有 更多内毒素。这可解释不健康齿龈趋于在探测时出血的原因。
实施例3—使用LAL测定试剂盒的技术开发
如实施例1中所述，LAL测定被改性用于开发技术，所述技术抑制 LPS在LAL测定中激活酶原。Thermo Scientific Pierce LAL显色内毒素定量 试剂盒是用于检测LPS的定量终点测定，所述LPS在改性的鲎变形细胞裂 解物测定(LAL)中催化酶原的激活。然后激活的酶原从无色底物Ac-Ile- Glu-Ala-Arg-pNA中***对硝基苯胺(pNA)。产物pNA在405-410nm下 光度测量。如果SnF2结合到LPS，则后者不能与LAL试剂盒中的酶原反 应。因此，酶原未激活，并且无色底物Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA将不***并 且不产生有色产物。将牙龈卟啉单胞菌LPS 1690(1ng/ml)或大肠杆菌 (1ng/ml)和氟化亚锡以及如表2中所列的其它物质(50和500μM)溶于 不含内毒素的水中。然后将50μl LAL加入每个孔中。将所述板轻轻振摇并 且在37℃下温育10min。加入100μl的显色底物并在37℃下温育6min。最 后，加入50μl的终止剂，并且在Spectramax M3盘式分析仪(Molecular Device，Sunnyvale，CA)上在405-410nm下测量吸光度。
如表2中所示，SnF2和一些其它化合物抑制LAL测定时的LPS活 性。
Figure GDA0001491126810000181
实施例4—BODIPY-TR-尸胺与LPS结合，并且用氟化亚锡置换结合的LPS
除了LPS的LAL量化之外，BODIPY方法可用于评估LPS含量。解毒 技术能够靶向并中和细菌毒力因子，诸如LPS和LTA。为了开发诸如LPS 和LTA螯合作用技术，使用高通量筛选来鉴定破坏由LPS和LTA和其它 毒力因子对Toll样受体的激活的分子。高通量筛选利用荧光染料BODIPY- TR-尸胺5-(((4-(4,4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-3-基) 苯氧基)乙酰基)氨基)戊胺盐酸盐(BC荧光染料)，购自Life Technologies(Carlsbad，CA)，如先前由Wood、Miller和David(2004)所述的 (Comb Chem HighThroughput Screen，2004年5月；7(3)：239-49。Anti- endotoxin agents.1.Developmentof a fluorescent probe displacement method optimized for the rapididentification of lipopolysaccharide-binding agents)。 在22℃下进行实验。在96孔实心黑色平底板(Corning Incorporated, Corning,NY)的孔中将大肠杆菌LPS(15μg/ml)与pH 7.4的30μl 50mM Tris缓冲液中的SNF2和氯化鲸蜡基吡啶鎓混合10min，然后添加20μl 60μM BC荧光染料，紧接着在22℃或室温下进行荧光测量。在SpectraMax M3自动96孔板分析仪中进行荧光测量(Molecular Device，Sunnyvale， CA)。激发波长为580nM，并且荧光发射在620nM下测量。
如表3中所示，主要的抗齿龈炎技术，诸如氟化亚锡从BODIPY TR尸 胺中置换LPS。
表3由结合到BODIPY TR尸胺置换LPS
Figure GDA0001491126810000191
实施例5—来自不同细菌的脂多糖的细胞培养和毒力测定
报告基因细胞系，人HEK 293T细胞购自Invivogen(San Diego， CA)。HEK 293T细胞用至少两种外源基因，TLR4结构基因和受NFkB转 录因子控制的SEAP报告基因稳定转染。细胞系在本文中命名为TLR4- SEAP。报告基因编码分泌型酶，其被称为胚胎碱性磷酸酶或SEAP。将 SEAP报告基因置于与五个NFkB和AP-1-结合位点融合的干扰素-β最小启 动子的控制下。此外，TLR4-SEAP细胞系还包含CD14辅助受体基因，其 是将LPS转移到TLR4受体所需的。重组体TLR结合其配体，或不同的病 原体结合分子，引发一系列应答，从而导致NFkB和AP1转录因子聚集到 报告基因启动子，这诱导SEAP表达。
细胞培养和处理：在37℃、5％CO2和95％湿度下，在T75烧瓶中， 使500,000个基因报告细胞在包含补充有10％胎牛血清的DMEM培养基的 15ml生长培养基中生长并保持三天。就处理而言，96孔板的孔在100μL生 长培养基中以10,000个细胞/孔接种。在37℃、5％CO2和95％湿度下将所 述细胞温育72小时直至第4天。在第4天，将培养基更换为测定培养基 (90μl)，其是不具有胎牛血清的DMEM培养基。如实施例1中所述，首 先将LPS、细菌和细菌的培养基溶解或与测定培养基混合。将10μl的细 菌、LPS和细菌生长的培养基加入TLR4-SEAP细胞中。24小时后取样，之 后添加LPS、细菌和培养基。利用可商购获得的试剂盒量化报告基因 (SEAP)的表达(Cayman Chemical Co.(Ann Arbor，MI)的SEAP报告 基因测定)。
使用GraphPad Prism软件计算EC50(GraphPad Software，La Jolla， CA)。具有较低EC50的样本比具有较高EC50的那些样本在激活TLR4报 告基因方面更有效。如图2A所示，来自大肠杆菌的LPS比来自牙龈卟啉 单胞菌的LPS具有更低的EC50，因此比牙龈卟啉单胞菌(Pg)更有效。明 尼苏达沙门氏菌(Salmonella Minnesota)LPS不如大肠杆菌那样有效，但 是比牙龈卟啉单胞菌LPS 1690和1435的那些更有效。细菌的每个物种产 生多种形式的LPS。来自相同物种的细菌的每种形式的LPS在刺激TLR4- 下游信号通路方面具有不同效能。例如，Pg 1690LPS比Pg1435/50更有 效。LPS为细胞壁中的组分。同样，当其与宿主血细胞直接接触时，大肠 杆菌细胞壁比牙龈卟啉单胞菌在诱导宿主细胞中产生促炎细胞因子方面更 具毒力。如图2B所示，牙龈卟啉单胞菌比苍白普雷沃菌和变黑普雷沃菌在 刺激TLR4受体基因表达方面具有高得多的EC50，这表明苍白普雷沃菌和 变黑普雷沃菌比牙龈卟啉单胞菌更容易在宿主细胞中促进促炎细胞因子的 产生。
细菌将LPS释放到细菌培养物的上清液中。如图2C所示，在刺激 TLR4报告基因的表达方面，苍白普雷沃菌的上清液具有类似于变黑普雷沃 菌的EC50，但远低于牙龈卟啉单胞菌。同样，那些结果意味着苍白普雷沃 菌和变黑普雷沃菌的产物比牙龈卟啉单胞菌更容易在宿主细胞中促进促炎 细胞因子的产生。
实施例6—开发抑制LPS对刺激经NFkB调节的报告基因表达的作用的技术
氟化亚锡为P&G牙膏产品的主要的抗齿龈炎技术。进行测试以理解氟 化亚锡是否可降低触发宿主细胞中的促炎性应答的能力。在存在或不存在 LPS的情况下，使用如实施例5中所述的相同条件，制备TLR4-SEAP报告 细胞。SEAP的生产也如实施例5所述的进行量化。
图3示出62.5uM至1,000uM的各种浓度下的亚锡对100ng/ml大肠杆 菌LPS的作用，如由TLR-4的激活所报告的。在500uM或更高的亚锡浓度 下，TLR-4的大肠杆菌诱导水平降低。
图4示出62.5uM至1,000uM的各种浓度下的亚锡对牙龈卟啉单胞菌 LPS的作用，如由TLR-2的激活所报告的。在1000uM的亚锡浓度下， TLR-2的牙龈卟啉单胞菌诱导水平降低。
图5中的数据示出通过来自氟化亚锡盐的亚锡离子降低LPS活性。所 述数据示出1.6mM和3.2mM的氟化亚锡减少约50％的牙龈卟啉单胞菌LPS (500ng/ml)对TLP4报告体系的激活(一个星号表示P<0.05，两个星号 表示P<0.01)。
实施例7—在由临床样本激活TLR4-SEAP信号转导时的细胞培养和EC50毒力测定
实施例5中所述的方法在测定不同细菌的LPS效能时是有效的。使用 相同的方法测定临床样本的EC50，如实施例2中所述。如图6所示，来自 不健康位点的牙菌斑比来自健康位点的那些具有更小的EC50，这表明来自 不健康位点的牙菌斑包含更多毒力因子。
实施例5中所述的相同方法用于检查另一研究中的临床样本。进行临 床研究以评估样本收集方法和测量程序。其是受控的不知道检查者的研 究。四十名专家小组成员满足纳入标准，其中为了纳入研究，每位专家小 组成员必须：
·提供书面知情同意来参与研究；
·为18岁或更大；
·同意在该研究过程中不参加任何其它口腔/牙科产品研究；
·同意延迟任何选择性牙科(包括牙病预防)直至研究已经完成；
·同意在治疗阶段期间避免任何形式的非特定口腔卫生，包括但不限 于使用产品，诸如牙线或美白产品；
·同意返回以进行所有定期访问并遵循研究程序；
·必须具有至少16个天然牙齿；
·处于良好的总体健康下，如基于参与研究的健康史/更新的综述，由 研究者/指定人员所确定的。
就不健康组而言(高出血者组)：
·具有至少20个出血位点(关于GBI指数，分数为1或2的位 点)；具有最少3个取样位点，其中出血和袋深度>3mm但不深于 4mm；
·具有最少3个取样位点，但未出血，并且袋深度<2mm
就健康组而言(低出血者组)：
·具有最大3个出血位点(关于GBI指数，分数为1或2的位点)；
·不具有深于2mm的袋。二十(20)名专门小组成员定性为健康-最 高达3个出血位点，并且所有袋的深度小于或等于2mm，并且二十 (20)名专门小组成员定性为不健康-具有大于20个出血位点，其 中至少3个袋大于或等于3mm但不深于4mm并且出血，并且至少 3个袋的深度小于或等于2mm，并且取样时无出血。所有专门小组 成员都具有被确定为“取样位点”的6个位点。“取样位点”具有 在基线处、第2周、和第4周收集的龈上菌斑和龈下菌斑。从预确 定位点中从齿龈沟获取龈下菌斑。在样本收集之前，所述位点具有 利用刮匙移除的龈上菌斑。将所述位点干燥并且用另一牙科刮匙收 集龈下菌斑样本(例如，Gracey 13/14、15/16、11/12、7/8、1/2)。 每个Gracey刮匙被设计成适用于特定区域或牙齿表面。例如，Gracey 13/14被设计成适用于后牙的远端表面。来自每个位点的样 本置于包含300μl的DPBS缓冲液与约50个无菌1mm玻璃珠的预 标记2.0ml无菌管中。将样本储存于4℃。将龈下样本储存于-80℃ 直至分析。将样本在室温下解冻并且以30次振摇/秒在TissueLyser II(Qiagen，Valencia，CA，USA)中分散3min。使用Pierce microBCA蛋白质试剂盒(ThermoFisher Scientific，Grand Island， NY，USA)测量分散的龈下样本的蛋白质浓度。
通过用4ml水冲洗30秒并且然后将口腔内容物吐到离心管中，在清醒 时收集口腔灌洗样本(每个专门小组成员一次)。将这些样本在家中冷冻 直至其被带入冷库中的位置中。在整个研究过程中每个专门小组成员收集 最多至15个样本。提交的唾液样本在-70℃下冷冻。
给予所有专门小组成员以下研究的产品：在用
Figure GDA0001491126810000231
Pro-Health Clinical 护龈牙膏(0.454％氟化亚锡)和
Figure GDA0001491126810000232
Indicator软手动牙刷。专门小组成 员继续其定期口腔卫生习惯，并且从基线开始到四周治疗研究结束不使用 任何新产品。在四周治疗期间，专门小组成员以其习惯方式使用指定的牙 粉和软手动牙刷每天早上和晚上刷牙两次。
