CN107531749A - 超纯化DsbA和DsbC及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供以非常高水平的纯度生产二硫化物氧化还原酶A(DsbA)和二硫化物氧化还原酶C(DsbC)多肽的方法。还提供了超纯DsbA和DsbC及其使用方法，例如用于免疫测定以显示从细菌中产生的生物制品中DsbA和DsbC的去除。

Description

超纯化DsbA和DsbC及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年3月6日提交的美国临时专利申请No.62/129,701的权益，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。
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发明领域
本发明提供以非常高水平的纯度生产二硫化物氧化还原酶A(DsbA)和二硫化物氧化还原酶C(DsbC)多肽的方法。还提供了超纯DsbA和DsbC及其使用方法，例如用于免疫测定以显示从在细菌中产生的生物制品中DsbA和DsbC的去除。
背景技术
在发酵条件下通过在细菌宿主细胞中表达而大量产生的真核多肽的产量和质量通常被修饰以改善分泌的异源多聚体蛋白(例如抗体)的适当组装和折叠。分子伴侣蛋白(例如二硫化物氧化还原酶(Dsb))蛋白(包括DsbA和DsbC)的过度表达促进了在细菌宿主细胞中产生的异源蛋白质(如抗体)的适当折叠和溶解。DsbA是强硫醇氧化剂，以及向分泌蛋白质的二硫键的中间供体。DsbC催化二硫键的异构化，并且可以移动错误折叠的二硫键。Dsb蛋白是细菌中二硫键形成和异构化的主要催化剂，并促进蛋白质的正确蛋白质折叠。Chen等人(1999)J Bio Chem 274：19601-19605；Georgiou等人美国专利号6,083,715；Georgiou等人美国专利号6,027,888；Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275：17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275：17106-17113；Arie等人(2001)Mol.Microbiol.39：199-210。
对于对人类给药可接受的重组生物药物蛋白质，重要的是从最终的生物产品中除去在制备和纯化过程产生的残余杂质。这些过程组分包括培养基蛋白、免疫球蛋白亲和配体、病毒、内毒素、DNA和宿主细胞蛋白。这些宿主细胞杂质包括过程特异性宿主细胞蛋白(HCP)，其是来自重组DNA技术的生物产品中的过程相关杂质，例如过量表达以促进蛋白质折叠的DsbA和DsbC伴侣分子。虽然HCP通常少量(以百万分之几份或每毫克预期重组多肽的纳克量)存在于最终药物中，但是认识到HCP是不期望的并且其量应该被最小化。例如，美国食品和药物管理局(FDA)要求旨在用于体内人体使用的生物药物应尽可能不含外源杂质，并且需要用于检测和定量潜在杂质(如HCP)的测试。此外，国际协调会议(ICH)还提供了对生物技术/生物产品测试程序和验收标准的指南。该指南表明，对于HCP，利用能够检测广大范围蛋白质杂质的敏感免疫测定。已经开发了用于检测免疫球蛋白、DNA、内毒素、病毒和总HCP(例如总大肠杆菌蛋白(ECP))的测定和试剂，但是这种测定和试剂不能精确地检测辅助蛋白如DsbA或DsbC。目前没有具有足够的特异性和灵敏性的商业试剂或分析方法，用于检测和定量蛋白质如DsbA或DsbC，这些蛋白质通常不会在细菌中以高水平表达，但可在重组细菌宿主细胞中过表达以促进生物产品的折叠和分泌。
因没有具有足够的一致性、灵敏性、特异性或效率的现有测定和试剂，特别需要用于检测DsbA和DsbC的试剂、方法和试剂盒。本文描述的发明满足上述某些需求并提供其它益处。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，通过引用整体并入本文。
发明概述
在一些方面，本发明提供了用于从包含DsbA多肽的细胞裂解物中纯化DsbA多肽的方法，包括a)将聚乙烯亚胺(PEI)加入至包含DsbA多肽的细胞裂解物中，至终浓度约0.01％至约1.0％，b)通过离心来澄清细胞裂解物，c)将包含DsbA多肽的澄清细胞裂解物施用于阴离子交换色谱材料，d)从阴离子交换色谱材料洗脱DsbA多肽以产生包含DsbA多肽的阴离子交换洗脱物，e)将包含DsbA多肽的阴离子交换洗脱物施用于阳离子交换色谱材料，f)从阳离子交换色谱材料洗脱DsbA多肽以产生包含纯化的DsbA多肽的阳离子交换洗脱物。在一些实施方案中，包含DsbA多肽的细胞裂解物在阴离子交换色谱之前保持在PEI中至少约16小时。在一些实施方案中，裂解物中的PEI的最终浓度为约0.1％。在一些实施方案中，包含DsbA多肽和PEI的裂解物的pH为约7.0。
在上述实施方案的一些实施方案中，阴离子交换色谱材料是强阴离子交换剂。在一些实施方案中，强阴离子交换剂包含季胺。在另外的实施方案中，季胺与交联的琼脂糖连接。在一些实施方案中，阴离子交换剂是QSFF阴离子交换剂。
在上述实施方案的一些实施方案中，使用盐梯度从阴离子色谱材料中洗脱DsbA。在另外的实施方案中，盐梯度是不连续梯度。在一些实施方案中，澄清的裂解物包含10mMMOPS，pH7.1。
在一些实施方案或上述实施方案中，利用以下步骤从阴离子交换色谱材料中洗脱DsbA：约15％的约25mM Tris和约250mM NaCl，在约pH9.2下约4个柱体积，约20％的约25mMTris和约250mM NaCl在约pH9.2下约4个柱体积，约25％的约25mM Tris和约250mM NaCl，在约pH 9.2直至从柱中洗脱出DsbA。
在上述实施方案的一些实施方案中，将步骤b)的包含DsbA多肽的澄清裂解物在阴离子交换色谱之前通过0.22μm过滤器。在一些实施方案中，将步骤b)的包含DsbA多肽的澄清裂解物在阴离子交换色谱之前调节至pH约9.0。
在一些实施方案中，阴离子交换洗脱物以级分收集。在一些实施方案中，级分为约0.3至约1.0柱体积(CV)。在一些实施方案中，在阳离子交换色谱之前通过尺寸排阻色谱分析级分。在一些实施方案中，选择包含至少约55％DsbA的级分用于进一步纯化。
在上述实施方案的一些实施方案中，阳离子交换材料包含磺丙基部分。在一些实施方案中，磺丙基部分与交联的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基质连接。在一些实施方案中，阳离子交换介质是POROS HS 50或等同物。在一些实施方案中，将步骤d)的阴离子交换洗脱物在阳离子交换色谱之前调节至pH约5.0。
在一些实施方案中，使用盐梯度从阳离子色谱材料中洗脱DsbA。在一些实施方案中，阳离子色谱材料用5个柱体积的12.5mM MES洗涤。在一些实施方案中，盐梯度是15个柱体积以上的从约0％至约60％的12.5mM MES和1M NaCl的梯度。在一些实施方案中，阳离子交换洗脱物以级分收集。在一些实施方案中，通过尺寸排阻色谱分析级分。在一些实施方案中，合并包含至少约95％DsbA的级分。
在任何上述实施方案的一些实施方案中，DsbA多肽是大肠杆菌DsbA多肽。在一些实施方案中，DsbA多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在其它实施方案中，DsbA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少约80％相同。在一些实施方案中，DsbA在细胞中表达。在一些实施方案中，细胞是原核细胞。在另外的实施方案中，细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，将细胞改造，以比DsbA的内源表达更高的水平表达DsbA。在一些实施方案中，使用微流化器裂解细胞。
在一些方面，本发明提供包含通过上述任一实施方案的方法纯化的DsbA多肽的组合物。在一些方面，本发明提供了包含纯化的DsbA多肽的组合物，其中组合物包含至少约95％的单体DsbA多肽。在一些方面，本发明提供包含纯化的DsbA多肽的组合物，其中所述组合物包含至少约98％的单体DsbA多肽。在一些实施方案中，组合物包含少于约2％的低分子量物质。在一些实施方案中，组合物包含小于约1％的高分子量物质。在一些实施方案中，单体DsbA多肽的百分比通过尺寸排阻色谱法检测。在一些实施方案中，组合物包含小于约5％的杂质。在一些实施方案中，杂质是相对于天然或所需DsbA的高分子量和/或低分子量多肽物质。在一些实施方案中，杂质是大肠杆菌蛋白(ECP)、DsbA的聚集体、DsbA的片段、核酸或细胞培养基组分中的一种或多种。在一些实施方案中，DsbA对于一个或多个冻融循环是稳定的。在一些实施方案中，DsbA对于一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十个以上的冻融循环是稳定的。在一些实施方案中，超纯DsbA用作参考标准；例如，确定测试样品中DsbA的量或浓度。在一些实施方案中，超纯DsbA用作阳性对照；例如，在用于确定样品中DsbA的存在和/或量的测定中。
在一些实施方案中，组合物中DsbA多肽的纯度通过色谱法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳或Western印迹分析来测量。在一些实施方案中，通过高效液相色谱(HPLC)测量组合物中DsbA多肽的纯度。在一些实施方案中，色谱法是尺寸排阻色谱法(例如SEC-HPLC)。在一些实施方案中，组合物中DsbA多肽的纯度通过使用荧光蛋白染色剂或银染色剂的SDS凝胶电泳来测量。在一些实施方案中，组合物中非DsbA多肽的存在通过由凝胶电泳鉴定的与抗-DsbA抗体不具有免疫反应性的物质的存在来鉴定，如Western印迹分析所示。在一些实施方案中，组合物中DsbA多肽的聚集体的存在是通过Western印迹分析分子量大于天然DsbA的物质的存在来鉴定。在一些实施方案中，组合物中DsbA多肽的片段的存在是通过Western印迹分析分子量小于天然DsbA的物质的存在来鉴定。
在一些方面，本发明提供了用于产生特异性结合DsbA的抗体的方法，包括将动物暴露于如上所述纯化的超纯DsbA。在另外的实施方案中，该方法包括从动物收集血清，其中血清包含特异性结合DsbA的抗体。在一些实施方案中，血清包含特异性结合DsbA的多克隆抗体。在一些方面，本发明提供从血清分离的一种或多种单克隆抗体。在一些实施方案中，动物是山羊、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、驴或鸡。
在一些方面，本发明提供了用于纯化特异性结合DsbA的抗体的方法，包括将包含抗DsbA抗体的组合物与包含结合到支持材料的超纯DsbA的色谱材料接触，洗涤色谱材料以除去未结合的化合物，以及洗脱抗DsbA抗体。在一些实施方案中，超纯DsbA包含至少约95％的单体DsbA多肽。在一些实施方案中，超纯DsbA包含小于约5％的杂质，小于约1％的杂质或小于约0.1％的杂质。在一些实施方案中，超纯DsbA通过本文所述的任何方法制备。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，根据本文所述的任何方法制备抗体。在一些实施方案中，小于1％的抗体特异性结合非DsbA化合物。
在一些方面，本发明提供包含特异性结合DsbA的多克隆抗体的组合物，其中所述多克隆抗体通过将动物暴露于上述任何DsbA组合物而产生。在一些实施方案中，从动物的血清中收集多克隆抗体。在一些实施方案中，本发明提供包含特异性结合DsbA的单克隆抗体的组合物，其中所述单克隆抗体通过将动物暴露于上述任何DsbA组合物而产生。在一些实施方案中，动物是山羊、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、驴或鸡。
在一些实施方案中，本发明提供了用于分析重组多肽样品中DsbA的存在和/或量的方法，包括使用免疫测定检测样品中的DsbA并将样品中检测到的DsbA的量与超纯DsbA参考标准的一个或多个浓度的检测相比较。在一些实施方案中，测试参考标准DsbA的多个不同浓度，以建立在检测水平与参考标准中DsbA浓度之间的相关性。可以通过比较测试样品中DsbA的检测水平与参考标准中DsbA的已知浓度的检测来确定测试样品中DsbA的浓度。在一些实施方案中，所述制品包含小于约1％的杂质中的任何一种。在一些实施方案中，通过本文所述的方法制备超纯DsbA参考标准。在一些实施方案中，免疫测定包括特异性结合超纯DsbA的抗体。在一些实施方案中，特异性结合超纯DsbA的抗体结合小于约1％的非DsbA化合物中的任何一种。在一些实施方案中，特异性结合超纯DsbA的抗体是多克隆抗体。在其他实施方案中，特异性结合超纯DsbA的抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，将特异性结合超纯DsbA的抗体用作免疫测定中的捕获抗体。在一些实施方案中，将特异性结合超纯DsbA的抗体用作检测抗体。在一些实施方案中，检测抗体与检测剂(例如，辣根过氧化物酶)缀合。在一些实施方案中，DsbA是大肠杆菌DsbA。在一些实施方案中，重组多肽在宿主细胞(例如，大肠杆菌宿主细胞)中制备。在一些实施方案中，宿主细胞过表达DsbA(例如，过表达DsbA的大肠杆菌宿主细胞)。在一些实施方案中，样品是细胞裂解物或从重组多肽制品获得，并且其中重组多肽制品已进行一个或多个色谱纯化步骤。在一些实施方案中，重组多肽制品是最终纯化产物。
在一些方面，本发明提供了用于检测样品中的DsbA的免疫测定方法，例如其中样品获自重组多肽制品或宿主细胞系，所述方法包括：(a)将结合DsbA的捕获抗体与样品接触，从而产生样品捕获抗体组合材料；(b)将结合DsbA的检测抗体与样品捕获抗体组合材料接触；和(c)检测与样品捕获抗体组合材料结合的抗体。在另外的实施方案中，该方法包括使用标准滴定曲线定量结合的检测抗体水平。在另外的实施方案中，该方法包括基于结合的检测抗体水平计算样品中存在的DsbA的量。在一些实施方案中，通过将标准滴定曲线与用超纯DsbA组合物生成的标准滴定曲线进行比较来确定样品中存在的DsbA的量。在一些实施方案中，超纯DsbA组合物包含至少约95％的单体DsbA多肽。在一些实施方案中，超纯DsbA组合物包含小于约5％的杂质，小于约1％的杂质或小于约0.1％的杂质。在一些实施方案中，组合物中的超纯DsbA通过本文所述的任何方法制备。在一些实施方案中，捕获抗体特异性结合超纯DsbA。在一些实施方案中，检测抗体特异性结合超纯DsbA。在一些实施方案中，特异性结合超纯DsbA的抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，结合DsbA的检测抗体与辣根过氧化物酶缀合。在一些实施方案中，免疫测定是夹心测定。在另外的实施方案中，夹心测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。在一些实施方案中，DsbA是大肠杆菌DsbA。在一些实施方案中，重组多肽制品或宿主细胞系获自大肠杆菌。在一些实施方案中，宿主细胞系过表达DsbA(例如，过表达DsbA的大肠杆菌宿主细胞)。在一些实施方案中，样品是细胞裂解物。在一些实施方案中，样品从重组多肽制品获得，并且其中重组多肽制品已进行一个或多个色谱纯化步骤。在一些实施方案中，重组多肽制品是最终纯化产物。在一些实施方案中，重组多肽制品中包含的重组多肽是抗体或免疫黏附素。在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。在一些实施方案中，重组多肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在一些实施方案中，本发明提供了用于包含从细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物的质量测定，包括使所述药物组合物进行如本文所述的免疫测定的释放测定，其中在所述免疫测定中的DsbA检测表明该药物组合物不适合于对动物的治疗给药。在一些实施方案中，DsbA在药物组合物中的量小于约1ppm表明该药物组合物适合于施用给动物。在一些实施方案中，重组多肽由大肠杆菌细胞制备。在一些实施方案中，细菌细胞过表达DsbA。在一些实施方案中，样品是细胞裂解物。在一些实施方案中，样品从重组多肽制品获得，并且其中重组多肽制品已进行一个或多个色谱纯化步骤。在一些实施方案中，重组多肽制品是最终纯化产物。在一些实施方案中，重组多肽制品中包含的重组多肽是抗体或免疫黏附素。在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。在一些实施方案中，重组多肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在一些方面，本发明提供了用于从包含DsbC多肽的细胞裂解物中纯化DsbC多肽的方法，包括a)将聚乙烯亚胺(PEI)加入至包含DsbC多肽的细胞裂解物中，至终浓度约0.01％至约1.0％，b)通过离心来澄清细胞裂解物，c)将包含DsbC多肽的澄清细胞裂解物施用于阴离子交换色谱材料，d)从阴离子交换色谱材料洗脱DsbC多肽以产生包含DsbC多肽的阴离子交换洗脱物，e)将包含DsbC多肽的阴离子交换洗脱物施用于疏水相互作用色谱(HIC)材料，f)从HIC材料洗脱DsbC多肽以产生HIC洗脱物，g)将包含DsbC多肽的HIC洗脱物施用于尺寸排阻色谱，h)从包含纯化的DsbC多肽的尺寸排阻色谱收集级分。在一些实施方案中，包含DsbC多肽的细胞裂解物在阴离子交换色谱之前保持在PEI中至少约16小时。在一些实施方案中，裂解物中的PEI的最终浓度为约0.1％。在一些实施方案中，包含DsbC多肽和PEI的裂解物的pH为约7.0。
在上述实施方案的一些实施方案中，阴离子交换色谱材料是弱阴离子交换剂。在还另外的实施方案中，弱阴离子交换剂包含季胺。在还另外的实施方案中，季胺与交联的琼脂糖连接。
在一些实施方案中，使用盐梯度从阳离子色谱材料中洗脱DsbC。在另外的实施方案中，盐梯度是线性梯度。在一些实施方案中，阴离子交换材料在10mM MOPS中洗涤。在一些实施方案中，盐梯度是15个柱体积以上的约0％至约60％的10mM MOPS和250mM NaCl的梯度。
在上述实施方案的一些实施方案中，将步骤b)的包含DsbC多肽的澄清裂解物在阴离子交换色谱之前通过0.22μm过滤器。在一些实施方案中，将步骤b)的包含DsbC多肽的澄清裂解物在阴离子交换色谱之前调节至pH约8.0。
在一些实施方案中，阴离子交换洗脱物以级分收集。在一些实施方案中，在疏水相互作用色谱之前通过尺寸排阻色谱分析级分。在一些实施方案中，选择包含至少约25％DsbC的级分用于进一步纯化。
在上述实施方案的一些实施方案中，HIC材料包含苯基部分。在另外的实施方案中，苯基部分与交联的琼脂糖连接。在一些实施方案中，在HIC色谱之前将阴离子交换洗脱物调节为含有约0.54M硫酸钠和约50mM PO4，约pH 7。在一些实施方案中，使用水从HIC材料中洗脱DsbC。在一些实施方案中，以级分收集HIC洗脱物。在另外的实施方案中，合并包含DsbC的级分。
在上述实施方案的一些实施方案中，尺寸排阻色谱材料包含交联的琼脂糖和葡聚糖的球形复合物。在一些实施方案中，通过的尺寸排阻流以级分收集。在一些实施方案中，HIC洗脱物在尺寸排阻色谱之前被超滤。在一些实施方案中，合并包含DsbC的级分。
在任何上述实施方案的一些实施方案中，DsbC多肽是大肠杆菌DsbC多肽。在一些实施方案中，DsbC多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在其它实施方案中，DsbC多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少约80％相同。
在上述实施方案的一些实施方案中，DsbC在细胞中表达。在一些实施方案中，细胞是原核细胞。在一些实施方案中，细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，将细胞改造，以比DsbC的内源表达更高的水平表达DsbC。在一些实施方案中，使用微流化器裂解细胞。
在一些方面，本发明提供包含通过上述任一实施方案的方法纯化的DsbC多肽的组合物。在一些方面，本发明提供了包含纯化的DsbC多肽的组合物，其中组合物包含至少约95％的单体DsbC多肽。在一些实施方案中，组合物包含至少约98％的单体DsbC多肽。在一些实施方案中，组合物包含至少约99％的单体DsbC多肽。在一些实施方案中，组合物包含至少约99.5％的单体DsbC多肽。在一些实施方案中，组合物包含少于约2％的低分子量物质。在一些实施方案中，组合物包含小于约1％的高分子量物质。在一些实施方案中，单体DsbC多肽的百分比通过尺寸排阻色谱法检测。在一些实施方案中，杂质是相对于天然或所需DsbC的高分子量和/或低分子量多肽物质。在一些实施方案中，杂质是大肠杆菌蛋白(ECP)、DsbC的聚集体、DsbC的片段、核酸或细胞培养基组分中的一种或多种。在一些实施方案中，DsbC对于一个或多个冻融循环是稳定的。在一些实施方案中，DsbC对于一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十个以上的冻融循环是稳定的。在一些实施方案中，超纯DsbC用作参考标准；例如，确定测试样品中DsbC的量或浓度。在一些实施方案中，超纯DsbC用作阳性对照；例如，在用于确定样品中DsbC的存在和/或量的测定中。
在一些实施方案中，组合物中DsbC多肽的纯度通过色谱法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳或Western印迹分析来测量。在一些实施方案中，通过高效液相色谱(HPLC)测量组合物中DsbC多肽的纯度。在一些实施方案中，色谱法是尺寸排阻色谱法(例如SEC-HPLC)。在一些实施方案中，组合物中DsbC多肽的纯度通过使用荧光蛋白染色剂或银染色剂的SDS凝胶电泳来测量。在一些实施方案中，组合物中非DsbC多肽的存在通过由凝胶电泳鉴定的与抗-DsbC抗体不具有免疫反应性的物质的存在来鉴定，如Western印迹分析所示。在一些实施方案中，组合物中DsbC多肽的聚集体的存在是通过Western印迹分析分子量大于天然DsbC的物质的存在来鉴定。在一些实施方案中，组合物中DsbC多肽的片段的存在是通过Western印迹分析分子量小于天然DsbC的物质的存在来鉴定。
在一些方面，本发明提供了用于产生特异性结合DsbC的抗体的方法，包括将动物暴露于如上所述纯化的超纯DsbC。在另外的实施方案中，该方法包括从动物收集血清，其中血清包含特异性结合DsbC的抗体。在一些实施方案中，血清包含特异性结合DsbC的多克隆抗体。在一些方面，本发明提供从血清分离的一种或多种单克隆抗体。在一些实施方案中，动物是山羊、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、驴或鸡。
在一些方面，本发明提供了用于纯化特异性结合DsbC的抗体的方法，包括将包含抗DsbC抗体的组合物与包含结合到支持材料的超纯DsbC的色谱材料接触，洗涤色谱材料以除去未结合的化合物，以及洗脱抗DsbC抗体。在一些实施方案中，超纯DsbC包含多于约95％的单体DsbC多肽。在一些实施方案中，超纯DsbC包含小于约5％的杂质，小于约1％的杂质或小于约0.1％的杂质。在一些实施方案中，超纯DsbC通过本文所述的任何方法制备。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，根据本文所述的任何方法制备抗体。在一些实施方案中，小于1％的抗体特异性结合非DsbC化合物。
在一些方面，本发明提供包含特异性结合DsbC的多克隆抗体的组合物，其中所述多克隆抗体通过将动物暴露于上述任何DsbC组合物而产生。在一些实施方案中，从动物的血清中收集多克隆抗体。在一些实施方案中，本发明提供包含特异性结合DsbC的单克隆抗体的组合物，其中所述单克隆抗体通过将动物暴露于上述任何DsbC组合物而产生。在一些实施方案中，动物是山羊、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、驴或鸡。
