CN107550917B - 常春藤皂苷元及其衍生物或其盐在制备治疗骨性关节炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有通式（I）所示的常春藤皂苷元及其衍生物或其盐在制备治疗骨性关节炎药物中的应用；

（I）其中，R₁和R₂相同或不同，彼此独立的表示H或‑CO(CH2)nCOOH，n=1‑3；R₃为H、Na、K或NH₃。实验研究发现，具有通式（I）所示的常春藤皂苷元及其衍生物或其盐可促进原代软骨细胞增殖，并且可以显著地抑制H₂O₂所诱导的软骨细胞凋亡，抑制软骨细胞分泌MMPs，IL‑6，促进软骨细胞分泌TIMP‑1；体内给予该常春藤皂苷元及其衍生物或其盐可抑制MIA引起的炎症性反应，抑制血清中IL‑1β，TNF‑α表达，且抑制基质金属蛋白酶MMPs，促进TIMP‑1的表达，表明该常春藤皂苷元及其衍生物或其盐具有保护膝关节软骨，改善骨关节炎作用，具有确切治疗骨关节炎的效果，可提高骨关节炎患者的生存质量。

Description

常春藤皂苷元及其衍生物或其盐在制备治疗骨性关节炎药物 中的应用

技术领域

本发明涉及常春藤皂苷元及其衍生物或其盐的新用途，具体涉及常春藤皂苷元及其衍生物或其盐在制备治疗骨性关节炎药物中的应用。

背景技术

关节炎是指由炎症、感染、创伤或其他因素所致的关节及其周围组织的炎性病变，表现为关节红、肿、热、痛和功能障碍；根据病因可分为类风湿性关节炎、骨性关节炎、强直性脊柱炎、反应性关节炎、痛风性关节炎，其中最常见的是类风湿性关节炎和骨性关节炎两种。

类风湿性关节炎(RA)是一种病因不明的自身免疫性疾病，以对称性、侵蚀性滑膜炎为特征，以近端指间关节、掌指关节、腕和足趾小关节受累最多见；晚期出现关节周围肌肉萎缩，关节强直、掌指关节尺侧半脱位，手指“天鹅颈”及“纽扣花”等畸形。实验室检查可有血沉、C反应蛋白和类风湿因子增高，但均无特异性；抗环瓜氨酸肽抗体、抗角蛋白抗体阳性特异性＞90％。

骨性关节炎(OA)在某些国家的疾病统计报告中发病率仅次于心脏病，被称为“不死的癌症”，与心脑血管疾病、癌症并列成为威胁人类健康的“三大杀手”；其最直接的症状是关节疼痛。OA是一种慢性进行性骨关节病，是以骨关节软骨退行性变和周围骨质增生为特点的慢性关节疾病，又被称为退行性关节炎，多发于中老年人群，常累及全身骨关节中的脊柱、髋关节和膝关节等负重较大的关节，导致受累关节僵硬、变形；具体表现为：远端指间关节和近端指间关节出现骨性结节、方形手、“蛇型手”、膝内翻、膝外翻等，从而使关节功能受到严重影响；其实验室检查中血沉、C反应蛋白和类风湿因子一般均无异常。

OA作为最常见的关节退化性疾病，其主要特征是关节软骨进行性退变、软骨细胞凋亡、软骨下骨重建、炎症、滑膜炎和骨赘形成，引起受累关节疼痛、活动受限并最终导致关节功能障碍。针对OA的发病原因目前医学界尚没有一个完全确切的定论，其发病原因不明。国际通用标准根据美国风湿病协会(ASA)所制定的将OA分为原发性和继发性。原发性OA又称“特发性OA”，确切原因不清楚，认为是多种因素所造成的例如遗传、环境、气候等因素。而继发性OA是指继发于关节外伤、先天性或遗传性疾病、内分泌及代谢病、炎性关节病、地方性关节病、其他骨关节病等。

流行病学调查显示关节软骨破坏的程度与滑膜炎症的活动性有非常明确的关系。相关文献(张红亮,等.致炎细胞因子在骨性关节炎病理生理中的作用[J].现代生物医学进展,2014,14(5):989-992)报道了致炎细胞因子扰乱OA的关节组织新陈代谢并加强关节组织分解代谢。白细胞介素-1(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-6(IL-6)在OA的病理生理中是主要的致炎细胞因子，其他致炎细胞因子比如：IL-15，IL-17，IL-18，IL-21，白血病抑制因子(LIF)和趋化因子同样在OA病理生理中同样有重要作用。在涉及OA的致炎细胞因子中，IL-1β和TNF被认为是最主要细胞因子，主要由软骨细胞、单核细胞、成骨细胞和滑液组织产生；IL-1β主要与软骨破坏有关，而TNF主要促进致炎细胞因子的级联反应，IL-1β和TNF同时可诱导大量的炎性和分解性因子产生。在OA的患者中，IL-1β和TNF在滑液，滑膜组织，软骨下骨和软骨中高水平表达大量的研究证明IL-1β和TNF通过抑制软骨细胞蛋白质合成代谢的活性从而减少主要细胞外基质成分的合成。IL-1β和TNF刺激软骨细胞释放多种蛋白水解酶类，其中包括基质金属蛋白酶类(MMPs)；在软骨破坏中起重要作用，从而使替代抗细胞因子治疗，尤其是对MMPs靶向治疗，将成为治疗OA的主要手段。