以如实施例5所述的程序，将来自上述临床研究的龈下菌斑施用于 TLR4报告细胞。表7A示出从基线开始在利用Crest ProHealth Clinical牙膏 治疗四周内的40名专门小组成员的四周研究的结果。高出血者组的出血位 点中的龈下菌斑样本刺激TLR4报告基因的高表达。样本中的较多毒力引 起TLR4报告基因测定中的较高RLU(相对发光单位)读数。如图7A所 示，高出血者组的基线样本在出血和非出血位点上比低出血者的那些具有更高的RLU。在用
Figure GDA0001491126810000233
Pro-Health Clinical护龈牙膏(0.454％氟化亚锡) 和
Figure GDA0001491126810000234
Indicator软手动牙刷治疗四周后，在高出血者和低出血者组中出 血和非出血位点两者处的毒力在第4周均降低。
以如实施例5所述的程序，将口腔灌洗样本施用于TLR4报告细胞。 如图7B所示，在TLR4-SEAP报告基因测定中评价口腔灌洗(健康相对于 齿龈炎)样本。高出血者组的基线样本比低出血者的那些基线样本具有更 高的RLU。在用
Figure GDA0001491126810000235
Pro-Health Clinical护龈牙膏(0.454％氟化亚锡)和
Figure GDA0001491126810000236
Indicator软手动牙刷治疗四周后，高出血组中的毒力在第4周降 低。
实施例8—来自不同细菌的脂磷壁酸的细胞培养和毒力测定
报告基因细胞系，人HEK 293T细胞购自Invivogen(San Diego， CA)。HEK 293T细胞用至少两种外源基因，TLR2结构基因和受NFkB转 录因子控制的SEAP报告基因稳定转染。细胞系在本文中命名为TLR2- SEAP。报告基因编码分泌型酶，其被称为胚胎碱性磷酸酶或SEAP。将SEAP报告基因置于与五个NFkB和AP-1-结合位点融合的干扰素-β最小启 动子的控制下。另外，在CD14已被鉴定为增强TLR应答的TLR2配体的 辅助受体时，将CD14辅助受体基因转染到表达TLR2的报告基因细胞中。 需要CD14辅助受体以将LTA转移到TLR2受体。重组体TLR2结合其配 体或不同的病原体结合的分子，引发一系列应答，从而导致NFkB和AP1 转录因子聚集到报告基因启动子，这诱导SEAP表达。
细胞培养和处理：在37℃、5％CO2和95％湿度下，在T75烧瓶中， 使500,000个基因报告细胞在包含补充有10％胎牛血清的DMEM培养基的 15ml生长培养基中生长并保持三天。就利用LTA处理而言，96孔板的孔 在100μL生长培养基中以10,000个细胞/孔接种。在37℃、5％CO2和95％ 湿度下将所述细胞温育72小时直至第4天。在第4天，将培养基 (100μL)装入不具有胎牛血清的DMEM培养基中。如实施例7中所述， 加入LTA、LPS和细菌细胞。24小时之后取样，之后添加样本。利用可商 购获得的试剂盒定量报告基因(SEAP)的表达(Cayman Chemical Co. (Ann Arbor，MI)的SEAP报告基因测定)。
如图8A、8B、8C和8D所示，LTA、LPS、细菌和细菌培养物的上清 液可结合到TLR2并且以剂量依赖性方式激活TLR2下游信号通路。如图 8A所示，枯草芽孢杆菌(BS)LTA比海氏肠球菌(Enterococccus hirae) 的效能更大。如图8B所示，牙龈卟啉单胞菌LPS也激活TLR2报告基因的 表达。例如，如图8B所示，Pg1690激活TLR2-SEAP信号转导，并刺激 SEAP产生。如图8B所示，大肠杆菌LPS未激活TLR2-SEAP报告细胞。 还应当注意，苍白普雷沃菌、变黑普雷沃菌和牙龈卟啉单胞菌在刺激TLR2 报告基因的表达时具有相似的EC50(图8C)。然而，从三种不同的细菌 释放的TLR2配体对TLR2报告基因的激活具有非常不同的EC50。
实施例9—在由临床样本激活TLR4-SEAP信号转导时的细胞培养和EC50毒力测定。
实施例8所述的方法在测定不同细菌的LTA和其它TLR2配体的 EC50时是有效的。使用相同的方法测定临床样本的EC50，如实施例2中 所述。如图9所示，来自不健康(出血)位点的牙菌斑比来自健康(未出 血)位点的那些具有更小的EC50，这表明来自不健康位点的牙菌斑包含更 多毒力因子。
使用TLR2-SEAP报告基因测定来检查如实施例7的图7A所述的临床 样本。结果示于图10A中。来自不健康组(高出血者)的不健康(出血) 位点中的龈下样本比其它位点具有更多毒力因子。高出血者组的基线样本 在出血位点和非出血位点上比低出血者的那些具有更高的RLU。在用
Figure GDA0001491126810000251
Pro-Health Clinical护龈牙膏(0.454％氟化亚锡)和
Figure GDA0001491126810000252
Indicator 软手动牙刷治疗四周后，在高出血者和低出血者组中在出血位点处，毒力 在第4周均降低。
使用TLR2-SEAP报告基因测定来检查如实施例7的图7B所述的临床 样本。如图10B所示，评价口腔灌洗物(健康对齿龈炎)。用
Figure GDA0001491126810000253
Pro- Health Clinical护龈牙膏(0.454％氟化亚锡)和
Figure GDA0001491126810000254
Indicator软手动牙 刷治疗四周后，高出血组的毒力在第4周降低。
实施例10—来自不同细菌的鞭毛蛋白的细胞培养和毒力测定
报告基因细胞系，人HEK 293T细胞购自Invivogen(San Diego CA)。HEK 293T细胞用两种外源基因，TLR5结构基因和受NFkB转录因 子控制的SEAP报告基因稳定转染。细胞系被命名为TLR5-NFkB-SEAP。 报告基因编码分泌型酶，其被称为胚胎碱性磷酸酶或SEAP。将SEAP报告 基因置于与五个NFkB和AP-1-结合位点融合的干扰素-β最小启动子的控制 下。重组体TLR5结合其配体，或不同的病原体结合的分子，并且引发一 系列应答，从而导致NFkB和AP1转录因子聚集到报告基因启动子，这诱 导SEAP表达。
细胞培养和处理：在37℃、5％CO2和95％湿度下，在T75烧瓶中， 使500,000个基因报告细胞在补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中生长 并保持三天。就利用鞭毛蛋白处理而言，96孔板的孔在100μL生长培养基 中以10,000个细胞/孔接种。所述细胞在37℃、5％CO2和95％湿度下温育 72小时直至在将细胞接种到96孔板的孔上之后的第4天。在第4天，将培 养基(100μL)装入不具有胎牛血清的DMEM培养基中。以0.97ng至 1μg/ml的浓度范围，添加枯草芽孢杆菌(S.subtilis)和金黄色葡萄球菌(S. Aureus)鞭毛蛋白。在添加鞭毛蛋白之后的6小时和24小时获取样本。利 用可商购获得的试剂盒定量报告基因(SEAP)的表达(Cayman Chemical Co.(Ann Arbor，MI)的SEAP报告基因测定)。
图11示出两种鞭毛蛋白(枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌)均可激活 TLR5下游信号通路。来自枯草芽孢杆菌的鞭毛蛋白以剂量依赖性方式刺激 TLR5-SEAP信号转导。鞭毛蛋白对TLR5的EC50在5小时为0.02ng/ml并 且在23小时为0.014ng/ml。来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 的鞭毛蛋白对TLR5的EC50在5小时为0.0049并且在23小时为0.0019。 来自铜绿假单胞菌的鞭毛蛋白对于刺激TLR5信号通路更有效。
实施例11—细胞培养和来自不同细菌的LPS在THP1双报告细胞中的毒力测定
细菌细胞壁和膜组分由TLR2识别。TLR2识别微生物基序PGN(肽 聚糖)/脂蛋白/dectin和LPS。TLR1和TLR6与TLR2形成异源二聚体并分 别结合三酰化脂蛋白和二酰化脂蛋白。THP1NFkB-SEAP和IRF-LuciaTM报 告单核细胞购自Invivogen，San Diego，CA。THP1-双细胞通过两个诱导型 报告基因构建体的稳定整合源自人THP-1单核细胞系。THP1-双细胞特征 在于Lucia基因在ISG54(干扰素-刺激基因)最小启动子连同五个干扰素- 刺激的应答元件的控制下。THP1-双细胞还表达由IFN-b最小启动子驱动的 SEAP报告基因，所述IFN-b最小启动子融合到NF-kB共有转录应答元件的 五个拷贝和c-Rel结合位点的三个拷贝。因此，THP1-双细胞允许同时通过 监测SEAP的活性研究NFkB途径，和通过评估Lucia的活性研究干扰素调 节因子(IRF)途径(IRF-Luc)。在细胞培养上清液中可容易地测量两种 报告蛋白。该THP-1细胞系具有购自Invivogen的功能性TLR1、TLR2、 TLR4、TLR5、TLR6和TLR8。TLR4感觉来自革兰氏阴性菌的LPS，然而 TLR5识别来自革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两者的细菌鞭毛蛋白，TLR8 检测长单链RNA。
培养和处理：将THP1-双细胞在37℃和5％CO2下在T75烧瓶中在 15ml生长培养基(RPMI 1640与10％加热灭活的胎牛血清)中培养。每隔 3至4天通过将300,000-500,000个细胞/ml接种到具有15ml的新鲜生长培 养基的新鲜T75烧瓶中，使得细胞传递。为测定细菌组分对报告基因表达 的影响，以90μl生长培养基中100,000个细胞接种96孔板中的孔。将10μl 的细胞壁和膜组分，或加热灭活全细菌加入每个孔中。在37℃和5％CO2下培养18小时之后，用可商购获得的测定试剂盒量化分泌型荧光素酶和 SEAP(对于荧光素酶，QUANTI-Luc，Invivogen，San Diego，California； 对于SEAP，SEAP报告基因测定，Cayman ChemicalCo.，Ann Arbor， MI)。
如图12A所示，利用LPS的三种不同制剂处理DHP1-双报告细胞。所 有三种LPS(ng/ml)以剂量依赖性方式激活NFkB-SEAP报告基因的产 生。此外，Pg 1690LPS和大肠杆菌LPS也刺激IRF-荧光素酶报告基因的表 达。在结合到TLR4受体时，TLR4配体激活至少两个信号通路。一种是通 用通路NFkB-SEAP，其可在所有TLR配体结合到其特异性受体时被TLR 配体激活。例如，TLR2配体，LTA，可与TLR2受体结合并激活NFkB- SEAP信号通路。类似地，在结合到TLR4受体时，TLR4配体，LPS，也能 够激活NFkB-SEAP信号转导。如图12A所示，大肠杆菌LPS是比牙龈卟 啉单胞菌1690LPS对激活NFkB-SEAP和IRF-荧光素酶信号转导两者均更 具效能的配体。THP-1细胞产生了多种功能性TLR受体。并且所有TLR受 体可激活NFkB通路，因此促进NFkB-SEAP报告基因的表达。NFkB-SEAP 的阅读是所有TLR受体(诸如TLR2、TLR1、TLR6和TLR4)的集体行 为。来自不同细菌的所有LPS均刺激NFkB-SEAP报告基因。另一方面，IRF-荧光素酶报告基因受有限数的TLR受体，主要是TLR3、TLR4、 TLR7、TLR8和TLR9驱动。牙龈卟啉单胞菌LPS 1690和大肠杆菌LPS以 剂量依赖性方式刺激IRF-荧光素酶的表达。
THP-1报告细胞用于检查临床样本，如对于实施例7的图7B所述。如 图12B所示，使用THP-1细胞中的IRF-Luc报告基因评价口腔灌洗物(健 康对齿龈炎)。用