在一些实施方案中，本发明提供了用于分析重组多肽样品中DsbC的存在和/或量的方法，包括使用免疫测定检测样品中的DsbC并将样品中检测到的DsbC的量与超纯DsbC参考标准的一个或多个浓度的检测相比较。在一些实施方案中，测试参考标准DsbC的多个不同浓度，以建立在检测水平与参考标准中DsbC浓度之间的相关性。可以通过比较测试样品中DsbC的检测水平与参考标准中DsbC的已知浓度的检测来确定测试样品中DsbC的浓度。在一些实施方案中，所述制品包含小于约1％的杂质中的任何一种。在一些实施方案中，通过本文所述的方法制备超纯DsbC参考标准。在一些实施方案中，免疫测定包括特异性结合超纯DsbC的抗体。在一些实施方案中，特异性结合超纯DsbC的抗体结合小于约1％的非DsbC化合物中的任何一种。在一些实施方案中，特异性结合超纯DsbC的抗体是多克隆抗体。在其他实施方案中，特异性结合超纯DsbC的抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，将特异性结合超纯DsbC的抗体用作免疫测定中的捕获抗体。在一些实施方案中，将特异性结合超纯DsbC的抗体用作检测抗体。在一些实施方案中，检测抗体与检测剂(例如，辣根过氧化物酶)缀合。在一些实施方案中，DsbC是大肠杆菌DsbC。在一些实施方案中，重组多肽在宿主细胞(例如，大肠杆菌宿主细胞)中制备。在一些实施方案中，宿主细胞过表达DsbC(例如，过表达DsbC的大肠杆菌宿主细胞)。在一些实施方案中，样品是细胞裂解物或从重组多肽制品获得，并且其中重组多肽制品已进行一个或多个色谱纯化步骤。在一些实施方案中，重组多肽制品是最终纯化产物。
在一些方面，本发明提供了用于检测样品中的DsbC的免疫测定方法，例如其中样品获自重组多肽制品或宿主细胞系，所述方法包括：(a)将结合DsbC的捕获抗体与样品接触，从而产生样品捕获抗体组合材料；(b)将结合DsbC的检测抗体与样品捕获抗体组合材料接触；和(c)检测与样品捕获抗体组合材料结合的抗体。在另外的实施方案中，该方法包括使用标准滴定曲线定量结合的检测抗体水平。在另外的实施方案中，该方法包括基于结合的检测抗体水平计算样品中存在的DsbC的量。在一些实施方案中，通过将标准滴定曲线与用超纯DsbC组合物生成的标准滴定曲线进行比较来确定样品中存在的DsbC的量。在一些实施方案中，超纯DsbC组合物包含至少约95％的单体DsbC多肽。在一些实施方案中，超纯DsbC组合物包含小于约5％的杂质，小于约1％的杂质或小于约0.1％的杂质。在一些实施方案中，组合物中的超纯DsbC通过本文所述的任何方法制备。在一些实施方案中，捕获抗体特异性结合超纯DsbC。在一些实施方案中，检测抗体特异性结合超纯DsbC。在一些实施方案中，特异性结合超纯DsbC的抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，结合DsbC的检测抗体与辣根过氧化物酶缀合。在一些实施方案中，免疫测定是夹心测定。在另外的实施方案中，夹心测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。在一些实施方案中，DsbC是大肠杆菌DsbC。在一些实施方案中，重组多肽制品或宿主细胞系获自大肠杆菌。在一些实施方案中，宿主细胞系过表达DsbC(例如，过表达DsbC的大肠杆菌宿主细胞)。在一些实施方案中，样品是细胞裂解物。在一些实施方案中，样品从重组多肽制品获得，并且其中重组多肽制品已进行一个或多个色谱纯化步骤。在一些实施方案中，重组多肽制品是最终纯化产物。在一些实施方案中，重组多肽制品中包含的重组多肽是抗体或免疫黏附素。在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。在一些实施方案中，重组多肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在一些实施方案中，本发明提供了用于包含从细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物的质量测定，包括使所述药物组合物进行如本文所述的免疫测定的释放测定，其中在所述免疫测定中的DsbC检测表明该药物组合物不适合于对动物的治疗给药。在一些实施方案中，DsbC在药物组合物中的量小于约1ppm表明该药物组合物适合于施用给动物。在一些实施方案中，重组多肽由大肠杆菌细胞制备。在一些实施方案中，细菌细胞过表达DsbC。在一些实施方案中，样品是细胞裂解物。在一些实施方案中，样品从重组多肽制品获得，并且其中重组多肽制品已进行一个或多个色谱纯化步骤。在一些实施方案中，重组多肽制品是最终纯化产物。在一些实施方案中，重组多肽制品中包含的重组多肽是抗体或免疫黏附素。在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。在一些实施方案中，重组多肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在一些方面，本发明提供用于检测在包含从细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物中的DsbA的试剂盒，所述试剂盒包含通过本文所述的任何方法制备的抗DsbA抗体或任何本文所述的抗DsbA抗体的组合物。
在一些方面，本发明提供了用于检测在包含从细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物中的DsbC的试剂盒，所述试剂盒包含通过本文所述的任何方法制备的抗DsbC抗体或任何本文所述的抗DsbC抗体的组合物。
在一些方面，本发明提供用于检测在包含从细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物中的DsbA和DsbC的试剂盒，所述试剂盒包含通过任何本文所述的方法制备的抗DsbA抗体和抗DsbC抗体或本文所述的任何抗DsbA抗体和任何抗DsbC抗体的组合物。在一些实施方案中，试剂盒还包含超纯DsbA和/或DsbC，用作生成用于定量样品中的DsbA和/或DsbC的标准曲线的参考标准。在一些实施方案中，试剂盒还包含超纯DsbA和/或DsbC，在测定中用作阳性对照以检测样品中的DsbA和/或DsbC。
附图说明
图1示出了显示用于纯化DsbA的QSFF级分的尺寸排阻色谱的色谱图。从上到下，色谱图表示以下级分：加载，级分3，级分7，级分10，级分11和级分15。
图2示出了用于纯化DsbA的Poros HS池级分的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
图3示出了用于纯化DsbA的Poros加载和Poros池级分的尺寸排阻色谱的色谱图。
图4示出了DsbA Poros HS池级分的Western印迹。模拟(mock)池主要包含DsbA分子。
图5是用于纯化DsbC的级分的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
图6A示出了用于纯化DsbC的DEAE FF色谱的色谱图。图6B示出了图6A所示的洗脱部分的放大。
图7示出了用于纯化DsbC的DEAE-FF级分的SDS PAGE。
图8A和8B示出了在DsbC纯化中的色谱样品的电泳。图8A是使用抗DsbC-HRP作为检测试剂的Western印迹。图8B是用考马斯蓝染色的级分的SDS PAGE。
图9示出了SPFF级分的SDS-PAGE。
图10示出了在DsbC纯化的筛选HIS色谱中使用的SDS-PAGE。
图11示出了在DsbC纯化的筛选HIS色谱中使用的SDS-PAGE。
图12示出了在DsbC纯化中HIC色谱级分的SDS-PAGE。
图13示出了DsbC的superdex 75色谱级分的SDS-PAGE。
图14示出了显示配制的DsbC的高效液相色谱(HPLC)的色谱图。
图15示出了DsbA和DsbC的SDS PAGE。未还原的样品在左列提供。还原的样品在右列提供。
图16示出了在直接结合ELISA中抗DsbC亲和池的比较。正方形表示分级材料(94％主峰)，圆形表示未分级材料(78％主峰)。
图17示出了使用低聚集Superdex 200抗-DsbC亲和池的ELISA的结果。
具体实施方案
本发明提供了产生DsbA和DsbC的超纯组合物的方法。这样的组合物用于产生对DsbA或DsbC高度特异性的抗体。这些抗体接下来可用于检测在细菌发酵培养物中制备的重组多肽中的DsbA和DsbC，其中DsbA和DsbC被过表达以促进重组多肽折叠和组装。例如，抗体可用于开发重组多肽(例如抗体)的药物制剂中的释放测定。
I.定义
术语“检测”在本文中以最广泛的含义使用，包括靶分子的定性和定量测量两者。检测包括鉴定样品中仅存在靶分子，以及确定靶分子是否以可检测水平存在于样品中。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任意长度的氨基酸聚合物。聚合物可以线性的或分枝的，它可以包含修饰氨基酸，它可以被非氨基酸打断。该术语还涵盖已天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任意其他操作或修饰，如与标记成分缀合。还包括在该定义内的是例如包含一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。本文所用的术语“多肽”和“蛋白质”明确涵盖抗体。
“纯化的”多肽(例如抗体或免疫黏附素)意指纯度已提高的多肽，使得它以比它在其天然环境中存在和/或最初在实验室条件下合成和/或扩增时更纯的形式存在。纯度是相对术语，并非必然意指绝对纯度。
如本文所用，“超纯DsbA”和“超纯DsbC”是指这样的DsbA或DsbC组合物，其中在组合物中至少约95％的蛋白质是所需蛋白质、单体DsbA或单体DsbC。在一些实例中，超纯DsbA和超纯DsbC包含至少约96％、97％、98％、99％或99.5％的单体DsbA或单体DsbC。在一些实施方案中，单体DsbA或单体DsbC由SEC测定。
当用于提及多肽时，“Dsb”蛋白是指细菌二硫化物氧化还原酶。细菌二硫化物键氧化还原酶是酶的二硫键家族的成员。Dsb家族的成员包括DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和DsbG。DsbA形成链内二硫键，因为在细胞的周质中氧化蛋白质折叠期间肽出现在细胞的周质中，并且DsbC充当二硫键异构酶。
如本文所用，“DsbA”也可以称为周质蛋白二硫化物异构酶I。示例性DsbA蛋白是大肠杆菌DsbA。大肠杆菌DsbA的氨基酸序列由NCBI登录号NP_418297(SEQ ID NO：1)提供，大肠杆菌dsbA基因的核酸序列由NCBI登录号NC_000913.3或EcoGene：EG11297(SEQ ID NO：2)提供。
如本文所用，“DsbC”也可以称为周质蛋白二硫化物异构酶II。示例性的DsbC蛋白是大肠杆菌DsbC。大肠杆菌DsbC的氨基酸序列由NCBI登录号NP_417369.1(SEQ ID NO：3)提供，大肠杆菌dsbC基因的核酸序列由NCBI登录号NC_000913.3或EcoGene:EG11070(SEQ IDNO：4)提供。
“样品”是指较大数量的材料的一小部分。通常，对样品进行根据本文描述的方法的测试。样品通常从获自例如培养的表达重组多肽的细胞系(本文也称为“产物细胞系”)或培养的宿主细胞的重组多肽制品获得。如本文所用，“宿主细胞”不包含用于表达目标重组多肽或产物的基因。样品可以从例如但不限于收获的细胞培养液(其来自纯化过程中的某个步骤的过程池)或从最终纯化产物获得。
“捕获抗体”是指特异性结合样品中的靶分子的抗体。在某些条件下，捕获抗体与靶分子形成复合物，使得抗体-靶分子复合物可以与样品的其余部分分离。在某些实施方案中，这种分离可以包括洗去样品中未结合捕获抗体的物质或材料。在某些实施方案中，捕获抗体可以结合到固体支持物表面，例如但不限于平板或珠。
“检测抗体”是指特异性结合样品或样品-捕获抗体组合材料中的靶分子的抗体。在某些条件下，检测抗体与靶分子或靶分子-捕获抗体复合物形成复合物。检测抗体能够直接通过可以被扩增的标记或间接地例如通过使用被标记并结合该检测抗体的另一种抗体来检测。对于直接标记，检测抗体通常与通过某些方式可检测的部分缀合，例如包括但不限于生物素或钌。
术语“标记”或“可检测标记”是指可以连接到待检测或定量的物质(例如抗体)的任何化学基团或部分。通常，标记是适用于物质的灵敏检测或定量的可检测的标记。可检测标记的实例包括但不限于发光标记(例如荧光、磷光、化学发光、生物发光和电化学发光标记)、放射性标记、酶、颗粒、磁性物质、电活性种类等。或者，可检测标记可以通过参与特异性结合反应来表明其存在。此类标记的实例包括半抗原、抗体、生物素、链霉抗生物素、his标签、次氮基三乙酸、谷胱甘肽S-转移酶、谷胱甘肽等。
术语“检测手段”是指用于通过信号报告(其随后在测定中读出)检测可检测抗体的存在的部分或技术。通常，检测手段使用扩增固定化标记(例如捕获在微量滴定板上的标记)的试剂，例如抗生物素蛋白或链霉抗生物素-HRP。
“光致发光”是指其中材料吸收光(或者称为电磁福射)并且随后该材料发光的过程。荧光和磷光是两种不同类型的光致发光。“化学发光”方法涉及通过化学反应产生发光物质。“电化学发光”或“ECL”是一种过程，其中物质(例如抗体)暴露于适当的周围化学环境中的电化学能量时，该物质发光。
“结合”目的抗原，例如，宿主细胞蛋白，的抗体是以足够的亲和力结合抗原使得抗体可用作测定试剂的抗体，例如作为捕获抗体或作为检测抗体。通常，这样的抗体与其他多肽不显著交叉反应。
关于多肽与靶分子的结合，术语“特异性结合的”或“特异性地结合”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位是指与非特异性相互作用具有可测量的不同的结合。特异性结合可以例如通过确定与对照分子的结合相比，靶分子的结合来测量，对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。在一些实施方案中，多克隆抗体的制品特异性结合DsbA或DsbC。例如，多克隆抗体制品中至少约99％的抗体结合所需多肽(例如DsbA或DsbC)。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些。
用于本文目的的“活性的”或“活性”是指保留天然或天然存在多肽的生物学和/或免疫活性的多肽的形式，其中“生物”活性是指除了诱导产生针对通过天然或天然存在的多肽具有的抗原表位的抗体的能力以外，由天然或天然存在的多肽引起的生物功能(抑制性或刺激性)，并且“免疫”活性是指诱导产生针对天然或天然存在的多肽所具有的抗原表位的抗体的能力。
术语“拮抗剂”以最广泛的含义使用，并且包括部分或完全阻断、抑制或中和天然多肽的生物活性的任何分子。以类似的方式，术语“激动剂”以最广泛的含义使用，并且包括模拟天然多肽生物活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂分子具体包括激动剂或拮抗剂抗体或抗体片段，天然多肽的片段或氨基酸序列变体等。鉴定多肽的激动剂或拮抗剂的方法可包括使多肽与候选激动剂或拮抗剂分子接触并测量通常与多肽相关的一种或多种生物活性的可检测变化。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，且具体涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、从至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)及抗体片段，只要它们显示希望得到的生物活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可与抗体互换使用。
抗体是天然存在的免疫球蛋白分子，其具有全都基于免疫球蛋白折叠的不同结构。例如，IgG抗体具有通过二硫键键合形成功能性抗体的两条“重”链和两条“轻”链。每条重链和轻链本身包含“恒定”(C)区和“可变”(V)区。V区决定抗体的抗原结合特异性，而C区提供结构支持，并在与免疫效应物的非抗原特异性相互作用中发挥作用。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性是抗体特异性结合具体抗原的能力。
抗体的抗原结合特异性由V区的结构特征决定。可变性并非在可变结构域的110个氨基酸的跨度内均匀分布。相反，V区由15-30个氨基酸的称为构架区(FR)的相对不变的序列组成，该序列由长度各为9-12个氨基酸的称为“高变区”的极端可变的较短区域分隔开。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR，四个FR主要采用β-折叠构型，通过三个高变区连接，该高变区形成连接β-折叠结构且在一些情况下形成β-折叠结构的部分的环。各链中的高变区通过FR近距离保持在一起，并与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但显示多种效应子功能，如抗体在抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)中的参与。
每个V区通常包含3个互补决定区(“CDR”)(其中每个CDR包含“高变环”)和4个构架区。因此，抗体结合部位(以实质性亲和力结合特定希望的抗原所需的最小结构单位)通常将包含3个CDR及散布其间来支持并以适当的构象呈递CDR的至少3个、优选4个构架区。经典的四链抗体具有通过相互协作的VH和VL结构域定义的抗原结合部位。某些抗体(如骆驼抗体和鲨鱼抗体)缺乏轻链，依赖于仅由重链形成的结合部位。可以制备单结构域改造免疫球蛋白，其中在缺乏VH和VL间协作的情况下由重链或轻链单独形成结合部位。
术语“可变的”指这样的事实，可变结构域的某些部分的序列在抗体间广泛不同，且用于各具体抗体对其具体抗原的结合和亲和力。但是，可变性并非在抗体的整个可变结构域内均匀分布。它集中在轻链可变结构域和重链可变结构域二者中称为高变区的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR，四个FR主要采用β-折叠构型，通过三个高变区连接，该高变区形成连接β-折叠结构且在一些情况下形成β-折叠结构的部分的环。各链中的高变区通过FR近距离保持在一起，并与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但显示多种效应子功能，如抗体在抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)中的参与。
在本文中使用时，术语“高变区”指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区可以包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，VL中的约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，VH中的约31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)))和/或来自“高变环”的那些残基(例如VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，VH中的26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987)))。
“构架”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基外的那些可变结构域残基。
在抗体或半抗体的上下文中，“铰链区”通常定义为从人IgG1的Glu216延伸至Pro230(Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985))。通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同的位置，可以将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列比对。
Fc区的“下铰链区”通常被定义为紧邻铰链区C末端的残基段，即Fc区的残基233至239。在本发明之前，FcγR结合通常归因于IgG Fc区的下铰链区中的氨基酸残基。
人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从IgG的约残基231至约340延伸。CH2结构域是唯一的，因为它不与另一个结构域紧密配对。相反，两个N-连接的支链碳水化合物链被***完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。已经推测，碳水化合物可以提供结构域-结构域配对的替代物并有助于稳定CH2结构域。Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985)。
“CH3结构域”包含在Fc区域的C-末端至CH2结构域的残基的段(即从IgG的大约氨基酸残基341至约氨基酸残基447)。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；串联双抗体(taDb)、线性抗体(例如美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单臂抗体、单可变结构域抗体、微抗体、单链抗体分子；形成自抗体片段(例如，包括但不限于Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3、(scFV)4-Fc、di-scFv、bi-scFv或串联(di,tri)-scFv)的多特异性抗体；及双特异性T细胞衔接物(BiTE)。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，和残留的“Fc”片段，即反映容易结晶的能力的指示。Fab片段由整个L链以及H链的可变区域结构域(VH)和一条重链的第一个恒定结构域(CH1)组成。胃蛋白酶处理抗体产生单个大的F(ab’)2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段不同之处在于，在CH1结构域的羧基末端具有额外的少量残基，其包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是在本文中指示Fab'，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。F(ab’)2抗体片段最初作为成对的Fab'片段产生，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“Fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。此区域由紧密非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。各可变结构域的三个高变区正是在此构型中相互作用来定义VH-VL二聚体表面上的抗原结合部位。六个高变区共同赋予抗体抗原结合特异性。但是，甚至单个可变结构域(或Fv的一半，其仅包含三个对抗原特异的高变区)也具有识别和结合抗原的能力，虽然亲和力低于整个结合部位。
Fab片段还包含轻链恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同在于，在重链CH1结构域的羧基端加入了几个残基，其包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab’-SH是本文中对其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基具有至少一个自由巯基的Fab’的命名。F(ab’)2抗体片段最初作为其间具有铰合部半胱氨酸的Fab’片段对产生。还已知抗体片段的其他化学偶联。
根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任意脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”归置称为κ和λ的两个明显不同的类型之一。
