CN107532218A - 稳定化还原剂及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了稳定化还原剂及将其用于样品制备的方法。本文描述的稳定化还原剂为发生副反应的还原剂提供了易于使用的替代还原剂，所述副反应可致使其作为还原剂无效和/或降低可用还原剂的浓度。在一些情况下，稳定化还原剂是可以在向所述还原剂施加刺激之后活化的可活化还原剂。

Description

稳定化还原剂及其使用方法

交叉引用

本申请案要求2015年5月18日提交的美国临时专利申请案序列号62/163,298的优先权，该申请案以引用的方式整体并入本文用于所有目的。

发明背景

许多关键反应对反应混合物中存在的各种试剂的浓度都高度敏感，使得只有当某些试剂在非常狭窄的浓度窗口范围内存在时才可以实现有效反应。在一些情况下，这可能是由于反应中所涉及的计量化学，其中特定试剂的浓度超过反应所需的浓度可能有毒。在其它情况下，指定试剂的瞬变特性，例如不稳定性、挥发性或交叉反应性，可能需要其在特定时刻以指定浓度存在于反应中。

在使用这些瞬变试剂执行化学过程中可产生困难，因为它们可能需要在每次使用之前制备新鲜试剂，需要在高度受控且可能是次优的条件下使用，和/或在通过反应试剂盒将反应过程转移给其他人(例如消费者)中产生极度困难等。

发明概要

期望能够通过提供稳定化试剂组合物为瞬变试剂提供替代试剂，稳定化试剂组合物可以更精确地提供所需浓度的指定反应物，同时呈易于为广泛不同技巧水平的研究人员使用的稳固宽容形式提供反应物。本公开解决了这些和其它需求。

本公开提供了稳定化还原剂及其使用方法。稳定化还原剂可用于各种情况，包括样品制备。而且，还原剂的稳定可使其成为可活化还原剂。此类稳定化、可活化还原剂可在向还原剂施加刺激后活化。

本公开的一个方面提供了一种用于核酸扩增的方法。该方法包括在反应体积中提供试剂，其中所述试剂包含第一组分，所述第一组分通过可还原键联与第二组分偶联，并且其中所述反应体积包括模板核酸分子和稳定化还原剂；借助于稳定化还原剂裂解所述可还原键联以使第一组分与第二组分去偶联；并且使用第一组分，使模板核酸分子经受扩增反应，以得到作为所述模板核酸分子扩增产物的核酸分子。在一些情况下，在使模板核酸分子经受扩增反应之前，所述稳定化还原剂对于可还原键联的还原活性可有至多20％的变化。在一些情况下，在使模板核酸分子经受扩增反应之前，所述稳定化还原剂对于可还原键联的还原活性可有至多10％的变化。在一些情况下，在使模板核酸分子经受扩增反应之前，所述稳定化还原剂对于可还原键联的还原活性可有至多5％的变化。在一些情况下，在使模板核酸分子经受扩增反应之前，所述稳定化还原剂对于可还原键联的还原活性可有至多1％的变化。而且，在一些情况下，使模板核酸分子经受扩增反应可包括使所述反应体积的温度循环。在一些情况下，使模板核酸分子经受扩增之后，所述方法还包括提供所述扩增产物的至少一部分的序列。

在一些情况下，所述稳定化还原剂包含含稳定化硫醇的化合物。在一些情况下，所述含稳定化硫醇的化合物包含空间受阻的硫醇基团。在一些情况下，所述含稳定化硫醇的化合物包含青霉胺。在一些情况下，第二组分包含珠粒。

在一些情况下，第一组分包含核酸分子且第二组分包含大分子基质。在一些情况下，所述大分子基质包含聚合物基质。在一些情况下，所述聚合物基质包含水凝胶。在一些情况下，所述水凝胶包含交联聚丙烯酰胺。在一些情况下，所述交联聚丙烯酰胺通过可还原交键联交联，并且所述方法还可包括在使模板核酸分子经受扩增反应之前裂解所述可还原交键联。在一些情况下，所述可还原交键联包括二硫键联。

在一些情况下，所述可还原键联包括连接所述核酸分子与所述聚合物基质的二硫键联。在一些情况下，所述核酸分子包含条码序列。在一些情况下，所述扩增产物包含条码序列。在一些情况下，所述扩增产物包含局部发夹结构。

在一些情况下，在油包水乳液中的液滴的水性内部提供所述反应体积。在一些情况下，所述反应体积包含酶，例如，参与所述扩增反应的聚合酶。在一些情况下，在一些情况下，在一些情况下，在一些情况下，所述第一组分包含参与所述扩增反应的引物。

另一方面，本公开提供了一种进行还原反应的方法。该方法包括在反应体积中提供试剂，其中所述试剂包含第一组分，所述第一组分通过可还原键联与第二组分偶联，并且其中所述反应体积包括呈非活性状态的还原剂，使得所述还原剂与所述可还原键联基本上不反应；使所述还原剂经受活化条件，使得所述还原剂变得与所述可还原键联有反应性；并且容许所述还原剂与所述可还原键联反应以使所述第一组分与所述第二组分去偶联。在一些情况下，该方法还包括测定所述扩增产物的至少一部分序列的序列。

在一些情况下，所述反应体积包括模板核酸分子并且所述第一组分包含引物。所述方法还可包括在容许所述还原剂与可还原键联反应之后，使用所述第一组分，使所述模板核酸分子经受扩增反应，以得到作为所述模板核酸分子扩增产物的核酸分子。在一些情况下，所述引物包含条码序列。

在一些情况下，所述活化条件包括向所述反应体积添加热能。在一些情况下，所述活化条件裂解所述还原剂的共价键。在一些情况下，呈其非活性状态的所述还原剂是稳定化还原剂。在一些情况下，所述稳定化还原剂包含含稳定化硫醇的化合物。在一些情况下，所述含稳定化硫醇的化合物包含空间受阻的硫醇基团。

在一些情况下，所述含稳定化硫醇的化合物包含经取代的二硫丁胺(DTBA)。在一些情况下，所述经取代的DTBA包含：

在一些情况下，所述第二组分包含珠粒。在一些情况下，所述第一组分包含核酸分子且所述第二组分包含大分子基质。在一些情况下，所述大分子基质包含聚合物基质。在一些情况下，所述聚合物基质包含水凝胶。在一些情况下，所述水凝胶包含交联聚丙烯酰胺。在一些情况下，所述交联聚丙烯酰胺通过可还原交键联交联。在一些情况下，所述可还原交键联包括二硫键联。在一些情况下，在使所述还原剂经受活化条件之后，所述方法还包括裂解所述可还原交键联。

在一些情况下，所述可还原键联包括连接所述核酸分子与所述聚合物基质的二硫键联。在一些情况下，所述核酸分子包含条码序列。在一些情况下，在油包水乳液中的液滴的水性内部提供所述反应体积。在一些情况下，所述反应体积包含酶，其可以是，例如聚合酶。

另一方面，本公开提供了一种还原剂，其包含：

本公开另外的方面和优点对于本领域的技术人员而言从下列详细描述将变得显而易见，其中仅示出并描述了本公开的说明性实施方案。正如将意识到的那样，本公开能够有其它不同的实施方案，并且其几个细节能够在各个明显方面进行修改，其全部都不背离本公开。因此，本质上要将附图和说明书视为说明性的，而非限制性的。

以引用方式并入

本说明书中提到的所有公开案、专利和专利申请以引用的方式并入本文，其程度如同特别地且单独地指出将每个单独的公开案、专利或专利申请以引用的方式并入一样。在以引用的方式并入的公开案和专利或专利申请与本说明书中所含的公开内容矛盾的程度上，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾材料。

附图简述

在所附权利要求书中特别阐述了本发明的新颖特征。参考以下阐述说明性实施方案(其中利用了本发明的原理)的详细描述和附图(本文也称为“图片”和“图”)，将获得对本发明特征和优点更好的理解，图中：

图1提供了示例还原剂的化学结构；

图2提供了二硫苏糖醇(DTT)氧化的图示(图A)、二硫丁胺(DTBA)氧化的图示(图B)和本文描述的示例经取代的DTBA还原剂的功能性的图示(图C)；

图3(图A-F)提供了用于核酸片段条码化和扩增的示例方法的示意图；

图4提供了在实施例1中描述的实验中获得数据的图示；

图5(图A和B)提供了在实施例2中描述的实验中获得数据的图示；

图6(图A、B和C)提供了在实施例3中描述的实验中获得数据的图示；

图7(图A、B和C)提供了在实施例4中描述的实验中获得数据的图示；

图8(图A、B和C)提供了在实施例5中描述的实验中获得数据的图示；

图9(图A、B和C)提供了在实施例6中描述的实验中获得数据的图示；

图10(图A和B)提供了在实施例7中描述的实验中获得数据的图示；

图11提供了在实施例8中描述的实验中获得数据的图示；

图12提供了在实施例9中描述的实验中获得数据的图示；及

图13示意性描绘了本文描述的示例计算机控制***。

具体实施方式

虽然本文已经示出并描述了本发明的各个实施方案，但对于本领域的技术人员将显而易见的是，此类实施方案仅以举例的方式提供。对于本领域的技术人员而言在不背离本发明的前提下可进行许多改变、变化和取代。应理解，可以采用本文描述的本发明实施方案的各种替代方案。

稳定化还原剂

本公开提供了包含稳定化还原剂的组合物及那些组合物在各种不同方法和工艺中的用途。对于许多所需反应而言，例如，对于分析、加工或其它用途而言，采用还原剂以便引发所需还原反应和/或利用还原反应的产物的一个或多个反应，或防止对不需要的氧化反应的引发。常见还原剂的实例包括(S)-2-氨基丁烷-1,4-二硫醇盐酸盐(例如，参见图1中的图A)、二硫苏糖醇(DTT)(例如，参见图1中的图B)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)(例如，参见图1中的图C)。