Figure GDA0001491126810000271
Pro-Health Clinical护龈牙膏(0.454％氟化亚锡) 和
Figure GDA0001491126810000272
Indicator软手动牙刷治疗四周后，高出血组或低出血组两者中的 毒力均在第4周降低。
THP-1报告细胞用于检查临床样本，如对于实施例7的图7A所述。如 图12C所示，使用THP-1细胞中的NFkB报告基因检查龈下菌斑(健康对 齿龈炎)。高出血者组的基线样本比低出血者的那些基线样本具有更高的 RLU。用
Figure GDA0001491126810000273
Pro-Health Clinical护龈牙膏(0.454％氟化亚锡)和
Figure GDA0001491126810000274
Indicator软手动牙刷治疗四周后，高出血组或低出血组两者的出血位点中的 毒力在第4周均降低。
实施例12—细胞培养和来自不同细菌和生物膜的LTA在THP1双报告细胞中的毒力 测定
THP1双报告细胞还表达TLR2、TLR1和TLR6受体。细菌细胞壁和一 些膜组分由TLR2、TLR1和TLR6识别。TLR2识别微生物基序PGN(肽 聚糖)/脂蛋白/dectin和LPS。为确定来自不同细菌的LTA是否对刺激 NFkB-SEAP报告基因在THP1双报告细胞中表达具有不同作用，以与实施 例11所述的相同程序制备并处理细胞。如图13所示，来自枯草芽孢杆菌 和金黄色葡萄球菌两者的LTA促进报告基因在THP1双报告细胞中表达方 面具有相似效能。
实施例13—区分来自人原齿龈上皮细胞中不同细菌的细菌组分
原人齿龈上皮细胞购自Zen-bio(Research Triangle Park，NC)，并且 在37℃下在5％CO2气氛下保持在T75烧瓶中的15ml生长培养基中(补充 有CellnTec生长添加剂的CellnTec培养基中，购自CellnTec Advanced Cell Systems AG，Bern，Switzerland)。在实验进行到24h、48h和72h时间点 时，并且在测定培养基、单独的CellnTec培养基或添加剂的情况下，在 37℃下在5％CO2气氛下，在100μl的CELLnTEC生长培养基中，以7,500 个细胞/孔接种六个96孔板。将生长培养基更换为测定培养基，然后立即添 加LPS或细菌DNA。例如，如果测定培养基为不具有添加剂的CellnTec培 养基，则在每个孔中添加100μl的CellnTec培养基但不加入添加剂。如果 测定培养基为生长培养基，则将100μl的生长培养基加入每个孔中。将牙龈 卟啉单胞菌LPS和细菌DNA加入细胞中。在24h、48h和72h时，收集培 养基用于分析。根据制造商的说明书，使用得自Meso Scale Discovery (Rockville,MD)的Elisa试剂盒测量细胞因子。
如表4中所示，用牙龈卟啉单胞菌DNA以0、0.3、1和2μg/ml处理人 原齿龈上皮细胞。该培养基在处理之后的24小时和48小时收集，并且使 用得自Meso Scale Discovery的ELISA试剂盒分析六个促炎细胞因子(干扰 素-γ、IL-1β、IL-2、IL-10、IL-12p70和TNF-α)。如表4所示，干扰素-γ、 IL-1β、IL-2、IL-10、IL-12p70和TNF-α的表达低或几乎不可检测(每个值 是一个实验中三次重复测量的平均值)。它们不是区分细菌DNA的活生物 标志物。表4中的结果示出缺乏来自人齿龈上皮细胞的炎性应答，因此展 示需要使用工程化细胞。
表4：对于用牙龈卟啉单胞菌DNA处理的炎性标志物筛选人齿龈上皮细胞
Figure GDA0001491126810000291
以上述程序，利用牙龈卟啉单胞菌LPS以0、0.3、1和2μg/ml用处理 人原齿龈上皮细胞。如表5所示，同样干扰素-γ、IL-1β、IL-2、IL-10、IL- 12p70和TNF-α的表达低或几乎不可检测。它们不是区分原人齿龈上皮细 胞中的细菌LPS的活生物标志物。表5中的结果还示出人齿龈细胞对用于 测定的细菌毒力因子不够敏感的原因，因此需要利用能够展示对毒力因子 的剂量依赖性应答的细胞系。
表5：对于用牙龈卟啉单胞菌LPS处理的炎性标志物筛选人齿龈上皮细胞
在利用牙龈卟啉单胞菌LPS处理的原人齿龈上皮细胞中产生细胞因子(pg/ml)
Figure GDA0001491126810000292
Figure GDA0001491126810000301
实施例14—在六周齿龈炎治疗中，富含齿龈炎的细菌的丰度减少
由69名专门小组成员进行了随机的两组临床研究(35名在阴性对照组 中，并且34名在测试方案组中)。专门小组成员平均年龄为39岁，范围 从20岁至69岁，并且46％的专门小组成员是女性。使治疗组良好平衡， 因为对于齿龈出血指数(GBI)(平均值＝29.957并且至少20个出血位点) 和改性齿龈指数(MGI)(平均值＝2.086)而言，人口统计特征(年龄、种族、性别)或者起始测量值没有统计学上的显著(p≥0.395)差异。所有六 十九个专门小组成员均参加每次访问并完成治疗过程。经过6周时间段比 较以下治疗组：
测试方案：
Figure GDA0001491126810000302
Pro-Health Clinical菌斑控制(0.454％氟化亚锡)牙 粉、具有精准清洁型刷头的
Figure GDA0001491126810000303
专业护理1000和
Figure GDA0001491126810000304
Pro-Health清新 爽洁薄荷(0.07％CPC)漱口水。对照方案：
Figure GDA0001491126810000305
口腔保护(0.243％氟化 钠)牙粉和
Figure GDA0001491126810000306
Indicator软手动牙刷。
如实施例2中所述，在临床研究时从测试方案中的相同专门小组成员 收集牙菌斑。用无菌刮匙从每个小组成员的牙齿/齿龈界面处获取龈上样 本，小心避免与口腔软组织接触。菌斑从所有可用天然牙齿(仅上牙弓) 中取样，直至菌斑不可见。在取样之后，将菌斑样本置于预标记的(专门 小组成员ID、样本缩写、访问和日期)具有1ml的PBS/甘油缓冲液和约 50个无菌1mm玻璃珠的Eppendorf管中，储存在冰上直至收集所有样本。 然后将样本转移到-70℃冷冻机用于储存直至进一步加工。根据制造商的说 明，使用
Figure GDA0001491126810000307
基因组DNA试剂盒(Qiagen，Germany)从龈上菌斑样 本分离基因组DNA。在BGI AmericasCorporation(Cambridge，MA)进行 元测序。在Global Biotech，Procter&Gamble Company(Mason，Ohio)分 析所有数据。
临床测量：与对照方案相比，在第1周、第3周和第6周，测试方案 中的出血位点(GBI)显著减少(图14)。类似地，测试方案中的炎症 (MGI)等级也降低(图14)。
对测试方案中的龈上菌斑的基因组DNA进行测序。如图15所示，龈 上菌斑中特定细菌的丰度在六周治疗中改变。在第1周和第3周，某些细 菌，诸如卟啉单胞菌属口腔类279和苍白普雷沃菌减少(图15)。在治疗 的四个时间段内对每种细菌物种的量作图。在六周治疗期间，某些细菌诸 如口炎消化链球菌和中间普雷沃菌的量减少，如图15所示。
实施例15—在6周治疗期间，随着齿龈炎症状减轻，细胞因子、趋化因子和其它生 物活性蛋白质的产生减少
在与实施例14所述的相同临床研究中，从与实施例14相同的专门小 组成员收集齿龈-刷样本。在取样之前，专门小组成员用水漱口30秒。然后 牙科卫生员用颊面拭子刷(Epicentre Biotechnologies目录号MB100SP)对 龈线正上方的区域取样。将拭子立即置于1.5ml Eppendorf管的1ml提取缓 冲液[PBS，0.25M NaCl，1X HaltTM蛋白酶抑制剂一次性混合物 (Lifetechnologies，Grand Island，NY)]中涡旋30秒，并在干冰上立即冷 冻并储存在-80C冷冻机中直至分析。从冷冻机中取出样本、解冻并通过在 4℃下将样本置于试管振荡器上30分钟进行提取。所述管在Eppendorf离心 机5417R(Eppendorf，Ontario，Canada)中以15000RPM离心10min，以 将任何碎屑制成粒料。使用Bio-Rad蛋白质测定(BioRad，Hercules， CA)分析提取物(800μl)的蛋白质浓度。
使用V-PLEX人生物标志物40-Plex试剂盒(Meso Scale Diagnostics Rockville，Maryland)测量齿龈样本中的四十种蛋白质。按照制造商的说明 进行所述测定。
在齿龈样本中测量的蛋白质中，促炎组1(人)、细胞因子组1 (人)、趋化因子组1(人)、血管新生组1(人)、和血管损伤组2 (人)中的大部分蛋白质在6周治疗期间在其丰度方面显著变化(表6)。 那些包括FN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、TNF-α、GM-CSF、IL-5、IL-16、IL-7、IL-12/IL-23p40、IL-1α、 VEGF-A、IL-17A、IL-15、TNF-β、IL-8(HA)、MCP-1、MCP-4、嗜酸性粒 细胞趋化因子、IP-10、MDC、嗜酸性粒细胞趋化因子-3、TARC、MIP- 1α、MIP-1β、VEGF-C、VEGF-D、Tie-2、Flt-1/VEGFR1、PlGF、FGF(碱 性)、SAA、CRP、VCAM-1、和ICAM-1。
表6：齿龈-刷样本中蛋白质丰度的变化
Figure GDA0001491126810000321
实施例16—鉴定齿龈样本中的一百七十种代谢物
将与实施例15中所述的相同齿龈-刷样本用于代谢组学分析。十四名 专门小组成员随机选自每个治疗组以确定在治疗的前3周期间齿龈样本中 的任何代谢物浓度是否变化。将基线和第3周样本均送至Metabolon,Inc. (Durham，NC)用于代谢组学测量。鉴定并量化170种代谢物。如表7中 所示，在前3周治疗期间一些代谢物浓度变化。在治疗方案组中在三周治 疗后，齿龈样本中的瓜氨酸浓度降低。类似地，在三周治疗后，治疗方案 组中的鸟氨酸也减少。瓜氨酸和鸟氨酸的减少可能与齿龈炎的减轻相关。
表7：在基线和齿龈炎治疗期间的第3周之间齿龈刷样本中的代谢物的比较结果
Figure GDA0001491126810000331
实施例17—在6周内方案治疗中的瓜氨酸减少
齿龈-刷样本提取物中的瓜氨酸和鸟氨酸的量化使用梯度亲水性相互作 用液相色谱与串联质谱(HILIC/MS/MS)进行。从与实施例14中所述临床 研究相同的人专门小组成员获得齿龈-刷样本，然后将其置于如实施例15所 述的提取缓冲液中。上清液经历HILIC/MS/MS和BCA分析两者。就游离 的瓜氨酸和鸟氨酸分析而言，将齿龈-刷样本的提取物直接(50μl未稀释样 本溶液)在50/50乙腈/超纯水与0.754％甲酸中分析或稀释五倍分析。就总瓜氨酸和鸟氨酸分析而言，将齿龈-刷样本的提取物首先使用6N HCl (50μL的提取物与450μL的6N HCl)水解，不振摇，并置于110℃下的热 板上16小时。然后在室温下在真空中干燥水解样本(Savant speedvac of Lifetechnology，Grand Island，NY)，然后在1ml的稀释溶液(50/50乙腈/ 超纯水与0.754％甲酸)中重构用于分析。标准品和样本使用亲水梯度性相互作用液相色谱与串联质谱(HILIC/MS/MS)进行分析。使用表8所示的 选择的反应监测方案，通过电喷雾电离(ESI)以正离子模式来监测分析物 和对应ISTD(稳定同位素标记的内标)。通过给信号绘图构建标准曲线， 本文将其定义为每个标准品与对应标准品的每个分析物质量的峰面积比率 (峰面积分析物/峰面积ISTD)。然后使用生成的回归公式返算在校准基准 和齿龈-刷提取样本中的每个分析物质量。作为分别从总瓜氨酸或鸟氨酸的 浓度中减去游离瓜氨酸或鸟氨酸的浓度的结果，来计算蛋白质结合的瓜氨 酸或鸟氨酸的浓度。所述结果记录为瓜氨酸或鸟氨酸的浓度，或者结果通 过除以瓜氨酸或鸟氨酸的量乘以存在于提取物的总蛋白量来标准化。