取决于其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体归置不同种类。存在五个主要种类的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几个可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同种类的抗体的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型众所周知。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽进一步在VH和VL结构域之间包含多肽接头，该多肽接头使得scFv能够形成希望的结构用于抗原结合。scFv的综述参见Plückthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,纽约,269-315页(1994)。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合部位的小的抗体片段，该片段包含在同一条多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH-VL)。通过使用太短而不允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一条链上的互补结构域配对，并产生两个抗原结合部位。双抗体更充分地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。
术语“多特异性抗体”以最广泛的含义使用，且明确涵盖具有多表位特异性的抗体。这类多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中VHVL单位具有多表位特异性；具有两个或多个VL和VH结构域的抗体，每个VHVL单位结合不同的表位；具有两个或多个单可变结构域的抗体，每个单可变结构域结合不同的表位；全长抗体；抗体片段如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体、三链抗体、三功能抗体、已共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”指特异性结合相同或不同靶标上的两个或多个不同表位的能力。“单特异性”指仅结合一个表位的能力。根据一个实施方案，多特异性抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力结合各表位的IgG抗体。
表述“单结构域抗体”(sdAb)或“单可变结构域(SVD)抗体”一般指其中单个可变结构域(VH或VL)可以赋予抗原结合的抗体。换言之，该单可变结构域无需与另一可变结构域相互作用来识别靶抗原。单结构域抗体的实例包括衍生自骆驼(羊驼和骆驼)和软骨鱼(例如铰口鲨)的那些，以及来自人类和小鼠抗体的衍生自重组方法的那些(Nature(1989)341:544-546；Dev Comp Immunol(2006)30:43-56；Trend Biochem Sci(2001)26:230-235；Trends Biotechnol(2003):21:484-490；WO 2005/035572；WO 03/035694；FEBS Lett(1994)339:285-290；WO00/29004；WO 02/051870)。
本文所用的术语“单克隆抗体”指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即除了可以在产生单克隆抗体的过程中出现的可能的变体(这类变体通常以较小的量存在)外，包含该单个抗体的群体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外，单克隆体的优势在于它们未受其他免疫球蛋白污染。修饰词“单克隆的”指抗体获自基本上同质的抗体群体的特征，而不解释为需要通过任意特定的方法来产生抗体。例如，待按照本文提供的方法使用的单克隆抗体可以通过最先由Kohler等,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤法制备，或者可以通过重组DNA法制备(参见例如美国专利号4,816,567)。还可以用例如Clackson等,Nature 352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中所述的技术从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。
本文的单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或隶属于特定抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与衍生自另一物种或隶属于另一抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，以及这类抗体的片段，只要它们显示希望得到的生物活性(美国专利号4,816,567；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文的目的嵌合抗体包括“灵长类源化(primatized)”抗体，其包含衍生自非人灵长类(例如旧大陆猴，如狒狒、猕猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列(美国专利号5,693,780)。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其包含最少的衍生自非人免疫球蛋白的序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中用来自具有希望得到的特异性、亲和力和容量的诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的非人物种的高变区(供体抗体)的残基取代来自受体的高变区的残基。在一些情况下，用对应的非人残基取代人免疫球蛋白的构架区(FR)残基。此外，人源化抗体可以包含不见于受体抗体中或供体抗体中的残基。产生这些修饰来进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个(且通常为两个)可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，而除上文指出的一个或多个FR取代外，全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还将可选地包含至少部分免疫球蛋白恒定区，通常是人免疫球蛋白的恒定区。进一步的详情参见Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
为了本文的的目的，“完整抗体”是包含重链可变结构域和轻链可变结构域以及Fc区的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
“天然抗体”通常是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间不同。每条重链和轻链还具有规则间隔开的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是许多恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐(align)，轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定氨基酸残基形成轻链可变结构域和重链可变结构域之间的界面。
“裸抗体”是未与异源分子(如毒性部分或放射性标记)缀合的抗体(如本文所定义)。
如本文所用，术语“免疫黏附素”是指将异源蛋白(“黏附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能相结合的分子。在结构上，免疫黏附素包含具有所需结合特异性的氨基酸序列的融合物，该氨基酸序列不同于抗体的抗原识别和结合位点(即，与抗体的恒定区相比是“异源的”)，和免疫球蛋白恒定结构域序列(例如IgG的CH2和/或CH3序列)。示例性的黏附素序列包括连续的氨基酸序列，其包含与目的蛋白质结合的受体或配体的一部分。黏附素序列也可以是结合目的蛋白质而不是受体或配体序列(例如，peptibody中的黏附素序列)的序列。可以通过各种方法选择或鉴定这些多肽序列，包括噬菌体展示技术和高通量分选方法。免疫黏附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以从任何免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD、或IgM，获得。
在一些实施方案中，抗体“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和依赖补体的细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指分子在补体存在下裂解靶的能力。补体激活途径是通过将补体***的第一组分(C1q)与和同族(cognate)抗原复合的分子(例如多肽(例如，抗体))结合引发的。为了评估补体活化，可以执行CDC测定法，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别结合在靶细胞上的抗体，随后引起该靶细胞的裂解。用于介导ADCC的初级细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的ADCC测定。用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或此外，可以例如在动物模型中，如在Clynes等,PNAS(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估目的分子的ADCC活性。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。在一些实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII，并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。
用术语“Fc受体”或“FcR”来描述与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施方案中，该FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有主要在其胞质结构域中不同的相似的氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR综述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。本文的术语“FcR”涵盖了其他FcR，包括有待在将来鉴定的那些。该术语还包括负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)；和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。
术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指引入了外来核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代与亲本细胞在核酸内容上可能不完全相同，而可能含有突变。在本文中包括具有与在原始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变体后代。
本文所用的术语“杂质”是指与期望的多肽产物不同的材料或物质。杂质包括但不限于宿主细胞材料，如大肠杆菌宿主细胞蛋白(ECP)；浸出蛋白A；核酸；所需多肽的变体、片段、聚集体或衍生物；另一种多肽；内毒素；病毒性污染物；细胞培养基组分等。在一些实例中，杂质可以是来自例如但不限于细菌细胞如大肠杆菌细胞(例如ECP)的宿主细胞蛋白(HCP)。在一些实施方案中，杂质可以是修剪的DsbA或DsbC和/或DsbA或DsbC的聚集体。
“分离的”核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但核酸分子存在于染色体外或在与其天然染色***置不同的染色***置存在。
相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，如果需要引入缺口，达到最大百分比的序列同一性，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分。可以本领域技术范围内的各种方式实现测定百分比氨基酸序列同一性目的的比对，例如，使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件来实现。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当的参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。在某些实施方案中，使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经与用户文档提交给美国版权局，华盛顿，20559，其以美国版权注册号TXU510087注册。ALIGN-2程序可公开获自Genentech,Inc.，南圣弗朗西斯科，加利福尼亚，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作***，包括数字UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
当ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相较于、与、或针对给定氨基酸序列B(或者可表述为相较于、与、或针对给定氨基酸序列B具有或包含一定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)的％氨基酸序列同一性如下计算：
100乘以分数X/Y
其中X是在A和B的程序比对中由序列对比程序ALIGN-2打分为相同匹配的氨基酸残基的数目，其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相较于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相较于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明，本文所用的所有％氨基酸序列同一性值如紧接在前面的段落中所述，使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“可变区”或“可变结构域”是指涉及结合抗体与抗原的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见例如Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域来分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
本文所用的术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制核酸结构的载体以及并入宿主细胞(其中已被引入该载体)的基因组中的载体。某些载体能够引导其有效连接的核酸的表达。这些载体在本文中称为“表达载体”。
本文关于色谱所用的术语“顺次的”指在第一色谱后进行第二色谱。在该第一色谱和第二色谱之间可以包括附加的步骤。
本文关于色谱所用的术语“连续的”指将第一色谱材料和第二色谱材料直接连接，或允许两种色谱材料之间连续流动的某种其他机制。
“加载密度”是指与一定体积(例如，升)的色谱材料接触的组合物的量，例如，克。在一些实例中，加载密度以g/L表示。
本文提到的“约”某个值或参数包括(和描述)涉及该值或参数本身的变动。例如，提到“约X”的描述包括了“X”的描述。
除非文中清楚地另有说明，本文及所附权利要求中使用的单数形式“一”、“或”和“该”包括复数指代物。应理解，本文描述的本发明的方面和变通形式包括由该方面和变通形式组成和/或基本上由该方面和变通形式组成。
II.纯化方法
本文提供了用于产生DsbA和DsbC的超纯制品的方法。在一些实施方案中，制品包含大于约95.0％、96.0％、97.0％、98.0％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的任何的纯DsbA或DsbC。在一些实施方案中，99％纯DsbA或99％纯DsbC的制品表明在制品中少于1％的材料是存在于在DsbA或DsbC的生产过程中存在的细胞或细胞裂解物中存在的物质(例如蛋白质、核酸、脂质等)。DsbA或DsbC的99％纯制品可含有用于纯化或配制DsbA或DsbC的缓冲液、盐或其他赋形剂。
A.DsbA纯化
在一些方面，本发明提供了用于产生DsbA的超纯制品的方法。在一些实施方案中，DsbA通过在细菌发酵培养物如大肠杆菌培养物中过表达DsbA来产生。发酵后，收集细菌细胞并离心。将所得细胞浆重新悬浮于裂解缓冲液(例如，10mM MOPS pH 7.1)中并裂解(例如通过使用微流化器)。在一些实施方案中，细胞裂解物用聚乙烯亚胺(PEI)调理。在一些实施方案中，细胞裂解物用PEI调理，其终浓度大于约0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1.0％中任何。在一些实施方案中，细胞裂解物用PEI调理超过约15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20小时或24小时之任何。在一些实施方案中，细胞裂解物在大约大于0℃、4℃或21℃中任何下用PEI调理。在一些实施方案中，细胞裂解物在环境温度(～21℃)下用PEI调理。在一些实施方案中，将PE调理的裂解物离心以除去微粒。在一些实施方案中，在色谱法之前过滤PEI调理的裂解物。在一些实施方案中，在色谱之前，通过22μm过滤器过滤PEI调理的裂解物。
在一些实施方案中，该方法包括用于从包含DsbA多肽的细胞裂解物中纯化DsbA多肽的方法，所述方法包括a)将聚乙烯亚胺(PEI)加入至包含DsbA多肽的细胞裂解物中，至终浓度约0.01％至约1.0％，b)通过离心来澄清细胞裂解物，c)将包含DsbA多肽的澄清细胞裂解物施用于阴离子交换色谱材料，d)从阴离子交换色谱材料洗脱DsbA多肽以产生包含DsbA多肽的阴离子交换洗脱物，e)将包含DsbA多肽的阴离子交换洗脱物施用于阳离子交换色谱材料，f)从阳离子交换色谱材料洗脱DsbA多肽以产生包含纯化的DsbA多肽的阳离子交换洗脱物。
在本文所述的任意方法的一些实施方案中，阴离子交换色谱材料是固相(该固相带正电荷)，且具有用于与流过或通过该固相的水溶液中的阴离子交换的游离阴离子。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，该阴离子交换材料可以是膜、monolith或树脂。在一个实施方案中，该阴离子交换材料可以是树脂。在一些实施方案中，该阴离子交换材料可以包含伯胺、仲胺、叔胺或季铵离子官能团、多胺官能团或二乙氨基乙基官能团。在以上的一些实施方案中，该阴离子交换色谱材料是阴离子交换色谱柱。在以上的一些实施方案中，该阴离子交换色谱材料是阴离子交换色谱膜。
在本文所述的任意方法的一些实施方案中，阳离子交换材料是固相(该固相带负电荷)，且具有用于与流过或通过该固相的水溶液中的阳离子交换的游离阳离子。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，该阳离子交换材料可以是膜、monolith或树脂。在一些实施方案中，该阳离子交换材料可以是树脂。该阳离子交换材料可以包含羧酸官能团或磺酸官能团，例如但不限于磺酸盐、羧酸、羧甲基磺酸、磺异丁基、磺乙基、羧基、磺丙基、磺酰基、磺酰氧乙基(sulphoxyethyl)或正磷酸盐。在以上的一些实施方案中，该阳离子交换色谱材料是阳离子交换色谱柱。在以上的一些实施方案中，该阳离子交换色谱材料是阳离子交换色谱膜。在本发明的一些实施方案中，该色谱材料不是阳离子交换色谱材料。
在本文所述的任意方法的一些实施方案中，该离子交换材料可以利用常规色谱材料或对流色谱材料。常规色谱材料包括例如灌注性材料(例如聚(苯乙烯-二乙烯苯)树脂)和扩散性材料(例如交联琼脂糖树脂)。在一些实施方案中，该聚(苯乙烯-二乙烯苯)树脂可以是Poros树脂。在一些实施方案中，该交联琼脂糖树脂可以是磺丙基-Sepharose FastFlow(“SPSFF”)树脂。对流色谱材料可以是膜(例如聚醚砜)或monolith材料(例如交联聚合物)。该聚醚砜膜可以是Mustang。交联聚合物monolith材料可以是交联聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)。
阴离子交换材料的实例为本领域已知，其包括但不限于Poros HQ 50、Poros PI50、Poros D、Mustang Q、QFF(QSFF)和DEAE或其等同物。在一些实施方案中，阴离子交换材料是弱阴离子交换材料；例如DEAE。在其它实施方案中，阴离子交换材料是强阴离子交换材料；例如QSFF。
阳离子交换材料的实例为本领域已知，其包括但不限于Mustang S、Sartobind S、SO3Monolith、S Ceramic HyperD、Poros XS、Poros HS50、Poros HS20、SPSFF、SP-Sepharose XL(SPXL)、CM Sepharose Fast Flow、Capto S、Fractogel Se HiCap、Fractogel SO3或Fractogel COO或其等同物。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，该阳离子交换材料是Poros HS50。在一些实施方案中，该Poros HS树脂可以是Poros HS 50μm或Poros HS 20μm颗粒。在一些实施方案中，阳离子交换材料是弱阳离子交换材料；例如CM或其等同物。在其它实施方案中，阳离子交换材料是强阳离子交换材料；例如POROS HS 50或其等同物。
对在色谱材料上包含DsbA的组合物的加载进行优化以将DsbA产物与杂质分离。在一些实施方案中，对组合物加载到色谱材料针对杂质与色谱材料结合而进行优化。例如，可以将组合物加载到在多个不同pH的加载缓冲液中的色谱材料(例如，色谱柱)上，同时加载缓冲液的电导率恒定。或者，可以将组合物以多个不同的电导率加载到加载缓冲液中的色谱材料上，同时加载缓冲液的pH恒定。当完成将组合物加载在色谱材料上并且将产物从色谱材料洗脱到池级分中时，池级分中的污染物的量提供了关于针对给定pH或电导率的产物与杂质的分离的信息。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，将包含DsbA的组合物以小于或等于约10mg/mL、9mg/mL、8mg/mL、7mg/mL、6mg/mL、5mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL或1mg/mL的阴离子交换色谱材料之任何的多肽的加载密度加载到阴离子交换色谱材料上。组合物可以以在约1mg/mL和2mg/mL、2mg/mL和3mg/mL、3mg/mL和4mg/mL、4mg/mL和5mg/mL、5mg/mL和6mg/mL、6mg/mL和7mg/mL、7mg/mL和8mg/mL、8mg/mL和9mg/mL或9mg/mL和10mg/mL阴离子色谱材料的多肽之任何之间的加载密度加载到阴离子交换色谱材料上。在一些实施方案中，阴离子交换色谱材料是交联至琼脂糖的季胺；例如QSFF。
在本文所述任何方法的一些实施方案中，将包含DsbA的组合物以小于或等于约10mg/mL、9mg/mL、8mg/mL、7mg/mL、6mg/mL、5mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL或1mg/mL的阴离子交换色谱材料的多肽之任何的加载密度加载在阳离子交换色谱材料上。组合物可以以在大约1mg/mL和2mg/mL，2mg/mL和3mg/mL、3mg/mL和4mg/mL、4mg/mL和5mg/mL、5mg/mL和6mg/mL、6mg/mL和7mg/mL、7mg/mL和8mg/mL、8mg/mL和9mg/mL或9mg/mL和10mg/mL的阳离子交换色谱材料的多肽之任何之间的加载密度加载到阳离子色谱材料上。在一些实施方案中，阳离子交换色谱材料是与聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基质交联的磺丙基部分；例如POROS HS50或其等同物。
