CN107543919B - 基于rna适体的茶碱定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本案公开了一种基于RNA适体的茶碱定量检测方法，包括：采用两条RNA探针特异性捕获茶碱并形成夹心结构，其中，一条RNA探针1还用于与电极结合，另一条RNA探针2结合电信号分子；通过测量经修饰后的电极的电化学响应值获得茶碱的含量；其中，两条RNA探针具有能够彼此互补配对的片段，以使得夹心片段能够首尾串联并最终形成线状长链。本案通过结合适体的特异性识别功能、DNA四面体的分子界面组装功能和银纳米颗粒的电化学溶出伏安性能，实现了茶碱的高灵敏度、高特异性、低干扰的电化学检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种茶碱的检测方法，特别涉及一种基于RNA适体的茶碱电化学定量检测方法。
背景技术
茶碱(theophylline)为1,3-二甲基-3,7-二氢-1H-嘌呤-2,6-二酮，外观为白色结晶或结晶性粉末，无臭、味苦，其分子式为C7H8N4O2，分子量为180.16，沸点为390.1℃(760mmHg)，蒸汽压为2.72E-06mmHg(25℃)。在临床上广泛用于治疗哮喘、慢性阻塞性肺病和早产儿呼吸暂停等疾病。此外，茶碱还有促进儿茶酚胺释放和调节钙离子内流的作用。
然而茶碱的药物动力学容易受到多种因素的影响，个体差异大。用药量大、血药浓度高时往往表现为非线性动力学，特别是早产儿发育过程的不可预见性和非线性，治疗浓度与中毒浓度往往重叠，导致临床上某些患儿的血药浓度过低或过高，造成治疗效果不佳或发生毒副作用，从临床表现难以判定是否浓度过低，因此急需发展对血药浓度进行监测的技术。
传统的检测方法包括紫外-可见分光光度计法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法以及一些商用的免疫法试剂盒。然而以上方法存在一些限制，包括需要使用大型设备、昂贵的试剂等，因此仍需要开发新型的灵敏度高、成本低的检测方法。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本案提出了一种基于RNA适体的茶碱定量检测方法，以期用于实现对茶碱浓度的实时精准监测。
为实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：
一种基于RNA适体的茶碱定量检测方法，其包括：
采用两条RNA探针特异性捕获茶碱并形成夹心结构，其中，一条RNA探针1还用于与电极结合，另一条RNA探针2结合电信号分子；
通过测量经修饰后的电极的电化学响应值获得茶碱的含量；
其中，两条RNA探针具有能够彼此互补配对的片段，以使得夹心片段能够首尾串联并最终形成线状长链。
优选的是，所述的基于RNA适体的茶碱定量检测方法，其中，RNA探针1通过一分子组装界面与电极结合。
优选的是，所述的基于RNA适体的茶碱定量检测方法，其中，该分子组装界面是具有四面体结构的DNA分子。
优选的是，所述的基于RNA适体的茶碱定量检测方法，其中，该具有四面体结构的DNA分子由4条DNA探针组成，该4条DNA探针的序列分别为：
DNA探针a：CCAGCCGAAAACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA；
DNA探针b：HS-C6-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC；
DNA探针c：HS-C6-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC；
DNA探针d：HS-C6-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT。
优选的是，所述的基于RNA适体的茶碱定量检测方法，其中，所述RNA探针1的序列为CGGCUGGGGCGAUACCAGCCGAAA。
优选的是，所述的基于RNA适体的茶碱定量检测方法，其中，所述RNA探针2的序列为CCAGCCGAAAGGCCCUUGGCAGCGUCGGG-NH2。
优选的是，所述的基于RNA适体的茶碱定量检测方法，其中，所述电信号分子为银纳米颗粒。
