CN107557342A - 一种CAR‑Treg 细胞的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于治疗自身免疫***疾病的CAR‑Treg细胞制备方法，主要包括以下步骤：1.从患者外周血内分离出PBMC细胞；2.通过免疫磁珠分离出CD4+CD25+Treg细胞；3.通过CD3/28磁珠活化Treg细胞；4.将活化的Treg细胞在体外用慢病毒进行转导；5.将扩增后的CAR‑Treg细胞用PBS清洗后静脉回输治疗自身免疫***疾病。本方法通过靶向B细胞表面标志物，特异性激活Treg细胞，通过Treg细胞对B细胞的抑制作用，调节B细胞的功能，达到治疗或减轻自身免疫性疾病的目的。

Description

一种CAR-Treg 细胞的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学和分子生物学领域，具体而言，涉及一种制备CAR-Treg细胞的方法以及制得的CAR-T 细胞及其应用。

背景技术

自身免疫性疾病(autoimlnune disease)是指以自身免疫应答反应导致组织器官损伤和相应功能障碍为主要发病机制的一类疾病。是临床上常见的一大类疾病，目前已被公认的自身免疫性疾病至少有30 多种。根据自身免疫反应对组织器官造成损伤的范围，通常将自身免疫性疾病分器官特异与非器官特性两大类。

临床上常见的自身免疫性疾病包括：***疾病：类风湿关节炎(RA)、幼年特发性关节炎(JIA)、***性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、多肌炎/皮肌炎(PM/DM)、硬皮病(SSc)、***性血管炎；神经肌肉疾病：多发性硬化症(MS)、重症肌无力(MG)、脱髓鞘疾病；内分泌性疾病：原发性贤上腺皮质萎缩、慢性甲状腺炎、糖尿病；消化***疾病：炎性肠病(克罗恩病、溃疡性结肠炎)、慢性活动性肝炎、恶性贫血与萎缩性胃炎；泌尿***疾病：自身免疫性肾小球肾炎、肺肾出血性综合征；血液***疾病：自身免疫性溶血性贫血、原发性血小板减少性紫癜(ITP)、特发性白细胞减少症。

B 淋巴细胞或称B 细胞来源于骨髓的多能干细胞，由骨髓中的造血干细胞分化发育而来。与T 淋巴细胞相比，它的体积略大。这种淋巴细胞受抗原刺激后，会增殖分化出大量浆细胞。浆细胞可合成和分泌抗体并在血液中循环。

从骨髓来的干细胞或前B 细胞，在迁入法氏囊或类囊器官后，逐步分化为有免疫潜能的B 细胞。成熟的B 细胞经外周血迁出，进入脾脏、***，主要分布于脾小结、脾索及淋巴小结、淋巴索及消化道粘膜下的淋巴小结中，受抗原刺激后，分化增殖为浆细胞，合成抗体，发挥体液免疫的功能。目前使用的大多数疫苗就是通过刺激这类B 淋巴细胞产生抗体的。B 细胞在骨髓和集合***中的数量较T 细胞多，在血液和***中的数量比T 细胞少，在胸导管中则更少，仅少数参加再循环。B 细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原及表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。

B 淋巴细胞的祖细胞存在于胎肝（胚胎小鼠14 天或通顺儿8-9 周）的造血细胞岛（islanksofhaemopoieticcells）中，此后B 淋巴细胞的产生和分化场所逐渐被骨髓所代替。B 淋巴细胞（blymphocytes）简称B 细胞，成熟的B 细胞主要定居于***皮质浅层的淋巴小结和脾脏的红髓和白髓的淋巴小结内。B 细胞在抗原刺激下可分化为浆细胞，合成和分泌免疫球蛋白，主要执行机体的体液免疫（humoralimmunity）。

B 细胞在自身免疫病中起着重要作用，在皮肤科方面，***性红斑狼疮患者的B细胞反应性过高，产生多种自身抗体，抗核抗体在SLE 发病机制中起关键作用，可形成免疫复合物导致损伤。B 细胞还可激活致病性T 细胞。SLE病人中B 细胞活化因子升高并与疾病活动性和抗dsDNA 抗体水平升高相关。