本文描述的稳定化还原剂以许多方式中的一种或多种提供反应性还原剂的稳定性。稳定化还原剂，如本文中所用，通常是指包含通过降低或基本上抑制其在一种或多种非所需反应(包括，例如还原反应、氧化反应或其它不期望的副反应、挥发等)中的反应性来保持其用于所需还原反应的还原电位的结构和/或功能性的还原剂。在一些情况下，稳定化还原剂包含一个或多个在还原反应中具有还原活性的空间受阻的官能团。例如，在包含一个或多个反应性硫醇基团的稳定化还原剂的情况下，硫醇基团可被分子中的一个或多个其它官能团空间阻碍。而且，也可通过生成呈非活性状态的还原剂使稳定化还原剂稳定化。在一些情况下，可通过取代还原剂的一个或多个官能团将活性还原剂转化为非活性状态。取代可为还原剂的还原性官能团提供空间阻碍，致使此类基团低反应性或无反应性。在一些情况下，还原剂的经取代形式可如以下所讨论的那样转化为活性状态。

而且，稳定化还原剂可以呈防止在常规储存条件下氧化的形式提供。还原剂易于氧化，因为它们反应，包括经由分子内反应，形成氧化产物。例如，如图2(图A)所示，DTT在氧化反应中(例如，在空气的存在下)可自身反应以生成具有环结构的氧化形式的DTT。氧化形式的DTT与其还原形式相比活性较低或无效，因此，这种氧化倾向可限制DTT作为还原剂的有效性。在另一实例中，如图2(图B)所示，二硫丁胺(DTBA)在氧化反应中可自身反应以生成同样具有环结构的氧化形式的DTBA。与DTT类似，氧化形式的DTBA与其还原形式相比活性较低或无效，因此，这种氧化倾向可限制DTBA作为还原剂的有效性。

另外或可选地，稳定化还原剂可以呈与物质反应性较低的形式提供，其中此类反应是目标反应不太需要的副反应，或其中此类试剂可不易挥发或瞬变。通过提供稳定化试剂，可以更肯定的是供给的原反应浓度的指定试剂在使用时将保持不变并且在有用浓度范围内。可选地，可以为反应给予过量的指定试剂，对目标反应可能有负面影响，或者可以精确预测在特定条件下发生反应时将存在多少反应物。

在一些情况下，为了引发所需还原反应，可需要阈值水平的还原剂。然而，许多还原剂由于(例如)氧化(例如，如上所述的DTT、DTBA)在储存时随时间推移而具有相对较低的稳定性。因而，并且如上所述，为了确保可以向目标反应递送足量的还原剂，可能需要反应过量加剂，因为无法确定陈年试剂的还原能力。如上所述，为反应加过量还原剂本身可能对反应或其组成反应物具有显著的负面影响。因而，期望提供随时间推移具有相对较高稳定性的还原剂，以便可以更容易地了解应用于任何指定反应的还原能力。

对于许多情况而言，目标反应对反应混合物中存在的反应性还原剂的量高度敏感。因此，反应混合物内反应性还原剂的量的较小波动可对反应效力具有显著影响，并且在一些情况下，甚至具有显著的负面影响。试剂在本质上瞬变时，不管使用者理解或不理解，可简单地发生这些较小波动。因此，按有用浓度提供的试剂到使用时可在有用浓度范围之外。这在想要运输试剂并储存一段时间时，例如，当试剂盒供消费者使用时会成问题。而且，在一些情况下，不稳定的还原剂可引起不期望的副反应，这可以导致所需反应产物的量不可预知且往往减少。在一些情况下，不稳定的还原剂可与一种或多种非所需物质反应，这可以影响由还原反应或利用还原反应的一种或多种产物的任何下游还原反应生成的反应产物。还原剂浓度的波动，如以上所讨论的，可进一步放大与不稳定的还原剂相关的不可预知的/负面效应。

例如，相对不稳定的还原剂，例如DTT或DTBA，可在还原反应和/或任何下游反应中产生不同的反应性能(例如，反应产物的生成)，由于反应体积中还原剂的浓度随时间推移可变，下游反应依赖还原剂的还原活性以使得一种或多种反应组分和/或条件可用于下游反应。而且，使用抑制量的还原剂(例如，以补偿活性还原剂由于非所需氧化的损失)时，相对不稳定的还原剂可以对一种或多种反应组分发挥抑制作用，也导致可变并且可能降低的反应性能。例如，相对高浓度的还原剂可在反应期间抑制酶，例如核酸扩增反应中的聚合酶。因此，本公开的稳定化还原剂可在还原反应和/或任何下游反应中提供更恒定的反应性能(并且，可能提供更高的产物产量)，下游反应依赖稳定化还原剂的还原活性以使得一种或多种反应组分和/或条件可用于下游反应。

在还原反应和/或依赖稳定化还原剂的还原活性的任何下游反应过程中稳定化还原剂的还原活性可相对恒定。例如，在还原反应和/或依赖稳定化还原剂的还原活性的任何下游反应过程中稳定化还原剂的还原活性可有至多50％、至多40％、至多35％、至多30％、至多25％、至多20％、至多15％、至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％的变化或在反应过程中可变化更少。在另一实例中，在一些情况下暴露于O₂之后，在至多约1小时、30分钟、20分钟、10分钟、5分钟、1分钟、30秒、10秒或1秒的时间段内，稳定化还原剂的还原活性可有至多50％、至多40％、至多35％、至多30％、至多25％、至多20％、至多15％、至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％的变化。在一些情况下，在还原反应和/或依赖稳定化还原剂的还原活性的任何下游反应过程中稳定化还原剂的还原活性在反应过程中可有至多20％的变化。在一些情况下，在还原反应和/或依赖稳定化还原剂的还原活性的任何下游反应过程中稳定化还原剂的还原活性在反应过程中可有至多10％的变化。在一些情况下，在还原反应和/或依赖稳定化还原剂的还原活性的任何下游反应过程中稳定化还原剂的还原活性在反应过程中可有至多5％的变化。在一些情况下，在还原反应和/或依赖稳定化还原剂的还原活性的任何下游反应过程中稳定化还原剂的还原活性在反应过程中可有至多1％的变化。

稳定化还原剂可具有基本上稳定的还原活性。在一些实例中，在一段时间内在具有可还原联建的试剂不存在而O₂存在时，稳定化还原剂浓度的降低速率低于DTT、DTBA或(S)-2-氨基丁烷-1,4-二硫醇盐酸盐的浓度在该时间段内的降低速率。稳定化还原剂与DTT、DTBA或(S)-2-氨基丁烷-1,4-二硫醇盐酸盐相比可具有较低氧化速率。稳定化还原剂与DTT、DTBA或(S)-2-氨基丁烷-1,4-二硫醇盐酸盐相比对可还原键联(例如，二硫键联)可具有较高选择性。

青霉胺(例如，参见图1D)，包括D-青霉胺和L-青霉胺是稳定化还原剂的实例。青霉胺呈其D和L立体异构体形式均可为反应性还原剂。取代青霉胺的α-碳(例如，用甲基)降低了相邻硫原子的反应性。硫醇基团降低的反应性容许青霉胺起还原剂的作用，其通常不具有反应性来参与可抑制依赖于还原剂的功能性的反应或另一所需反应的一个或多个副反应。立体稳定化还原剂的另一实例为TCEP。

此外，稳定化还原剂可起到可活化还原剂的作用。在此类情况下，稳定化还原剂可在未活化时在还原反应的情况下通常反应性较低或无反应性。而且，可通过将稳定化、可活化还原剂(例如，或包含可活化还原剂的反应体积)暴露于一种或多种刺激来活化稳定化、可活化还原剂。此类刺激的实例包括热刺激(例如，添加或去除热能如热量)、化学刺激(例如，使稳定化、可活化还原剂接触一种或多种化学活化剂)和物理刺激(例如，光)。稳定化、可活化还原剂暴露于其适当的一种或多种刺激后，还原剂可转化为活性状态。在一些情况下，稳定化、可活化还原剂对刺激的暴露使还原剂的一个或多个共价键，使其变得有活性。

稳定化、可活化还原剂可用于引发和/或控制还原反应和(在一些情况下)利用还原反应的一种或多种产物的一个或多个反应的进展。在一些情况下，就反应引发和/或控制而论，稳定化、可活化还原剂可替代反应中的另一可活化物质。例如，在核酸扩增反应中，反应中所用的可活化聚合酶可为热启动聚合酶，由此对于合适的聚合酶功能性而言需要适当温度。使聚合酶暴露于适当温度之后，引发了核酸扩增反应。稳定的、可活化还原剂可用作热启动聚合酶的替代物用于引发核酸扩增反应。在此类情况下，可以使用无热启动依赖性功能性的聚合酶。还原剂活化之后，可进行还原反应和任何下游反应。在一些情况下，还原剂和另一试剂均可活化，例如热启动，以便更好地控制目标反应的引发和进展。

图2(图C)描绘了呈经取代的DTBA形式的稳定化、可活化还原剂的实例(图2C中的“可活化DTBA”)。图2(图C)中所示的经取代的DTBA可通过使DTBA与马来酸酐反应生成。呈其稳定化形式时，如图2(图C)所示，由于其硫醇基团的空间受阻，经取代的DTBA通常不能够进行分子内氧化。另外，其硫醇基团的空间受阻还降低或抑制其作为还原剂的反应性。经取代的DTBA暴露于适当温度(例如，经由加热)之后，柠康酸可从经取代的DTBA裂解(例如，经由经取代的DTBA的C-N共价键的裂解)以得到活性形式的DTBA，其可在能力范围内起还原剂的作用。DTBA稳定化为经取代的DTBA可防止DTBA在其储存期间氧化为其氧化产物并且还容许其用于通过向DTBA施加热刺激而引发的受控反应中。

使用稳定化还原剂进行反应的方法

本文提供了进行反应的方法。一方面，本公开提供了一种进行反应的方法。所述反应可在包括试剂的反应体积中进行，所述试剂包括第一组分，所述第一组分通过可还原键联与第二组分偶联。反应体积还可包括稳定化还原剂(例如，可能有或无活性)，其(例如，在活化之后)裂解可还原键联并且使第一组分从第二组分释放。释放的第一组分然后可参与反应。第一组分可包括多种不同类型的试剂或试剂组中的一种。例如，在某些情况下，第一组合可包含生物分子，例如蛋白质、酶、肽、小分子、抗体或抗体片段或核酸例如DNA、RNA或这些的寡核苷酸或多核苷酸部分。而且，可以使用任何合适的稳定化还原剂，包括含稳定化硫醇的化合物(例如，包含空间受阻的硫醇基团如青霉胺)和/或如本文别处描述的稳定化、可活化还原剂(例如经取代的DTBA)。