优选的是，所述的基于RNA适体的茶碱定量检测方法，其中，所述电极为金电极。
本案的有益效果是：本案通过结合适体的特异性识别功能、DNA四面体的分子界面组装功能和银纳米颗粒的电化学溶出伏安性能，实现了茶碱的高灵敏度、高特异性、低干扰的电化学检测。
附图说明
图1为茶碱检测的原理示意图，其中图中A为线状长链的组装原理图；B为茶碱的电化学检测原理图。
图2为金电极不同修饰阶段的交流阻抗图：(A)裸金电极；(B)DNA四面体修饰电极；(C)DNA四面体修饰电极与茶碱单独反应后；(D)DNA四面体修饰电极与RNA探针1和2单独作用后；(E)DNA四面体修饰电极与茶碱、RNA探针1和2混合物作用后。
图3A为不同修饰阶段金电极孵育银纳米颗粒后的线性扫描伏安图：(a)裸金电极，(b)DNA四面体修饰电极，(c)DNA四面体修饰电极与茶碱单独作用后，(d)DNA四面体修饰电极与RNA探针1和2单独作用后，(e)DNA四面体修饰电极与茶碱、RNA探针1和2混合物作用后；图3B为对应在0.122V处的电流值。
图4A为检测不同浓度的茶碱最终呈现的线性扫描伏安图；图4B为茶碱浓度相对应的线性扫描伏安峰电流值的标准曲线，内嵌图是线性范围；误差条表示三次独立测量的相对标准偏差。
图5A为茶碱及四种类似物的结构；图5B为向四种不同浓度茶碱类似物中加入100μM茶碱后的峰电流值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本案列出一实施例的基于RNA适体的茶碱定量检测方法，其原理如图1所示，该方法包括：
采用两条RNA探针特异性捕获茶碱并形成夹心结构，其中，一条RNA探针1还用于与电极结合，另一条RNA探针2结合电信号分子；通过测量经修饰后的电极的电化学响应值获得茶碱的含量；其中，两条RNA探针具有能够彼此互补配对的片段，以使得夹心片段能够首尾串联并最终形成线状长链。
RNA探针1通过一分子组装界面与电极结合。电极优选为金电极。该分子组装界面是具有四面体结构的DNA分子。该具有四面体结构的DNA分子由4条DNA探针组成，该4条DNA探针的序列分别为：
DNA探针a：CCAGCCGAAAACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA；
DNA探针b：HS-C6-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC；
DNA探针c：HS-C6-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC；
DNA探针d：HS-C6-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT。
DNA探针b-d中的巯基用于与金电极表面发生共价键合，巯基与探针序列之间修饰C6(6个碳基，一般可以是-(CH2)6-)起到连接作用，即便功能基团(巯基)靠近探针也不会影响其功能，提供必要的间隔以减少标记的巯基基团与探针的相互作用。
上述4条DNA探针中，a中的“ACATTCCTAAGTCTGAA”与d中的“TTCAGACTTAGGAATGT”配对；a中的“ATTACAGCTTGCTACAC”与b中的“GTGTAGCAAGCTGTAAT”配对；a中的“GAAGAGCCGCCATAGTA”与c中的“TACTATGGCGGCTCTTC”配对；b中的“TATCACCAGGCAGTTGA”与c中的“TCAACTGCCTGGTGATA”配对；b中的“ATGCGAGGGTCCAATAC”与d中的“GTATTGGACCCTCGCAT”配对；c中的“ACGACACTACGTGGGAA”与d中的“TTCCCACGTAGTGTCGT”配对。DNA探针a-d经过配对，形成了具有四面体结构的DNA分子(图1)。本案选择四面体结构作组装界面的原因是：1)相较于采用单链，四面体结构的组装效率高，单个四面体具有三个巯基，与金电极的反应速度快，而若采用单链，一个单链最多具有一个巯基，其与金电极的反应时间至少需要16小时；2)四面体结构的引入避免了占位分子的使用，若采用单链结构，需额外加入巯基乙醇占位；3)四面体具有刚性结构，便于控制其在电极上的形态保持稳定，若采用单链，则其在电极的形态无法在空间上控制成直立，影响后续探针的配对。