当前对于OA治疗目的在于缓解疼痛、阻止和延缓疾病的进展、保护关节功能、改善生活质量。骨关节炎诊断及治疗指南中提出治疗方案应个体化，充分考虑患者的患病危险因素、受累关节的部位、关节结构改变、炎症情况、疼痛程度、伴发病等具体情况及病情。治疗原则应以非药物治疗联合药物治疗为主，必要时手术治疗。非药物治疗在OA的治疗中有很重要的作用，包括患者教育、运动、生活指导及物理治疗等；药物治疗主要分为控制症状的药物、改善病情的药物及软骨保护剂；对于经内科治疗无明显疗效，病变严重及关节功能明显障碍的患者可以考虑外科治疗，以校正畸形和改善关节功能，外科治疗的主要途径是通过关节镜手术和开放手术。

在药物治疗中，控制症状的药物按给药途径分为口服、注射和局部外用药。口服药包括乙酰氨基酚、非甾体抗炎药(NSAIDs)、阿片类药。OA的滑膜炎在发病初期并非主要因素，故轻症可短期使用一般镇痛剂作为首选药物如对乙酰氨基酚，主要不良反应有胃肠道症状和肝毒性。NSAIDs既有止痛作用又有抗炎作用，是最常用的一类控制OA症状的药物；主要通过抑制环氧化酶活性，减少***素合成，发挥减轻关节炎症所致的疼痛及肿胀、改善关节活动的作用；其主要不良反应有胃肠道症状、肾或肝功能损害、影响血小板功能、可增加心血管不良事件发生的风险。对于急性疼痛发作的患者，当对乙酰氨基酚及NSAIDs不能充分缓解疼痛或有用药禁忌时，可考虑用弱阿片类药物，这类药物耐受性较好而成瘾性小。

注射药有糖皮质激素、透明质酸和NSAIDs。关节腔注射长效糖皮质激素可缓解疼痛、减少渗出，疗效持续数周至数月，但在同一关节不应反复注射，注射间隔时间不应短于4～6个月。非药物疗法和单纯止痛剂疗效不佳的膝关节OA可采用关节腔内注射透明质酸(玻璃酸)类制剂治疗，对减轻关节疼痛、增加关节活动度、保护软骨均有效，治疗效果可持续数月；对轻中度的OA具有良好的疗效。每周1次膝关节腔内注射，4～6周为1个疗程，注射频率可以根据患者症状适当调整。肌肉注射NSAIDs起效快，胃肠道反应不明显。

局部外用药有NSAIDs和辣椒碱。局部外用NSAIDs制剂，可减轻关节疼痛，不良反应小；辣椒碱乳剂可消耗局部感觉神经末梢的P物质，可减轻关节疼痛和压痛。

治疗骨性关节炎的慢作用药(DMOAD)及软骨保护剂一般起效较慢，需治疗数周才见效；具有降低基质金属蛋白酶、胶原酶等活性的作用，既可抗炎、止痛，又可保护关节软骨，有延缓OA发展的作用。但目前尚未有公认的理想的药物，常用药物氨基葡萄糖、硫酸软骨素、双醋瑞因等可能有一定的作用；但其起效时间长，费用和时间成本高，对其推广有一定的限制。

氨基葡萄糖为天然的氨基单糖，是人体关节软骨基质中合成蛋白聚糖所必需的重要成分；可改善关节软骨的代谢，提高关节软骨的修复能力，保护损伤的关节软骨，同时缓解OA的疼痛症状，改善关节功能，延缓OA的病理过程和疾病进程，因而兼具症状调控和结构调控效应；需持续服用8周以上显效，使用1年以上疗效更稳定。

硫酸软骨素通过竞争性抑制降解酶的活性，减少软骨基质和关节滑液成分的破坏；通过减少纤维蛋白血栓的形成，改善滑膜和软骨下骨的血液循环；能有效减轻OA的症状，减轻疼痛，改善关节功能，减少NSAIDs或其他止痛药的用量。

双醋瑞因是白细胞介素(IL)-1抑制剂，可抑制软骨降解、促进软骨合成并抑制滑膜炎症。它不仅能有效地改善骨关节炎的症状、减轻疼痛、改善关节功能，且具有后续效应；它还可延缓OA病程的进展，具有结构调节作用。该药不抑制***素的合成。一般服用时间不少于3个月。