可以对从色谱材料中洗脱DsbA进行优化用于具有最小的杂质和最小的池体积的DsbA的产量。例如，可以将组合物加载到在加载缓冲液中的色谱材料上，例如，色谱柱。加载完成后，产物用多种不同pH的缓冲液洗脱，而洗脱缓冲液的电导率是恒定的。或者，产物可以在洗脱缓冲液中以多种不同的电导率从色谱材料中洗脱，同时洗脱缓冲液的pH恒定。在从色谱材料中完成产物洗脱后，池级分中的污染物的量提供关于针对给定pH或电导率下将产物与杂质分离的信息。以大量级分(例如8个柱体积)洗脱产物表明洗脱曲线的“拖尾”。在本发明的一些实施方案中，洗脱的拖尾被最小化。
根据例如缓冲液所需的pH、缓冲液所需的电导率、目的蛋白质的特征以及纯化方法可以使用多种缓冲液。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述方法包括使用缓冲液。缓冲液可以是加载缓冲液、平衡缓冲液或洗涤缓冲液。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种是相同的。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液是不同的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，缓冲液包含盐。加载缓冲液可以包含氯化钠、乙酸钠或其混合物。在一些实施方案中，加载缓冲液是氯化钠缓冲液。在一些实施方案中，加载缓冲液是乙酸钠缓冲液。
本文所用的加载是加载至色谱材料上的组合物。加载缓冲液是用于将包含DsbA的组合物加载至色谱材料上的缓冲液。可以在加载待纯化的组合物之前用平衡缓冲液平衡色谱材料。在一些实例中，在将组合物加载至色谱材料之后和从固相洗脱目的多肽之前使用洗涤缓冲液。
本文所用的洗脱是从色谱材料去除产物，例如DsbA。洗脱缓冲液是用于从色谱材料洗脱多肽或其他目的产物的缓冲液。在许多情况下，洗脱缓冲液具有不同于加载缓冲液的物理特征。例如，洗脱缓冲液可以具有不同于加载缓冲液的电导率或不同于加载缓冲液的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液低的电导率。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液高的电导率。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液低的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液高的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有不同于加载缓冲液的电导率和不同于加载缓冲液的pH。洗脱缓冲液可以具有较高或较低的电导率和较高或较低的pH的任意组合。
电导率指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子转运流动。因此，随着水溶液中存在的离子的量逐渐增加，溶液将具有更高的电导率。测量电导率的基本单位是Siemen(或mho)、mho(mS/cm)，且可以用电导率计测量，如多种型号的Orion电导率计。由于电解质电导率是溶液中的离子携带电流的能力，可以通过改变其中离子的浓度来改变溶液的电导率。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如氯化钠、乙酸钠或氯化钾)的浓度，以达到希望得到的电导率。优选地，改变多种缓冲液的盐浓度以达到希望得到的电导率。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，加载缓冲液的电导率大于大约4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm或10mS/cm之任何。电导率可以是介于约4mS/cm和17mS/cm、4mS/cm和10mS/cm、4mS/cm和7mS/cm、5mS/cm和17mS/cm、5mS/cm和10mS/cm、或5mS/cm和7mS/cm之任何之间。在一些实施方案中、电导率约为4mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm或10mS/cm之任何。在一个方面，电导率是加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的电导率。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和洗涤缓冲液中的一种或多种的电导率相同。在一些实施方案中，加载缓冲液的电导率不同于洗涤缓冲液和/或平衡缓冲液的电导率。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率大于加载缓冲液的电导率。在本文所述任何方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液具有大于约5mS/cm、10mS/cm、15mS/cm、20mS/cm、25mS/cm、30mS/cm、35mS/cm、40mS/cm、45mS/cm、50mS/cm、55mS/cm、60mS/cm、65mS/cm、70mS/cm、75mS/cm、80mS/cm、85mS/cm、90mS/cm、95mS/cm、或100mS/cm之任何的电导率。在一些实施方案中，上述洗脱缓冲液用于阴离子交换或阳离子交换色谱。在一些实施方案中，通过改变洗脱缓冲液的盐浓度来改变洗脱缓冲液的电导率。
在任何上述实施方案的一些方面，洗脱缓冲液的电导率通过不连续梯度或线性梯度从加载和/或洗涤缓冲液等度改变。
在一些实施方案中，通过以下步骤将DsbA从阴离子交换色谱材料中洗脱：1)对约4个柱体积，约15％的约25mM Tris和约250mM NaCl，约pH 9.2，2)对约4柱体积，约20％的约25mM Tris和约250mM NaCl，约pH 4.2，和3)约25％的约25mM Tris和约250mM NaCl，约pH9.2，直到DsbA从柱中洗脱出来。在一些实施方案中，使用15个柱体积以上的约0％至约60％12mM MES和1M NaCl的盐梯度从阳离子交换色谱中洗脱DsbA。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阴离子交换加载缓冲液具有小于大约10、9、8、7、6或5中任何的pH。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，加载缓冲液的pH大于大约4、5、6、7、8或9中的任何。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种的pH相同。在一些实施方案中，加载缓冲液的pH不同于平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的pH。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH小于加载缓冲液的pH。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液具有小于大于8、7、6、5、4、3或2中任何的pH。洗脱缓冲液的pH可以介于大约4和9、4和8、4和7、4和6、4和5、5和9、5和8、5和7、5和6、6和9、6和8、6和7之任何之间。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH约为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0之任何。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阳离子交换加载缓冲液具有小于约4、5、6或7中任何的pH。在本文所述任何方法的一些实施方案中，加载缓冲液具有大于约4、5、6或7中任何的pH。在一些实施方案中，加载缓冲液，平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种的pH相同。在一些实施方案中，加载缓冲液的pH不同于平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的pH。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH值大于加载缓冲液的pH。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH大于大约5、6、7、8或9中任何。洗脱缓冲液的pH可以介于大约4和9、5和9、6和9、7和9、8和9、4和8、5和8、6和8、7和8、4和7、5和7、以及6和7之任何之间。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，流速小于约50CV/hr、40CV/hr或30CV/hr中的任何。流速可以是介于大约5CV/hr和50CV/hr，10CV/hr和40CV/hr，或18CV/hr和36CV/hr之任何的之间。在一些实施方案中，流速约为9CV/hr、18CV/hr、25CV/hr、30CV/hr、36CV/hr或40CV/hr之任何。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，流速小于约200cm/hr、150cm/hr、100cm/hr、75cm/hr或50cm/hr中的任何。流速可以是介于大约25cm/hr和200cm/hr、25cm/hr和175cm/hr、25cm/hr和150cm/hr、25cm/hr和100cm/hr，50cm cm/hr和100cm/hr，或65cm/hr和85cm/hr的任何之间。
床高度是使用的色谱材料的高度。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，床高度大于大约3cm、10cm、15cm、20cm、25cm、30cm、35cm、40cm、45cm或50cm中的任何。床高度可以是介于大约3cm和50cm、5cm和35cm、3cm和35cm、或5cm和50cm的任何之间。在一些实施方案中，基于加载中的多肽或杂质的量来确定床高度。
在一些实施方案中，色谱在容器柱中，体积大于约1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、40mL、50mL、75mL、100mL或200mL。
在本发明的一些实施方案中，从色谱收集级分。在一些实施方案中，收集的级分大于约0.01CV、0.02CV、0.03CV、0.04CV、0.05CV、0.06CV、0.07CV、0.08CV、0.09CV、0.1CV、0.2CV、0.3CV、0.4CV、0.5CV、0.6CV、0.7CV、0.8CV、0.9CV、1.0CV、2.0CV、3.0CV、4.0CV、5.0CV、6.0CV、7.0CV、8.0CV、9.0CV或10.0CV。在一些实施方案中，合并含有产物(例如多肽)的级分。在一些实施方案中，合并来自加载级分和从洗脱级分的含有多肽的级分。级分中多肽的量可由本领域技术人员确定；例如，可以通过紫外光谱测定级分中的多肽的量。在一些实施方案中，合并含有可检测多肽片段的级分。在一些实施方案中，级分中DsbA的存在和纯度通过尺寸排阻色谱法测定。
示例性实施方案
在一些实施方案中，本发明提供了用于制备DsbA超纯制品的以下示例性但非限制性方法。DsbA在大肠杆菌中表达。将细胞浆在10mM MOPS pH 7.1中悬浮(50g细胞浆/1L)并混合直到悬浮液均匀。使用Microfluidizer 110F在室压(～7000psi)下通过3次进行细胞裂解。将匀浆调理至0.1％PEI(使用10％PEI储备溶液)，并在环境温度(～21℃)下混合30分钟。将悬浮液在Sorval RC-5B+离心机中使用“GSA”转子以8500rpm离心30分钟。通过0.22umDurapore过滤器收集并过滤浓缩物。
(a)步骤
将细胞裂解物以结合和洗脱模式施用于FF(GE)。柱高度约为20-30cm高，流速为150cm/h，加载密度≤6mg/mL。柱用25mM Tris，1M NaCl，pH 9.2，86mS/cm，4柱体积(CV)预平衡。柱用25mM Tris，pH 9.1，0.3mS/cm，4CV平衡。包含DsbA的浓缩物用水(1:1)稀释，然后用1.5M Tris Base pH 9.0，电导率～1.0mS/cm，≤6mg/mL进行pH调节至9.0。然后用6CV的平衡缓冲液洗柱。使用盐浓度的不连续梯度增加从柱上洗脱DsbA。缓冲液B为25mM Tris，250mM NaCl，pH9.2，26mS/cm。通过首先施用针对4CV的15％缓冲液B，然后针对4CV的20％缓冲液B，最后针对剩余洗脱相的25％缓冲液B来从柱洗脱DsbA。通过SEC测定池，并基于含有最大量的DsbA的级分合并。
(b)POROS HS50步骤
然后将合并的QSFF级分以结合和洗脱模式施用于POROS HS50柱。用2.0M乙酸将QSFF级分调节至pH5.0。柱高约20-30cm，流速约150cm/h，并且加载密度约≤6mg/mL。POROSHS50柱首先用12.5mM MES，pH 5.5，0.4mS/cm，4CV平衡。用2M乙酸调节pH至5.0，然后用水(1:2)稀释的QSFF池pH 5.0，0.4mS/cm加载到POROS HS50柱上。然后用5CV平衡缓冲液洗涤柱。DsbA以盐梯度从柱上洗脱。缓冲液B为12.5mM MES，250mM NaCl pH 5.5，25mS/cm。梯度为15CV以上的0至60％B。1CV级分是收集的峰。基于SDS-PAGE凝胶和SEC的纯度分析并合并级分。使用10kD Centricon膜(Millipore)将POROS池浓缩至～3.0mg/mL，使用Sorval RC-3B离心机以3000rpm离心约30分钟。
B.DsbC纯化
在一些方面，本发明提供了用于产生DsbC的超纯制品的方法。在一些实施方案中，DsbC通过在细菌发酵培养物如大肠杆菌培养物中过表达DsbC来产生。发酵后，收集细菌细胞并离心。将所得细胞浆重新悬浮于裂解缓冲液(例如，10mM MOPS pH 7.1)中并裂解(例如通过使用微流化器)。在一些实施方案中，细胞裂解物用聚乙烯亚胺(PEI)调理。在一些实施方案中，细胞裂解物用PEI调理，其终浓度大于约0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1.0％中任何。在一些实施方案中，细胞裂解物用PEI调理超过约15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20小时或24小时之任何。在一些实施方案中，细胞裂解物在大约大于0℃、4℃或21℃中任何下用PEI调理。在一些实施方案中，细胞裂解物在环境温度(～21℃)下用PEI调理。在一些实施方案中，将PE调理的裂解物离心以除去微粒。在一些实施方案中，在色谱法之前过滤PEI调理的裂解物。在一些实施方案中，在色谱之前，通过22μm过滤器过滤PEI调理的裂解物。
在一些实施方案中，该方法包括用于从包含DsbC多肽的细胞裂解物中纯化DsbC多肽的方法，所述方法包括a)将聚乙烯亚胺(PEI)加入至包含DsbC多肽的细胞裂解物中，至终浓度约0.01％至约1.0％，b)通过离心来澄清细胞裂解物，c)将包含DsbC多肽的澄清细胞裂解物施用于阴离子交换色谱材料，d)从阴离子交换色谱材料洗脱DsbC多肽以产生包含DsbC多肽的阴离子交换洗脱物，e)将包含DsbC多肽的阴离子交换洗脱物施用于疏水相互作用色谱(HIC)材料，f)从HIC材料洗脱DsbC多肽以产生HIC洗脱物，g)将包含DsbC多肽的HIC洗脱物施用于尺寸排阻色谱，h)从包含纯化的DsbC多肽的尺寸排阻色谱收集级分。
在本文所述的任意方法的一些实施方案中，阴离子交换色谱材料是固相(该固相带正电荷)，且具有用于与流过或通过该固相的水溶液中的阴离子交换的游离阴离子。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，该阴离子交换材料可以是膜、monolith或树脂。在一个实施方案中，该阴离子交换材料可以是树脂。在一些实施方案中，该阴离子交换材料可以包含伯胺、仲胺、叔胺或季铵离子官能团、多胺官能团或二乙氨基乙基官能团。在以上的一些实施方案中，该阴离子交换色谱材料是阴离子交换色谱柱。在以上的一些实施方案中，该阴离子交换色谱材料是阴离子交换色谱膜。
在本文所述的任意方法的一些实施方案中，该阴离子交换材料可以利用常规色谱材料或对流色谱材料。常规色谱材料包括例如灌注性材料(例如聚(苯乙烯-二乙烯苯)树脂)和扩散性材料(例如交联琼脂糖树脂)。在一些实施方案中，该聚(苯乙烯-二乙烯苯)树脂可以是Poros树脂。在一些实施方案中，该交联琼脂糖树脂可以是磺丙基-SepharoseFast Flow(“SPSFF”)树脂。对流色谱材料可以是膜(例如聚醚砜)或monolith材料(例如交联聚合物)。该聚醚砜膜可以是Mustang。交联聚合物monolith材料可以是交联聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)。
阴离子交换材料的实例为本领域已知，其包括但不限于Poros HQ 50、Poros PI50、Poros D、Mustang Q、QFF(QSFF)和DEAE或其等同物。在一些实施方案中，阴离子交换材料是弱阴离子交换材料；例如DEAE。在其它实施方案中，阴离子交换材料是强阴离子交换材料；例如QSFF。在一些实施方案中，用于纯化DsbC的阴离子交换材料是弱阴离子交换材料。在一些实施方案中，弱阴离子交换材料包括季胺。在一些实施方案中，季胺与交联的琼脂糖连接。在一些实施方案中，用于纯化DsbC的阴离子交换材料是DEAE
在本文所述任何方法的一些实施方案中，疏水相互作用色谱(HIC)是根据疏水性分离生物分子的液相色谱技术。HIC色谱材料的实例包括但不限于Toyopearl hexyl 650、Toyopear butyl 650、Toyopearl phenyl 650、Toyopearl ether 650、Source、Resource、Hi-Trap、Octyl苯基在上述的一些实施方案中，HIC色谱材料是HIC色谱柱。在上述的一些实施方案中，HIC色谱材料是HIC色谱膜。在一些实施方案中，HIC材料包含苯基部分。在一些实施方案中，苯基部分与交联的琼脂糖连接。在一些实施方案中，用于纯化DsbC的HIC材料是苯基
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，尺寸排阻色谱是根据其大小和形状分离生物分子的液相色谱技术。尺寸排阻色谱材料具有不同的孔径，用于有效分离特定重量范围的分子。尺寸排阻色谱材料的实例包括但不限于葡聚糖、多孔琼脂糖颗粒、交联的琼脂糖、交联的琼脂糖和葡聚糖、以及交联的丙烯酰胺。尺寸排阻色谱材料的实例包括但不限于Sephadex、Superdex、Sephacryl、TSKgel和Bio-Gel。在一些实施方案中，Superdex 75尺寸排阻色谱用于DsbC的纯化。
对在色谱材料上包含DsbC的组合物的加载进行优化以将DsbC产物与杂质分离。在一些实施方案中，对组合物加载到色谱材料针对杂质与色谱材料结合而进行优化。例如，可以将组合物加载到在多个不同pH的加载缓冲液中的色谱材料(例如，色谱柱)上，同时加载缓冲液的电导率恒定。或者，可以将组合物以多个不同的电导率加载到加载缓冲液中的色谱材料上，同时加载缓冲液的pH恒定。当完成将组合物加载在色谱材料上并且将产物从色谱材料洗脱到池级分中时，池级分中的污染物的量提供了关于针对给定pH或电导率的产物与杂质的分离的信息。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，将包含DsbC的组合物以小于或等于约10mg/mL、9mg/mL、8mg/mL、7mg/mL、6mg/mL、5mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL或1mg/mL的阴离子交换色谱材料之任何的多肽的加载密度加载到阴离子交换色谱材料上。组合物可以以在约1mg/mL和2mg/mL、2mg/mL和3mg/mL、3mg/mL和4mg/mL、4mg/mL和5mg/mL、5mg/mL和6mg/mL、6mg/mL和7mg/mL、7mg/mL和8mg/mL、8mg/mL和9mg/mL或9mg/mL和10mg/mL阴离子色谱材料的多肽之任何之间的加载密度加载到阴离子交换色谱材料上。在一些实施方案中，阴离子交换色谱材料是交联至琼脂糖的季胺；例如DEAE
在本文所述任何方法的一些实施方案中，将包含DsbC的组合物以小于或等于约10mg/mL、9mg/mL、8mg/mL、7mg/mL、6mg/mL、5mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL或1mg/mL的HIC材料的多肽之任何的加载密度加载在HIC材料上。组合物可以以在大约1mg/mL和2mg/mL，2mg/mL和3mg/mL、3mg/mL和4mg/mL、4mg/mL和5mg/mL、5mg/mL和6mg/mL、6mg/mL和7mg/mL、7mg/mL和8mg/mL、8mg/mL和9mg/mL或9mg/mL和10mg/mL的HIC的多肽之任何之间的加载密度加载到HIC材料上。在一些实施方案中，HIC材料是交联至交联的琼脂糖的苯基部分；例如，苯基
可以对从色谱材料中洗脱DsbC进行优化用于具有最小的杂质和最小的池体积的DsbC的产量。例如，可以将组合物加载到在加载缓冲液中的色谱材料上，例如，色谱柱。加载完成后，产物用多种不同pH的缓冲液洗脱，而洗脱缓冲液的电导率是恒定的。或者，产物可以在洗脱缓冲液中以多种不同的电导率从色谱材料中洗脱，同时洗脱缓冲液的pH恒定。在从色谱材料中完成产物洗脱后，池级分中的污染物的量提供关于针对给定pH或电导率下将产物与杂质分离的信息。以大量级分(例如8个柱体积)洗脱产物表明洗脱曲线的“拖尾”。在本发明的一些实施方案中，洗脱的拖尾被最小化。
根据例如缓冲液所需的pH、缓冲液所需的电导率、目的蛋白质的特征以及纯化方法可以使用多种缓冲液。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述方法包括使用缓冲液。缓冲液可以是加载缓冲液、平衡缓冲液或洗涤缓冲液。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种是相同的。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液是不同的。在本文所述任何方法的一些实施方案中，缓冲液包含盐。加载缓冲液可以包含氯化钠、乙酸钠或其混合物。在一些实施方案中，加载缓冲液是氯化钠缓冲液。在一些实施方案中，加载缓冲液是乙酸钠缓冲液。
本文所用的加载是加载至色谱材料上的组合物。加载缓冲液是用于将包含DsbC的组合物加载至色谱材料上的缓冲液。可以在加载待纯化的组合物之前用平衡缓冲液平衡色谱材料。在一些实例中，在将组合物加载至色谱材料之后和从固相洗脱目的多肽之前使用洗涤缓冲液。
本文所用的洗脱是从色谱材料去除产物，例如DsbC。洗脱缓冲液是用于从色谱材料洗脱多肽或其他目的产物的缓冲液。在许多情况下，洗脱缓冲液具有不同于加载缓冲液的物理特征。例如，洗脱缓冲液可以具有不同于加载缓冲液的电导率或不同于加载缓冲液的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液低的电导率。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液高的电导率。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液低的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液高的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有不同于加载缓冲液的电导率和不同于加载缓冲液的pH。洗脱缓冲液可以具有较高或较低的电导率和较高或较低的pH的任意组合。