干燥综合症（SS）的B 细胞产生多种自身抗体，有的已证明与疾病的***受累相关。SS 的血清BAFF 水平也升高并与病人自身抗体的水平相关。寻常性天疱疮（PV）和落叶状天疱疮（PF）由抗桥粒芯糖蛋白（Dsg）自身抗体Dsg1和Dsg3 单独或共同引起。皮肌炎（DM）存在补体***的活化，导致膜攻击复合物沉积于病人的毛细血管。病人肌肉炎症浸润中血管周围的B 细胞数比肌内膜的T 细胞多。活动性DM 病人外周血B 细胞和Th 均活化，后者Th2 占优势。DM 病人血清BAFF 水平显著升高。

调节性T 细胞其具有免疫应答低下和免疫抑止两大特征，通过“主动”的方式抑止免疫***――发挥免疫负调作用。现已证实，除CD4Treg 外，部分CD8 T 细胞也为Treg。根据来源及作用机制，Treg 可分为天然产生的CD4+CD25+Treg(自然调节性T 细胞，nTreg)和诱导的适应性调节T 细胞(aTreg或iTreg)，如Th3、Trl 细胞等(CD4+CD25+Treg：CD4+CD25+Treg)除表达CD4分子和CD25 分子外，其特征性标志为Foxp3+。Foxp3 又称叉头状／翅膀状螺旋转录因子，在调控调节性T 细胞的发育中起重要作用，且对其发育和功能是必要的。CD4+CD25+Treg 可抑止免疫***及相关免疫细胞的功能和活性，从而发挥免疫负调节作用。同时，TGF-p 也可诱导CD4+CD25+Treg 的增生。研究表明，CD4-CD25+Treg 能以细胞因子依赖(1L-10 和TGF-和非细胞因子依赖)两种机制发挥免疫负调作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可方便进行平衡度调整的主轴轴芯装配结构，其也同时有效地降低电主轴因长期工作所带来的散热热量。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种CAR-Treg 细胞的制备方法，将包含CAR 的病毒感染CD4+CD25+的Treg细胞，得到上述CAR-Treg 细胞。

作为对上述一种CAR-Treg 细胞的制备方法的进一步描述， 所述CD4+CD25+Treg细胞采用以下方式制备：从外周血中分离得到外周单核细胞，然后从所述单核细胞中通过磁珠分选得到CD4+CD25+ Treg 细胞。

作为对上述一种CAR-Treg 细胞的制备方法的进一步描述，所述嵌合抗原受体包括依次串联的胞外区肽段、跨膜区肽段和胞内结构域肽段，所述胞外区肽段为抗CD19,CD20,CD22,CD33,CD38,CD123 中的一种或几种抗体或其抗原结合部分。

作为对上述一种CAR-Treg 细胞的制备方法的进一步描述，所述肽段为抗CD19,CD20,CD22,CD33,CD38,CD123 抗体或其抗原结合部分为全抗体、双特异性抗体、scFv、Fab、Fab' 、F(ab')2 、Fv。

作为对上述一种CAR-Treg 细胞的制备方法的进一步描述，所述跨膜区肽段为CD8跨膜区肽段，所述胞外区肽段与CD8 跨膜区肽段通过CD8 的铰链区肽段相连。

作为对上述一种CAR-Treg 细胞的制备方法的进一步描述，所述胞内结构域肽段为共刺激信号分子，选自4-1BB、CD28、CD3ζ的胞内结构域肽段中的一种或多种。

作为对上述一种CAR-Treg 细胞的制备方法的进一步描述，所述嵌合抗原受体分子还包括信号肽。

作为对上述一种CAR-Treg 细胞的制备方法的进一步描述，制备得到的CD4+CD25+Treg 细胞还包括进一步培养的步骤；所述培养采用的培养基为GIBICO OpTmizer™ CTS™T 细胞培养基。