常春藤皂苷元是中药材中常见的一种苷元，主要见于续断、预知子、木通、金银花等。目前，对常春藤皂苷元及其衍生物或其盐的研究多集中在抗糖尿病和抗抑郁方面，将常春藤皂苷元及其衍生物或其盐用于制备治疗骨性关节炎药物中的用途尚未见报道。

发明内容

本发明的首要目的在于提供具有如下通式(I)所示的常春藤皂苷元及其衍生物或其盐在制备治疗骨性关节炎药物中的应用；

其中，R₁和R₂相同或不同，彼此独立的表示H或-CO(CH₂)_nCOOH，其中n＝1-3；

R₃为H、Na、K或NH₃。

优选的，R₁和R₂相同，表示H或-CO(CH₂)₂COOH。

更优选的，R₃为H。

当R₁和R₂表示-CO(CH₂)_nCOOH时，其羧基可进一步与碱反应形成一个或多个盐，优选的，具有通式(I)所示的常春藤皂苷元及其衍生物的盐为钠盐或钾盐。

常春藤皂苷元可从中药材中采用公知的制备方法提取得到或直接从市面购买得到。常春藤皂苷元衍生物可以常春藤皂苷元为原料，通过酰化反应、酯化反应或酯交换反应得到，该衍生物可与碱反应进一步得到其盐。

本发明的另一目的在于提供一种治疗骨性关节炎的药物，包含具有通式(I)所示的常春藤皂苷元及其衍生物或其盐和药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，从具体的分类上看，包括(但并不限于)：赋形剂，如淀粉或水等中的一种或多种；填充剂，如淀粉、乳糖、糊精、蔗糖、微晶纤维素或甘露醇等中的一种或多种；黏合剂，如预胶化淀粉、糊精、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇等中的一种或多种；崩解剂，如羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠或交联聚维酮等中的一种或多种；润滑剂，如硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或甘油等中的一种或多种；润湿剂，如水或乙醇等中的一种或多种；渗透压调节剂，如氯化钠、葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一种或多种；抗氧剂，如亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠或硫脲等中的一种或多种；溶剂，如水、甘油、二甲基亚砜、乙醇、聚乙二醇、丙二醇或植物油等中的一种或多种；缓冲剂，如醋酸/醋酸钠、枸橼酸/枸橼酸钠、乳酸或酒石酸/酒石酸钠等中的一种或多种；吸收促进剂，如季铵化合物等；表面活性剂，如十六烷醇等；吸附载体，如高岭土或皂粘土等中的一种或多种；另外，还可以加入其它辅剂，如遮光剂、香味剂或甜味剂等中的一种或多种。

本发明所述的具有通式(I)所示的常春藤皂苷元及其衍生物或其盐还能够以组合物的形式联合使用，例如，可以将本发明的常春藤皂苷元及其衍生物或其盐加入适于给与受治疗者的药用组合物中。该组合物特别是药物组合物可以有各种形式，包括例如液体、半固体和固体等剂量形式中的一种或多种；其中所说的药物组合物包括治疗有效量的具有通式(I)所示的常春藤皂苷元及其衍生物或其盐为活性成分，以及一种或多种医药学上可接受的载体。

包含具有通式(I)所示的常春藤皂苷元及其衍生物或其盐的药物可以采用本领域公知的常规生产方法制成各种剂型，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂，采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种)等中的一种或多种给药途径进行骨性关节炎及其直接相关疾病的治疗或科学研究。

以上药物或药物组合物能够使用各种途径，在所述的使用形式中，优选的形式是口服制剂(如片剂、包衣片剂、胶囊、溶液或混悬液)、非肠道给予剂型(如注射剂、软膏或贴剂)等中的一种或多种，进一步优选片剂或胶囊。

通过体外、体内药理试验，试验结果证明本发明所述的具有通式(I)所示的常春藤皂苷元及其衍生物或其盐对骨性关节的治疗机制取得突破，它不仅能促进软骨细胞的增殖，显著地抑制H₂O₂所诱导的软骨细胞凋亡；并且可以促进软骨细胞分泌基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1)，抑制软骨细胞分泌基质金属蛋白酶(MMPs)、IL-6；还可抑制MIA引起的炎症性反应，抑制骨关节炎大鼠血清中IL-1β、TNF-α表达和软骨中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的降解。大鼠给予1～10mg/kg就有良好的治疗作用。

用于患者时，本发明所述的具有通式(I)所示的常春藤皂苷元及其衍生物或其盐的有效剂量为5～100mg/次，一天用药1-3次；该剂量或用量通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明通过实验研究发现，具有通式(I)所示的常春藤皂苷元及其衍生物或其盐可促进原代软骨细胞增殖，并且可以显著地抑制H₂O₂所诱导的软骨细胞凋亡，抑制软骨细胞分泌MMPs，IL-6，促进软骨细胞分泌TIMP-1；体内给予该常春藤皂苷元及其衍生物或其盐可抑制MIA引起的炎症性反应，抑制血清中IL-1β，TNF-α表达，且抑制基质金属蛋白酶MMPs，促进TIMP-1的表达，表明该常春藤皂苷元及其衍生物或其盐具有保护膝关节软骨，改善骨关节炎作用，具有确切治疗骨关节炎的效果，可提高骨关节炎患者的生存质量。