电导率指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子转运流动。因此，随着水溶液中存在的离子的量逐渐增加，溶液将具有更高的电导率。测量电导率的基本单位是Siemen(或mho)、mho(mS/cm)，且可以用电导率计测量，如多种型号的Orion电导率计。由于电解质电导率是溶液中的离子携带电流的能力，可以通过改变其中离子的浓度来改变溶液的电导率。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如氯化钠、乙酸钠或氯化钾)的浓度，以达到希望得到的电导率。优选地，改变多种缓冲液的盐浓度以达到希望得到的电导率。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阴离子交换加载缓冲液的电导率大于大约4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm或10mS/cm之任何。电导率可以是介于约4mS/cm和17mS/cm、4mS/cm和10mS/cm、4mS/cm和7mS/cm、5mS/cm和17mS/cm、5mS/cm和10mS/cm、或5mS/cm和7mS/cm之任何之间。在一些实施方案中、电导率约为4mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm或10mS/cm之任何。在一个方面，电导率是加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的电导率。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和洗涤缓冲液中的一种或多种的电导率相同。在一些实施方案中，加载缓冲液的电导率不同于洗涤缓冲液和/或平衡缓冲液的电导率。
在一些实施方案中，阴离子交换洗脱缓冲液的电导率大于加载缓冲液的电导率。在本文所述任何方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液具有大于约5mS/cm、10mS/cm、15mS/cm、20mS/cm、25mS/cm、30mS/cm、35mS/cm、40mS/cm、45mS/cm、50mS/cm、55mS/cm、60mS/cm、65mS/cm、70mS/cm、75mS/cm、80mS/cm、85mS/cm、90mS/cm、95mS/cm、或100mS/cm之任何的电导率。在一些实施方案中，通过改变洗脱缓冲液的盐浓度来改变洗脱缓冲液的电导率。
在一些实施方案中，HIC加载缓冲液具有大于洗脱缓冲液的电导率的电导率。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，HIC加载缓冲液具有大于约5mS/cm、10mS/cm、15mS/cm、20mS/cm、25mS/cm、30mS/cm、35mS/cm、40mS/cm、45mS/cm、50mS/cm、55mS/cm、60mS/cm、65mS/cm、70mS/cm、75mS/mS/cm、80mS/cm、85mS/cm、90mS/cm、95mS/cm或100mS/cm之任何的电导率。在一些实施方案中，通过改变洗脱缓冲液的盐浓度来改变洗脱缓冲液的电导率。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，HIC洗脱缓冲液具有小于约4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm或10mS/cm之任何的电导率。
在任何上述实施方案的一些方面，洗脱缓冲液的电导率通过不连续梯度或线性梯度从加载和/或洗涤缓冲液等度改变。
在一些实施方案中，从阴离子交换色谱材料中用15％柱体积以上的约0％至约60％的10mM MOPS和250mM NaCl的盐梯度从阴离子交换色谱材料洗脱DsbC。在一些实施方案中，盐梯度为10个柱体积以上的约0％至约60％的10mM MOPS和250mM NaCl。
在一些实施方案中，使用纯化水从HIC材料洗脱DsbC，直到DsbC从HIC材料洗脱出来。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阴离子交换加载缓冲液具有小于大约10、9、8、7、6或5中任何的pH。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，加载缓冲液的pH大于大约4、5、6、7、8或9中的任何。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种的pH相同。在一些实施方案中，加载缓冲液的pH不同于平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的pH。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH小于加载缓冲液的pH。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液具有小于大于8、7、6、5、4、3或2中任何的pH。洗脱缓冲液的pH可以介于大约4和9、4和8、4和7、4和6、4和5、5和9、5和8、5和7、5和6、6和9、6和8、6和7之任何之间。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH约为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0之任何。在一些实施方案中，将包含DsbC的组合物在pH8的加载缓冲液中加载到阴离子交换材料上，并在pH约7.0或7.1的洗脱缓冲液中从阴离子交换材料洗脱。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，HIC加载缓冲液具有小于约6、7或8中任何的pH。在本文所述任何方法的一些实施方案中，加载缓冲液具有大于约6、7或8中任何的pH。在一些实施方案中，加载缓冲液，平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种的pH相同。在一些实施方案中，加载缓冲液的pH不同于平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的pH。
在一些实施方案中，尺寸排阻色谱以流通模式使用。在一些实施方案中，用于尺寸排阻色谱的缓冲液为PBS pH 7.0±0.4。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，流速小于约50CV/hr、40CV/hr或30CV/hr中的任何。流速可以是介于大约5CV/hr和50CV/hr，10CV/hr和40CV/hr，或18CV/hr和36CV/hr之任何的之间。在一些实施方案中，流速约为9CV/hr、18CV/hr、25CV/hr、30CV/hr、36CV/hr或40CV/hr之任何。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，流速小于约200cm/hr、150cm/hr、100cm/hr、75cm/hr或50cm/hr中的任何。流速可以是介于大约25cm/hr和200cm/hr、25cm/hr和175cm/hr、25cm/hr和150cm/hr、25cm/hr和100cm/hr，50cm cm/hr和100cm/hr，或65cm/hr和85cm/hr的任何之间。在一些实施方案中，流速约大于约0.1mL/min、0.25mL/min、0.5mL/min、0.75mL/min、1mL/min、2mL/min、3mL/min、4mL/min、5mL/min、6mL/min、7mL/min、8mL/min、9mL/min、10mL/min、11mL/min、12mL/min、13mL/min、14mL/min、15mL/min、20mL/min、25mL/min和50mL/min。在一些实施方案中，流速在约0.1mL/min和1mL/min、1mL/min和5mL/min、1mL/min和10mL/min、5mL/min和10mL/min、10mL/min和15mL/min、10mL/min和25mL/min、以及15mL/min和25mL/min之间。在一些实施方案中，DsbC的阴离子交换色谱的流速为约13.3ml/min。在一些实施方案中，DsbC的疏水相互作用色谱的流速为约13.2ml/min。在一些实施方案中，DsbC的尺寸排阻色谱的流速为约1ml/min。
床高度是使用的色谱材料的高度。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，床高度大于大约3cm、10cm、15cm、20cm、25cm、30cm、35cm、40cm、45cm、50cm、60cm,70cm,80cm,90cm或100cm中的任何。床高度可以是介于大约3cm和50cm、5cm和35cm、3cm和35cm、或5cm和50cm的任何之间。在一些实施方案中，基于加载中的多肽或杂质的量来确定床高度。
在一些实施方案中，色谱在容器柱中，体积大于约1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、40mL、50mL、75mL、100mL或200mL。
在本发明的一些实施方案中，从色谱收集级分。在一些实施方案中，收集的级分大于约0.01CV、0.02CV、0.03CV、0.04CV、0.05CV、0.06CV、0.07CV、0.08CV、0.09CV、0.1CV、0.2CV、0.3CV、0.4CV、0.5CV、0.6CV、0.7CV、0.8CV、0.9CV、1.0CV、2.0CV、3.0CV、4.0CV、5.0CV、6.0CV、7.0CV、8.0CV、9.0CV或10.0CV。在一些实施方案中，合并含有产物(例如多肽)的级分。在一些实施方案中，合并来自加载级分和从洗脱级分的含有多肽的级分。级分中多肽的量可由本领域技术人员确定；例如，可以通过紫外光谱测定级分中的多肽的量。在一些实施方案中，合并含有可检测多肽片段的级分。在一些实施方案中，级分中DsbC的存在和纯度通过尺寸排阻色谱法测定。
示例性实施方案
在一些实施方案中，本发明提供了用于制备DsbC超纯制品的以下示例性但非限制性方法。DsbC在大肠杆菌中表达。将细胞浆在10mM MOPS pH 7.1中悬浮(50g细胞浆/1L)并混合直到悬浮液均匀。使用Microfluidizer 110F在室压(～7000psi)下通过3次进行细胞裂解。将匀浆调理至0.1％PEI(使用10％PEI储备溶液)，并在环境温度(～21℃)下混合30分钟。将悬浮液在Sorval RC-5B+离心机中使用“GSA”转子以8500rpm离心30分钟。通过0.22umDurapore过滤器收集并过滤浓缩物。
(a)DEAE Sepharose
将澄清的浓缩物(用1.5M Tris碱调理至pH8.0)以结合和洗脱模式加载到含有Fast Flow(GE Healthcare)的柱中。该柱具有以下特性：柱直径为28.4cm×2.6cm，体积为151mL，蛋白质容量≤50mg/mL树脂。柱用3CV 250mM MOPS pH 7.1预平衡；条件是6.2mS/cm，并用10mM MOPS，pH7.1平衡；条件是0.3mS/cm。在加载结束时，用12CV的平衡缓冲液洗涤柱子。使用0-60％缓冲液B的15CV梯度洗脱DsbC。洗脱是15CV以上的到洗脱缓冲液中的0-60％缓冲液B的线性梯度。通过SDS-PAGE分析级分。
(b)苯基Sepharose
然后将合并的DEAE级分以结合和洗脱模式施加到苯基Sepharose色谱上。该柱具有以下特性：柱直径为20cm×2.6cm，体积为106mL，蛋白质容量≤20mg/mL树脂。柱用0.6M硫酸钠，50mM磷酸钠，pH7.0平衡。将含有DsbC的调理的DEAE池加载到苯基Sepharose柱上，随后用1.2M硫酸钠1:1稀释，用1M磷酸钠1:20稀释，并调节至pH7.0，～68mS/cm，然后加载。然后用7CV 0.6M硫酸钠，50mM磷酸钠，pH7.0，然后用7CV 0.6M硫酸钠，50mM磷酸钠，pH7.0洗涤柱。用纯化水从柱中洗脱DsbC。收集级分并通过柱级分的SDS-PAGE分析进行分析。
(c)Superdex
然后使用Superdex 75将合并的苯基琼脂糖级分进行尺寸排阻色谱。该步骤用于除去任何残留的高MW和低MW物质并配制DsbC。Superdex 75具有分级范围(5kDa至70kDa)，更适合于较小的蛋白质(～24kDa)，如DsbC。该柱为Superdex 75，并具有以下特性：柱直径为60cm×2.6cm，体积为320mL，加载体积≤16mL。使用离心过滤器将HIC池(级分7-11)浓缩至≤16mL(≤5％的SEC CV)的体积。使用临床离心机以4000rpm离心所述单元，20min间隔，直到达到靶体积。Superdex 75尺寸排阻柱用3CV PBS，pH 7.0±0.4平衡。将苯基sepharose级分加载在柱上，用PBS洗脱，pH 7.0±0.4以1mL/min的流速洗脱。
C.确定DsbA和DsbC纯度的方法
确定DsbA和DsbC的制品纯度的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，制品中的纯度DsbA或DsbC通过尺寸排阻色谱法(SEC)测定。在一些实施方案中，通过高效液相色谱法尺寸排阻色谱法(HPLC SEC)测定制品中纯度DsbA或DsbC。在一些实施方案中，制品中的纯度DsbA或DsbC通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定。在一些实施方案中，使用荧光蛋白染色来鉴定SDS PAGE凝胶上的蛋白质。在一些实施方案中，荧光蛋白染色是Ruby染色。在一些实施方案中，使用Heukeshoven银染色可视化SDS-PAGE上的蛋白质。在其他实施方案中，使用表征测定确认DsbA或DsbC分子的身份，该表征测定包括但不限于N-末端序列分析、肽质量指纹图谱(PMF)、CHIP TOF的完整/还原质量和Western印迹分析。
在一些实施方案中，本发明提供了DsbA的超纯制品。在一些实施方案中，本发明提供DsbA的制品，其中单体DsbA组成制品的至少约95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的任何。在一些实施方案中，单体DsbA约为制品的95％、96％、97％、98％、99％和/或99.5％中的任何。在一些实施方案中，制品包含小于大约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％之任何的杂质。杂质可以包括但不限于宿主细胞蛋白如大肠杆菌宿主细胞蛋白、核酸、病毒、细胞培养组分如细胞培养基组分、以及DsbA的聚集体或DsbA片段(例如，DsbA的非功能片段)。在一些实施方案中，制品包含小于约2％、1.5％或1％之任何的低分子量物质。在一些实施方案中，制品包含小于约1％、0.5％或0.1％的高分子量物质。在一些实施方案中，高分子量物质是不可检测的。在一些实施方案中，通过SEC检测单体DsbA、低分子量物质和/或高分子量物质的存在。
在一些实施方案中，本发明提供了DsbC的超纯制品。在一些实施方案中，本发明提供了DsbC的制品，其中单体DsbC组成制品的至少约95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的任何。在一些实施方案中，单体DsbC约为制品的95％、96％、97％、98％、99％和/或99.5％中的任何。在一些实施方案中，制品包含小于大约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％之任何的杂质。杂质可以包括但不限于宿主细胞蛋白如大肠杆菌宿主细胞蛋白、核酸、病毒、细胞培养组分如细胞培养基组分以及DsbC的聚集体或DsbC片段(例如，DsbC的非功能片段)。在一些实施方案中，所述制品包含小于约1％、0.5％或0.1％之任何的低分子量物质。在一些实施方案中，制品包含小于约1％、0.5％或0.1％的高分子量物质。在一些实施方案中，通过SEC检测单体DsbC、低分子量物质和/或高分子量物质的存在。
测量DNA如宿主细胞DNA的方法为本领域已知，并描述于实施例章节中。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，DNA的量减少大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，或90％中的任一个。DNA的量可以减少约10％和99％、30％和95％、30％和99％、50％和95％、50％和99％、75％和99％，或85％和99％中的任一个之间。DNA的量可以减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％中的任一个。在一些实施方案中，通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中DNA的量与该一个或多个纯化步骤之前组合物中DNA的量相比较来确定该减少。
细胞培养基成分指存在于细胞培养基中的成分。细胞培养基可以是收获细胞时的细胞培养基。在一些实施方案中，该细胞培养基成分是庆大霉素。庆大霉素的量可以通过ELISA测量。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，细胞培养基成分的量减少大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任一个。细胞培养基成分的量可以减少约10％和99％、30％和95％、30％和99％、50％和95％、50％和99％、75％和99％，或85％和99％中的任一个之间。在一些实施方案中，细胞培养基成分的量减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％中的任一个。在一些实施方案中，通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中细胞培养基成分的量与该一个或多个纯化步骤之前组合物中细胞培养基成分的量相比较来确定该减少。
III.多肽-DsbA和DsbC
本发明提供了产生DsbA和DsbC的超纯制品的方法。术语“Dsb”蛋白是指细菌二硫化物氧化还原酶。DsbA形成链内二硫键，因为肽在细胞的周质中氧化蛋白质折叠期间出现在细胞的周质中，并且DsbC充当二硫键异构酶。在一些实施方案中，DsbA和DsbC衍生自细菌。在一些实施方案中，DsbA和DsbC多肽是大肠杆菌DsbA和DsbC多肽。在其他实施方案中，DsbA和DsbC多肽衍生自肠杆菌(Enterobacteria)、不动杆菌(Actinetobacter)、固氮弧菌(Azoarcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、巴克纳氏菌属(Buchnera)、木杆菌属(Xylella)、黄单胞菌(Xanthmonas)、弯曲杆菌(Campylobacter)、志贺氏菌(Shigella)、假单胞菌(Pseudomonas)、耶尔森菌(Yersina)、欧文氏菌属(Erwinia)和奈瑟氏球菌(Neisseria)的任何物种。在一些实施方案中，DsbA多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，DsbA多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性之任何的氨基酸序列。在一些实施方案中，DsbC多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在一些实施方案中，DsbC多肽包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性之任何的氨基酸序列。
要使用本文所述方法纯化的DsbA和DsbC多肽通常是使用重组技术产生的。在细菌中产生重组多肽的方法是本领域已知的。当使用重组技术时，多肽可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。在一些实施方案中，将编码DsbA或DsbC的核酸引入宿主细胞以用于多肽的过表达。在一些实施方案中，编码DsbA或DsbC的核酸由表达载体例如质粒表达。在一些实施方案中，编码DsbA多肽的核酸包含SEQ ID NO：2的核酸序列。在一些实施方案中，编码DsbA的核酸包含与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％之任何的同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码DsbC的核酸包含SEQ ID NO：4的核酸序列。在一些实施方案中，编码DsbC的核酸包含与SEQ ID NO：3的核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％之任何的同一性的核酸序列。
可以从培养基或从宿主细胞裂解物回收多肽。可以通过多种物理或化学手段来破碎用于表达多肽的细胞，如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂。如果多肽在胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤来去除颗粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了用于分离分泌至大肠杆菌周质间隙的多肽的方法。简言之，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下融化细胞糊约30分钟。可以通过离心去除细胞碎片。在多肽分泌进入培养基中时，通常先用市售多肽浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这类表达***的上清。可以在任意前述步骤中包含诸如PMSF的蛋白酶抑制剂来抑制蛋白质水解，且可以包含抗生素来阻止外来污染物的生长。
IV.DsbA和/或DsbC可用于生产的多肽。
在可以通过DsbA和/或DsbC的过表达来辅助蛋白质折叠和组装的细菌(例如大肠杆菌)中产生的多肽的实例包括但不限于免疫球蛋白、免疫黏附素、抗体、酶、激素、融合蛋白质、包含Fc的蛋白质、免疫缀合物、细胞因子和白细胞介素。多肽的实例包括但不限于哺乳动物蛋白质，如，例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；***；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、组织因子和von Willebrands因子；抗凝血因子，如C蛋白；心房钠尿肽；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(调节活化正常T-细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠***相关肽；酶；微生物蛋白质，如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；A蛋白或D；类风湿因子；神经营养因子，如骨衍生神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子，如NGF-b；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；***-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，***结合蛋白(IGFBP)；细胞因子；CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；***；骨诱导因子；免疫毒素；融合多肽，即包含两种或多种异源多肽或其片段且由重组核酸编码的多肽；包含Fc的多肽，例如，包含与第二多肽融合的免疫球蛋白Fc区或其片段的融合蛋白质；免疫结合物；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS被膜的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，如CA125(卵巢癌抗原)或HER2、HER3或HER4受体；免疫黏附素；上列蛋白质中任一种的片段和/或变体；以及与包括例如上列蛋白质中任一种的蛋白质结合的抗体，包括抗体片段。
在一些实施方案中，用于在本文所描述的任何测定方法中的多肽制品包含目的抗体，即，由宿主细胞所产生的重组多肽是抗体。