作为对上述一种CAR-Treg 细胞的制备方法的进一步描述，制备得到的CD4+CD25+Treg 细胞采用CD3/28 磁珠活化。

本发明还可将上述制备的CAR-Treg 细胞在制备治疗自身免疫性疾病中应用。

与现有技术相比，B 细胞-靶向疗法始于用抗CD20 抗体利妥昔单抗（RTX）去除B细胞治疗B 细胞淋巴瘤。其后RTX 治疗类奥风湿性关节炎疗效显著，推动了B 细胞靶向疗法治疗自身免疫疾病的研究。本方法通过靶向B 细胞表面标志物，特异性激活Treg 细胞，通过Treg 细胞对B 细胞的抑制作用，调节B 细胞的功能，达到治疗或减轻自身免疫性疾病的目的。

具体实施方式

实施例1

靶向CD19 的CAR-Treg 载体构建：

将抗CD19 的scFv 序列与CD137 的胞内结构域和CD3Zeta 的ITAM 区进行融合，将融合序列采用人工基因合成的方式进行全基因合成，合成后的序列使用酶切位点EcoRI-BamHI，并亚克隆至Plvx-EF1a-IRES 载体中,构建成嵌合抗原受体慢病毒表达载体。

实施例2

慢病毒制备

S1、准备10cm 皿，接种5*106 个细胞，加入完全培养基（DMEM 高糖、10%FBS、双抗），置于37℃、5% CO2 培养箱，过夜培养。

S2、从冰箱中取出Lip2000 及慢病毒包装质粒（pLVX-EF1a-CAR、pHR、pVSVG），室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出OPTI-MEM 培养基，温热至室温。取0.5mLOPTI-MEM 培养基至EP 管，加入40μL Lip2000 混匀静止5min，另取0.5ml OPTI-MEM 至EP 管，加入10μg pLVX-EF1a- CAR、7.5μg pHR、2.5μg pVSVG，移液枪上下吹打充分混匀后，将两个EP管混合，室温下静置20 分钟。

S3、将上述复合物逐滴加入到10cm 培养皿中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5% CO2 培养箱，培养6~8 小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基。

连续培养48 小时后，收集培养皿中含有病毒的培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，转至离心管中，配平后，20000xg 4℃离心2 小时。离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入500μL PBS 缓冲液将沉淀重悬，将病毒置于-80℃保存。

实施例3

原代Treg 细胞的分离

具体实验步骤如下：

S1、采集患者外周血100ml。

S2、在生物安全柜中，将血液加入到50mL 离心管中800g 离心10min 中，分离出上层血浆，56 度水浴灭活备用。

S3、将下层细胞加入PBS 至原先体积进行稀释。

S4、另取50ml 离心管加入20ml 淋巴细胞分离液，使用移液枪小心的将稀释后的血样沿管壁缓慢添加至分离液的上层，避免分离试剂与血样的混合。

S5、将离心机设置为800xg，转速下降速度设为最慢，室温离心20 分钟。

S6、将白膜层的单核细胞层吸至一个新的离心管中，使用培养基洗涤细

胞一次。

S7、将细胞密度调整至1*108 细胞/mL，重悬于5mL 的圆底管中。

S8 、加入100 μ l/mL 的CD4+CD25+CD127dim/ – T CellBiotin-AntibodyCocktail II，充分混匀,2-8 度孵育5min。