本发明通过实验研究发现，具有通式(I)所示的常春藤皂苷元及其衍生物或其盐的药理活性突破了现临床的单纯抗炎止痛、改善关节腔润滑、或软骨保护作用，其具有软骨损伤修复(促进软骨细胞增殖，抑制软骨中蛋白聚糖和II型胶原的降解，作用优于阳性药双醋瑞因)、抗软骨损伤(抑制软骨细胞分泌MMPS，促进TIMP-1分泌，抑制软骨细胞分泌IL-6)、还有良好的抗炎作用(降低血清中IL-1β、TNF-α含量)，三重作用对骨性关节炎有可能形成突破疗法，真正起到标本兼治，成为临床一线用药。

附图说明

图1A：10倍放大的实施例1的分离培养24h的原代软骨细胞形态照片；

图1B：10倍放大的实施例1的分离培养72h的原代软骨细胞形态照片；

图1C：10倍放大的实施例1的传代(3代以后)的传代软骨细胞形态照片；

图2：HEDS对于碘乙酸钠诱导的骨关节炎大鼠膝关节大体光镜观察的照片。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。

实施例1：通式(I)所示的常春藤皂苷元及其衍生物或其盐对骨性关节炎的治疗作用的体外实验

1、试验材料

1.1药品与试剂

受试药物：

化合物HED(即：R₁、R₂和R₃为H)，由广州博济医药生物技术股份有限公司制作提供，批号0150215，其结构式为：

化合物HEDS(即：R₁和R₂为-CO(CH₂)₂COONa，R₃＝H)，由广州博济医药生物技术股份有限公司制作提供，批号：150626，其结构式为：

临用前先以DMSO溶解成母液100mmol并分装，于4℃保存。用前将化合物用含血清DMEM配制成所需各浓度梯度(各浓度含DMSO＝0.1％)。

试剂：

过氧化氢(H₂O₂)，来源：德国Merck公司；胎牛血清FBS、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶(Trypsin 1:250)、HEPES溶液，均来源：美国life technologies公司GIBCO；噻唑蓝(MTT)，来源：美国Amresco公司；二甲基亚砜(DMSO)，来源：南京生兴生物技术有限公司；Ⅱ型胶原蛋白酶，来源：美国Sigma公司；甲苯胺蓝染液、台盼蓝染色液，均来源：北京索莱宝科技有限公司。

兔II型胶原蛋白抗体、大鼠MMP-13ELISA试剂盒，来源：北京博奥森生物技术有限公司；大鼠MMP-2ELISA试剂盒、大鼠MMP-9ELISA试剂盒，来源：武汉博士德生物工程有限公司；大鼠IL-6ELISA试剂盒、大鼠血管内皮生长因子ELISA试剂盒、大鼠TNF-αELISA试剂盒、大鼠IL-1βELISA试剂盒，来源：依科赛生物科技有限公司；Hieff^TMQpcr SYBR GreenMasterMix，来源：上海翊圣生物科技有限公司。

阳性对照药：双醋瑞因，来源：上海晶纯生化科技有限公司。

其它试剂等均为市售常规试剂。

1.2实验仪器

细胞培养箱(德国Heraeus公司)；倒置显微镜(XSZ-D2，上海***实业有限公司)；酶标仪(BioTek，美国Epoch公司)；流式细胞仪(德国美天旎生物技术有限公司)；激光共聚焦显微镜(德国Zeiss公司)；超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、电子分析天平。

2、实验方法

2.1原代软骨细胞培养

参考Hu等(Hu D N,Yang P Y,Ku M C,et al.Iso1ation and cultivation ofhuman articularchondrocytes[J].Kaohsiung J Med Sci,2002,18(3):1132120.)，采用机械解离+化学解离的方法，取新生一周SD大鼠(10只左右)，脱颈处死，放入盛有酒精的烧杯中。软骨细胞分离培养方法进行实验，于5％CO₂，37℃培养箱内单层培养，隔2d首次换液，4-5d达到85％融合后进行传代。台盼蓝染色法计算细胞活性。

2.2原代软骨细胞鉴定

2.2.1甲苯胺蓝染色

因软骨细胞中多聚糖成分对甲苯胺蓝具有特异染色，所以采用甲苯胺蓝染色作为鉴定软骨细胞的方法。将培养在激光共聚焦小皿中的细胞用PBS洗三遍，再用4％多聚甲醛室温下固定30min。加入1％甲苯胺蓝染液，37℃孵育2h。倒置荧光显微镜下观察细胞并拍照。