此类抗体的分子靶标包括CD蛋白及其配体，如，但不限于：(i)CD3、CD4、CD8、CD19、CD11a、CD20、CD22、CD34、CD40、CD79？(CD79a)和CD79β(CD79b)；(ii)ErbB受体家族的成员，如EGF受体，HER2、HER3或HER4受体；(iii)细胞黏附分子，如LFA-1、Mac1、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如抗-CD11a、抗-CD18或抗-CD11b抗体)；(iv)生长因子，如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；C蛋白、BR3、c-met、组织因子、β7等；及(v)细胞表面和跨膜肿瘤相关抗原(TAA)，如美国专利号7,521,541中所述的那些。
其他示例性抗体非限制性地包括选自以下的那些：抗-***受体抗体、抗-孕酮受体抗体、抗-p53抗体、抗-HER-2/neu抗体、抗-EGFR抗体、抗-组织蛋白酶D抗体、抗-Bcl-2抗体、抗-E-钙黏蛋白抗体、抗-CA125抗体、抗-CA15-3抗体、抗-CA19-9抗体、抗-c-erbB-2抗体、抗-P-糖蛋白抗体、抗-CEA抗体、抗-成视网膜细胞瘤蛋白抗体、抗-ras癌蛋白抗体、抗-Lewis X抗体、抗-Ki-67抗体、抗-PCNA抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD5抗体、抗-CD7抗体、抗-CD8抗体、抗-CD9/p24抗体、抗-CD10抗体、抗-CD11a抗体、抗-CD11c抗体、抗-CD13抗体、抗-CD14抗体、抗-CD15抗体、抗-CD19抗体、抗-CD20抗体、抗-CD22抗体、抗-CD23抗体、抗-CD30抗体、抗-CD31抗体、抗-CD33抗体、抗-CD34抗体、抗-CD35抗体、抗-CD38抗体、抗-CD41抗体、抗-LCA/CD45抗体、抗-CD45RO抗体、抗-CD45RA抗体、抗-CD39抗体、抗-CD100抗体、抗-CD95/Fas抗体、抗-CD99抗体、抗-CD106抗体、抗-泛素抗体、抗-CD71抗体、抗-c-myc抗体、抗-细胞角蛋白抗体、抗-波形蛋白抗体、抗-HPV蛋白抗体、抗-κ轻链抗体、抗-λ轻链抗体、抗-黑素体抗体、抗-***特异性抗原抗体、抗-S-100抗体、抗-tau抗原抗体、抗-纤维蛋白抗体、抗-角蛋白抗体和抗-Tn抗原抗体。
多克隆抗体
在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体。优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来在动物中制备多克隆抗体。用双功能剂或衍生剂(例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基)将相关抗原与在待免疫的物种中具有免疫原性的多肽(例如匙孔槭血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合可以是有用的。
通过将例如100μg或5μg的多肽或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂组合，并在多个部位皮内注射该溶液来针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫动物。一个月后，通过在多个部位皮下注射来用弗氏完全佐剂中的初始量的1/5至1/10的肽或缀合物加强免疫动物。7至14天后，对动物进行采血，并测定血清的抗体效价。加强免疫动物，直至效价平台期。在一些实施方案中，用同一抗原的缀合物加强免疫动物，但该抗原与不同的多肽缀合和/或通过不同的交联剂缀合。缀合物还可以作为多肽融合物在重组细胞培养物中制备。另外，适宜地用诸如明矾的聚集剂来增强免疫应答。
单克隆抗体
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体获自基本上同质的抗体的群体，即除在产生单克隆抗体的过程中出现的可能的变体(这类变体通常以较小的量存在)外，包含该单个抗体的群体是相同的和/或结合相同的表位。因此，修饰词“单克隆的”指抗体不是不相关抗体的混合物或多克隆抗体的特征。
例如，单克隆抗体可以用最先由Kohler等,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤法制备，或者可以通过重组DNA法制备(美国专利号4,816,567)。
在杂交瘤法中，按本文所述免疫小鼠或其他适宜的宿主动物来引诱淋巴细胞，该淋巴细胞产生或能够产生将特异性结合用于免疫的多肽的抗体。备选地，可以体外免疫淋巴细胞。然后用适宜的融合剂(如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,59-103页(AcademicPress,1986))。
将这样制备的杂交瘤细胞接种和培养在适宜的培养基中，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止缺乏HGPRT的细胞生长。
在一些实施方案中，该骨髓瘤细胞是高效融合、通过所选择的产抗体细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对诸如HAT培养基的培养基敏感的那些。在这些中，在一些实施方案中，该骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如可从索尔克细胞销售中心(Salk InstituteCell Distribution Center),San Diego,California，美国获得的衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，及可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection),Rockville,Maryland，美国获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。还针对人单克隆抗体的产生描述了人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications 51-63页(Marcel Dekker,Inc.,纽约,1987))。
针对抗该抗原的单克隆抗体的产生测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基。在一些实施方案中，通过免疫沉淀或通过诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的体外结合测定来测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
可以例如通过Munson等,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来测定单克隆抗体的结合亲和力。
鉴定出产生具有希望得到的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释法亚克隆该克隆，并通过标准方法培养(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice 59-103页(Academic Press,1986))。适合用于此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可以在动物中作为腹水肿瘤体内培养该杂交瘤细胞。
通过常规免疫球蛋白纯化方法(例如多肽A-Sepharose、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱)适宜地从培养基、腹水或血清分离该亚克隆分泌的单克隆抗体。
编码该单克隆抗体的DNA易于用常规方法分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。在一些实施方案中，该杂交瘤细胞可作为这种DNA的来源。一旦分离，即可以将该DNA放入表达载体中，然后将该表达载体转染入诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、人胚肾(HEK)293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不以其他方式产生免疫球蛋白多肽的骨髓瘤细胞的宿主细胞中，以获得单克隆抗体在该重组宿主细胞中的合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等,Curr.Opinion in Immunol.5:256-262(1993)和Plückthun,Immunol.Revs.,130:151-188(1992)。
在另一实施方案中，可以从用描述于McCafferty等,Nature 348:552-554(1990)中的技术产生的抗体噬菌体文库分离抗体或抗体片段。Clackson等,Nature 352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分别描述了用噬菌体文库分离鼠抗体和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992))，以及作为构建非常大的噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等,Nuc.Acids.Res.21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是除传统单克隆抗体杂交瘤技术之外用于分离单克隆抗体的可行的选择。
还可以例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison等,Proc.Natl Acad.Sci.USA 81:6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接来修饰DNA。
通常，这类非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定区，或者它们取代抗体的一个抗原结合部位的可变结构域来产生嵌合二价抗体，该嵌合二价抗体包含对抗原具有特异性的一个抗原结合部位和对不同抗原具有特异性的另一抗原结合部位。
在本文所述任意方法中的一些实施方案中，该抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些实施方案中，该抗体是IgG单克隆抗体。
抗体片段
在一些实施方案中，该抗体是抗体片段。已发展了多种技术来产生抗体片段。通常，通过完整抗体的蛋白水解消化来衍生这些片段(参见例如Morimoto等,Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)和Brennan等,Science 229:81(1985))。但是，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可以从上文讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。备选地，可以从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段，并化学偶联来形成F(ab’)2片段(Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab’)2片段。用于产生抗体片段的其他技术对熟练的从业者而言显而易见。在其他实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利号5,571,894；及美国专利号5,587,458。抗体片段还可以是描述于例如美国专利号5,641,870中的“线性抗体”。这类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
在一些实施方案中，提供本文所述的抗体的片段。在一些实施方案中，该抗体片段是抗原结合片段。在一些实施方案中，该抗原结合片段选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、Fv和双抗体。
多肽变体和修饰
在某些实施方案中，考虑本文蛋白质的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善蛋白质的结合亲和力和/或其他生物学性质。蛋白质的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入到编码蛋白质的核苷酸序列中，或通过肽合成来制备。这样的修饰包括例如蛋白质的氨基酸序列中的残基的缺失和/或***和/或取代。可以进行缺失、***和取代的任何组合以实现最终构建体，只要最终构建体具有所需的特征。
变体多肽
本文定义的“多肽变体”意指与该多肽的全长天然序列、缺乏信号肽的多肽序列、有信号肽或无信号肽的多肽胞外域具有至少约80％氨基酸序列同一性的多肽，例如活性多肽。这类多肽变体包括例如这样的多肽，其中在全长天然氨基酸序列的N端或C端添加或缺失了一个或多个氨基酸残基。通常，多肽变体将与全长天然序列多肽序列、缺乏信号肽的多肽序列、有信号肽或无信号肽的多肽胞外域具有至少约80％氨基酸序列同一性，备选地，具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个的氨基酸序列同一性。可选地，与天然多肽序列相比，变体多肽将具有不超过一个保守氨基酸取代，备选地，与天然多肽序列相比，具有不超过约2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一个的保守氨基酸取代。
例如与全长天然多肽相比，变体多肽可以在N端或C端截短，或者可以缺乏内部残基。某些变体多肽可以缺乏并非希望得到的生物学活性所必需的氨基酸残基。可以通过许多常规技术中的任一种来制备这些具有截短、缺失和***的变体多肽。可以化学合成希望得到的变体多肽。另一适宜的技术涉及通过聚合酶链反应(PCR)分离和扩增编码希望得到的变体多肽的核酸片段。在PCR中的5’和3’引物上利用定义希望得到的核酸片段末端的寡核苷酸。优选地，变体多肽与本文公开的天然多肽共有至少一种生物学和/或免疫学活性。
氨基酸序列***包括长度从一个残基至包含一百或更多个残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N端蛋氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其他***变体包括抗体的N端或C端与增加该抗体的血清半衰期的酶或多肽的融合。
例如，可以希望改善多肽的结合亲和力和/或其他生物学特性。通过在抗体核酸中引入适当的核苷酸改变或通过肽合成来制备多肽的氨基酸序列变体。这类修饰包括例如从多肽的氨基酸序列内缺失残基，和/或在多肽的氨基酸序列内***残基，和/或取代多肽的氨基酸序列内的残基。产生缺失、***和取代的任意组合来达到最终构建体，只要该最终构建体具有希望得到的特征。氨基酸改变还可以改变多肽(例如抗体)的翻译后加工，如改变糖基化位点的数目或位置。
通过将多肽的序列与已知的同源多肽分子的序列相比较，并最小化在高同源性区域中产生的氨基酸序列改变的数目，可以发现确定可以***、取代或缺失哪一个氨基酸残基而不负面影响希望得到的活性的指导。
如Cunningham和Wells,Science 244:1081-1085(1989)所述，用于鉴定多肽(例如抗体)的某些残基或区域作为优选的诱变位置的方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在此，鉴定残基或靶残基组(例如带电荷残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性氨基酸或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在取代位点或针对取代位点引入进一步的变体或其他变体来精炼对取代显示功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，虽然预先确定引入氨基酸序列变异的位点，但无需预先确定突变本身的性质。例如，为了分析给定位点上的突变的表现，在靶密码子或靶区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变，并针对希望得到的活性筛选所表达的抗体变体。
另一类变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗体分子中具有至少一个被不同残基取代的氨基酸残基。对取代诱变而言，最有意义的位点包括高变区，但也考虑FR改变。如果这类取代导致生物学活性的改变，则可以引入表1中命名为“示例性取代”或如下文参考氨基酸种类进一步描述的更实质性的改变，并筛选产物。
表1.
通过选择这样的取代来达到多肽的生物学特性的实质性修饰，该取代在其对维持以下的作用上显著不同：(a)取代区域的多肽主链的结构，例如，作为折叠或螺旋构象；(b)该分子在靶位点处的电荷或疏水性；或(c)侧链的大小。可以根据其侧链性质的相似性来分组氨基酸(在A.L.Lehninger,Biochemistry第2版,73-75页,Worth Publishers,纽约(1975)中)：
(1)非极性氨基酸：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；
(2)不带电荷的极性氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；
(3)酸性氨基酸：Asp(D)、Glu(E)；
(4)碱性氨基酸：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。
备选地，可以根据共同的侧链特性来对天然存在的残基进行分组：
(1)疏水性氨基酸：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性氨基酸：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性氨基酸：Asp、Glu；
(4)碱性氨基酸：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族氨基酸：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代必需将这些种类之一的成员换为另一种类。
还可以取代(通常用丝氨酸)不涉及维持抗体的正确构象的任意半胱氨酸残基来改善该分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可以向多肽中加入一个或多个半胱氨酸键来改善其稳定性(尤其是在该抗体是诸如Fv片段的抗体片段时)。
取代变体的一个实例涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体)的一个或多个高变区残基。通常，相对于它们所产生自的亲本抗体，所得到的选择用于进一步研发的一个或多个变体将具有改善的生物学特性。用于产生这类取代变体的方便的方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，突变几个高变区位点(例如6-7个位点)来产生各位点上所有可能的氨基酸取代。这样产生的抗体变体作为与包装在各颗粒内的M13的基因III产物的融合以单价形式从丝状噬菌体颗粒展示。然后按照本文所公开针对它们的生物学活性(例如结合亲和力)筛选噬菌体展示的变体。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变来鉴定显著促成抗原结合的高变区残基。备选地，或此外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和靶标之间的接触点可以是有益的。这类接触残基和邻近残基是按照本文所述技术进行取代的候选残基。一旦产生这类变体，即可以按照本文所述对该系列变体进行筛选，并选择在一项或多项相关测定中具有较优特性的抗体用于进一步研发。
多肽的另一类氨基酸变体改变抗体的初始糖基化模式。多肽可以包含非氨基酸部分。例如，多肽可以是糖基化的。这种糖基化可以在在宿主细胞或宿主生物中表达多肽的过程中天然发生，或者可以是源自人为干预的故意修饰。改变意指缺失一个或多个见于该多肽中的糖类部分，和/或加入一个或多个不存在于该多肽中的糖基化位点。
多肽的糖基化通常是N联糖基化或O联糖基化。N联糖基化指糖类部分附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)是糖类部分酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一个在多肽中的存在将产生潜在的糖基化位点。O联糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列，使得它包含一个或多个上述三肽序列(对于N联糖基化位点)来方便地达到在多肽中加入糖基化位点。还可以通过向初始抗体的序列中加入一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代初始抗体的序列来产生改变(对于O联糖基化位点)。
可以通过化学方法或酶促方法或通过编码作为糖基化靶点的氨基酸残基的密码子的突变取代来达到去除存在于多肽上的糖类部分。可以通过使用多种内切和外切糖苷酶来达到多肽上的糖类部分的酶促切割。
其他修饰包括分别脱酰胺化谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基为对应的谷氨酰和天东氨酰残基，羟化脯氨酸和赖氨酸，磷酸化丝氨酰或苏氨酰残基的羟基，甲基化赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基，乙酰化N端胺，及酰胺化任意C端羧基。
嵌合多肽
可以以形成嵌合分子的方式修饰本文所述的多肽，该嵌合分子包含与另一异源多肽或氨基酸序列融合的多肽。在一些实施方案中，嵌合分子包含多肽与标记多肽的融合，该标记多肽提供抗-标记抗体可以选择性结合的表位。该表位标记通常放置在多肽的氨基端或羧基端。可以用抗该标记多肽的抗体来检测这类表位标记形式的多肽的存在。另外，表位标记的提供使得能够使用抗-标记抗体或另一类结合该表位标记的亲和基质，通过亲和纯化容易地纯化该多肽。
多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同部位具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，该结合特异性之一针对c-met，另一种针对任意其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与c-met的两个不同表位结合。双特异性抗体还可以用于将细胞毒剂定位至表达c-met的细胞。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段制备。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)；WO 93/08829；及Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991))和“杵入臼”改造(参见例如美国专利号5,731,168)。还可以通过以下来制备多特异性抗体：用于制备抗体Fc-异二聚体分子的工程静电引导作用(WO 2009/089004A1)；交联两种或多种抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980和Brennan等,Science,229:81(1985))；用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于制备双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；按例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或多个功能性抗原结合部位的改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还可以包括含有与c-met以及另一不同抗原(如EGFR)结合的抗原结合部位的“双重作用FAb”或“DAF”(参见例如US 2008/0069820)。