另一方面，本公开提供了一种用于核酸扩增的方法。该方法可包括在反应体积中提供试剂，其中所述试剂包含第一组分，所述第一组分通过可还原键联与第二组分偶联。所述反应体积还包括模板核酸分子和稳定化还原剂。所述方法还可包括借助于稳定化还原剂裂解可还原键联(例如，从而使第一组分与第二组分去偶联)并且使用第一组分，使模板核酸分子经受扩增反应，以得到作为所述模板核酸分子扩增产物的核酸分子。任何合适的稳定化还原剂均可使用，包括如本文别处描述的含稳定化硫醇的化合物(例如，包含空间受阻的硫醇基团，如青霉胺)。而且，可通过使反应体积的温度循环(例如，热循环)进行扩增反应。在一些情况下，所述方法还可包括测定如本文别处描述的扩增产物的至少一部分序列。

对于可还原键联且在提供反应体积，裂解可还原键联和/或使模板核酸分子经受扩增反应的过程中稳定化还原剂的还原活性可相对恒定。稳定化还原剂相对恒定的还原活性可导致生成低可变量的扩增产物和/或更高产量。例如，对于可还原键联且在提供反应体积，裂解可还原键联和/或使模板核酸分子经受扩增反应的过程中稳定化还原剂的还原活性可有至多50％、至多40％、至多35％、至多30％、至多25％、至多20％、至多15％、至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％的变化或可变化更少。在一些情况下，对于可还原键联且在提供反应体积，裂解可还原键联和/或使模板核酸分子经受扩增反应的过程中稳定化还原剂的还原活性可有至多20％的变化。在一些情况下，对于可还原键联且在提供反应体积，裂解可还原键联和/或使模板核酸分子经受扩增反应的过程中稳定化还原剂的还原活性可有至多10％的变化。在一些情况下，对于可还原键联且在提供反应体积，裂解可还原键联和/或使模板核酸分子经受扩增反应的过程中稳定化还原剂的还原活性可有至多5％的变化。在一些情况下，对于可还原键联且在提供反应体积，裂解可还原键联和/或使模板核酸分子经受扩增反应的过程中稳定化还原剂的还原活性可有至多1％的变化。

如上所述，稳定化还原剂可具有基本上稳定的还原活性。在一些实例中，在一段时间内在所述试剂不存在而O₂存在时，稳定化还原剂浓度的降低速率低于DTT、DTBA或(S)-2-氨基丁烷-1,4-二硫醇盐酸盐的浓度在该时间段内的降低速率。稳定化还原剂与DTT、DTBA或(S)-2-氨基丁烷-1,4-二硫醇盐酸盐相比可具有较低氧化速率。稳定化还原剂与DTT、DTBA或(S)-2-氨基丁烷-1,4-二硫醇盐酸盐相比对可还原键联(例如，二硫键联)可具有较高选择性。

另一方面，本公开提供了一种进行还原反应的方法。该方法可包括在反应体积中提供试剂，其中所述试剂包含第一组分，所述第一组分通过可还原键联与第二组分偶联。所述反应体积还包括呈非活性状态的还原剂，使得所述还原剂与所述可还原键联基本上不反应。所述方法还可包括使所述还原剂经受活化条件，使得所述还原剂变得与所述可还原键联有反应性并容许还原剂与可还原键联反应，从而使第一组分与第二组分去偶联。一般而言，反应体积中的还原剂可以是呈其非活性状态的可活化还原剂，由此活化条件使可活化还原剂活化，使其与可还原键联有反应性。在一些情况下，还原剂可包含如本文别处所描述的稳定化、可活化还原剂(例如，经取代的DTBA)。

在一些情况下，活化条件可包括向反应体积并因此向还原剂施加刺激。如本文别处所述，此类刺激的实例包括热刺激(例如，向反应体积添加热量)、化学刺激和物理刺激。在一些情况下，活化条件包括向反应体积添加热量。

在一些情况下，反应体积可包括模板核酸并且方法还可包括使用第一组分，使模板核酸分子经受扩增反应以得到作为模板核酸分子扩增产物的核酸分子。而且，所述方法还可包括测定所述扩增产物的至少一部分序列的序列。

在各个方面中，第一组分可包含核酸分子，例如引物。反应体积包含模板核酸分子时，所述引物可用于扩增模板核酸分子以得到作为核酸分子扩增产物的核酸分子。在一些情况下，如本文别处所述，所述引物可包含可用于核酸测序的条码序列。用包含核酸条码的引物扩增模板核酸分子可产生包含条码序列的扩增产物(例如，参见图3)。

在各个方面中，第二组分可包含载体组分，其可包括载体分子和/或载体颗粒。载体组分可包含大分子(例如大分子基质，如聚合物基质)或可以为指定反应体积中的试剂提供相对稳定性的其它组分和/或其可包含(例如)利于一些附加活性，例如跨细胞膜运输等的活性载体组分。在一些情况下，载体组分可包含与第一组分通过可还原键联连接的颗粒或珠粒组分。例如，第一组分可包含核酸分子且第二组分可包含大分子基质，其中大分子组分可包括在颗粒或珠粒中。已经描述了各种不同的颗粒，一般用作试剂的载体，且尤其是生物分子，包括例如有机和无机颗粒，如琼脂糖珠粒、硅珠、聚丙烯酰胺珠粒、磁珠、铁磁珠等。此类珠粒可包括活性位点，试剂可通过活性位点与珠粒结合或缔合。如本文所指出的，该键联可包括可还原键联，例如二硫键联等。

在一些情况下，载体组分可包含聚合物颗粒或珠粒，其包含任何合适的聚合物种类的聚合物基质(包括水凝胶)。例如，聚合物颗粒或珠粒可包含聚合物基质，如交联聚丙烯酰胺(例如，交联线性聚丙烯酰胺)的基质。交联聚丙烯酰胺(例如，交联线性聚丙烯酰胺)可通过可还原交键联例如二硫键联交联。聚丙烯酰胺珠粒的实例包括例如美国专利公开案第2014/0378345号和2015年5月18日提交的美国临时专利申请第62/163,238号中描述的那些，其全部公开内容以引用的方式整体并入本文用于所有目的。在一些方面中，除第一组分和第二组分之间的可还原键联外，还原剂(例如，稳定化还原剂)也可裂解第二组分的可还原交键联。此类裂解可进一步帮助第一组分与第二组分去偶联。在一个实例中，第二组分可为包含胱胺交键联的聚丙烯酰胺凝胶珠粒。颗粒暴露于还原剂(例如，稳定化还原剂、活化还原剂)后，胱胺的二硫键联被破坏并且颗粒可降解为其低级聚合物组分。

在各个方面中，反应体积可包含参与反应体积的反应的酶。稳定化还原剂可防止酶与还原剂的抑制性副反应，包括在相对高浓度的还原剂下。在一些情况下，还原剂可通过还原酶的一个或多个二硫键联来抑制酶。例如，DTT可还原聚合酶的二硫键联，使得二硫键联裂解成单独的游离硫醇基团。取决于特定的酶，此类副反应可能是不期望的。稳定化还原剂，例如青霉胺，可通过与酶形成二硫键联而还原酶的二硫键联，从而仅产生单个游离硫醇，而非一对硫醇。稳定化还原剂的此类功能性可对酶性能产生较少可变性/较少抑制并且，因此在下游产量上产生较小可变性且下游产量更高。发生核酸扩增反应时，酶可为参与核酸扩增反应的聚合酶。聚合酶的非限制性实例包括天然和经修饰的DNA聚合酶，如Taq聚合酶、突变校正聚合酶、古细菌聚合酶，如9degrees north、Pfu、Deep Vent及这些酶的外切核酸酶缺陷形式、phi29聚合酶、Klenow等。

反应包括核酸扩增反应，例如模板核酸的扩增时，反应体积可包括适于作为扩增反应的一部分进行的引物延伸反应的组分(即，引物、一种或多种聚合酶、dNTP等)。可完成的扩增反应的实例包括聚合酶链反应(PCR)、数字PCR、逆转录PCR、多重PCR、巢式PCR、重叠-延伸PCR、定量PCR、多重置换扩增(MDA)或连接酶链反应(LCR)及液滴内扩增(例如，数字PCR)。美国专利公开案第2014/0378345号提供了扩增反应另外的实例，其全部公开内容以引用的方式整体并入本文用于所有目的。

各个方面包括可以在任何合适的反应容器中提供的反应体积。可容纳反应体积的反应容器的非限制性实例包括管(例如，离心管、微量离心管、小瓶、试管等)、孔、多孔板(例如，微型板)的孔、烧杯、烧瓶、微胶囊和胶束。反应容器的另一实例类型为乳液的液滴。乳液(例如，油包水乳液、水包油乳液)可以提供多个液滴，其各自包含反应体积。因此，乳液和液滴技术可容许在单一介质(例如，乳液)中同时有许多个反应体积(例如，各自具有反应体积的单独液滴)。

混合两种或更多种不混溶液体，例如水和油时，可形成液滴。包含两种或更多种不混溶液体的混合物的实例为乳液，例如油包水乳液。分散在小球中的第一液体可称为非连续相，而其中分散有小球的第二液体可称为连续相或分散介质。在一些实例中，连续相可为疏水性流体，如油，并且非连续相可为水相溶液。此类混合物可视为油包水乳液，其中水性液滴分散在油连续相中。在其它情况下，乳液可为水包油乳液。在此类乳液中，非连续相可为疏水性溶液(例如，油)且连续相可为水溶液，其中油滴分散在水相中。在一些实例中，乳液可包含多重乳液。多重乳液可包含包围一个或多个较小液滴的较大流体液滴(即，液滴内液滴)。多重乳液可含一种、两种、三种、四种或更多种嵌套流体，产生越来越复杂的液滴内液滴。