2.2.2Ⅱ型胶原免疫荧光染色

将培养在激光共聚焦小皿中的细胞去除培养液，PBS洗3次。4％多聚甲醛室温下固定30min，PBST(PBS+0.1％Triton X 100)透化5min。5％BSA室温封闭1h后加入Ⅱ型胶原抗体，4℃孵育过夜。第二天加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗兔二抗，室温避光孵育2h。加入10μg/L DAPI，室温避光孵育5min。最后加入抗荧光猝灭封片液，倒置荧光显微镜下观察细胞并拍照。

2.2.3 HED、HEDS对软骨细胞的毒性作用实验

将处于对数生长期的软骨细胞经胰酶消化并按5000/孔细胞接种于96孔板中。每孔接种含量为100μl，放入CO₂培养箱静置培养。每组6个复孔。细胞贴壁后，弃去培养液，每孔加入化合物HED，HEDS(浓度分别为：0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10，30，100μM)，孵育3天后MTT法检测细胞活力。在酶标仪570nm、650nm双波长上测定各孔光吸收值，记录结果。

2.2.4 HED、HEDS对软骨细胞的增殖作用实验

将处于对数生长期的软骨细胞经胰酶消化并按5000/孔细胞接种于96孔板中。实验步骤同2.2.3，并加入阳性对照药物双醋瑞因(浓度为1μM)，分别培养7天后，MTT法检测细胞活力。在酶标仪570nm、650nm双波长上测定各孔光吸收值，记录结果。以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

2.2.5 H₂O₂对软骨细胞凋亡作用研究

将处于对数生长期的软骨细胞经胰酶消化并按5000/孔细胞接种于96孔板中。每孔接种含量为100μl，放入CO₂培养箱静置培养。每组6个复孔。培养24h，细胞贴壁后，每孔加H₂O₂，(浓度分别为：0.1，0.2，0.4，0.8mM)，继续孵育30min，1h，2h，4h。MTT法检测细胞活力，在酶标仪570nm、650nm双波长上测定各孔光吸收值，记录结果。

2.2.6 HED、HEDS对H₂O₂诱导的软骨细胞凋亡作用研究

将处于对数生长期的软骨细胞经胰酶消化并按2x10⁵个细胞/皿接种于60x15mmdish中。放入CO₂培养箱静置培养。第二天分别给予化合物HED、HEDS(0.01，0.1，1μM)和阳性药物双醋瑞因(1μM)，孵育七天后，各组给予0.8mM H₂O₂，处理时间4h。PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶消化细胞。具体步骤参照碧云天生物技术Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒说明书。

2.2.7 ELISA检测HED、HEDS对软骨细胞分泌MMPs等因子的影响。

将处于对数生长期的软骨细胞经胰酶消化并按2x10⁵个细胞/皿接种于60x15mmdish中，方法同2.2.6。从孵育箱中取出小皿，PBS洗涤后加入裂解液充***解，12,000rpm离心10min，取上清，用样品稀释液稀释10倍后进行分析。具体步骤参照武汉博士德生物工程有限公司ELISA试剂盒说明书。

2.2.8 Q-PCR检测HED、HEDS对软骨细胞分泌MMPs等因子的影响。

将处于对数生长期的软骨细胞经胰酶消化并按2x10⁵个细胞/皿接种于60x15mmdish中，方法同2.2.6。从孵育箱中取出小皿，PBS洗涤后加入Trizol裂解液充***解，具体步骤参照

1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书。

3、实验结果

3.1软骨细胞形态学观察结果

倒置显微镜下观察发现，分离培养的原代软骨细胞呈圆球形，24h后大部分贴壁，呈扁平形、短梭形、三角形、多角形等不同形态(图1A)。72h后细胞已基本铺满皿底，细胞呈典型的“铺路石”状，(图1B)。传代后，细胞生长速度较原代快，形态同原代；随着传代次数的增加(3代以后)，细胞逐渐变大，生长速度减慢，甚至停滞，(图1C)。

3.2软骨细胞染色鉴定结果

3.2.1甲苯胺蓝染色结果

染色结果显示，细胞核呈深蓝色，胞浆呈淡蓝色，细胞外基质着浅蓝色。细胞中硫酸糖胺多糖为阳性,说明软骨细胞的正常表型蛋白表达活跃。

3.2.2Ⅱ型胶原免疫荧光染色结果

染色结果显示，细胞胞浆呈现绿色荧光，且均为阳性结果，细胞核经DAPI染色后激发出蓝色荧光。几乎100％细胞表达Ⅱ型胶原，提示软骨细胞纯度很高。

3.3细胞毒性结果

由表1和表2的MTT结果显示，化合物HED在0.01-10μM，化合物HEDS在0.01-100μM浓度范围内对软骨细胞无细胞毒性。

表1化合物HED对软骨细胞的细胞毒性(x±s，n＝6)

注：

n＝6，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，与对照组比较

表2化合物HEDS对软骨细胞的细胞毒性(

n＝6)