用于制备双特异性抗体的方法为本领域已知。通常，双特异性抗体的重组产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Milstein和Cuello,Nature,305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四价体杂交瘤(quadromas))产生10种不同抗体分子的可能的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤进行)非常麻烦，且产物产率低。1993年5月13日公开的WO 93/08829中及Traunecker等,EMBO J.,10:3655(1991)中公开了类似的方法。
根据不同和更优选的方法，将具有希望得到的结合特异性(抗体-抗原结合部位)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。该融合优选是与包含至少部分铰合部、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域融合。优选使包含轻链结合所必需的部位的第一重链恒定区(CH1)存在于至少融合之一中。将编码免疫球蛋白重链融合和(如果希望)免疫球蛋白轻链的DNA***分开的表达载体，并共转染入适宜的宿主生物。在不等比例的三种多肽链用于构建可提供最佳产率的实施方案中，这提供了调整三种多肽片段的相互比例的极大灵活性。但是，在以等比例表达至少两种多肽链产生高产率时或该比例没有具体意义时，可能将两种或全部三种多肽链的编码序列***一个表达载体中。
在此方法的优选实施方案中，该双特异性抗体由一条臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现此不对称结构便于从不想要的免疫球蛋白链组合分离希望得到的双特异性化合物，因为免疫球蛋白轻链仅存在于该双特异性分子的一半中提供了容易的分离方式。此方法公开于WO 94/04690中。产生双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等,Methods inEnzymology 121:210(1986)。
根据另一种方法，可以改造一对抗体分子间的界面来最大化从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比。优选的界面包含抗体恒定结构域的至少一部分CH3结构域。在此方法中，用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)(杵或凸起)取代来自第一抗体分子的界面的一个或多个小的氨基酸侧链。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大的氨基酸侧链来在第二抗体分子的界面上产生大小与该一个或多个大的侧链相同或相似的补偿“凹陷”(臼)。这提供了增加异二聚体的产率超过其他不想要的终产物(如同二聚体)的机制。本文中进一步描述杵和臼。
杵入臼
杵入臼作为产生多特异性抗体和/或单臂抗体和/或免疫黏附素的方法的用途为本领域公知。参见1998年3月24日授权、归属于Genentech的美国专利号5,731,168；2009年7月16日公开、归属于Amgen的PCT公开号WO2009089004；及2009年7月16日公开、归属于NovoNordisk A/S的美国专利公开号20090182127。还参见Marvin和Zhu,Acta PharmacologicaSincia(2005)26(6):649-658及Kontermann(2005)Acta Pharacol.Sin.,26:1-9。本文提供简要的讨论。
“凸起”指至少一个氨基酸侧链，其从第一多肽的界面凸出来，因此可定位在邻近界面(即第二多肽的界面)中的互补凹陷内来稳定该异源多体，从而例如偏向异源多体形成而不是同源多体形成。该凸起可以存在于原始界面上或可以合成引入(例如通过改变编码该界面的核酸)。通常，改变编码第一多肽的界面的核酸来编码凸起。为此，用编码至少一个“输入”氨基酸残基的核酸取代编码第一多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸，该输入氨基酸残基具有比该原始氨基酸残基大的侧链体积。应理解，可以存在一个以上原始残基和对应的输入残基。取代的原始残基的数目的上限是第一多肽的界面中的残基的总数。下表中显示多种氨基残基的侧链体积。
表2.氨基酸的特性
a氨基酸分子量减去水的分子量。来自Handbook of Chemistry and Physics,第43版Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961的值。
b来自A.A.Zamyatnin,Prog.Biophys.Mol.Biol.24:107-123,1972的值。
c来自C.Chothia,J.Mol.Biol.105:1-14,1975的值。可接近表面积在此参考文献的图6-20中定义。
优选的用于形成凸起的输入残基一般是天然存在的氨基酸残基，且优选选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。最优选的是色氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，用于形成凸起的原始残基具有小的侧链体积，如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。CH3结构域中用于形成凸起的示例性氨基酸取代非限制性地包括T366W取代。
“凹陷”指至少一个氨基酸侧链，其从第二多肽的界面缩回，从而容纳第一多肽的邻近界面上对应的凸起。凹陷可以存在于原始界面中，或者可以合成引入(例如通过改变编码界面的核酸)。通常，改变编码第二多肽的界面的核酸来编码凹陷。为此，用编码至少一个“输入”氨基酸残基的DNA取代编码第二多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸，该输入氨基酸残基具有比该原始氨基酸残基小的侧链体积。应理解，可以存在一个以上原始残基和对应的输入残基。取代的原始残基的数目的上限是第二多肽的界面中的残基的总数。上文表2中显示多种氨基残基的侧链体积。优选的用于形成凹陷的输入残基通常是天然存在的氨基酸残基，且优选选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。最优选的是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中，用于形成凹陷的原始残基具有大的侧链体积，如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。CH3结构域中用于产生凹陷的示例性氨基酸取代非限制性地包括T366S、L368A和Y407A取代。
“原始”氨基酸残基是用“输入”残基取代的氨基酸残基，该输入残基可以具有比该原始残基小或大的侧链体积。输入氨基酸残基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸残基，但优选前者。“天然存在的”氨基酸残基是由遗传密码编码并在上文表2中列出的那些残基。“非天然存在的”氨基酸残基意指这样的残基，其不由遗传密码编码，但其能够在多肽链中共价结合邻近的一个或多个氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基的实例是正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸及其他氨基酸残基类似物，如描述于例如Ellman等,Meth.Enzym.202:301-336(1991)中的那些。为了产生这类非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等Science 244:182(1989)和Ellman等,上文的方法。简言之，这涉及用非天然存在的氨基酸残基化学活化阻抑型tRNA，然后进行RNA的体外转录和翻译。本发明的方法涉及取代至少一个原始残基，但可以取代一个以上的原始残基。通常，取代的原始氨基酸残基将不超过第一或第二多肽的界面中的总残基。通常，取代的原始残基是“埋藏的”。“埋藏的”意指溶剂基本上不可接近该残基。通常，输入残基不是半胱氨酸，以防止可能的氧化或二硫键的错配。
凸起“可定位”在凹陷中意指凸起和凹陷各自在第一多肽和第二多肽的界面上的空间定位及凸起和凹陷的大小是这样，使得凸起可以定位在凹陷中而不显著扰乱第一和第二多肽在界面上的正常结合。由于诸如Tyr、Phe和Trp的凸起通常不从界面的轴垂直延伸，且具有优选的构象，凸起与对应的凹陷的对齐依赖于根据三维结构(如通过X射线晶体分析法或核磁共振(NMR)获得的那些)模拟凸起/凹陷对。这可以用本领域广泛接受的技术来达到。
“原始或模板核酸”意指编码目的多肽的核酸，其可以“改变”(即遗传改造或突变)为编码凸起或凹陷。原始或起始核酸可以是天然存在的核酸，或者可以包含之前已进行了改变的核酸(例如人源化抗体片段)。“改变”核酸意指通过***、缺失或取代至少一个编码目的氨基酸残基的密码子来突变原始核酸。通常，用编码输入残基的密码子取代编码原始残基的密码子。用于以这种方式遗传修饰DNA的技术综述于Mutagenesis:a Practical Approach,M.J.McPherson编辑,(IRL Press,Oxford,UK.(1991)中，且包括例如定位诱变、盒诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变。通过突变原始/模板核酸，从而相应地改变了该原始/模板核酸编码的原始/模板多肽。
可以通过合成手段，例如通过重组技术、体外肽合成、之前描述的用于引入非天然存在的氨基酸残基的那些技术，通过肽的酶偶联或化学偶联，或这些技术的某种组合，来将凸起或凹陷“引入”第一或第二多肽的界面。因此，“引入的”凸起或凹陷是“非天然存在的”或“非天然的”，其意指它不存在于自然界中或原始多肽(例如人源化单克隆抗体)中。
通常，用于形成凸起的输入氨基酸残基具有数目相对小的“旋转异构体”(例如约3-6)。“旋转异构体”是氨基酸侧链在能量上有利的构象。多种氨基酸残基的旋转异构体的数目综述于Ponders和Richards,J.Mol.Biol.193:775-791(1987)中。
在一个实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽在界面上相遇/相互作用。在其中第一和第二Fc多肽在界面上相遇的一些实施方案中，第二Fc多肽(序列)的界面包含凸起(也称为“杵”)，该凸起可定位在第一Fc多肽(序列)的界面中的凹陷(也称为“臼”)内。在一个实施方案中，已从模板/原始多肽改变第一Fc多肽以编码凹陷，或已从模板/原始多肽改变第二Fc多肽以编码凸起，或编码二者。在一个实施方案中，已从模板/原始多肽改变第一Fc多肽以编码凹陷，并已从模板/原始多肽改变第二Fc多肽以编码凸起。在一个实施方案中，第二Fc多肽的界面包含凸起，该凸起可定位在第一Fc多肽的界面中的凹陷内，其中已分别在第一和第二Fc多肽的界面中引入凹陷或凸起或二者。在其中第一和第二Fc多肽在界面上相遇的一些实施方案中，第一Fc多肽(序列)的界面包含凸起，该凸起可定位在第二Fc多肽(序列)的界面中的凹陷内。在一个实施方案中，已从模板/原始多肽改变第二Fc多肽以编码凹陷，或已从模板/原始多肽改变第一Fc多肽以编码凸起，或编码二者。在一个实施方案中，已从模板/原始多肽改变第二Fc多肽以编码凹陷，并已从模板/原始多肽改变第一Fc多肽以编码凸起。在一个实施方案中，第一Fc多肽的界面包含凸起，该凸起可定位在第二Fc多肽的界面中的凹陷内，其中已分别在第一和第二Fc多肽的界面中引入凸起或凹陷或二者。
在一个实施方案中，凸起和凹陷各包含天然存在的氨基酸残基。在一个实施方案中，通过用具有比原始残基大的侧链体积的输入残基取代来自模板/原始多肽的界面的原始残基来产生包含凸起的Fc多肽。在一个实施方案中，通过包括这样的步骤的方法来产生包含凸起的Fc多肽，在该步骤中，用编码具有比原始残基大的侧链体积的输入残基的多核苷酸取代编码来自该多肽的界面的原始残基的多核苷酸。在一个实施方案中，该原始残基是苏氨酸。在一个实施方案中，该原始残基是T366。在一个实施方案中，该输入残基是精氨酸(R)。在一个实施方案中，该输入残基是苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，该输入残基是酪氨酸(Y)。在一个实施方案中，该输入残基是色氨酸(W)。在一个实施方案中，该输入残基是R、F、Y或W。在一个实施方案中，通过取代模板/原始多肽中的两个或多个残基来产生凸起。在一个实施方案中，含有凸起的Fc多肽包含用色氨酸取代336位苏氨酸，按照Kabat等的EU编号方案(688-696页in Sequences of proteins of immunological interest,第5版,1卷(1991；NIH,Bethesda,MD))的氨基酸编号。
在一些实施方案中，通过用具有比原始残基小的侧链体积的输入残基取代模板/原始多肽的界面中的原始残基来产生包含凹陷的Fc多肽。例如，通过包括这样的步骤的方法来产生包含凹陷的Fc多肽，在该步骤中，用编码具有比原始残基小的侧链体积的输入残基的多核苷酸取代编码来自该多肽的界面的原始残基的多核苷酸。在一个实施方案中，该原始残基是苏氨酸。在一个实施方案中，该原始残基是亮氨酸。在一个实施方案中，该原始残基是酪氨酸。在一个实施方案中，该输入残基不是半胱氨酸(C)。在一个实施方案中，该输入残基是丙氨酸(A)。在一个实施方案中，该输入残基是丝氨酸(S)。在一个实施方案中，该输入残基是苏氨酸(T)。在一个实施方案中，该输入残基是缬氨酸(V)。可以通过取代模板/原始多肽的一个或多个原始残基来产生凹陷。例如，在一个实施方案中，含有凹陷的Fc多肽包含选自苏氨酸、亮氨酸和酪氨酸的两个或多个原始氨基酸的取代。在一个实施方案中，含有凹陷的Fc多肽包含选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸的两个或多个输入残基。在一些实施方案中，含有凹陷的Fc多肽包含选自苏氨酸、亮氨酸和酪氨酸的两个或多个原始氨基酸的取代，且其中用选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸的输入残基取代该原始残基。在一些实施方案中，所取代的原始氨基酸是T366、L368和/或Y407。在一个实施方案中，含有凹陷的Fc多肽包含用丝氨酸取代366位苏氨酸，按照Kabat等上文的EU编号方案的氨基酸编号。在一个实施方案中，含有凹陷的Fc多肽包含用丙氨酸取代368位亮氨酸，按照Kabat等上文的EU编号方案的氨基酸编号。在一个实施方案中，含有凹陷的Fc多肽包含用缬氨酸取代407位酪氨酸，按照Kabat等上文的EU编号方案的氨基酸编号。在一个实施方案中，含有凹陷的Fc多肽包含选自T366S、L368A和Y407V的两个或多个氨基酸取代，按照Kabat等上文的EU编号方案的氨基酸编号。在这些抗体片段的一些实施方案中，含有凸起的Fc多肽包含用色氨酸取代366位苏氨酸，按照Kabat等上文的EU编号方案的氨基酸编号。
在一个实施方案中，该抗体包含WO2005/063816中所述的构成“杵”和“臼”的Fc突变。例如，臼突变可以是Fc多肽中的T366A、L368A和/或Y407V中的一个或多个，杵突变可以是T366W。
载体、宿主细胞和重组方法
为了使用DsbA和DsbC重组产生异源多肽(例如抗体)，分离编码它的核酸，并***可复制载体用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。编码多肽(例如抗体)的DNA易于用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序。许多载体可用。载体的选择部分取决于要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞具有原核来源。应理解，任意同种型的恒定区都可以用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，且这类恒定区可以从任何人或动物物种获得。
A.用原核宿主细胞产生抗体
i.载体构建
编码本发明的多肽(例如抗体)的多肽成分的多核苷酸序列可以用标准重组技术获得。可以从产生抗体的细胞(如杂交瘤细胞)分离和测序希望得到的多核苷酸序列。备选地，可以用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，即可以将编码多肽的序列***能够在原核宿主中复制和表达异源多肽的重组载体。本领域可得和已知的许多载体可以用于本发明的目的。适宜载体的选择将主要取决于待***载体的核酸的大小及待用该载体转化的具体宿主细胞。取决于其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者)及其与它所驻留的具体宿主细胞的相容性，每个载体包含多种成分。载体成分通常包括但不限于：复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸***片段和转录终止序列。
通常，将包含源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主结合使用。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，通常用源自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，从而提供容易的手段用于鉴定转化细胞。pBR322、其衍生物、或其他微生物质粒或噬菌体还可以包含或修饰为包含用于表达内源蛋白质的微生物可以使用的启动子。用于表达具体抗体的pBR322衍生物的实例详细描述于Carter等的美国专利号5,648,237中。
此外，含有与宿主生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作与这些宿主结合的转化载体。例如，诸如GEMTM-11的噬菌体可以用于制备可以用来转化诸如大肠杆菌LE392的易感宿主细胞的重组载体。
本发明的表达载体可以包含编码多肽成分中的每一种的两个或多个启动子-顺反子对。启动子是位于调节其表达的顺反子上游(5’)的非翻译调节序列。原核启动子通常分为两类：诱导型和组成型。诱导型启动子是响应培养条件的变化(例如营养物的存在或缺乏或温度的变化)而起始处于其控制下的顺反子的提高水平的转录的启动子。
多种潜在的宿主细胞识别的大量启动子为本领域公知。可以通过经限制酶消化从来源DNA去除启动子并将该分离的启动子***本发明的载体来将所选择的启动子有效连接至编码轻链或重链的顺反子DNA。天然启动子序列和许多异源启动子都可以用来指导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，利用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常允许所表达的靶基因更多的转录和更高的产率。
适合用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、内酰胺酶和乳糖启动子***、色氨酸(trp)启动子***和杂合启动子，如tac或trc启动子。但是，在细菌中具有功能的其他启动子(如其他已知的细菌或噬菌体启动子)也是适宜的。它们的核苷酸序列已公开，从而使得技术人员能够用接头或衔接子提供所需的任意限制位点来将它们有效连接至编码靶轻链和重链的基因的顺反子(Siebenlist等,(1980)Cell 20:269)。
翻译起始区(TIR)是蛋白质总体翻译水平的主要决定因素。TIR包括编码信号序列的多核苷酸，且从Shine-Delgarno序列的刚好上游延伸至起始密码子下游约20个核苷酸。通常，载体将包含TIR，TIR和变体TIR为本领域已知，且用于产生TIR的方法为本领域已知。可以产生一系列具有不同翻译强度的核酸序列变体，从而提供方便的手段来针对许多不同多肽的最佳分泌调节此因素。与这些变体融合的报道基因(如PhoA)的使用提供了定量不同翻译起始区的相对翻译强度的方法。变体或突变体TIR可以在质粒载体背景中提供，从而提供可***目的基因并测量其表达的一套质粒，以便为成熟多肽的最大表达确定翻译强度的最适范围。变体TIR公开于USP 8,241,901中。
在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子包含指导所表达的多肽跨膜易位的分泌信号序列成分。通常，该信号序列可以是载体的成分，或者它可以是***载体的靶多肽DNA的部分。选择用于本发明的目的的信号序列应是该宿主细胞识别和加工(即通过信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，用选自例如本发明的信号肽的原核信号序列取代该信号序列。此外，载体可以包含选自碱性磷酸酶、青霉素酶、Lpp或热稳定肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP的信号序列。
在一方面，一个或多个多核苷酸(例如表达载体)共同编码抗体。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码抗体的轻链，分开的多核苷酸编码抗体的重链。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码抗体的轻链和重链。在一些实施方案中，一个或多个多核苷酸(例如表达载体)共同编码单臂抗体。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码(a)单臂抗体的轻链和重链及(b)Fc多肽。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码单臂抗体的轻链和重链，分开的多核苷酸编码Fc多肽。在一个实施方案中，分开的多核苷酸分别编码单臂抗体的轻链成分、单臂抗体的重链成分和Fc多肽。单臂抗体的产生描述于例如WO2005063816中。
适合用于表达本发明的抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria)，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物。有用的细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、芽孢杆菌属(Bacilli)(例如枯草芽孢杆菌)、肠细菌、假单胞菌属物种(Pseudomonas species)(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，用大肠杆菌作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,第2卷(Washington,D.C.:AmericanSociety for Microbiology,1987),1190-1219页；ATCC保藏号27,325)及其衍生菌株，包括具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41kanR的菌株33D3(美国专利号5,639,635)，及菌株63C1和64B4。在一些实施方案中，大肠杆菌菌株是命名为62A7的W3110衍生物(ΔfhuA(ΔtonA)ptr3、lacIq、lacL8、ompTΔ(nmpc-fepE)ΔdegP ilvG修复的)。诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)的其他菌株及其衍生菌株也是适宜的。这些实例是说明性的而不是限制性的。用于构建任意上述细菌的具有确定基因型的衍生菌株的方法为本领域已知，并描述于例如Bass等,Proteins,8:309-314(1990)中。通常有必要考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适当的细菌。例如，在用诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410的众所周知的质粒来提供复制子时，可以适宜地用大肠杆菌、沙雷氏菌属(Serratia)或沙门氏菌属(Salmonella)物种作为宿主。通常，宿主细胞应分泌最小量的蛋白水解酶，且可以希望将附加的蛋白酶抑制剂掺入细胞培养物中。