可根据化学性质，其中例如分子结构、含量、溶剂化强度、粘度、沸点、热膨胀系数、水包油溶解性、油包水溶解性、介电常数、极性、油包水表面张力和/或水包油表面张力。用于乳液(例如，油包水乳液)中的油的实例包括但不限于氟化油、非氟化油、烷烃、包含三氟乙酸的油、包含六氟异丙醇的油、Krytox油(例如，包含六氟环氧丙烯和/或其聚合物的油)、包含聚六氟氧化丙烯和/或其聚合物的油、Krytox GPL油、包含全氟聚醚的油、包含全氟烷基醚的油、包含全氟聚烷基醚的油、Solvay Galden油和包括氢氟醚的油(例如，HFE-7500、HFE-7100、HFE-7200、HFE-7600)。

乳液还可包含表面活性剂。表面活性剂可为含氟表面活性剂。表面活性剂可以稳定连续相内的液滴。用于稳定氟化油和其它油中的液滴的含氟表面活性剂的实例在美国专利公开案第2010/0105112号中有详细描述，其全部公开内容据此以引用的方式整体并入。在一些实例中，油包水乳液可包含本文描述的具有一种或多种表面活性剂(例如，含氟表面活性剂)的一种或多种油，其中水性液滴分散在油中。

液滴可通过多种方法形成。在非水或油连续相中产生稳定液滴的乳化体系在例如美国专利公开案第2010/0105112号中有详细描述。在一些情况下，微流体通道网络可用于产生液滴。此类微流体装置的实例包括在2015年4月9日提交的美国专利申请第14/682,952号中详细描述的那些，所述申请的全部公开内容以引用的方式整体并入本文用于所有目的。液滴可以规则周期性形成或者可以不规则的周期性形成。在一些方面中，液滴的大小和/或形状可由在其中形成液滴的通道的大小和形状决定。

在一些实例中，液滴通常通过以下方式产生：使水性液流(例如，包含反应体积的组分如试剂和还原剂(稳定化还原剂等))流入微流体***的两个或更多个通道的接合处，非水流体液流(例如，氟化油)也流入接合处，以便在非水性流体的流动液流中产生液滴。液滴内容物包含水性内部，其包含反应体积。可通过控制体系的多个不同参数，包括例如，水性液流中物质的浓度、水性液流和/或非水液流的流速等来调节液滴内物质的相对量。

液滴的总体积可小于1000pL、小于900pL、小于800pL、小于700pL、小于600pL、小于500pL、小于400pL、小于300pL、小于200pL、小于100pL、小于50pL、小于20pL、小于10pL或甚至小于1pL。液滴可为单分散性(即，大小基本上均匀)或多分散性(即，大小基本上不均匀)。可产生多个液滴。

取决于特定的乳液，乳液可包含不同数量的液滴。例如，乳液可包含至少10个液滴、至少50个液滴、至少100个液滴、至少500个液滴、至少1000个液滴、至少5000个液滴、至少10,000个液滴、至少50,000个液滴、至少100,000个液滴、至少500,000个液滴、至少1,000,000个液滴、至少5,000,000个液滴、至少10,000,000个液滴、至少50,000,000个液滴、至少100,000,000个液滴及以上。

用于制备核酸测序文库的稳定化还原剂

本文描述的稳定化还原剂可用于样品制备以进行核酸测序。此类还原剂可用于控制可产生测序文库的核酸扩增反应。在一些情况下，可产生核酸分子文库，其中该文库包含多个液滴或其它类型的包含核酸分子的分区。制备分区内的核酸分子文库的实例详细提供于例如，美国专利公开案第2014/0378345号、2014年6月26日提交的美国临时专利申请第62/017,808号和2015年1月12日提交的美国临时专利申请62/102,420中，其全部公开内容以引用的方式整体并入用于所有目的。当核酸分子文库包含多个具有核酸分子的液滴时，可以使所述多个液滴去稳定化，从而使核酸分子从所述多个液滴释放到公共库中。释放的核酸分子(例如，靶核酸分子)可从公共库中回收/纯化。适于纯化液滴内容物(包括核酸)的纯化方法详细提供于2015年2月24日提交的美国临时专利申请第61/119,930号中，其全部公开内容以引用的方式整体并入本文用于所有目的。纯化的核酸分子可任选地进行如本文别处所述的进一步加工并进行测序，由此可以测定纯化核酸分子(或经进一步加工的纯化核酸分子)的至少一个子集的序列。可通过任何合适类型的测序平台，包括本文别处描述的实例平台来进行测序。

图3示出了可在液滴(例如，具有反应体积)中进行并且可用于在多个液滴中产生核酸测序文库的扩增反应的实例。在该实例中，包括条码序列的寡核苷酸连同样品核酸304一起共同分隔在乳液中的液滴302内。寡核苷酸308可通过可还原键联(例如，二硫键联)与珠粒306偶联，该珠粒可随样品核酸304一起分隔，如图A所示。珠粒306还可包含通过可还原键联(例如，二硫键联)交联的交联聚丙烯酰胺的聚合物基质，可还原键联可能是或可能不是连接寡核苷酸308与珠粒306的相同可还原键联。除一个或多个功能序列，例如序列310、314和316外，寡核苷酸308还包括条码序列312。例如，将寡核苷酸308显示为包含条码序列312，以及序列310，其可起到指定测序***的附着或固定序列的作用，例如用于附着于Illumina Hiseq或Miseq***中的流动室的P5序列。如图所示，寡核苷酸308还包括引物序列316，其可包括用于引发部分样品核酸304复制的随机或靶向N-聚体。在寡核苷酸308中还可包括序列314，其可提供测序引发区，如“read1”或R1引发区，引发区可用于通过测序***中的合成反应而引发聚合酶介导的、模板引导的测序。在许多情况下，条码序列312、固定序列310和R1序列314可为附着于指定珠粒的所有寡核苷酸共有。引物序列316对于随机N-聚体引物而言可以变化，或者可为用于某些靶向应用的指定珠粒上的寡核苷酸所共有的。

液滴302还可包括稳定化还原剂330。在一些情况下，稳定化还原剂330可呈活性状态(例如，青霉胺)，以致其可以还原寡核苷酸308和珠粒306之间的可还原键联(例如，二硫键联)和/或珠粒306的任何可还原交键联(例如，二硫键联)。偶联的寡核苷酸308和珠粒306可在其可还原键联被稳定化还原剂330裂解之后去偶联。去偶联的寡核苷酸然后可作为引物参与扩增样品核酸304的扩增反应(例如，图3B-F，如本文所述)。

稳定化还原剂330的还原活性在还原可还原键联和/或进行扩增反应的过程中可相对恒定。稳定化还原剂相对恒定的还原活性可在扩增产物328产量上产生较小可变性且扩增产物328产量更高。例如，在寡核苷酸308与珠粒306去偶联和/或在扩增反应中扩增样品核酸304的过程中，稳定化还原剂330的还原活性可有至多50％、至多40％、至多35％、至多30％、至多25％、至多20％、至多15％、至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％的变化或者可变化更少。在一些情况下，在寡核苷酸308与珠粒306去偶联和/或在扩增反应中扩增样品核酸304的过程中，稳定化还原剂330的还原活性可有至多20％的变化。在一些情况下，在寡核苷酸308与珠粒306去偶联和/或在扩增反应中扩增样品核酸304的过程中，稳定化还原剂330的还原活性可有至多10％的变化。在一些情况下，在寡核苷酸308与珠粒306去偶联和/或在扩增反应中扩增样品核酸304的过程中，稳定化还原剂330的还原活性可有至多5％的变化。在一些情况下，在寡核苷酸308与珠粒306去偶联和/或在扩增反应中扩增样品核酸304的过程中，稳定化还原剂330的还原活性可有至多1％的变化。

在一些情况下，稳定化还原剂330可以是最初呈非活性状态存在于液滴302中的稳定化、可活化还原剂。例如，稳定化还原剂330可以是经取代的DTBA，例如图2(图C)所示那种。液滴302可暴露于热刺激(例如，向液滴302添加热能如加热)以便使柠康酸从经取代的DTBA裂解并且得到活性DTBA还原剂。寡核苷酸308与珠粒306之间的可还原键联为二硫键联时，则活性DTBA还原剂可还原寡核苷酸308与珠粒306之间的可还原键联。如果珠粒306也包含二硫化物交键联，则活性DTBA也可还原这些键联。偶联的寡核苷酸308和珠粒306可在其可还原键联被稳定化还原剂裂解之后去偶联。去偶联的寡核苷酸然后可作为引物参与扩增样品核酸304的扩增反应(例如，图3B-F，如下文所述)。

如图3所示，可通过图A中稳定化还原剂330的活化来发挥对图B-F所示扩增反应的控制和引发。如图3的图B-F所示的扩增通常在寡核苷酸308从珠粒306释放之后才开始。而且，使用稳定化、可活化还原剂可减少或消除使用另一可活化组分来引发/控制扩增反应的任何需要。例如，使用图2C所示的经取代的DTBA可充当热启动聚合酶的可活化替代物，热启动聚合酶也可用于引发/控制扩增反应。

在寡核苷酸308从珠粒306释放之后，可进行扩增反应。基于引物序列316的存在，去偶联的寡核苷酸308能够引发如图B所示的样品核酸，这允许使用聚合酶(例如，DeepVent聚合酶、9degrees North聚合酶)和也随珠粒306和样品核酸304共同分隔的其它延伸试剂来延伸寡核苷酸308和308a。如图C所示，在对于随机N-聚体引物而言，可退火为样品核酸304的多个不同区域的寡核苷酸延伸之后，产生核酸的多个重叠互补序列或片段，例如片段318和320。虽然包括与部分样品核酸互补的序列部分，例如序列322和324，但本文通常将这些构建体称为包含样品核酸304的具有附着条码序列的片段。正如可以认识到的那样，本文常常将如上所述的模板序列的复制部分称为该模板序列的“片段”。然而，尽管如此，但术语“片段”涵盖起始核酸序列的一部分的任何表示，例如模板或样品核酸，包括通过提供部分模板序列的其它机制，例如指定序列分子的实际片段化，例如通过酶、化学或机械片段化产生的那些。然而，在一些情况下，模板或样品核酸序列的片段可以指基础序列或其互补序列的复制部分。