注：

n＝6，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，与对照组比较

3.4HED、HEDS对软骨细胞的增殖作用结果

化合物HED、HEDS均可促进原代软骨细胞增殖，根据MTT结果拟合细胞增殖曲线可得，HED在0.01μM浓度时七天内的最佳增值率312.43％。HEDS在0.01μM浓度时七天内最佳增值率368.04％。化合物HED、HEDS在0.01μM浓度对细胞增殖效果均优于阳性对照药双醋瑞因，结果见表3-6。

表3化合物HED对软骨细胞增殖的影响-1(

％)

注：

n＝5，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，与对照组比较

表4化合物HED对软骨细胞增殖的影响-2(

％)

注：

n＝5，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，与对照组比较

表5化合物HEDS对软骨细胞增殖的影响-1(

％)

注：

n＝5，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，与对照组比较

表6化合物HEDS对软骨细胞增殖的影响-2(

％)

注：

n＝5，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，与对照组比较

3.5 H₂O₂对软骨细胞凋亡的影响

结果表明H₂O₂显著诱导浓度依赖性的细胞毒性，在0.8mM时细胞存活率显著下降，但H₂O₂诱导的细胞毒性并没有显著的时间依赖性，0.8mM H₂O₂处理细胞30min，1h，2h，4h细胞存活率相似，结果见表7。在后续时间中选择0.8mM H₂O₂，处理时间4h作为模型，分析HED、HEDS对H₂O₂诱导的软骨细胞凋亡作用研究。

表7 H₂O₂对软骨细胞的细胞毒性(

％)

注：

n＝6，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，与对照组比较

3.6 HED、HEDS对H₂O₂诱导的软骨细胞凋亡的影响

Annexin V-FITC/PI双染法结果显示，化合物HED、HEDS在0.01-1μM浓度范围可显著地抑制H₂O₂所诱导的软骨细胞凋亡，结果见表8、表9。

表8化合物HED对过氧化氢诱导的软骨细胞凋亡的影响

％)

注：

n＝3，^###P<0.001与阴性对照组比较；^***P<0.001，与模型组比较

表9化合物HEDS对过氧化氢诱导的软骨细胞凋亡的影响(

％)

注：

n＝3，^###P<0.001与阴性对照组比较；^***P<0.001，与模型组比较

3.7 HED、HEDS对H₂O₂诱导的软骨细胞分泌MMPs等因子的影响

ELISA结果显示化合物HED、HEDS在1μM可以显著抑制软骨细胞分泌MMPs，VEGF，IL-6，促进软骨细胞分泌TIMP-1；结果见表10、表11。

表10化合物HED对过氧化氢诱导的软骨细胞分泌MMPs等因子的影响(

ng/ml)

注：

n＝3，^###P<0.001与阴性对照组比较；^**P<0.01，^***P<0.001，与模型组比较。

表11化合物HEDS对过氧化氢诱导的软骨细胞分泌MMPs等因子的影响(

ng/ml)

注：

n＝3，^###P<0.001与阴性对照组比较；^**P<0.01，^***P<0.001，与模型组比较。

3.8 HED、HEDS对H₂O₂诱导的软骨细胞分泌MMPs等因子的影响

Q-PCR结果显示化合物HED、HEDS在1μM可以显著抑制软骨细胞分泌MMPs，促进TIMP-1以此来抑制MMPs破坏软骨细胞基质平衡；结果见表12、表13。

表12化合物HED对过氧化氢诱导软骨细胞MMPs等mRNA表达量的影响(

n＝3)

注：

n＝3，^###P<0.001与阴性对照组比较；^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，与模型组比较。

表13化合物HEDS对过氧化氢诱导软骨细胞MMPs等mRNA表达量的影响(

n＝3)

注：

n＝3，^###P<0.001与阴性对照组比较；^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，与模型组比较。

4、实验结果分析

总体而言，采用机械解离+化学解离的方法可获得原代软骨细胞，前3代细胞的状态和增殖情况良好，至第4代后出现细胞分化现象，形态以梭形或肥大化为主，增殖能力减弱，生长停滞。故在后续实验中，取前3代细胞用于实验。

在正常的关节软骨内，软骨细胞可合成大量的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖(PG)等物质，因此Ⅱ型胶原和蛋白聚糖(PG)作为软骨的特征性分泌物，是鉴定软骨细胞的关键。通过甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色进一步说明了所提取的细胞为纯度很高的软骨细胞。

通过MTT法检测续断化合物对软骨细胞毒性及增殖作用。结果表明化合物HED在0.01-10μM，HEDS在0.01-100μM浓度范围内对软骨细胞无细胞毒性，并且化合物在安全浓度范围内可促进原代软骨细胞增殖。