表8：分析物及其对应的稳定同位素标记的内标的多反应监测(MRM)转换
分析物 MRM 内标 MRM
瓜氨酸 176→159 d<sub>7</sub>-瓜氨酸 181→164
鸟氨酸 133→70 d<sub>6</sub>-鸟氨酸 139→76
分析来自测试方案的所有专门小组成员的所有样本[
Figure GDA0001491126810000341
Pro-HealthClinical菌斑控制(0.454％氟化亚锡)牙粉、具有精准清洁型刷头的Oral-
Figure GDA0001491126810000342
专业护理1000和
Figure GDA0001491126810000343
Pro-Health清新爽洁薄荷(0.07％CPC)漱口 水]。如图16所述，在治疗的第一周瓜氨酸含量快速减少，并且然后在治疗 的第3周和第6周持续梯度下降。这些结果与临床观察结果一致，其中齿 龈出血位点(GBI)和齿龈炎症(MGI)在6周治疗阶段内减少。
实施例18—经过6周治疗包含鸟氨酸的蛋白质含量减少
使用如实施例17中所述的程序分析与实施例17所述相同的样本。治 疗齿龈炎并持续6周。基线(BL)代表疾病状态。从第1周至第6周治 疗，齿龈炎的症状减轻。如图17所示，齿龈炎中的蛋白质结合鸟氨酸(总 鸟氨酸和游离鸟氨酸之间的差)较高。随着齿龈炎的严重性下降，蛋白质 结合鸟氨酸逐渐减少。
实施例19-在6周治疗期间齿龈样本中的鸟氨酸-瓜氨酸-精氨酸循环中的酶表达 变化
如实施例15所述，从与实施例15相同的专门小组成员收集齿龈样 本，并在测试方案[
Figure GDA0001491126810000351
Pro-Health Clinical菌斑控制(0.454％氟化亚锡) 牙粉、具有精准清洁型刷头的
Figure GDA0001491126810000352
专业护理1000和
Figure GDA0001491126810000353
Pro-Health清 新爽洁薄荷(0.07％CPC)漱口水]和对照方案[
Figure GDA0001491126810000354
口腔保护(0.243％氟 化钠)牙粉和
Figure GDA0001491126810000355
Indicator软手动牙刷]情况下，将其用于检查在6周 治疗期间的基因表达。
收集样本后，将刷完全浸入RNAlater溶液(1.5ml Eppendorf管中的 1ml)，以避免RNA在运输和储存期间降解(Qiagen，Valencia，CA)。 将微量离心管涡旋/混合30秒，立即在干冰上冷冻，储存并从干冰上转移到 实验室用于生物标志物分析。RNA分析和微阵列分析如先前在出版物中所 述(Offenbacher S、Barros SP、Paquette DW、Winston JL、Biesbrock AR、 Thomason RG、Gibb RD、Fulmer AW、Tiesman JP、Juhlin KD、Wang SL、Reichling TD、Chen KS、Ho B.J Periodontol.2009年12月；80(12)： 1963-82.doi：10.1902/jop.2009.080645.Gingival transcriptome patterns during induction andresolution of experimental gingivitis in humans)。
鸟氨酸-瓜氨酸-精氨酸循环由四种酶组成(图18)。循环的主要特征 在于三种氨基酸(精氨酸、鸟氨酸、和瓜氨酸)可彼此转换。第一酶为鸟 氨酸转氨甲酰基酶，其将氨甲酰基基团从氨甲酰基磷酸酯转移到鸟氨酸以 产生瓜氨酸。该反应在线粒体的基质中发生。鸟氨酸转氨甲酰基酶的表达 在治疗时减少(图19)。第二酶为精氨酸代琥珀酸合成酶。该酶使用ATP 以通过形成瓜氨酰基-AMP中间体来激活瓜氨酸，其被天冬氨酸残基的氨基 基团攻击以产生精氨酸代琥珀酸酯。这个反应和后续两个应答在胞质溶胶 中发生。同样，精氨酸代琥珀酸合成酶的表达在治疗期间减少。第三酶为 精氨酸代琥珀酸裂合酶，其催化精氨酸代琥珀酸酯裂解成富马酸和精氨 酸。最后的酶为精氨酸酶。精氨酸酶裂解精氨酸以产生尿素和鸟氨酸。与 鸟氨酸转氨甲酰基酶和精氨酸代琥珀酸合成酶基因的表达减少相比，精氨酸酶I和II增加(图19)。
精氨酸也是一氧化氮合酶的底物，其氧化精氨酸以产生瓜氨酸和一氧 化氮。一氧化氮合酶基因的表达也增加(图19)。
实施例20—在实验齿龈炎中齿龈样本中的瓜氨酸增加
实验齿龈炎：进行另一临床研究以确定健康人专门小组成员中的实验 诱导性齿龈炎中的瓜氨酸是否增加。这是招募了60名专门小组成员的病例 对照研究。研究群包括以下两组：组1或高出血者组，具有至少20个出血 位点的三十(30)名专门小组成员，其中出血是基线处的GBI现场得分为 1或2。组2或低出血者组，具有至少2个或更少个出血位点的三十(30) 名专门小组成员，其中出血是GBI现场得分为1或2。
研究由两个阶段组成：具有牙疾病预防、抛光和严格的口腔卫生的健 康/严格卫生阶段；和不具有口腔卫生的诱导性齿龈炎阶段。在筛选访问 时，专门小组成员进行口腔软组织评估，并具有齿龈炎评价(改性的齿龈 指数(MGI)和齿龈出血指数(GBI))。在访问时，2名具有资格的专门 小组成员接受口腔软组织检查之后接受齿龈炎评价，并收集齿龈菌斑和齿 龈拭子以进行qPCR、蛋白质和RNA宿主生物标志物分析。在此之后，所 有专门小组成员接受牙疾病预防，并进入健康/严格卫生阶段，持续两周。 在严格的卫生两周之后，专门小组成员进行诱导性齿龈炎阶段，持续三 周。重新评价口腔软组织检查和齿龈炎，并且在基线、第0周和第2周收 集所有样本(齿龈拭子)。
齿龈样本收集—使用如实施例15所述的程序从上牙弓的每一侧收集齿 龈拭子。仅从颊面位点接近龈线(优选从四个相邻的牙齿-优选地从前磨牙 和磨牙区域)收集齿龈拭子。专门小组成员用15ml的Listerine漱口水漱口 30秒以清洁取样区域的表面。在Listerine漱口水之后，专门小组成员利用 20ml水冲洗30秒。之后，用棉棒分离所选位点并且用空气注射器温和干 燥，并从靠近所选牙齿的龈线的齿龈区域用收集刷/拭子获取两个齿龈拭 子。将样本置于预标记的(专门小组成员ID、样本ID、访问和日期) 1.5ml微离心管中，所述微离心管包含800ul DPBS(Dulbecco的磷酸盐缓 冲盐水)(Lifetechnologies，Grand Island，NY)与蛋白酶抑制剂，包括 AEBSF(4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐)2mM、抑肽酶0.3μM、苯丁抑制 素130μM、EDTA(乙二胺四乙酸)1mM、E-64 1μM和亮抑酶肽1μM。将 小瓶涡旋/混合30秒，立即在干冰上冷冻，储存并从干冰上转移到实验室用 于生物标志物分析。使用实施例17中所述的程序分析来自三次访问的样 本，并且示于图20中。那三次访问为基线、第0周(正好在健康/严格卫生 阶段之后和在诱导性齿龈炎阶段之前)和第2周(在诱导性齿龈炎阶段结 束时)。在基线和第0周时，高出血者组和低出血者组两者中的游离瓜氨 酸水平均较低，但在第2周时两组中的诱导性齿龈炎均迅速上升。
实施例21—实验诱导性齿龈炎中的包含瓜氨酸的蛋白质含量减少
使用如实施例17中所述的相同程序。样本与实施例20中所述相同。 在高出血者组和低出血者组中，齿龈组织中的蛋白质结合瓜氨酸在基线处 比在第0周时更低，如图21所示。在第2周时两个组中的实验性齿龈炎较 低。
实施例22—在实验齿龈炎中齿龈样本的包含鸟氨酸的蛋白质含量增加
使用实施例17中所述的程序分析来自实验齿龈炎(实施例20)的相 同临床样本。在两组中结合的鸟氨酸在第0周均最低(图22)。其在基线 处的含量高于在第0周时的那些。当在第2周时在两组中诱导齿龈炎时， 结合的鸟氨酸达到峰值。另外，值得注意的是在两个组中在诱导性齿龈炎 中总鸟氨酸(游离的和蛋白结合的鸟氨酸)增加(图23)。
实施例23—在实验诱导性齿龈炎中齿龈样本中的包含精氨酸的蛋白质含量减小
使用如实施例17所述的相同程序。样本与实施例20中所述相同。在 两组中在诱导性齿龈炎中，蛋白质结合的精氨酸均最低(图24)。在两组 中，其含量在第0周时比在基线处更高。齿龈刷样本中的总精氨酸显示与 蛋白结合的精氨酸相同的模式(图25)。
实施例24—瓜氨酸抑制LPS刺激人THP-1细胞中促炎性细胞因子的产生
瓜氨酸购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。THP1-DualTM细胞购自 Invivogen(SanDiego，California)。按照制造商的说明培养细胞，如实施 例11所述。就治疗而言，首先将0.3mM至9mM的瓜氨酸加入培养基中。 然后，在60分钟后加入300ng/ml牙龈卟啉单胞菌LPS1690。在治疗24小 时之后，收集培养基并使用9-plex试剂盒(Meso Scale DiagnosticsRockville，Maryland)分析细胞因子产生。
牙龈卟啉单胞菌LPS 1690刺激细胞因子产生，如图26中所示。瓜氨 酸以剂量依赖性方式抑制牙龈卟啉单胞菌LPS 1690对促炎性细胞因子产生 的作用。那些细胞因子包括IL-6、TNF-α、IL-12p70、IL-10、IL-2、IFN-r 和IL-1β。
实施例25—BODIPY-TR-尸胺与细菌及其产物的结合
细菌及其产物可激活TLR2和TLR4报告基因，如实施例5和8所述。 本文中，以如实施例4所述的程序，进行实验以确定不同的细菌及其产物 在降低BODIPY-TR-尸胺的荧光强度(下文称为BC)方面是否具有不同的 IC50。简而言之，高通量筛选利用荧光染料BODIPY-TR-尸胺5-(((4-(4,4-二 氟-5-(2-噻吩基)-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-3-基)苯氧基)乙酰基)氨基)戊 胺盐酸盐(BC荧光染料)，购自Life Technologies(Carlsbad，CA)，如先前由Wood、Miller和David(2004)所述的(Comb Chem High Throughput Screen，2004年5月；7(3)：239-49。Anti-endotoxin agents.1.Development of a fluorescent probedisplacement method optimized for the rapid identification oflipopolysaccharide-binding agents)。所述实验在室 温下进行。在96孔实心黑色平底板(Corning Incorporated,Corning,NY)的 孔中将大肠杆菌LPS(15μg/ml)与pH 7.4下的30μl的50mM Tris缓冲液 中的SnF2和氯化鲸蜡基吡啶鎓混合并持续10min，然后添加20μl的60μM BC荧光染料，紧接着在21℃或室温下进行荧光测量。在SpectraMax M3自 动96孔板分析仪中进行荧光测量(Molecular Device，Sunnyvale，CA)。 激发波长为580nM，并且荧光发射在620nM下测量。半最大抑制浓度 (IC50)是细菌产物抑制BC发射荧光的有效性的量度。其通过使用 GraphPad Prism软件(GraphPad Software，La Jolla，CA)指示抑制一半BC 荧光所需的细菌物质量。如图27和28所示，每种细菌产物以剂量依赖方 式降低BC的荧光强度。类似地，全细菌细胞和细菌生长的上清液也以剂量 依赖性方式减少BC的荧光(图29和30)。