然后可以使条码化核酸片段经受(例如)通过序列分析的表征，或可在如图D所示的过程中使其进一步扩增。例如，也从珠粒306释放的附加寡核苷酸，例如寡核苷酸308b，可引发片段318和320。同样，基于寡核苷酸308b中随机N-聚体引物316b(其在许多情况下可不同于指定液滴内的其它随机N-聚体，例如引物序列316)的存在，寡核苷酸随片段318退火，并且可延伸以产生包括序列322的至少一部分片段318的互补序列326，序列322包含一部分样品核酸序列的副本。寡核苷酸308b的延伸继续，直至其复制通过片段318的寡核苷酸部分308。如本文别处所指出的那样，并且如图D中说明的那样，寡核苷酸可配置为促进在所需点停止通过聚合酶复制，例如，复制通过片段318中所包括的寡核苷酸308的序列316和314之后。这可通过不同方法实现，包括例如，并入不能够通过所用聚合酶加工的不同核苷酸和/或核苷酸类似物。例如，这可包括在序列区域312内包括含尿嘧啶的核苷酸以防止非尿嘧啶耐受的聚合酶中止该区域的复制。因此可产生片段326，其在一端包括全长寡核苷酸308b，包括条码序列312、附着序列310、R1引物区314和随机N-聚体序列316b。在该序列的另一端可包括第一寡核苷酸308的随机N-聚体的互补序列316’，以及整个或部分R1序列的互补序列(显示为序列314’)。然后R1序列314及其互补序列314’能够杂交在一起形成呈局部发夹结构328的条码化核酸分子。正如可以认识到的那样，因为随机N-聚体在不同寡核苷酸中不同，所以可预计这些序列及其互补序列不会参与发夹形成，例如可预计为随机N-聚体316的互补序列的序列316’与随机N-聚体序列316b不互补。这对于其它应用而言可能并非如此，例如靶向引物，其中N-聚体是指定液滴内寡核苷酸间共有的。通过形成这些局部发夹结构328，允许从进一步复制中去除样品序列的一级副本，例如防止拷贝的反复拷贝。局部发夹结构还为所产生的片段(例如，片段326)的后续加工提供了有用的结构。

正如可以认识到的那样，图3中描绘的示例扩增方案可在任何合适类型的分区，包括非液滴分区，例如微胶囊、孔(例如，微孔)、聚合物胶囊、微反应器、胶束等中完成。

可在液滴或其它类型的分区内进行的扩增反应的附加实例，包括可用于产生用于测序的核酸文库的扩增反应，在2015年1月12日提交的美国临时专利申请第62/102,420中提供，该申请以引用的方式整体并入本文用于所有目的。

用于产生条码化核酸分子的扩增过程，例如图3中描绘的示例方法可对多个液滴并行进行。来自多个不同液滴的片段可汇集(例如，通过收集液滴并且使本文别处所述的乳液去稳定化)以产生用于在高通量测序仪上测序的测序文库。因为每个片段按照其来源的液滴编码，所以可根据条码的存在将该片段的序列归结回其来源。

释放液滴的内容物可涵盖释出液滴内容物的任何方法。释放方法的非限制性实例包括破坏液滴表面，使液滴多孔以便内容物可以扩散出液滴，并且使液滴所在的乳液去稳定化。乳液可与引起液滴去稳定化并聚结的去稳定剂混合。去稳定剂可以是诱导乳液的液滴相互聚结的任何试剂。去稳定剂可按有效诱导聚结的量存在，其中可基于乳液的体积、乳液中载液的体积和/或液滴的总体积来选择。也可或可选地基于(例如)连续相流体的类型、每一相中表面活性剂的量和类型等来选择。在一些情况下，去稳定剂可为弱表面活性剂。不希望受理论约束，弱表面活性剂可与油/水界面处引起乳液毁坏的液滴表面活性剂竞争。在一些情况下，去稳定剂可为全氟辛醇(PFO)，然而，可以使用具有小亲水基团的其它氟化合物。去稳定剂的其它实例包括一种或多种卤素取代的烃。在一些情况下，去稳定剂可主要或至少基本上由一种或多种卤素取代的烃组成。去稳定剂另外的实例在美国专利公开案第2013/018970号和2015年2月24日提交的美国临时专利申请第62/119,930号中提供，其全部公开内容以引用的方式并入本文用于所有目的。

液滴的聚结可导致产生包含液滴内容物(例如，液滴内所含反应体积的内容物)的汇集混合物(例如，公共库)。液滴是油包水乳液中的水性液滴时，汇集混合物可包含具有包括在液滴内产生的条码化核酸分子的多个反应体积的内容物的水性混合物。液滴最初分散在其中的连续相(例如，油)物质、连续相中的表面活性剂和/或任何去稳定剂可通过纯化汇集混合物中的核酸而去除。适于从液滴纯化核酸分子的纯化方法的实例在2015年2月24日提交的美国临时专利申请第62/119,930号中有详细描述，其全部公开内容以引用的方式并入本文用于所有目的。

已经从液滴中回收并纯化的条码化核酸分子可进行进一步加工和/或分析。例如，从液滴中回收的条码化核酸分子可进一步扩增，例如在PCR反应或其它类型的扩增反应中。在回收的条码化核酸分子最初少量存在且更大拷贝数量对下游测序分析有帮助时，此类扩增可能有用。而且，也可完成此类扩增反应以向回收的条码化核酸分子添加一个或多个附加序列(例如，添加附加核苷酸)。此类附加序列可引起更大核酸分子的产生并且所述一个或多个添加的序列可以是一个或多个功能序列。此类功能序列的非限制性实例包括标签、附加条码序列、与测序仪器/方案序列相容性的适配子序列(例如，P5、P7 Illumina适配子序列)、测序引物结合位点、样品指数序列等。通过扩增反应(包括本体扩增反应)向核酸分子添加附加序列的实例在美国专利公开案第2014/0378345号和2015年1月12日提交的美国临时专利申请第62/102,420号中提供，其全部公开内容以引用的方式整体并入本文用于所有目的。

在一些情况下，可通过连接过程向条码化核酸分子添加一个或多个附加序列以产生然后可以测序的较大条码化核酸分子。在一些情况下，靶核酸分子可进行剪切过程以便产生靶核酸分子适合与附加核酸序列连接的一个或多个末端。附加核酸序列可包含本文描述的任何功能序列中的一个或多个。可用于向核酸分子添加附加序列的剪切和连接方法的实例在2015年1月12日提交的美国临时专利申请第62/102,420号中详细提供，其全部公开内容以引用的方式整体并入本文用于所有目的。向条码化核酸分子添加附加序列之后，可以扩增产生的较大序列以提供更大拷贝数。剪切、连接和任何后续扩增可大量进行。

条码化核酸分子(可以或可以不进一步加工和/或纯化)或已经向其添加了一个或多个附加序列的条码化核酸分子可进行核酸测序，由此可测定条码化核酸分子或较大条码化核酸分子的序列。向条码化核酸分子添加附加功能序列在制备用于测序的条码化核酸分子中有用。可为任何合适的测序平台制备条码化核酸分子并测序，向条码化核酸分子添加的适当功能序列取决于所利用的特定平台。可通过任何合适类型的测序平台进行测序，非限制性实例包括Illumina、Ion Torrent、Pacific Biosciences SMRT、Roche 454测序、SOLiD测序等。正如可以认识到的那样，从核酸分子获得的序列可组装成较大序列，核酸分子的序列源于较大序列。一般而言，测序平台利用一种或多种算法来解释测序数据并且由较短核酸测定的序列来重新构建较大序列，包括本文所述的条码化核酸分子(例如，图3中的328)。序列组装过程的实例在2014年6月26日提交的美国临时专利申请第62/017,589号中更加详细地提供，其全部内容以引用的方式并入本文用于所有目的。

正如可以认识到的那样，稳定化还原剂用作包括扩增待测序的核酸分子的反应方案的一部分可以提高测序性能。产生一致(且可能，更高)量的扩增产物可改善获得的下游测序数据的质量和/或此类数据的后续分析。在一些情况下，使用稳定化还原剂引发扩增反应，例如图3所示的示例方法，可以降低在下游测序数据中观察到的嵌合体率。

试剂盒

另一方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含一种或多种试剂和/或用于进行还原反应(可能连同核酸扩增反应一起)的容器。因此，试剂盒可包括以下的一种或多种：稳定化还原剂(包括本文所述的类型如青霉胺)、可活化还原剂(例如，包括稳定化、可活化还原剂如经取代的DTBA)、包含寡核苷酸条码的珠粒(例如，聚合物珠粒，如聚丙烯酰胺珠粒)和用于进行核酸扩增的试剂(例如，一种或多种引物、一种或多种聚合酶、dNTP、辅因子等)。在一些情况下，试剂盒可包含适于产生乳液的试剂。此类试剂的非限制性实例包括连续相(例如，油)和水相(例如，缓冲液)。试剂盒还可包含包装(例如，盒子)。所述试剂和装置可包装到单个试剂盒中。可选地，所述试剂和装置可单独包装。试剂盒还可包含使用试剂盒的说明书。这些说明可以呈装在试剂盒包装内的纸质文件或小册子的形式。可选地，说明书可以电子形式提供(即，在因特网上)。

计算机控制***

本公开提供了经编程以实施本公开的方法的计算机控制***。图13示出了经编程或另外配置以控制和/或执行核酸扩增反应和/或本文描述的还原反应的计算机***1301。计算机***1301可以，例如调节本公开的反应参数的各个方面，包括试剂量、反应条件(例如，温度、压力、湿度)、流体处理装置、反应设备等。计算机***1301可以是使用者的电子设备或相对于该电子设备远程定位的计算机***。电子设备可以是移动电子设备。

计算机***1301包括中央处理装置(CPU，本文也称为“处理器”和“计算机处理器”)1305，其可为单核或多核处理器，或用于并行处理的多个处理器。计算机***1301还包括存储器或存储位置1310(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元1315(例如，硬盘)、用于与一个或多个其它***通信的通信接口1320(例如，网络适配器)和***设备1325，例如高速缓存、其它存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器1310、存储单元1315、接口1320和***设备1325通过通信总线(实线)，例如主板与CPU1305通信。存储单元1315可为用于储存数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机***1301可借助于通信接口1320操作性耦合至计算机网络(“网络”)1330。网络1330可为因特网，与因特网通信的互联网和/或外联网，或内联网和/或外联网。在一些情况下的网络1330为电信和/或数据网络。网络1330可包括一个或多个计算机服务器，其可以使分布式计算，如云计算成为可能。网络1330，在一些情况下借助于计算机***1301，可实现对等式网络(peer-to-peer network)，其可以使耦合至计算机***1301的装置能够起客户端或服务器的作用。