研究表明，H₂O₂能诱导软骨细胞凋亡以及关节软骨的退化，故本实验采用H₂O₂建立关节软骨细胞氧化应激所导致的细胞凋亡模型，用MTT方法筛选出合适的H₂O₂浓度以及作用时间，再应用Annexin V-FITC/PI双染法对各个死亡阶段细胞进行区分，结果表明HED、HEDS在0.01-1μM浓度范围可以显著抑制H₂O₂所诱导的软骨细胞凋亡。

在软骨的退行性病变中，MMPs的释放会降解胶原，破坏软骨细胞基质的平衡，是软骨损伤的关键因素。结果显示化合物HED、HEDS在1μM，可以显著抑制软骨细胞分泌MMPs，促进TIMP-1以此来抑制MMPs破坏软骨细胞基质平衡。

实施例2：通式(I)所示的常春藤皂苷元及其衍生物或其盐对骨性关节炎的治疗作用的大鼠体内实验

1、试验材料

1.1药品与试剂

化合物HEDS(即：R₁和R₂为-CO(CH₂)₂COONa，R₃＝H)，由广州博济医药生物技术股份有限公司制作提供，批号：150626，其结构式为：

临用前先以DMSO溶解成母液100mmol并分装，于4℃保存。用前将化合物用含血清DMEM配制成所需各浓度梯度(各浓度含DMSO＝0.1％)。

其余试剂均同实施例1。

1.2实验仪器

同实施例1。

1.3实验动物

清洁级SD孕大鼠，体重250-300g；清洁级SD雄鼠，体重200-250g；均由上海杰思捷实验动物有限公司提供，均符合普通实验动物质量标准。

2、实验方法

2.1大鼠实验性OA模型制备

8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠60只，体重200±50g，关节腔内注射2mg/mL的碘乙酸钠生理盐水溶液50μl，造成大鼠骨关节炎模型。SD大鼠随机分为4组：正常对照组(Con组)10只、模型组(MIA组)10只、HEDS组(MIA+HEDS 0.1mg/kg，A1组；MIA+HEDS 1mg/kg，A2组；MIA+HEDS 10mg/kg，A3组)各10只。双醋瑞因阳性对照组(MIA+Diacerein10mg/kg，D1组)。Con组、MIA组每日每只灌胃生理盐水，A1、A2、A3和D1组大鼠每日每只灌胃HEDS(0.1，1或10mg/kg)，双醋瑞因(10mg/kg)。造模后第28天，各组大鼠腹主动脉取血，分离膝关节软骨标本。进行各项指标的检测。

2.2 HEDS对大鼠血清中炎症因子表达水平的影响

各组大鼠腹主动脉采血，大鼠血清检测IL-1β，TNF-α水平。具体步骤参照武汉博士德生物工程有限公司ELISA试剂盒说明书。

2.3 HEDS对造模后细胞外基质和炎症介质基因表达的影响

各组大鼠按期处死，右膝关节离体后，用手术刀片迅速刮下关节面软骨组织，分别置于预先冷冻的研钵中，加入1ml Trizol裂解液，充分研磨后静置5分钟，随后12,000rpm、4℃离心，具体步骤参照

1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书。

3、实验结果

3.1 HEDS对模型大鼠右膝关节大体观察及关节肿胀程度的影响

MIA造模30天后，Con组SD大鼠右膝关节标本未见明显异常，关节面清楚、平整、光滑有光泽，关节软骨透亮清晰，无破坏，关节边缘无骨赘形成。MIA组SD大鼠右膝关节面不平整，失去光泽，软骨缺损严重，多处骨赘形成。HEDS给药组及双醋瑞因阳性对照药组可见大鼠右膝关节较MIA组相比软骨破坏症状有所改善，关节面趋于平整、光滑。关节腔内结构清晰，可见明显的修复痕迹。以大鼠膝关节直径表示关节肿胀程度，MIA造模后与正常组相比，膝关节直径均显著增加。而HEDS给药28天后可缓解大鼠关节肿胀，对MIA诱导的大鼠膝关节炎具有一定的治疗作用，结果见图2、表14。

表14化合物HEDS对碘乙酸钠诱导的大鼠关节肿胀程度的影响(

mm)

注：

n＝6，^#P<0.05，^##P<0.01,^###P<0.001与阴性对照组比较；^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，与模型组比较

3.2 HEDS对模型大鼠血清中炎症因子表达的影响

ELISA结果显示，MIA组大鼠血清中IL-1β，TNF-α水平显著上升，而造模后给药1mg/kg，10mg/kg剂量的HEDS可浓度依赖性的抑制大鼠血清中炎性因子的表达；结果见表15。

表15化合物HEDS对模型大鼠血清中炎症因子表达的影响(

ng/ml)