实施例26—测定细菌毒力
细菌的生长：在37℃和以200rpm振摇下，在胰蛋白酶大豆肉汤培养 基(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中培养两种细菌，细菌A和细菌B。 在24小时时收获细菌并且将其悬浮于0.5ml磷酸盐缓冲盐水中，标记为 “存活”。将一半的“存活”细菌转移到1.5ml微管中，并加热至80℃且 持续30分钟。将热处理的细菌标记为“加热灭活”或“死亡”。
测量THP-1基因报告细胞中的TLR应答(NFkB-SEAP)：将存活细 菌和加热灭活细菌施用于THP-1细胞中，如实施例11所述。如图31所 示，测定细菌A和B对THP-1细胞中NFkB-SEAP报告基因的激活的 EC50。存活细菌和加热灭活(死亡)细菌两者均刺激NFkB-SEAP报告基 因的表达。细菌B比细菌A在激活NFkB-SEAP报告基因的表达方面具有 更低的EC50。
细胞因子产生和测量：人外周血单核细胞(hPBMC)作为白细胞去除 血购自AllCells公司(All Cells，Alameda，CA)。将白细胞去除血与等量 的补充有9.1％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM+glutaGRO (Thermo Fisher，Waltham，MA)混合。通过收集离心的Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)缓冲液密度梯度的血沉棕黄层，从血液和培养基的1:1混合物中分离hPBMC。将细胞(200,000个细胞)在补充有 9.1％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的200μl DMEM+glutaGRO中培养，并 用存活细菌和加热灭活细菌(6,250,000个菌落形成单位)进行处理。在添 加细菌之后在24小时收获培养基，并且按照制造商的说明(Meso Scale Diagnostics，Rockville，Maryland)在试剂盒中分析促炎性细胞因子。
如表9所示，两种存活细菌A和B刺激hPBMC中的细胞因子的产 生。细菌B比细菌A在促进hPBMC中的IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL- 1β、IL-6、IL-8和TNF-α产生方面更有效。
Figure GDA0001491126810000391
Figure GDA0001491126810000401
本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相 反，除非另外指明，否则每个这样的量纲旨在表示所述值以及围绕该值功 能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。
除非明确排除或以其他方式限制，本文中引用的每一篇文献，包括任 何交叉引用或相关专利或专利申请以及本申请对其要求优先权或其有益效 果的任何专利申请或专利，均据此全文以引用方式并入本文。任何文献的 引用不是对其相对于任何本发明所公开的或本文受权利要求书保护的现有 技术的认可，或不是对其单独地或以与任何其它参考文献或多个参考文献 的组合提出、建议或公开了任何此类发明的认可。此外，如果此文献中术 语的任何含义或定义与以引用方式并入本文的文献中相同术语的任何含义 或定义相冲突，将以此文献中赋予该术语的含义或定义为准。
虽然已经举例说明和描述了本发明的特定实施方案，但是对于本领域 技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作 出各种其它变化和修改。因此，本文旨在于所附权利要求中涵盖属于本发 明范围内的所有这些变化和修改。
序列表
<110> 宝洁公司(The Procter & Gamble Company)
<120> 口腔微生物毒力因子的检测
<130> 13837M
<160> 9
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 786
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Thr Ser Ile Phe His Phe Ala Ile Ile Phe Met Leu Ile Leu Gln
1 5 10 15
Ile Arg Ile Gln Leu Ser Glu Glu Ser Glu Phe Leu Val Asp Arg Ser
20 25 30
Lys Asn Gly Leu Ile His Val Pro Lys Asp Leu Ser Gln Lys Thr Thr
35 40 45
Ile Leu Asn Ile Ser Gln Asn Tyr Ile Ser Glu Leu Trp Thr Ser Asp
50 55 60
Ile Leu Ser Leu Ser Lys Leu Arg Ile Leu Ile Ile Ser His Asn Arg
65 70 75 80
Ile Gln Tyr Leu Asp Ile Ser Val Phe Lys Phe Asn Gln Glu Leu Glu
85 90 95
Tyr Leu Asp Leu Ser His Asn Lys Leu Val Lys Ile Ser Cys His Pro
100 105 110
Thr Val Asn Leu Lys His Leu Asp Leu Ser Phe Asn Ala Phe Asp Ala
115 120 125
Leu Pro Ile Cys Lys Glu Phe Gly Asn Met Ser Gln Leu Lys Phe Leu
130 135 140
Gly Leu Ser Thr Thr His Leu Glu Lys Ser Ser Val Leu Pro Ile Ala
145 150 155 160
His Leu Asn Ile Ser Lys Val Leu Leu Val Leu Gly Glu Thr Tyr Gly
165 170 175
Glu Lys Glu Asp Pro Glu Gly Leu Gln Asp Phe Asn Thr Glu Ser Leu
180 185 190
His Ile Val Phe Pro Thr Asn Lys Glu Phe His Phe Ile Leu Asp Val
195 200 205
Ser Val Lys Thr Val Ala Asn Leu Glu Leu Ser Asn Ile Lys Cys Val
210 215 220
Leu Glu Asp Asn Lys Cys Ser Tyr Phe Leu Ser Ile Leu Ala Lys Leu
225 230 235 240
Gln Thr Asn Pro Lys Leu Ser Asn Leu Thr Leu Asn Asn Ile Glu Thr
245 250 255
Thr Trp Asn Ser Phe Ile Arg Ile Leu Gln Leu Val Trp His Thr Thr
260 265 270
Val Trp Tyr Phe Ser Ile Ser Asn Val Lys Leu Gln Gly Gln Leu Asp
275 280 285
Phe Arg Asp Phe Asp Tyr Ser Gly Thr Ser Leu Lys Ala Leu Ser Ile
290 295 300
His Gln Val Val Ser Asp Val Phe Gly Phe Pro Gln Ser Tyr Ile Tyr
305 310 315 320
Glu Ile Phe Ser Asn Met Asn Ile Lys Asn Phe Thr Val Ser Gly Thr
325 330 335
Arg Met Val His Met Leu Cys Pro Ser Lys Ile Ser Pro Phe Leu His
340 345 350
Leu Asp Phe Ser Asn Asn Leu Leu Thr Asp Thr Val Phe Glu Asn Cys
355 360 365
Gly His Leu Thr Glu Leu Glu Thr Leu Ile Leu Gln Met Asn Gln Leu
370 375 380
Lys Glu Leu Ser Lys Ile Ala Glu Met Thr Thr Gln Met Lys Ser Leu
385 390 395 400
Gln Gln Leu Asp Ile Ser Gln Asn Ser Val Ser Tyr Asp Glu Lys Lys
405 410 415
Gly Asp Cys Ser Trp Thr Lys Ser Leu Leu Ser Leu Asn Met Ser Ser
420 425 430
Asn Ile Leu Thr Asp Thr Ile Phe Arg Cys Leu Pro Pro Arg Ile Lys
435 440 445
Val Leu Asp Leu His Ser Asn Lys Ile Lys Ser Ile Pro Lys Gln Val
450 455 460
Val Lys Leu Glu Ala Leu Gln Glu Leu Asn Val Ala Phe Asn Ser Leu
465 470 475 480
Thr Asp Leu Pro Gly Cys Gly Ser Phe Ser Ser Leu Ser Val Leu Ile
485 490 495
Ile Asp His Asn Ser Val Ser His Pro Ser Ala Asp Phe Phe Gln Ser
500 505 510
Cys Gln Lys Met Arg Ser Ile Lys Ala Gly Asp Asn Pro Phe Gln Cys
515 520 525
Thr Cys Glu Leu Gly Glu Phe Val Lys Asn Ile Asp Gln Val Ser Ser
530 535 540
Glu Val Leu Glu Gly Trp Pro Asp Ser Tyr Lys Cys Asp Tyr Pro Glu
545 550 555 560
Ser Tyr Arg Gly Thr Leu Leu Lys Asp Phe His Met Ser Glu Leu Ser
565 570 575
Cys Asn Ile Thr Leu Leu Ile Val Thr Ile Val Ala Thr Met Leu Val
580 585 590
Leu Ala Val Thr Val Thr Ser Leu Cys Ser Tyr Leu Asp Leu Pro Trp
595 600 605
Tyr Leu Arg Met Val Cys Gln Trp Thr Gln Thr Arg Arg Arg Ala Arg
610 615 620
Asn Ile Pro Leu Glu Glu Leu Gln Arg Asn Leu Gln Phe His Ala Phe