CPU 1305可执行一系列的机器可读指令，该指令可体现在程序或软件中。指令可存储在存储器位置，如存储器1310中。指令可以针对CPU 1305，这样随后可编程或另外配置CPU 1305以实施本公开的方法。通过CPU 1305进行的操作的实例可包括读取、解码、执行和回写。

CPU 1305可以是电路，例如集成电路的一部分。***1301的一个或多个组件可包括在电路中。在一些情况下，该电路为专用集成电路(ASIC)。

存储单元1315可存储文件，例如驱动程序、文库和保存的程序。存储单元1315可存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。在一些情况下计算机***1301可包括一个或多个附加数据存储单元，其在计算机***1301的外部，例如位于通过内联网或英特网与计算机***1301通信的远程服务器上。

计算机***1301可通过网络1330与一个或多个远程计算机***通信。例如，计算机***1301可与用户的远程计算机***通信。远程计算机***的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、板式或平板PC(例如，iPad、Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如，iPhone、支持Android的设备、)或个人数字助理。用户可经由网络1330访问计算机***1301。

如本文所述的方法可通过存储在计算机***1301的电子存储位置，诸如例如存储器1310或电子存储单元1315上的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现。机器可执行或机器可读代码可以呈软件形式提供。使用期间，可由处理器1305执行代码。在一些情况下，可从存储单元1315检索代码并存储在存储器1310上以便处理器1305轻易存取。在一些情形下，可除去电子存储单元1315，并且将机器可执行的指令存储在存储器1310上。

代码可预编译并且经配置以与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行期间编译。代码可用编程语言提供，可选择编程语言以使代码能够呈预编译或已编译形式执行。

本文提供的***和方法，例如计算机***1301的方方面面，可以体现在编程中。该技术的各个方面可以被认为是“产品”或“制品”，其通常呈在一类机器可读介质上携带或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式。机器可执行代码可存储在电子存储单元，例如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”型介质可包括计算机、处理器等或其相关模块的任何或所有有形存储器，例如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。全部或部分软件有时可通过英特网或各种其它电信网络通信。此类通信，例如，可使得软件从一个计算机或处理器向另一个，例如从管理服务器或主机向应用服务器的计算机平台的加载成为可能。因此，另一类可承载软件要素的介质包括光波、电波和电磁波，例如跨本地设备间的物理接口，通过有线和光固话网络和通过各种空中链路(air-links)使用。携带此类波的物理元件，例如有线或无线链路、光链路等，也可视为承载软件的介质。如本文中所用，除非限制为非临时性、有形“存储”介质，否则术语如计算机或机器“可读介质”是指参与向处理器提供指令以便执行的任何介质。

因此，机器可读介质，如计算机可执行的代码，可呈许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括，例如光盘或磁盘，如任何计算机等中的任何储存设备，例如可用于实现图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，例如此类计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括含计算机***内的总线的线。载波传输介质可以呈电信号或电磁信号或声波或光波的形式，例如射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些。因此计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、软磁盘、硬盘、磁带、任何其它磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其它光学介质、穿孔卡片纸带、具有穿孔模式的任何其它物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其它存储芯片或存储卡、载波传输数据或指令、传输此类载波的电缆或链路，或计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其它介质。这些形式中的许多计算机可读介质可涉及将一种或多种顺序的一个或多个指令携带到处理器以执行。

计算机***1301可包括电子显示器1335或与之通信，电子显示器包括用户界面(UI)1340，其用于提供，例如反应试剂的量、反应参数(例如，温度、压力、搅拌速率、时间等)，显示反应结果(例如，产物产量、产物品质等)、从反应中测量的原始数据、经分析或处理的为反应测量的数据等。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网页(web)的用户界面。

本公开的方法和***可通过一种或多种算法实现。一种算法可通过软件在由中央处理器1305执行后实现。该算法，例如，可以执行本文描述的核酸扩增反应和/或还原反应和/或获得并分析从此类反应获得的数据。

实施例

实施例1：DTT和聚合酶制剂对扩增反应性能的影响

进行三组平行扩增实验。每个实验组包括重复的反应体积，每个反应体积包含与含条码和引发序列的寡核苷酸(与图3所示的寡核苷酸308相似)连接(经由二硫键联)的聚丙烯酰胺凝胶珠粒、样品核酸分子、9degrees north聚合酶和DTT，全部在反应缓冲液中为起始浓度。每个实验组包括不同的9degrees north聚合酶制剂(如图4所示的“第3批”、“第4批”和“第5批”)并且每个实验组中的反应体积在其DTT初始浓度方面不同。每个反应体积经受热循环以在类似于图3中以图形方式描绘的示例扩增方法的扩增反应中扩增样品核酸分子。虽然产生了含扩增产物的局部发夹，但可以在本体反应体积而非如图3所示乳液中的液滴内完成扩增反应。在扩增反应期间，DTT还原寡核苷酸和珠粒之间的二硫键联，从而引发扩增反应。

图4中以图形方式描绘了各个实验组的扩增产物产量相对于还原剂初始浓度。第4批(图4中的重复实验402和405)和第5批(重复实验403和406)的实验组在通常较低的DTT初始浓度下显示出较高的扩增产物量，在较高浓度下扩增产物的量显著更低至没有。相反，第3批实验组(图4中的重复实验401和404)中产生的扩增产物与第4和5批中的那些同等或更佳并且在测试的初始DTT浓度范围内持续不变。数据表明当DTT用作还原剂时，反应性能可随不同聚合酶制剂而变化。此类差异可归因于测试的各个批次中酶的不同氧化态和/或如本文别处所述的DTT的相对不稳定特性。

实施例2：还原剂类型对扩增反应性能的影响

进行四组平行扩增实验。每个实验组包括重复的反应体积，每个反应体积包含与包含条码和引发序列的寡核苷酸(与图3所示的寡核苷酸308相似)连接(经由二硫键联)的聚丙烯酰胺凝胶珠粒、样品核酸分子、9degrees north聚合酶和还原剂，全部在反应缓冲液中。每个实验组包括不同的还原剂(如图4所示的DTT、TCEP、青霉胺和(S)-2-氨基丁烷-1,4-二硫醇盐酸盐)并且每个实验组中的反应体积在其还原剂的初始浓度方面不同。每个反应体积经受热循环以在类似于图3中以图形方式描绘的示例扩增方法的扩增反应中扩增样品核酸分子。虽然产生了含扩增产物的局部发夹，但可以在本体反应体积而非如图3所示乳液中的液滴内完成扩增反应。在扩增反应期间，适当的还原剂还原寡核苷酸和珠粒之间的二硫键联，从而引发扩增反应。

图5中以图形方式描绘了各个实验组的扩增产物产量。图5(图A)以图形方式在线性x-轴上描绘了随变化的初始还原剂浓度变化的扩增产量，而图5(图B)使用对数x-轴描绘相同数据。DTT(图5中的重复实验501和505)、TCEP(重复实验502和506)和(S)-2-氨基丁烷-1,4-二硫醇盐酸盐(重复实验504和508)的实验组在通常较低的还原剂初始浓度下显示出较高的扩增产物量，在较高浓度下扩增产物的量显著更低。

相反，在青霉胺实验组(图5中的重复实验503和507)中产生的扩增产物随还原剂的初始浓度有一定变化，然而生成的扩增产物在量上与其它还原剂同等或更佳，并且在测试的初始青霉胺浓度范围内与其它还原剂不同。数据表明与其它还原剂如DTT、TCEP和(S)-2-氨基丁烷-1,4-二硫醇盐酸盐相比时，在广泛的初始还原剂浓度范围内，青霉胺可以产生相对相似量的扩增产物。此类差异可归因于如本文别处所述的青霉胺的稳定特性(例如，经由其空间受阻的硫醇基团)。

实施例3：还原剂类型的影响和扩增产物产量

进行三组实验以比较在扩增反应中产生扩增产物中DTT和青霉胺的性能。在第一组实验中，该组包括重复的反应体积，每个反应体包含与包含条码和引发序列的寡核苷酸(与图3所示的寡核苷酸308相似)连接(经由二硫键联)的聚丙烯酰胺凝胶珠粒、样品核酸分子、9 degrees north聚合酶和DTT或青霉胺还原剂。在一类还原剂中反应体积在其还原剂初始浓度方面不同。第二组实验与第一组相同，除每个反应体积包含Deep Vent聚合酶而非9degrees north聚合酶以外。第一和第二实验组中的反应体积在本体反应体积中完成。第三实验组包括各自包含以3ng样品核酸分子输入产生的多个水性液滴的实验，其中每个液滴包含与包含条码和引发序列的寡核苷酸(与图3所示的寡核苷酸308相似)连接(经由二硫键联)的聚丙烯酰胺凝胶珠粒、样品核酸分子、9degrees north聚合酶和DTT或青霉胺还原剂。对指定还原剂的实验在其还原剂初始浓度方面不同。

每个实验组经受热循环以在类似于图3中以图形方式描绘的示例扩增方法的扩增反应中扩增样品核酸分子。在扩增反应期间，适当的还原剂还原寡核苷酸和珠粒之间的二硫键联，从而引发扩增反应。对于液滴内所进行的第三组实验，破坏包含液滴的乳液并且将扩增产物汇集成常见混合物。然后测量从每个实验组回收的扩增产物。

图6中以图形方式描绘了各个实验组的扩增产物产量相对于还原剂初始浓度。图6(图A)以图形方式描绘了来自于第一实验组的结果(601和602对应DTT重复实验，603和604对应青霉胺重复实验)；图6(图B)以图形方式描绘了来自于第二实验组的结果(611和612对应DTT重复实验，613和614对应青霉胺重复实验)；图6(图C)以图形方式描绘了来自于第三实验组的结果(621和622对应DTT重复实验，623和624对应青霉胺重复实验)。对于每个实验组而言，DTT重复实验在通常较低的还原剂初始浓度下显示出较高的扩增产物量，在较高初始浓度下扩增产物的量显著更低。