注：

n＝3，^##P<0.01与阴性对照组比较；^**P<0.01，^***P<0.001，与模型组比较

3.3对造模后细胞外基质和炎症介质基因表达的检测结果

Q-PCR结果显示，MIA组大鼠II型胶原与蛋白聚糖以及TIMP-1基因表达水平显著下降，MMP-2、MMP-9、MMP-13表达显著上升，而造模后给药1mg/kg，10mg/kg剂量的HEDS可提高II型胶原与蛋白聚糖以及TIMP-1表达，降低MMP-2、MMP-9、MMP-13表达，其效果优于阳性药物双醋瑞因，结果见表16。

表16化合物HEDS对模型大鼠MMP-2等因子mRNA表达量的影响(

n＝3)

注：

n＝3，^#P<0.05，^##P<0.01,^###P<0.001与阴性对照组比较；^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，与模型组比较

4、实验结果分析

为进一步证实化合物的软骨保护活性，采用碘乙酸钠(MIA)建立骨关节炎动物模型。相比其他手术或药物注射诱导的模型，MIA模型具有注射方法简便易行，周期较短，适于小动物试验，从而明显降低药物筛选中对药量的要求等优点。实验结果显示，HED、HEDS对大鼠实验性OA有一定的治疗作用。主要表现为抑制实验性OA大鼠关节肿胀，软骨细胞外基质降解，血清中炎症因子IL-1β及TNF-α的分泌。

因此上述实验初步表明，HEDS可以促进软骨细胞增殖，通过抑制软骨细胞的凋亡和MMPs的产生，从而减轻关节软骨的损伤和降解，化合物对于实验性OA也起到了一定的治疗作用。

实施例3：HED(R₁、R₂和R₃为H)片剂的制备

上述原辅料分别过100目筛，按上述处方量称取过筛后的HED、羧甲基淀粉钠、淀粉、微晶纤维素，混合均匀，用50％药用乙醇适量制成软材，过20目筛制湿颗粒，55℃条件下干燥4小时，用24目筛网整粒，加入硬脂酸镁混合均匀，压片，共制得932片。

实施例4：HEDS(R₁和R₂为-CO(CH₂)₂COONa，R₃为H)片剂的制备

上述原辅料分别过100目筛，按上述处方量称取过筛后的HEDS、微晶纤维素、乳糖和羟丙甲纤维素，混合均匀，用60％药用乙醇适量制成软材，过20目筛制湿颗粒，55℃条件下干燥4小时，用24目筛网整粒，加入硬脂酸镁混合均匀，压片，共制得948片。

实施例5：HED(R₁、R₂和R₃为H)胶囊剂的制备

上述原辅料分别过80目筛，按上述处方量称取过筛后的HED、羧甲基淀粉钠、微晶纤维素，混合均匀，用50％药用乙醇适量制成软材，过20目筛制湿颗粒，55℃条件下干燥4小时，用24目筛网整粒，加入硬脂酸镁混合均匀，填充胶囊，共制得胶囊951粒。

实施例6：HEDS(R₁和R₂为-CO(CH₂)₂COONa，R₃为H)颗粒剂的制备

上述原辅料分别过80目筛，按上述处方量称取过筛后的HEDS、糊精、蔗糖，混合均匀，用纯化水适量润湿制成软材，过12目筛制湿颗粒，55℃条件下干燥4小时，整粒，用复合铝膜分装，共制得964袋。

实施例7：HEDS(R₁和R₂为-CO(CH₂)₂COONa，R₃为H)注射剂的制备

称取处方量的HEDS、氯化钠、加入注射用水1500ml，50℃搅拌溶解；加入0.2％针剂活性炭，50℃保温搅拌30分钟；用0.45μm的微孔滤膜粗滤、脱炭；加注射用水定容至2000ml后，用0.22μm微孔滤膜过滤，测定中间体含量，灌装于2ml安瓿瓶中，熔封，121℃灭菌15min；得948瓶。

Claims (8)

1.常春藤皂苷元及其衍生物、或其盐在制备治疗骨性关节炎药物中的应用；

所述常春藤皂苷元及其衍生物具有如下通式（I）所示的结构：

（I）

其中，R₁和R₂相同，彼此独立的表示 H或-CO(CH2)nCOOH，其中n=1-3；

R₃为H。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述R₁和R₂相同，表示 H或-CO(CH2)2COOH。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述R₃为H。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具有通式（I）所示的常春藤皂苷元及其衍生物的盐为钠盐或钾盐。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具有如下通式（I）所示的常春藤皂苷元及其衍生物或其盐的有效剂量为5～100mg/次，一天用药1-3次。

6.一种治疗骨性关节炎的药物，包含常春藤皂苷元及其衍生物、或其盐和药学上可接受的载体；所述常春藤皂苷元及其衍生物具有如下通式（I）所示的结构：

（I）

其中，R₁和R₂相同，彼此独立的表示 -CO(CH2)nCOOH，其中n=1-3；

R₃为H。

7.根据权利要求6所述的治疗骨性关节炎的药物，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂。

8.根据权利要求7所述的治疗骨性关节炎的药物，其特征在于，所述药物的剂型为片剂或胶囊剂。

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