625 630 635 640
Ile Ser Tyr Ser Gly His Asp Ser Phe Trp Val Lys Asn Glu Leu Leu
645 650 655
Pro Asn Leu Glu Lys Glu Gly Met Gln Ile Cys Leu His Glu Arg Asn
660 665 670
Phe Val Pro Gly Lys Ser Ile Val Glu Asn Ile Ile Thr Cys Ile Glu
675 680 685
Lys Ser Tyr Lys Ser Ile Phe Val Leu Ser Pro Asn Phe Val Gln Ser
690 695 700
Glu Trp Cys His Tyr Glu Leu Tyr Phe Ala His His Asn Leu Phe His
705 710 715 720
Glu Gly Ser Asn Ser Leu Ile Leu Ile Leu Leu Glu Pro Ile Pro Gln
725 730 735
Tyr Ser Ile Pro Ser Ser Tyr His Lys Leu Lys Ser Leu Met Ala Arg
740 745 750
Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Pro Lys Glu Lys Ser Lys Arg Gly Leu Phe
755 760 765
Trp Ala Asn Leu Arg Ala Ala Ile Asn Ile Lys Leu Thr Glu Gln Ala
770 775 780
Lys Lys
785
<210> 2
<211> 784
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Met Pro His Thr Leu Trp Met Val Trp Val Leu Gly Val Ile Ile Ser
1 5 10 15
Leu Ser Lys Glu Glu Ser Ser Asn Gln Ala Ser Leu Ser Cys Asp Arg
20 25 30
Asn Gly Ile Cys Lys Gly Ser Ser Gly Ser Leu Asn Ser Ile Pro Ser
35 40 45
Gly Leu Thr Glu Ala Val Lys Ser Leu Asp Leu Ser Asn Asn Arg Ile
50 55 60
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Thr Phe Thr Lys Ile Gln Arg Lys Asp Phe Ala Gly Leu Thr Phe Leu
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<213> 智人（Homo sapiens）
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<213> 智人（Homo sapiens）
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Gln Phe His Ala Phe Ile Ser Tyr Ser Glu His Asp Ser Ala Trp Val
645 650 655
Lys Ser Glu Leu Val Pro Tyr Leu Glu Lys Glu Asp Ile Gln Ile Cys
660 665 670
Leu His Glu Arg Asn Phe Val Pro Gly Lys Ser Ile Val Glu Asn Ile
675 680 685
Ile Asn Cys Ile Glu Lys Ser Tyr Lys Ser Ile Phe Val Leu Ser Pro
690 695 700
Asn Phe Val Gln Ser Glu Trp Cys His Tyr Glu Leu Tyr Phe Ala His
705 710 715 720
His Asn Leu Phe His Glu Gly Ser Asn Asn Leu Ile Leu Ile Leu Leu
725 730 735
Glu Pro Ile Pro Gln Asn Ser Ile Pro Asn Lys Tyr His Lys Leu Lys
740 745 750
Ala Leu Met Thr Gln Arg Thr Tyr Leu Gln Trp Pro Lys Glu Lys Ser
755 760 765
Lys Arg Gly Leu Phe Trp Ala Asn Ile Arg Ala Ala Phe Asn Met Lys
770 775 780
Leu Thr Leu Val Thr Glu Asn Asn Asp Val Lys Ser
785 790 795
<210> 7
<211> 1049
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
Met Val Phe Pro Met Trp Thr Leu Lys Arg Gln Ile Leu Ile Leu Phe
1 5 10 15
Asn Ile Ile Leu Ile Ser Lys Leu Leu Gly Ala Arg Trp Phe Pro Lys
20 25 30
Thr Leu Pro Cys Asp Val Thr Leu Asp Val Pro Lys Asn His Val Ile
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Val Asp Cys Thr Asp Lys His Leu Thr Glu Ile Pro Gly Gly Ile Pro
50 55 60
Thr Asn Thr Thr Asn Leu Thr Leu Thr Ile Asn His Ile Pro Asp Ile
65 70 75 80
Ser Pro Ala Ser Phe His Arg Leu Asp His Leu Val Glu Ile Asp Phe
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Arg Cys Asn Cys Val Pro Ile Pro Leu Gly Ser Lys Asn Asn Met Cys
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Ile Lys Arg Leu Gln Ile Lys Pro Arg Ser Phe Ser Gly Leu Thr Tyr
115 120 125
Leu Lys Ser Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Gln Leu Leu Glu Ile Pro Gln
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Phe Ser Ile Arg Lys Glu Asn Leu Thr Glu Leu Ala Asn Ile Glu Ile
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Leu Tyr Leu Gly Gln Asn Cys Tyr Tyr Arg Asn Pro Cys Tyr Val Ser
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Tyr Ser Ile Glu Lys Asp Ala Phe Leu Asn Leu Thr Lys Leu Lys Val
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210 215 220
Ser Thr Leu Thr Glu Leu Tyr Leu Tyr Asn Asn Met Ile Ala Lys Ile
225 230 235 240
Gln Glu Asp Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gln Leu Gln Ile Leu Asp Leu
245 250 255
Ser Gly Asn Cys Pro Arg Cys Tyr Asn Ala Pro Phe Pro Cys Ala Pro
260 265 270
Cys Lys Asn Asn Ser Pro Leu Gln Ile Pro Val Asn Ala Phe Asp Ala
275 280 285
Leu Thr Glu Leu Lys Val Leu Arg Leu His Ser Asn Ser Leu Gln His
290 295 300
Val Pro Pro Arg Trp Phe Lys Asn Ile Asn Lys Leu Gln Glu Leu Asp
305 310 315 320
Leu Ser Gln Asn Phe Leu Ala Lys Glu Ile Gly Asp Ala Lys Phe Leu
325 330 335
His Phe Leu Pro Ser Leu Ile Gln Leu Asp Leu Ser Phe Asn Phe Glu
340 345 350
Leu Gln Val Tyr Arg Ala Ser Met Asn Leu Ser Gln Ala Phe Ser Ser
355 360 365
Leu Lys Ser Leu Lys Ile Leu Arg Ile Arg Gly Tyr Val Phe Lys Glu
370 375 380
Leu Lys Ser Phe Asn Leu Ser Pro Leu His Asn Leu Gln Asn Leu Glu
385 390 395 400
Val Leu Asp Leu Gly Thr Asn Phe Ile Lys Ile Ala Asn Leu Ser Met
405 410 415
Phe Lys Gln Phe Lys Arg Leu Lys Val Ile Asp Leu Ser Val Asn Lys
420 425 430
Ile Ser Pro Ser Gly Asp Ser Ser Glu Val Gly Phe Cys Ser Asn Ala
435 440 445
Arg Thr Ser Val Glu Ser Tyr Glu Pro Gln Val Leu Glu Gln Leu His
450 455 460
Tyr Phe Arg Tyr Asp Lys Tyr Ala Arg Ser Cys Arg Phe Lys Asn Lys
465 470 475 480
Glu Ala Ser Phe Met Ser Val Asn Glu Ser Cys Tyr Lys Tyr Gly Gln
485 490 495
Thr Leu Asp Leu Ser Lys Asn Ser Ile Phe Phe Val Lys Ser Ser Asp
500 505 510
Phe Gln His Leu Ser Phe Leu Lys Cys Leu Asn Leu Ser Gly Asn Leu
515 520 525
Ile Ser Gln Thr Leu Asn Gly Ser Glu Phe Gln Pro Leu Ala Glu Leu
530 535 540