相反，在全部三个实验组中，使用青霉胺产生的扩增产物随还原剂的初始浓度有一定变化，然而生成的扩增产物在量上与用DTT生成的量同等或更佳，并且与DTT不同，在测试的初始青霉胺浓度范围内量相对相似。数据表明与其它还原剂如DTT相比时，在广泛的初始还原剂浓度范围内，青霉胺可以产生相似量的扩增产物。此类差异可归因于如本文别处所述的青霉胺的稳定特性(例如，经由其空间受阻的硫醇基团)。

实施例4：还原剂类型的影响和扩增产物产量

进行三组实验以比较在扩增反应中产生扩增产物中DTT和青霉胺的性能。每个实验包括以6ng样品核酸分子输入产生的多个水性液滴，其中每个液滴包括与包含条码和引发序列的寡核苷酸(与图3所示的寡核苷酸308相似)连接(经由二硫键联)的聚丙烯酰胺凝胶珠粒、样品核酸分子、9degrees north聚合酶和DTT或青霉胺还原剂。每个实验组包括不同的9degrees north聚合酶制剂(第一制剂(图7的图A中“第5批：未处理”)、包含源自第一制剂的氧化漂白9degrees north的第二制剂(图7的图B中“第5批：漂白”)和包含并非源自第一制剂的9degrees north制剂的第三制剂(图7的图C中“第3批：对照”))。此外，对于给定还原剂而言实验中的液滴在其还原剂初始浓度方面不同。

每个实验组经受热循环以在类似于图3中以图形方式描绘的示例扩增方法的扩增反应中扩增样品核酸分子。在扩增反应期间，适当的还原剂还原寡核苷酸和珠粒之间的二硫键联，从而启动扩增反应。在扩增反应完成之后，对于每个实验而言破坏包含液滴的乳液并且将扩增产物汇集成常见混合物并测量回收的扩增产物的量。

图7中以图形方式描绘了各个实验组的扩增产物产量相对于还原剂初始浓度。图7(图A)以图形方式描绘了来自于对应第一9degrees north制剂的第一实验组的结果(701对应DTT，702对应青霉胺)；图7(图B)以图形方式描绘了来自于对应第二9degrees north制剂的第二实验组的结果(711对应DTT，712对应青霉胺)；图7(图C)以图形方式描绘了来自于对应第三9degrees north制剂的第三实验组的结果(721对应DTT，722对应青霉胺)。对于每个实验组而言，DTT在通常较低的还原剂初始浓度下显示出较高的扩增产物量，在较高初始浓度下扩增产物的量较低。

相反，在全部三个实验组中，使用青霉胺产生的扩增产物随还原剂的初始浓度有一定变化，然而生成的扩增产物在量上与用DTT生成的量同等或更佳，并且与DTT不同，在测试的初始青霉胺浓度范围内量相对相似。数据表明与其它还原剂如DTT相比时，在广泛的初始还原剂浓度范围内，青霉胺可以产生相似量的扩增产物。此类差异可归因于如本文别处所述的青霉胺的稳定特性(例如，经由其空间受阻的硫醇基团)。

实施例5：还原剂类型的影响和扩增产物产量

进行三组实验以比较在扩增反应中产生扩增产物中DTT和青霉胺的性能。每个实验包括以3ng样品核酸分子输入产生的多个水性液滴，其中每个液滴包括与包含条码和引发序列的寡核苷酸(与图3所示的寡核苷酸308相似)连接(通过二硫键联)的聚丙烯酰胺凝胶珠粒、样品核酸分子、三种聚合酶制剂之一和DTT或青霉胺还原剂。每个实验组包括不同的聚合酶制剂(Deep Vent聚合酶制剂(图8的图A中的“Deep Vent”)、氧化的9degreesnorth制剂(图8的图B中的“Blonde”)和未经处理的9degrees north制剂(图8的图C中的“对照”))。此外，对于给定还原剂而言实验中的液滴在其还原剂初始浓度方面不同。

每个实验组经受热循环以在类似于图3中以图形方式描绘的示例扩增方法的扩增反应中扩增样品核酸分子。在扩增反应期间，适当的还原剂还原寡核苷酸和珠粒之间的二硫键联，从而启动扩增反应。在扩增反应完成之后，对于每个实验而言破坏包含液滴的乳液并且将扩增产物汇集成常见混合物并测量回收的扩增产物的量。

图8中以图形方式描绘了各个实验组的扩增产物产量相对于还原剂初始浓度。图8(图A)以图形方式描绘了来自于对应Deep Vent制剂的第一实验组的结果(801对应DTT，802对应青霉胺)；图8(图B)以图形方式描绘了来自于对应氧化的9degrees north制剂的第二实验组的结果(811对应DTT，812对应青霉胺)；图8(图C)以图形方式描绘了来自于对应未处理的9degrees north制剂的第三实验组的结果(821对应DTT，822对应青霉胺)。对于每个实验组而言，DTT在通常较低初始浓度的还原剂下显示出较高的扩增产物量，在较高初始浓度下扩增产物的量较低。

相反，在全部三个实验组中，使用青霉胺产生的扩增产物随还原剂的初始浓度有一定变化，然而生成的扩增产物在量上与用DTT生成的量同等或更佳，并且与DTT不同，在测试的初始青霉胺浓度范围内量相对相似。数据表明与其它还原剂如DTT相比时，在广泛的初始还原剂浓度范围内，青霉胺可以产生相似量的扩增产物。此类差异可归因于如本文别处所述的青霉胺的稳定特性(例如，经由其空间受阻的硫醇基团)。

实施例6：还原剂类型的影响和扩增产物产量

进行三组实验以比较在扩增反应中产生扩增产物中DTT和青霉胺的性能。每个实验组包括重复实验，其包括多个水性液滴，其中每个液滴包括与包含条码和引发序列的寡核苷酸(与图3所示的寡核苷酸308相似)连接(经由二硫键联)的聚丙烯酰胺凝胶珠粒、样品核酸分子、三种聚合酶制剂之一和DTT或青霉胺还原剂。每个实验组包括聚合酶制剂和还原剂的不同组合(第一组包含未处理的9degrees north聚合酶制剂和DTT，第二组包含氧化的9degrees north聚合酶制剂和DTT且第三组包含氧化的9degrees north聚合酶制剂和青霉胺)。此外，实验组中的实验在其还原剂初始浓度方面不同。

每个实验组经受热循环以在类似于图3中以图形方式描绘的示例扩增方法的扩增反应中扩增样品核酸分子。在扩增反应期间，适当的还原剂还原寡核苷酸和珠粒之间的二硫键联，从而引发扩增反应。在扩增反应完成之后，对于每个实验而言破坏包含液滴的乳液并且将扩增产物汇集成常见混合物并测量回收的扩增产物的量。

图9中以图形方式描绘了各个实验组的扩增产物产量相对于还原剂初始浓度。图9(图A)以图形方式描绘了来自于对应未处理的9 degrees north制剂和DTT的第一实验组的重复结果(实线和虚线)；图9(图B)以图形方式描绘了来自于对应氧化的9degrees north制剂和DTT的第二实验组的重复结果(实线和虚线)；图9(图C)以图形方式描绘了来自于对应氧化的9degrees north制剂和青霉胺的第一实验组的重复结果(实线和虚线)。对于第一和第二实验组而言，DTT在通常较低初始浓度的还原剂下显示出较高的扩增产物量，在较高初始浓度下扩增产物的量较低。

相反，在第三实验组中，使用青霉胺产生的扩增产物随还原剂的初始浓度有一定变化，然而生成的扩增产物在量上与第一和第二实验组中用DTT生成的量同等或更佳，并且与DTT不同，在测试的初始青霉胺浓度范围内量相对相似。数据表明与其它还原剂如DTT相比时，在广泛的初始还原剂浓度范围内，青霉胺可以产生相似量的扩增产物。此类差异可归因于如本文别处所述的青霉胺的稳定特性(例如，经由其空间受阻的硫醇基团)。

实施例7：还原剂类型的影响和扩增产物产量

以一式两份，进行三组实验以比较在扩增反应中产生扩增产物中DTT和青霉胺的性能。每个实验包括多个水性液滴，其中每个液滴包括与包含条码和引发序列的寡核苷酸(与图3所示的寡核苷酸308相似)连接(经由二硫键联)的聚丙烯酰胺凝胶珠粒、样品核酸分子、三种聚合酶制剂之一和DTT或青霉胺还原剂。每个实验组包括不同的聚合酶制剂(第一氧化的9degrees north聚合酶制剂(图10的图A和B中的“第5批Ox”)、第二未处理的9degrees north制剂(图10的图A和B中的“Enzymatics(KB)”)和第三未处理的9degreesnorth制剂(图10的图A和B中的“Enzymatics(DB)”))。此外，对于给定的还原剂而言实验中的液滴在其还原剂初始浓度方面不同。

每个实验组经受热循环以在类似于图3中以图形方式描绘的示例扩增方法的扩增反应中扩增样品核酸分子。在扩增反应期间，适当的还原剂还原寡核苷酸和珠粒之间的二硫键联，从而引发扩增反应。在扩增反应完成之后，对于每个实验而言破坏包含液滴的乳液并且将扩增产物汇集成常见混合物并测量回收的扩增产物的量。

图10中以图形方式描绘了各个实验组的扩增产物产量相对于还原剂初始浓度。图10(图A)以图形方式描绘了实验第一次重复的结果并且图10(图B)以图形方式描绘了实验第二次重复的结果。对于第一次重复的每个实验组而言如图10(图A)所示，DTT(1001针对第一氧化的9degrees north聚合酶制，1003针对第二未处理的9degrees north聚合酶制剂，1005针对第三未处理的9degrees north聚合酶制剂)在通常较低初始浓度的还原剂下显示出较高的扩增产物量，在较高初始浓度下扩增产物的量较低。如图10(图B)所示，将DTT用作还原剂时对于实验第二次重复而言获得类似结果(1011针对第一氧化的9 degrees north聚合酶制，1013针对第二未处理的9degrees north聚合酶制剂，1015针对第三未处理的9degrees north聚合酶制剂)。