RNA探针1的序列为CGGCUGGGGCGAUACCAGCCGAAA。
RNA探针2的序列为CCAGCCGAAAGGCCCUUGGCAGCGUCGGG-NH2。
RNA探针1中的“GGCGAUACCAGCCGAAA”和RNA探针2中的“GGCCCUUGGCAGCGUC”用于特异性吸附茶碱分子，并形成夹心结构。RNA探针1中的“CGGCUGG”既可以与RNA探针2中的“CCAGCCG”配对，以使得夹心片段能够首尾串联自组装形成线状长链，又可以与DNA探针a中的“CCAGCCG”配对，以使得线状长链的一端能够与具有四面体结构的DNA分子结合，从而将线状长链固定在电极表面；即在溶液中，RNA探针1选择与RNA探针2串联，或者是选择与具有四面体结构的DNA分子结合，都是随机的，线状长链的长度也不一致，但由于体系中探针和四面体结构都是过量的，所有的线状长链最终都将结合到四面体上，所以不影响实现对茶碱分子的定量检测。设计成线状长链的好处是可以在有限的电极表面上结合上大量的电信号分子，以提高该方法的响应性和灵敏度。RNA探针2中与氨基相连的“GGG”的作用是增加氨基与主链的间距，使该段呈单链形态，以减小银纳米颗粒与氨基的反应位阻。
电信号分子为银纳米颗粒。RNA探针2末端修饰的氨基可以与银纳米颗粒发生共价反应，通过检测银纳米颗粒的溶出伏安相应，可以对目标茶碱分子进行定量检测。
银纳米颗粒的合成：配制浓度为0.25mM的硝酸银与柠檬酸三钠的混合溶液。配置浓度为10mM的硼氢化钠溶液。将100mL的硝酸银与柠檬酸三钠的混合溶液与3mL的硼氢化钠溶液混合，剧烈搅拌30分钟，然后将混合溶液在黑暗中静置过夜。12000g的转速离心3次，将银纳米颗粒进行纯化。
工作电极预处理：实验中使用金电极作为工作电极，电极在修饰前需在新配置的水虎鱼溶液(98％H2SO4∶30％H2O2＝3∶1)中浸泡5分钟，除去电极表面吸附的物质。用蒸馏水洗干净后，将电极用碳化硅砂纸(5000目)打磨到镜面光滑。然后，将电极分别在乙醇和蒸馏水中超声清洗各5分钟。接着，在使用前先在氮气氛围内干燥。将电极在50％硝酸溶液中浸泡30分钟，然后用蒸馏水清洗干净。接着，用0.5M硫酸溶液进行电化学清洗。然后，将电极用氮气干燥以进一步修饰。
DNA四面体的组装与修饰：分别配置浓度为4μM四条单链DNA(DNA probe a,b,c,d)，缓冲体系为10mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。然后，将四条单链DNA等体积混合，加热到95℃反应2分钟，然后自然冷却到室温即得DNA四面体。将组装好的DNA四面体滴加在金电极表面反应8小时。
茶碱分子的定量检测：在含有0.25M NaCl与1‰DEPC(v/v)的PBS(pH 7.4)中配置浓度范围从0.5μM到300μM的茶碱分子标准液。将RNA probe 1(RNA探针1)与RNA probe 2(RNA探针2)加入到茶碱溶液中，浓度为20nM，接着将经DNA四面体修饰的金电极***该溶液中反应1小时。然后用蒸馏水冲洗电极后，再将其浸泡入银纳米颗粒的溶液中反应1小时。最后，清洗后进行电化学检测。
所有电化学实验均使用计算机控制的CHI 660D电化学工作站(CH Instruments，上海辰华)进行。使用三电极***，其中工作电极是与铂辅助电极和银/氯化银参比电极结合的金电极(直径2mm)。交流阻抗谱的缓冲液为含有1mM KCl的5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液；线性扫描伏安法的电解液为0.1M KCl。
图2中的交流阻抗用于表征在多步表面修饰过程中[Fe(CN)6]3-/4-的化学性质，阻抗谱的半圆区域代表电荷转移受阻碍的程度。曲线A没有出现该区域，证明裸金电极表面电子交换能力良好；曲线B出现了一个较小的半圆区域，是由于DNA四面体中的DNA骨架的磷酸基团带有的负电荷与[Fe(CN)6]3-/4-之间的排斥作用；曲线C和D的半圆区域没有明显增大，证明单一的茶碱或RNA探针1和2无法在电极表面形成纳米线复合物；曲线E的半圆区明显增大，是由于电极表面形成了长链的复合物，使得电负性进一步增大。