Arg Tyr Leu Asp Phe Ser Asn Asn Arg Leu Asp Leu Leu His Ser Thr
545 550 555 560
Ala Phe Glu Glu Leu His Lys Leu Glu Val Leu Asp Ile Ser Ser Asn
565 570 575
Ser His Tyr Phe Gln Ser Glu Gly Ile Thr His Met Leu Asn Phe Thr
580 585 590
Lys Asn Leu Lys Val Leu Gln Lys Leu Met Met Asn Asp Asn Asp Ile
595 600 605
Ser Ser Ser Thr Ser Arg Thr Met Glu Ser Glu Ser Leu Arg Thr Leu
610 615 620
Glu Phe Arg Gly Asn His Leu Asp Val Leu Trp Arg Glu Gly Asp Asn
625 630 635 640
Arg Tyr Leu Gln Leu Phe Lys Asn Leu Leu Lys Leu Glu Glu Leu Asp
645 650 655
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660 665 670
Met Pro Pro Asn Leu Lys Asn Leu Ser Leu Ala Lys Asn Gly Leu Lys
675 680 685
Ser Phe Ser Trp Lys Lys Leu Gln Cys Leu Lys Asn Leu Glu Thr Leu
690 695 700
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705 710 715 720
Cys Ser Arg Ser Leu Lys Asn Leu Ile Leu Lys Asn Asn Gln Ile Arg
725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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820 825 830
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Tyr Gln Arg Leu Ile Ser Pro Asp Cys Cys Tyr Asp Ala Phe Ile Val
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<210> 8
<211> 1041
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
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1 5 10 15
Leu Ile Ser Gly Ser Cys Glu Leu Cys Ala Glu Glu Asn Phe Ser Arg
20 25 30
Ser Tyr Pro Cys Asp Glu Lys Lys Gln Asn Asp Ser Val Ile Ala Glu
35 40 45
Cys Ser Asn Arg Arg Leu Gln Glu Val Pro Gln Thr Val Gly Lys Tyr
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180 185 190
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Arg Lys Leu Phe Leu Ser Asn Thr Gln Ile Lys Tyr Ile Ser Glu Glu
225 230 235 240
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245 250 255
Cys Pro Arg Cys Phe Asn Ala Pro Phe Pro Cys Val Pro Cys Asp Gly
260 265 270
Gly Ala Ser Ile Asn Ile Asp Arg Phe Ala Phe Gln Asn Leu Thr Gln
275 280 285
Leu Arg Tyr Leu Asn Leu Ser Ser Thr Ser Leu Arg Lys Ile Asn Ala
290 295 300
Ala Trp Phe Lys Asn Met Pro His Leu Lys Val Leu Asp Leu Glu Phe
305 310 315 320
Asn Tyr Leu Val Gly Glu Ile Ala Ser Gly Ala Phe Leu Thr Met Leu
325 330 335
Pro Arg Leu Glu Ile Leu Asp Leu Ser Phe Asn Tyr Ile Lys Gly Ser
340 345 350
Tyr Pro Gln His Ile Asn Ile Ser Arg Asn Phe Ser Lys Leu Leu Ser
355 360 365
Leu Arg Ala Leu His Leu Arg Gly Tyr Val Phe Gln Glu Leu Arg Glu
370 375 380
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385 390 395 400
Leu Gly Ile Asn Phe Ile Lys Gln Ile Asp Phe Lys Leu Phe Gln Asn
405 410 415
Phe Ser Asn Leu Glu Ile Ile Tyr Leu Ser Glu Asn Arg Ile Ser Pro
420 425 430
Leu Val Lys Asp Thr Arg Gln Ser Tyr Ala Asn Ser Ser Ser Phe Gln
435 440 445
Arg His Ile Arg Lys Arg Arg Ser Thr Asp Phe Glu Phe Asp Pro His
450 455 460
Ser Asn Phe Tyr His Phe Thr Arg Pro Leu Ile Lys Pro Gln Cys Ala
465 470 475 480
Ala Tyr Gly Lys Ala Leu Asp Leu Ser Leu Asn Ser Ile Phe Phe Ile
485 490 495
Gly Pro Asn Gln Phe Glu Asn Leu Pro Asp Ile Ala Cys Leu Asn Leu
500 505 510
Ser Ala Asn Ser Asn Ala Gln Val Leu Ser Gly Thr Glu Phe Ser Ala
515 520 525
Ile Pro His Val Lys Tyr Leu Asp Leu Thr Asn Asn Arg Leu Asp Phe
530 535 540
Asp Asn Ala Ser Ala Leu Thr Glu Leu Ser Asp Leu Glu Val Leu Asp
545 550 555 560
Leu Ser Tyr Asn Ser His Tyr Phe Arg Ile Ala Gly Val Thr His His
565 570 575
Leu Glu Phe Ile Gln Asn Phe Thr Asn Leu Lys Val Leu Asn Leu Ser
580 585 590
His Asn Asn Ile Tyr Thr Leu Thr Asp Lys Tyr Asn Leu Glu Ser Lys
595 600 605
Ser Leu Val Glu Leu Val Phe Ser Gly Asn Arg Leu Asp Ile Leu Trp
610 615 620
Asn Asp Asp Asp Asn Arg Tyr Ile Ser Ile Phe Lys Gly Leu Lys Asn
625 630 635 640
Leu Thr Arg Leu Asp Leu Ser Leu Asn Arg Leu Lys His Ile Pro Asn
645 650 655
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660 665 670
Asp Asn Met Leu Lys Phe Phe Asn Trp Thr Leu Leu Gln Gln Phe Pro
675 680 685
Arg Leu Glu Leu Leu Asp Leu Arg Gly Asn Lys Leu Leu Phe Leu Thr
690 695 700
Asp Ser Leu Ser Asp Phe Thr Ser Ser Leu Arg Thr Leu Leu Leu Ser
705 710 715 720
His Asn Arg Ile Ser His Leu Pro Ser Gly Phe Leu Ser Glu Val Ser
725 730 735
Ser Leu Lys His Leu Asp Leu Ser Ser Asn Leu Leu Lys Thr Ile Asn
740 745 750
Lys Ser Ala Leu Glu Thr Lys Thr Thr Thr Lys Leu Ser Met Leu Glu
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Leu His Gly Asn Pro Phe Glu Cys Thr Cys Asp Ile Gly Asp Phe Arg
770 775 780
Arg Trp Met Asp Glu His Leu Asn Val Lys Ile Pro Arg Leu Val Asp
785 790 795 800
Val Ile Cys Ala Ser Pro Gly Asp Gln Arg Gly Lys Ser Ile Val Ser
805 810 815
Leu Glu Leu Thr Thr Cys Val Ser Asp Val Thr Ala Val Ile Leu Phe
820 825 830
Phe Phe Thr Phe Phe Ile Thr Thr Met Val Met Leu Ala Ala Leu Ala
835 840 845
His His Leu Phe Tyr Trp Asp Val Trp Phe Ile Tyr Asn Val Cys Leu
850 855 860
Ala Lys Val Lys Gly Tyr Arg Ser Leu Ser Thr Ser Gln Thr Phe Tyr
865 870 875 880
Asp Ala Tyr Ile Ser Tyr Asp Thr Lys Asp Ala Ser Val Thr Asp Trp
885 890 895
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900 905 910
Val Leu Leu Cys Leu Glu Glu Arg Asp Trp Asp Pro Gly Leu Ala Ile
915 920 925