相反，对于实验第一次重复中的全部三个实验组而言如图10(图A)所示，使用青霉胺产生的扩增产物(1002针对第一氧化的9degrees north聚合酶制剂，1004针对第二未处理的9degrees north聚合酶制剂，1006针对第三未处理的9degrees north聚合酶制剂)随还原剂的初始浓度有一定变化，然而生成的扩增产物在量上与用DTT生成的量同等或更佳，并且与DTT不同，在测试的初始青霉胺浓度范围内量相对相似。将青霉胺用作还原剂时对于实验第二次重复而言获得类似结果(1012针对第一氧化的9degrees north聚合酶制，1014针对第二未处理的9degrees north聚合酶制剂，1016针对第三未处理的9 degrees north聚合酶制剂)。

数据表明与其它还原剂如DTT相比时，在广泛的初始还原剂浓度范围内，青霉胺可以产生相似量的扩增产物。此类差异可归因于如本文别处所述的青霉胺的稳定特性(例如，经由其空间受阻的硫醇基团)。

实施例8：还原剂类型对核酸测序期间观察到的嵌合体率的影响

进行两组实验以比较DTT和青霉胺作为包括扩增反应的反应方案的一部分，产生在扩增产物的核酸测序期间具有可观察到的嵌合体的扩增产物的倾向。每个实验组包括具有多个水性液滴的实验，其中每个液滴包括与包含条码和引发序列的寡核苷酸(与图3所示的寡核苷酸308相似)连接(经由二硫键联)的聚丙烯酰胺凝胶珠粒、样品核酸分子、聚合酶制剂(例如，9degrees north、氧化的9degrees north)和还原剂。所述实验组在还原剂方面不同，一组包括DTT，另一组包括青霉胺。在给定实验组的实验中，对不同初始浓度的还原剂进行测试。

每个实验经受热循环以在类似于图3中以图形方式描绘的示例扩增方法的扩增反应中扩增样品核酸分子。在扩增反应期间，适当的还原剂还原寡核苷酸和珠粒之间的二硫键联，从而引发扩增反应。在扩增反应完成之后，对于每个实验而言破坏包含液滴的乳液并且将扩增产物汇集成常见混合物。每个实验汇集的扩增产物经纯化并经受剪切连接过程以向扩增产物添加另外的功能序列，然后在核酸测序仪上为进一步加工的扩增产物测序。

图11中以图形方式描绘了对于每个实验组中的各个实验观察到的嵌合体率。如图11所示，对于不同初始DTT浓度获得的数据(图11中的1101)显示了观察到的嵌合体率的范围，在测试的DTT初始浓度范围内嵌合体率相对较高。相反，同样如图11所示，对于不同初始浓度的青霉胺获得的数据(图11中的1102)显示在测试的青霉胺初始浓度范围内，与由DTT获得的数据相比观察到的嵌合体率较低并且在通常较窄的嵌合体率范围内。因此，数据表明在产生扩增产物的反应方案中使用稳定化还原剂如青霉胺，可以降低在扩增产物的下游测序中观察到的嵌合体率和/或嵌合体率可变性。

实施例9：还原剂类型对核酸测序期间观察到的嵌合体率的影响

进行两组实验以比较DTT和青霉胺作为包括扩增反应的反应方案的一部分，产生在扩增产物的核酸测序期间具有可观察到的嵌合体的扩增产物的倾向。每个实验组包括具有多个水性液滴的实验，其中每个液滴包括与包含条码和引发序列的寡核苷酸(与图3所示的寡核苷酸308相似)连接(经由二硫键联)的聚丙烯酰胺凝胶珠粒、样品核酸分子、聚合酶制剂(例如，9degrees north、氧化的9degrees north)和还原剂。所述实验组在还原剂方面不同，一组包括DTT(图12中的1200)，另一组包括青霉胺(图12中的1210)。每个实验组还利用不同的聚合酶制剂(9degrees north(图12的1200所示的“第3批”)或氧化的9degreesnorth(图12的1210所示的“Ox第5批”))。在每个实验组的实验中，聚丙烯酰胺珠粒在其来源/制备和/或偶联寡核苷酸的鸟嘌呤-胞嘧啶含量(G-C含量)方面不同。

每个实验经受热循环以在类似于图3中以图形方式描绘的示例扩增方法的扩增反应中扩增样品核酸分子。在扩增反应期间，适当的还原剂还原寡核苷酸和珠粒之间的二硫键联，从而引发扩增反应。在扩增反应完成之后，破坏包含液滴的乳液并且将扩增产物汇集成常见混合物。扩增产物经纯化并经受剪切连接过程以向扩增产物添加另外的功能序列，然后在核酸测序仪上为进一步加工的扩增产物测序。

图12中以图形方式描绘了对于每个实验组中的各个实验观察到的嵌合体率。如图12所示，对DTT实验获得的数据(图12中的1200)在与对青霉胺实验获得的数据(图12中的1210)相比时显示出更高的嵌合体率。

虽然本文已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域的技术人员而言显而易见的是，这样的实施方案仅以举例的方式提供。并非意图通过说明书中提供的具体实例来限制本发明。虽然已经参考上述说明来描述了本发明，但并非意在以限制性意义解释本文实施方案的描述和举例说明。在不背离本发明的前提下，本领域的技术人员可进行许多变型、改变和替代。此外，应理解本发明的所有方面均不限于本文阐述的具体描绘、构型或相对比例，这取决于多种条件和变量。应理解本文描述的本发明实施方案的各个替代方案可用于实践本发明。因此预计本发明还应该包括所有此类替代方案、修改、变型或等效案。其意图是以下权利要求限定本发明的范围并由此包括这些权利要求及其等同权利要求范围内的方法和结构。

Claims (51)

1.一种用于核酸扩增的方法，其包括：

(a)在反应体积中提供试剂，其中所述试剂包含第一组分，所述第一组分通过可还原键联与第二组分偶联，并且其中所述反应体积包括模板核酸分子和稳定化还原剂；

(b)借助于所述稳定化还原剂裂解所述可还原键联以使所述第一组分与所述第二组分去偶联；并且

(c)使用所述第一组分，使所述模板核酸分子经受扩增反应，以得到作为所述模板核酸分子扩增产物的核酸分子，

其中在(c)之前，所述稳定化还原剂对于所述可还原键联的还原活性有至多20％的变化。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在(c)之前，所述稳定化还原剂对于所述可还原键联的还原活性有至多10％的变化。

3.根据权利要求1所述的方法，其中在(c)之前，所述稳定化还原剂对于所述可还原键联的还原活性有至多5％的变化。

4.根据权利要求1所述的方法，其中在(c)之前，所述稳定化还原剂对于所述可还原键联的还原活性有至多1％的变化。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述经受包括使所述反应体积的温度循环。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述稳定化还原剂包含含稳定化硫醇的化合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述含稳定化硫醇的化合物包含空间受阻的硫醇基团。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述含稳定化硫醇的化合物包含青霉胺。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二组分包含珠粒。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一组分包含核酸分子且所述第二组分包含大分子基质。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述大分子基质包含聚合物基质。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述聚合物基质包含水凝胶。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述水凝胶包含交联聚丙烯酰胺。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述交联聚丙烯酰胺通过可还原交键联交联。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述可还原交键联包括二硫键联。

16.根据权利要求14所述的方法，其还包括在(c)之前，裂解所述可还原交键联。

17.根据权利要求11所述的方法，其中所述可还原键联包括连接所述核酸分子与所述聚合物基质的二硫键联。

18.根据权利要求12所述的方法，其中所述核酸分子包含条码序列。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，在(c)中，所述扩增产物包含所述条码序列。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增产物包含局部发夹结构。

21.根据权利要求1所述的方法，其还包括，在(c)之后，提供所述扩增产物的至少一部分的序列。

22.根据权利要求1所述的方法，其中在油包水乳液中的液滴的水性内部提供所述反应体积。

23.根据权利要求1所述的方法，其中在(a)中，所述反应体积包含酶。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述酶是参与所述扩增反应的聚合酶。

25.根据权利要求1所述的方法，其中在(a)中，所述第一组分包含参与所述扩增反应的引物。

26.一种进行还原反应的方法，其包括：

(a)在反应体积中提供试剂，其中所述试剂包含第一组分，所述第一组分通过可还原键联与第二组分偶联，并且其中所述反应体积包括呈非活性状态的还原剂，使得所述还原剂与所述可还原键联基本上不反应；

(b)使所述还原剂经受活化条件，使得所述还原剂变得与所述可还原键联有反应性；并且

(c)容许所述还原剂与所述可还原键联反应以使所述第一组分与所述第二组分去偶联。

27.根据权利要求26所述的方法，其中，在(a)中，所述反应体积包括模板核酸分子。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述第一组分包含引物。

29.根据权利要求27所述的方法，其还包括在(c)之后，使用所述第一组分，使所述模板核酸分子经受扩增反应，以得到作为所述模板核酸分子扩增产物的核酸分子。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述引物包含条码序列。

31.根据权利要求29所述的方法，其还包括测定所述扩增产物的至少一部分序列的序列。

32.根据权利要求26所述的方法，其中所述活化条件包括向所述反应体积添加热能。

33.根据权利要求26所述的方法，其中所述活化条件裂解所述还原剂的共价键。

34.根据权利要求26所述的方法，其中呈其非活性状态的所述还原剂是稳定化还原剂。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述稳定化还原剂包含含稳定化硫醇的化合物。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述含稳定化硫醇的化合物包含空间受阻的硫醇基团。

37.根据权利要求35所述的方法，其中所述含稳定化硫醇的化合物包含经取代的二硫丁胺(DTBA)。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述经取代的DTBA包含

39.根据权利要求26所述的方法，其中所述第二组分包含珠粒。

40.根据权利要求26所述的方法，其中所述第一组分包含核酸分子且所述第二组分包含大分子基质。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述大分子基质包含聚合物基质。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述聚合物基质包含水凝胶。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述水凝胶包含交联聚丙烯酰胺。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述交联聚丙烯酰胺通过可还原交键联交联。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述可还原交键联包括二硫键联。

46.根据权利要求45所述的方法，其还包括在(b)之后，裂解所述可还原交键联。

47.根据权利要求40所述的方法，其中所述可还原键联包括连接所述核酸分子与所述聚合物基质的二硫键联。

48.根据权利要求40所述的方法，其中所述核酸分子包含条码序列。

49.根据权利要求26所述的方法，其中在油包水乳液中的液滴的水性内部提供所述反应体积。

50.根据权利要求26所述的方法，其中在(a)中，所述反应体积包含酶。

51.一种还原剂，其包含：