图3中的线性扫描伏安图的趋势与图2的阻抗图结果一致，裸电极、DNA四面体修饰电极、茶碱作用修饰电极、RNA探针1、2作用修饰电极均未表现出明显的电流峰，而只有当茶碱、RNA探针1和2混合物作用后的修饰电极能表现出明显的电流峰(0.1V左右)，表明茶碱介导的界面线性长链构建成功。
图4使用不同浓度的茶碱与RNA探针1、2混合后，再与DNA四面体修饰电极作用，得到不同程度的界面线性长链，通过检测富集的不同数量的银纳米颗粒的线性扫描伏安图，对茶碱初始浓度进行检测。线性扫描伏安峰电流值在0.5至70μM的范围内显示与茶碱浓度的的线性关系。回归方程为i＝12.061+0.635c(R2＝0.990，n＝3)，其中i是峰电流值(μA)，c是茶碱浓度(μM)，检测限为50nM。
图5在不同浓度的茶碱中加入不同的茶碱类似物(100μM)，通过线性伏安扫描法检测，得到的峰电流值与原始茶碱的值类似，证实茶碱检测方法的特异性。
表1通过检测向血清中加入茶碱的回收率和相对标准偏差来验证本方法的准确性和精确性。
表1 血清中茶碱的检测
表1中，回收率＝茶碱量检测值/茶碱加入量；茶碱量检测值是三次检测的平均值；相对标准偏差是对三次重复测量的数据计算获得。回收率接近100％，相对标准偏差低于5％，说明本方法准确性和精确性都较高。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
DNA探针a：CCAGCCGAAAACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA；
DNA探针b：HS-C6-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC；
DNA探针c：HS-C6-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC；
DNA探针d：HS-C6-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT。
RNA探针1：CGGCUGGGGCGAUACCAGCCGAAA。
RNA探针2：CCAGCCGAAAGGCCCUUGGCAGCGUCGGG-NH2。
Claims (6)
1.一种基于RNA适体的茶碱定量检测方法，其特征在于，包括：
采用两条RNA探针特异性捕获茶碱并形成夹心结构，其中，一条RNA探针1还用于与电极结合，另一条RNA探针2结合电信号分子；
通过测量经修饰后的电极的电化学响应值获得茶碱的含量；
其中，两条RNA探针具有能够彼此互补配对的片段，以使得夹心片段能够首尾串联并最终形成线状长链；
所述RNA探针1的序列为CGGCUGGGGCGAUACCAGCCGAAA；
所述RNA探针2的序列为CCAGCCGAAAGGCCCUUGGCAGCGUCGGG-NH2。
2.如权利要求1所述的基于RNA适体的茶碱定量检测方法，其特征在于，RNA探针1通过一分子组装界面与电极结合。
3.如权利要求2所述的基于RNA适体的茶碱定量检测方法，其特征在于，该分子组装界面是具有四面体结构的DNA分子。
4.如权利要求3所述的基于RNA适体的茶碱定量检测方法，其特征在于，该具有四面体结构的DNA分子由4条DNA探针组成，该4条DNA探针的序列分别为：
DNA探针a：CCAGCCGAAAACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA；
DNA探针b：HS-C6-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC；
DNA探针c：HS-C6-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC；
DNA探针d：HS-C6-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT。
5.如权利要求1所述的基于RNA适体的茶碱定量检测方法，其特征在于，所述电信号分子为银纳米颗粒。
6.如权利要求1所述的基于RNA适体的茶碱定量检测方法，其特征在于，所述电极为金电极。
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