S9、加入300μL/ml buffer 和 200μL Anti-Biotin MicroBeads，在2-8度孵育10min。

S10、加入buffer 将体积调整至500ul。

S11、准备一支LD 柱，加2ml buffer 冲洗。

S12、 将细胞加入到LD 柱。自然流尽后加2mlbuffer 冲洗2 次。收集细胞。

S13 、300g 离心10min,并加90ul buffer/10^7 细胞。

S14 、加入10ulCD25 MicroBeads II/10^7 细胞，混匀。2-8 度孵育15min

S15、加2ml buffer 300g 离心10min。加500ul buffer 重悬。

S16、准备一支MS 柱子，加500ulbuffer 冲洗

S17、将重悬的细胞过MS 柱，加500ulbuffer 冲洗三次

S18、加1mlbuffer，将MS 柱从磁铁中取出，用柱塞将细胞打出。

S19、加入10mlT 细胞培养基混匀，400g 离心10min。

S20、将细胞重悬于X-vivo 15 培养基中，并添加10% FBS，300U/mL IL-2

实施例4

原代Treg 细胞激活与慢病毒感染

具体实验步骤如下：

S1、调整细胞密度至1*106 细胞/mL，加入细胞因子及抗体复合物（终浓度为300U/mL的IL-2、10ng/mL IL-7、5ng/mL IL-15、500ng/mL Anti-CD3(OKT3)、2ug/mL Anti-CD28），连续培养48 小时。

S2、按照MOI=20，计算所需要的病毒量。计算公式如下：所需病毒量（mL）=(MOI*细胞数量)/病毒滴度

S3、从-80℃冰箱取出病毒后，迅速在37℃水浴锅中融化。在六孔板中加入上述计算所得的病毒量，添加终浓度为6μg/mL 的polybrene，充分混匀后，使用封口膜将六孔板四边密封，800xg 离心1 小时。

S4、离心结束后，撕掉封口膜，将六孔板置于37℃ 5% CO2 的培养箱中，继续培养24 小时。

S5、250xg 离心10 分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的六孔板中，继续培养10-14 天后收集细胞并用生理盐水重悬后静脉回输。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种CAR-Treg 细胞的制备方法，其特征在于：将包含CAR 的病毒感染CD4+CD25+的Treg 细胞，得到上述CAR-Treg 细胞。

2.根据权利要求1 所述的一种CAR-Treg 细胞的制备方法，其特征在于，所述CD4+CD25+Treg 细胞采用以下方式制备：从外周血中分离得到外周单核细胞，然后从所述单核细胞中通过磁珠分选得到CD4+CD25+ Treg 细胞。

3.根据权利要求1 所述的一种CAR-Treg 细胞的制备方法，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括依次串联的胞外区肽段、跨膜区肽段和胞内结构域肽段，所述胞外区肽段为抗CD19，CD20，CD22，CD33，CD38，CD123 中的一种或几种抗体或其抗原结合部分。

4.根据权利要求3 所述的一种CAR-Treg 细胞的制备方法，其特征在于：所述肽段为抗CD19，CD20，CD22，CD33，CD38，CD123 抗体或其抗原结合部分为全抗体、双特异性抗体、scFv、Fab、Fab' 、F(ab')2 、Fv。

5.根据权利要求1 所述的一种CAR-Treg 细胞的制备方法，其特征在于：所述跨膜区肽段为CD8 跨膜区肽段，所述胞外区肽段与CD8 跨膜区肽段通过CD8 的铰链区肽段相连。

6.根据权利要求1 所述的一种CAR-Treg 细胞的制备方法，其特征在于：所述胞内结构域肽段为共刺激信号分子，选自4-1BB、CD28、CD3ζ的胞内结构域肽段中的一种或多种。

7.根据权利要求1 所述的一种CAR-Treg 细胞的制备方法，其特征在于：所述嵌合抗原受体分子还包括信号肽。

8.根据权利要求2 所述的一种CAR-Treg 细胞的制备方法，其特征在于，制备得到的CD4+CD25+Treg 细胞还包括进一步培养的步骤；所述培养采用的培养基为GIBICOOpTmizer™ CTS™ T 细胞培养基。

9.根据权利要求2 所述的一种CAR-Treg 细胞的制备方法，其特征在于，制备得到的CD4+CD25+Treg 细胞采用CD3/28 磁珠活化。

10.将权利要求1 所述的CAR-Treg 细胞在制备治疗自身免疫性疾病中的应用。