Ile Asp Asn Leu Met Gln Ser Ile Asn Gln Ser Lys Lys Thr Val Phe
930 935 940
Val Leu Thr Lys Lys Tyr Ala Lys Ser Trp Asn Phe Lys Thr Ala Phe
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Tyr Leu Ala Leu Gln Arg Leu Met Asp Glu Asn Met Asp Val Ile Ile
965 970 975
Phe Ile Leu Leu Glu Pro Val Leu Gln His Ser Gln Tyr Leu Arg Leu
980 985 990
Arg Gln Arg Ile Cys Lys Ser Ser Ile Leu Gln Trp Pro Asp Asn Pro
995 1000 1005
Lys Ala Glu Gly Leu Phe Trp Gln Thr Leu Arg Asn Val Val Leu
1010 1015 1020
Thr Glu Asn Asp Ser Arg Tyr Asn Asn Met Tyr Val Asp Ser Ile
1025 1030 1035
Lys Gln Tyr
1040
<210> 9
<211> 1032
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
Met Gly Phe Cys Arg Ser Ala Leu His Pro Leu Ser Leu Leu Val Gln
1 5 10 15
Ala Ile Met Leu Ala Met Thr Leu Ala Leu Gly Thr Leu Pro Ala Phe
20 25 30
Leu Pro Cys Glu Leu Gln Pro His Gly Leu Val Asn Cys Asn Trp Leu
35 40 45
Phe Leu Lys Ser Val Pro His Phe Ser Met Ala Ala Pro Arg Gly Asn
50 55 60
Val Thr Ser Leu Ser Leu Ser Ser Asn Arg Ile His His Leu His Asp
65 70 75 80
Ser Asp Phe Ala His Leu Pro Ser Leu Arg His Leu Asn Leu Lys Trp
85 90 95
Asn Cys Pro Pro Val Gly Leu Ser Pro Met His Phe Pro Cys His Met
100 105 110
Thr Ile Glu Pro Ser Thr Phe Leu Ala Val Pro Thr Leu Glu Glu Leu
115 120 125
Asn Leu Ser Tyr Asn Asn Ile Met Thr Val Pro Ala Leu Pro Lys Ser
130 135 140
Leu Ile Ser Leu Ser Leu Ser His Thr Asn Ile Leu Met Leu Asp Ser
145 150 155 160
Ala Ser Leu Ala Gly Leu His Ala Leu Arg Phe Leu Phe Met Asp Gly
165 170 175
Asn Cys Tyr Tyr Lys Asn Pro Cys Arg Gln Ala Leu Glu Val Ala Pro
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Gly Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Ser Leu Lys Tyr
195 200 205
Asn Asn Leu Thr Val Val Pro Arg Asn Leu Pro Ser Ser Leu Glu Tyr
210 215 220
Leu Leu Leu Ser Tyr Asn Arg Ile Val Lys Leu Ala Pro Glu Asp Leu
225 230 235 240
Ala Asn Leu Thr Ala Leu Arg Val Leu Asp Val Gly Gly Asn Cys Arg
245 250 255
Arg Cys Asp His Ala Pro Asn Pro Cys Met Glu Cys Pro Arg His Phe
260 265 270
Pro Gln Leu His Pro Asp Thr Phe Ser His Leu Ser Arg Leu Glu Gly
275 280 285
Leu Val Leu Lys Asp Ser Ser Leu Ser Trp Leu Asn Ala Ser Trp Phe
290 295 300
Arg Gly Leu Gly Asn Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Glu Asn Phe Leu
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Leu Asp Met His Gly Ile Phe Phe Arg Ser Leu Asp Glu Thr Thr Leu
370 375 380
Arg Pro Leu Ala Arg Leu Pro Met Leu Gln Thr Leu Arg Leu Gln Met
385 390 395 400
Asn Phe Ile Asn Gln Ala Gln Leu Gly Ile Phe Arg Ala Phe Pro Gly
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Asp Phe Arg Pro Asn Cys Ser Thr Leu Asn Phe Thr Leu Asp Leu Ser
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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Gln Gly Leu Ser Gly Leu Ile Trp Leu Asp Leu Ser Gln Asn Arg Leu
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Gln Ile Leu Asp Val Ser Ala Asn Pro Leu His Cys Ala Cys Gly Ala
755 760 765
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785 790 795 800
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885 890 895
Glu Cys Arg Gly Arg Trp Ala Leu Arg Leu Cys Leu Glu Glu Arg Asp
900 905 910
Trp Leu Pro Gly Lys Thr Leu Phe Glu Asn Leu Trp Ala Ser Val Tyr
915 920 925
Gly Ser Arg Lys Thr Leu Phe Val Leu Ala His Thr Asp Arg Val Ser
930 935 940
Gly Leu Leu Arg Ala Ser Phe Leu Leu Ala Gln Gln Arg Leu Leu Glu
945 950 955 960
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965 970 975
Arg Ser Arg Tyr Val Arg Leu Arg Gln Arg Leu Cys Arg Gln Ser Val
980 985 990
Leu Leu Trp Pro His Gln Pro Ser Gly Gln Arg Ser Phe Trp Ala Gln
995 1000 1005
Leu Gly Met Ala Leu Thr Arg Asp Asn His His Phe Tyr Asn Arg
1010 1015 1020
Asn Phe Cys Gln Gly Pro Thr Ala Glu
1025 1030

Claims (9)

1.表达至少一种toll样受体的报告细胞在制备用于测定口腔中细菌毒力的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括：
a. 提供所述表达至少一种toll样受体的报告细胞；
b. 提供口腔物质样本，其中所述口腔物质样本为下列中的至少一种：龈线菌斑、龈下菌斑、龈上菌斑、间质菌斑、龈沟液（GCF）、来自齿龈活检的样本、唾液或舌拭子；
c. 将所述口腔物质样本和所述报告细胞混合；
d. 测量所述toll样受体激活；
e. 提供来自在提供另一口腔物质样本之前使用口腔护理组合物的个体的另一口腔物质样本，其中所述口腔护理组合物是以下产品，其在一般使用过程中不是被故意吞咽以用于特定治疗剂的全身给药的目的，而是在口腔中保留足够长的时间以接触牙齿表面或口腔组织，并且选自洁齿剂、漱口水、摩丝、泡沫、口喷剂、锭剂、咀嚼片、口香糖、牙齿美白条、牙线及牙线涂层、口气清新可溶解条带、或义齿护理或粘合剂产品；并且其中所述口腔物质样本和所述另一口腔物质样本来自同一个体；
f. 将所述另一口腔物质样本和所述报告细胞混合；
g. 测量所述toll样受体激活；
h. 将来自所述口腔物质样本和所述另一口腔物质样本的toll样受体激活进行比较，其中如果来自所述口腔物质样本的toll样受体激活高于来自所述另一口腔物质样本的toll样受体激活，所述口腔中的细菌毒力增加；并且如果来自所述口腔物质样本的toll样受体激活低于来自所述另一口腔物质样本的toll样受体激活，所述口腔中的细菌毒力降低。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述toll样受体为TLR1至TLR9中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述报告细胞表达TLR2或TLR4中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述toll样受体激活报告基因。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述报告基因为分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）报告基因。
6.根据权利要求1至2和5中任一项所述的用途，其中所述口腔物质样本包含毒力因子，所述毒力因子为下列中的至少一种：革兰氏阳性细胞壁组分、革兰氏阴性细胞壁组分、细菌DNA、鞭毛蛋白、细菌代谢物、菌毛、外膜囊泡细菌蛋白或细菌酶。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述毒力因子为肽聚糖。
8.根据权利要求6所述的用途，其中所述口腔物质样本包含毒力因子，所述毒力因子为脂多糖或脂磷壁酸中的至少一种。
9.根据权利要求1-2、5和7-8中任一项所述的用途，其中所述toll样受体激活通过测量EC50或刺激倍数中的至少一个来测定。
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