为了提高细菌培养物中多肽的生产产量和质量，可以修饰细菌细胞。例如，为了改进分泌的抗体多肽的适当组装和折叠，细菌宿主细胞可以包含过量表达伴侣蛋白例如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)的其它载体，可用于共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白有助于在细菌宿主细胞中产生的异源蛋白质的适当折叠和溶解度。
ii.抗体产生
用上述表达载体转化宿主细胞，并培养在根据诱导启动子、选择转化体或扩增编码希望得到的序列的基因的需要改进的常规营养培养基中。
转化意指将DNA引入原核宿主，使得该DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合体复制。取决于所使用的宿主细胞，用适于这类细胞的标准技术进行转化。利用氯化钙的钙处理通常用于含有实质性细胞壁屏障的细菌细胞。另一转化方法利用聚乙二醇/DMSO。所使用另一技术是电穿孔。
将用来产生本发明的多肽的原核细胞培养在本领域已知且适合用于培养所选择的宿主细胞的培养基中。适宜的培养基的实例包括加入了必要的营养补充物的Luria培养基(LB)。在一些实施方案中，该培养基还包含根据表达载体的构建选择的选择剂，以选择性地允许含有该表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中加入氨苄青霉素。
除碳、氮和无机磷酸来源外，还可以按适当的浓度包含单独引入或作为与另一补充物或培养基(如复合氮源)的混合物引入的任意必要补充物。可选地，该培养基可以包含选自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇的一种或多种还原剂。
在适宜的温度下培养原核宿主细胞。对于大肠杆菌生长，例如，优选的温度范围从约20℃至约39℃，更优选从约25℃至约37℃，甚至更优选在约30℃。主要取决于宿主生物，培养基的pH可以是从约5至约9的范围内的任意pH。对于大肠杆菌，pH优选从约6.8至约7.4，更优选约7.0。
如果在本发明的表达载体中使用诱导型启动子，则在适合用于激活该启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，将转化的宿主细胞培养在磷酸盐限制培养基中进行诱导。优选地，该磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等,J.Immunol.Methods(2002),263:133-147)或WO2002/061090中所述的培养基。如本领域已知，根据所利用的载体构建体，可以使用多种其他诱导物。
在一个实施方案中，所表达的本发明的多肽分泌进入宿主细胞的周质，并从宿主细胞的周质回收。蛋白质回收通常涉及一般通过诸如渗透压休克、超声处理或裂解的手段破裂微生物。一旦破裂细胞，即可以通过离心或过滤来去除细胞碎片或整个细胞。可以例如通过亲和树脂层析来进一步纯化蛋白质。备选地，蛋白质可以转运入培养基，并从其中分离。可以从培养物去除细胞，过滤并浓缩培养物上清用于所产生的蛋白质的进一步纯化。可以用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹测定的公知方法来进一步分离和鉴定所表达的多肽。
在本发明的一个方面中，通过发酵方法来进行抗体的大量产生。多种大规模补料分批发酵方法可用于产生重组多肽。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐用搅拌桨来分布氧气和营养物，尤其是葡萄糖(优选的碳/能量来源)。小规模发酵一般指体积容量不超过约100升，且可以在约1升至约100升的范围内的发酵罐中的发酵。
在发酵方法中，通常将细胞在适宜条件下培养至希望得到的密度(例如约180-220的OD550，细胞在该阶段处于早平台期)后起始蛋白质表达的诱导。如本领域已知和本文所述，根据所利用的载体构建体，可以使用多种诱导物。细胞可以在诱导前培养更短的时期。通常诱导细胞约12-50小时，但也可以使用更长或更短的诱导时间。
为了改善本发明的多肽的产率和质量，可以改变多种发酵条件。例如，为了改善所分泌的抗体多肽的正确组装和折叠，可以用过量表达诸如Dsb蛋白质(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)的分子侣伴蛋白质的附加载体来共转化宿主原核细胞。已证明分子侣伴蛋白质便于细菌宿主细胞中产生的异源蛋白质的正确折叠和溶解。Chen等(1999)J.Biol.Chem.274:19601-19605；Georgiou等,美国专利号6,083,715；Georgiou等,美国专利号6,027,888；Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17106-17113；Arie等(2001)Mol.Microbiol.39:199-210。在一些实施方案中，在细菌宿主细胞中表达DsbA和C。
为了最小化所表达的异源蛋白质(尤其是蛋白酶解敏感的那些)的蛋白酶解，可以将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可以修饰宿主细胞菌株来在编码已知的细菌蛋白酶(如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合)的基因中产生一个或多个遗传突变。一些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株可用，并描述于例如Joly等,(1998),上文；Georgiou等,美国专利号5,264,365；Georgiou等,美国专利号5,508,192；Hara等,Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996)中。
在一个实施方案中，将蛋白水解酶缺陷并用过量表达一种或多种分子侣伴蛋白质的质粒转化的大肠杆菌菌株用作本发明的表达***中的宿主细胞。
iii.抗体纯化
可以利用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下方法是适宜的纯化方法的示例：免疫亲和或离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅石上或诸如DEAE的阳离子交换树脂上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
在一方面，用固定在固相上的蛋白A来进行本发明的抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是以高亲和力结合抗体Fc区的来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD细胞壁蛋白质。Lindmark等(1983)J.Immunol.Meth.62:1-13。固定蛋白A的固相优选是含有玻璃或硅石表面的柱，更优选可控孔度玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，在防止杂质非特异性附着的尝试中用诸如甘油的试剂包被柱。
作为纯化的第一步，将源自上述细胞培养物的制备物加载至固定了蛋白A的固相上，以允许目的抗体与蛋白A特异性结合。然后洗涤固相来去除非特异性结合于固相的杂质。最后，通过洗脱来从固相回收目的抗体。
在本发明的一些实施方案中，分析衍生自一个或多个纯化步骤的级分以除去DsbA和/或DsbC。在一些实施方案中，通过免疫测定测定DsbA和/或DsbC的去除；例如，通过本文所述的免疫测定。
本发明还提供免疫缀合物(可互换地称为“抗体-药物缀合”或“ADC”)，其包含与例如细胞毒剂缀合的本文所述任意抗体，该细胞毒剂如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)、或放射性同位素(即放射性缀合物)。
VI.DsbA和DsbC的组成
在一些方面、本发明提供包含超纯DsbA和/或DsbC的组合物。在一些实施方案中，组合物包含DsbA，其中DsbA大于大约95.0％、96.0％、97.0％、98.0％、99.0％或99.5％之任何的单体DsbA。在一些实施方案中，包含95％单体DsbA的组合物是这样的组合物，其中制品中少于5％的材料是在DsbA的生产过程中存在于细胞或细胞裂解物中的其它物质(例如蛋白质、核酸、脂质等)。在一些实施方案中，单体DsbA多肽的百分比通过尺寸排阻色谱法(例如SEC-HPLC)来测量。在一些实施方案中，包含超纯DsbA的组合物包含小于约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％之任何的低分子量物质(例如，通过SEC或SDS-PAGE测量，分子量小于单体DsbA的物质)。在一些实施方案中，包含超纯DsbA的组合物包含小于约2％的低分子量物质。在一些实施方案中，包含超纯DsbA的组合物包含小于约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％之任何的高分子量物质(例如，通过SEC或SDS-PAGE测量，分子量大于单体DsbA的物质)。在一些实施方案中，包含超纯DsbA的组合物包含小于约1％的高分子量物质。
在一些实施方案中，组合物包含DsbC，其中DsbC大于大约95.0％、96.0％、97.0％、98.0％、99.0％或99.5％之任何的单体DsbC。在一些实施方案中，包含95％单体DsbC的组合物是这样的组合物，其中制品中少于5％的材料是在DsbC的生产过程中存在于细胞或细胞裂解物中的其它物质(例如蛋白质、核酸、脂质等)。在一些实施方案中，单体DsbC多肽的百分比通过尺寸排阻色谱法(例如SEC-HPLC)来测量。在一些实施方案中，包含超纯DsbC的组合物包含小于约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％之任何的低分子量物质(例如，通过SEC或SDS-PAGE测量，分子量小于单体DsbC的物质)。在一些实施方案中，包含超纯DsbC的组合物包含小于约2％的低分子量物质。在一些实施方案中，包含超纯DsbC的组合物包含小于约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％之任何的高分子量物质(例如，通过SEC或SDS-PAGE测量，分子量大于单体DsbC的物质)。在一些实施方案中，包含超纯DsbC的组合物包含小于约1％的高分子量物质。
在一些实施方案中，配制包含高纯度的DsbA或DsbC的组合物备用。在一些实施方案中，包含超纯DsbA或DsbC的组合物被配制用于免疫动物以产生DsbA或DsbC的抗体；例如，通过添加佐剂以促进免疫应答的产生。在其他实施方案中，包含超纯DsbA或DsbC的组合物被配制用于免疫测定；例如，作为阳性对照或标准曲线。
VII.DsbA和DsbC的抗体的产生
在某些方面，本发明提供超纯DsbA和超纯DsbC以用作免疫原产生用于免疫测定的抗体(例如，多克隆抗体和/或单克隆抗体)，用于分析重组多肽样品中DsbA和/或DsbC的存在。例如，抗体可用于免疫测定以检测和/或定量重组多肽样品中的DsbA和/或DsbC，其中重组多肽在过表达DsbA和/或DsbC的细菌细胞中产生。在一些实施方案中，本发明提供了特异性结合超纯DsbA的多克隆抗体和/或特异性结合超纯DsbC的多克隆抗体。在某些方面，多克隆抗体特异性结合DsbA或DsbC的不同表位，因此提供用途以检测DsbA或DsbC片段、变体、错误折叠的蛋白质等。为了最小化兔抗体对宿主细胞蛋白质杂质的产生(所述杂质可能导致在免疫测定中待测量的样品中DsbA或DsbC水平的过量定量)，用超纯DsbA或DsbC免疫动物(例如兔)。
本发明提供特异性结合DsbA的抗体和特异性结合DsbC的抗体。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。多克隆抗体优选通过相关抗原和佐剂的多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射而在动物中产生。使用双功能剂或衍生剂(例如，马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基缀合)，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl2，或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基)，将相关抗原缀合至在将被免疫的物种中是免疫原性的多肽(例如，钥孔戚血蓝蛋白，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白，或大豆胰蛋白酶抑制剂)可以是有用的。
通过以下方法对动物进行针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物的免疫：将例如100μg或5μg多肽或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂混合，并将该溶液皮内注射于多个部位。一个月后，用弗氏完全佐剂中的1/5至1/10初始量的肽或缀合物，通过多个部位的皮下注射对动物进行加强。7至14天后，采集动物的血液并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强直至滴度达到平台。在一些实施方案中，用同一抗原的缀合物对动物进行加强，但缀合至不同的多肽和/或通过不同的交联试剂缀合。缀合物也可以在重组细胞培养物中作为多肽融合物来制备。同样地，聚集剂(如明矾)也适用于增强免疫应答。
在一些实施方案中，用DsbA或DsbC免疫的动物是山羊、绵羊、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、驴或鸡。
在一些实施方案中，特异性结合DsbA或DsbC的抗体是单克隆抗体。单克隆抗体是从一群基本上同质的抗体获得的，即，除了在产生单克隆抗体的过程中所发生的可能的变体(这样的变体通常以极小量存在)外，包含该群体的单个抗体是相同的和/或结合相同表位。因此，修饰语“单克隆”指明该抗体的这样的特征，即该抗体不是分立的或多克隆的抗体的混合物。如上所述，单克隆抗体可以使用首先由Kohler等人，Nature 256：495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制备。
在一些方面，本发明提供用于纯化特异性结合DsbA的抗体的方法，包括将包含抗DsbA抗体的组合物与包含结合到支持材料的超纯DsbA的色谱材料接触，洗涤色谱材料以除去未结合的化合物，以及洗脱抗DsbA抗体。在一些实施方案中，结合于支持材料的超纯DsbA包含小于1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.01％之任何的杂质。在一些实施方案中，超纯DsbA通过本文所述的方法制备。在一些实施方案中，本发明提供了纯化特异性结合DsbA的多克隆抗体的方法。在一些实施方案中，少于约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.01％之任何的多克隆抗体特异性结合非DsbA化合物。
在一些方面，本发明提供用于纯化特异性结合DsbC的抗体的方法，包括将包含抗DsbC抗体的组合物与包含结合到支持材料的超纯DsbC的色谱材料接触，洗涤色谱材料以除去未结合的化合物，以及洗脱抗DsbC抗体。在一些实施方案中，结合于支持材料的超纯DsbC包含小于1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.01％之任何的杂质。在一些实施方案中，超纯DsbC通过本文所述的方法制备。在一些实施方案中，本发明提供了纯化特异性结合DsbC的多克隆抗体的方法。在一些实施方案中，少于约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.01％之任何的多克隆抗体特异性结合非DsbC化合物。
在一些实施方案中，通过将抗体与固定在色谱材料上的超纯DsbA或DsbC(例如，固定在活化的甘油基控制的孔玻璃上的超纯DsbA和/或DsbC)接触来纯化抗DsbA和/或抗DsbC抗体。在一些实施方案中，例如，在与固定的DsbA或DsbC接触之前，通过硫酸铵沉淀浓缩抗体。在一些实施方案中，抗体与固定的DsbA或DsbC结合，然后洗涤固定的DsbA或DsbC-抗体复合物以除去未结合的杂质。在另外的实施方案中，通过用不同pH的缓冲液作为加载缓冲液洗脱，从固定的DsbA或DsbC洗脱抗体；例如，抗体与固定化的DsbA或DsbC在中性pH(例如pH7.2)下结合，并在酸性pH(例如pH2.0)下洗脱。在一些另外的实施方案中，将抗DsbA或抗DsbC抗体进行进一步色谱法；例如尺寸排阻色谱法。在一些实施方案中，分析纯化的抗DsbA或抗DsbC抗体(例如，多克隆抗体)与超纯化DsbA或DsbC的结合。
VIII.使用DsbA和DsbC抗体的免疫测定
在一些实施方案中，本发明提供了用于分析重组多肽样品中DsbA的存在和/或量的方法，包括使用免疫测定检测样品中的DsbA并将样品中检测到的DsbA的量与超纯DsbA参考标准的一个或多个浓度的检测相比较。在一些实施方案中，制品包含小于大约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％之任何的杂质。在一些实施方案中，通过本文所述的方法制备超纯DsbA参考标准。在一些实施方案中，免疫测定包括特异性结合超纯DsbA的抗体。在一些实施方案中，特异性结合超纯DsbA的抗体结合小于约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％之任何的非DsbA化合物。在一些实施方案中，特异性结合超纯DsbA的抗体是多克隆抗体。在其他实施方案中，特异性结合超纯DsbA的抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，将特异性结合超纯DsbA的抗体用作免疫测定中的捕获抗体。在一些实施方案中，将特异性结合超纯DsbA的抗体用作检测抗体。在一些实施方案中，检测抗体与检测剂(例如，辣根过氧化物酶)缀合。在一些实施方案中，DsbA是大肠杆菌DsbA。在一些实施方案中，重组多肽在宿主细胞(例如，大肠杆菌宿主细胞)中制备。在一些实施方案中，宿主细胞过表达DsbA(例如，过表达DsbA的大肠杆菌宿主细胞)。在一些实施方案中，样品是细胞裂解物或从重组多肽制品获得，并且其中重组多肽制品已进行一个或多个色谱纯化步骤。在一些实施方案中，重组多肽制品是最终纯化产物。在一些实施方案中，在免疫测定中，特异性结合超纯DsbA的抗体能够检测小于约和/或约任何的50ng/mL、25ng/mL、15ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL和/或1.5ng/mL DsbA。
在一些实施方案中，本发明提供了用于分析重组多肽样品中DsbC的存在和/或量的方法，包括使用免疫测定检测样品中的DsbC并将样品中检测到的DsbC的量与超纯DsbC参考标准的一个或多个浓度的检测相比较。在一些实施方案中，制品包含小于大约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％之任何的杂质。在一些实施方案中，通过本文所述的方法制备超纯DsbC参考标准。在一些实施方案中，免疫测定包括特异性结合超纯DsbC的抗体。在一些实施方案中，特异性结合超纯DsbC的抗体结合小于约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％之任何的非DsbC化合物。在一些实施方案中，特异性结合超纯DsbC的抗体是多克隆抗体。在其他实施方案中，特异性结合超纯DsbC的抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，将特异性结合超纯DsbC的抗体用作免疫测定中的捕获抗体。在一些实施方案中，在免疫测定中，特异性结合超纯DsbC的抗体能够检测小于约和/或约任何的50ng/mL、35ng/mL、25ng/mL、15ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.5ng/mL和/或1ng/mL DsbC。在一些实施方案中，将特异性结合超纯DsbC的抗体用作检测抗体。在一些实施方案中，检测抗体与检测剂(例如，辣根过氧化物酶)缀合。在一些实施方案中，DsbC是大肠杆菌DsbC。在一些实施方案中，重组多肽在宿主细胞(例如，大肠杆菌宿主细胞)中制备。在一些实施方案中，宿主细胞过表达DsbC(例如，过表达DsbC的大肠杆菌宿主细胞)。在一些实施方案中，样品是细胞裂解物或从重组多肽制品获得，并且其中重组多肽制品已进行一个或多个色谱纯化步骤。在一些实施方案中，重组多肽制品是最终纯化产物。
在一些方面，本发明提供了用于检测和定量DsbA和DsbC的免疫测定方法。这样的方法可用于在宿主细胞(例如大肠杆菌)中产生的重组多肽制品中DsbA和DsbC检测和定量，其中DsbA和/或DsbC被过表达以促进多肽折叠和组装。在一些实施方案中，免疫测定方法使用本文所述的捕获和检测抗DsbA或DsbC抗体。在一些实施方案中，抗体以本领域已知的任何免疫测定方法使用，包括但不限于夹心测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)测定、电化学测定(ECL)测定、磁免疫测定。在某些实施方案中，该方法包括使重组多肽制品的样品与本文所述的抗DsbA或抗DsbC抗体在允许将抗DsbA或抗DsbC抗体与DsbA或DsbC结合的条件下接触，并检测是否分别在抗DsbA或抗DsbC抗体与DsbA或DsbC之间形成复合体。
在某些实施方案中，提供标记的抗DsbA和/或抗DsbC抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(例如荧光、发色、电致密、化学发光和放射性标记)以及间接检测(例如通过酶反应或分子相互作用)的部分(例如酶或配体)。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹酰基，伞形酮，荧光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，与使用过氧化氢氧化染料前体(如HRP，乳过氧化物酶或微过氧化物酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定自由基等)的酶偶联的杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶。
在某些实施方案中，捕获抗DsbA或抗DsbC抗体固定在固相上。在一些实施方案中，用于固定的固相是基本上不溶于水且可用于免疫测定的任何惰性载体或载体，包括例如表面、颗粒、多孔基质、珠等形式的载体。常用支持体的实例包括小片、凝胶、聚氯乙烯、塑料珠以及由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等制成的测试板或试管，包括96孔微量滴定板以及颗粒材料如滤纸、琼脂糖、交联葡聚糖和其他多糖。或者，反应性水不溶性基质例如溴化氰活化的碳水化合物和美国专利第3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440号中描述的反应性底物适合用于捕获试剂固定。在一些实施方案中，将固定化的捕获试剂涂布在微量滴定板上，该微量滴定板可用于一次分析多个样品。示例性的微量滴定板包括但不限于 和固相用如上定义的捕获试剂包被，其可以根据需要通过非共价或共价相互作用或物理键连接。用于附着的技术包括美国专利第4,376,110号及其引用文献描述的那些。如果共价，则板或其它固相与捕获试剂以及与交联剂一起在本领域公知的条件下孵育，例如在室温下1小时。在一些实施方案中，板在测定本身之前长时间堆叠和包被，然后以手动、半自动或自动方式同时在多个样品上进行测定，例如通过使用机器人技术。
在一些实施方案中，用封闭剂处理包被的平板，所述封闭剂不特异地结合结合位点并使其饱和，以防止游离配体与板的孔上过量位点的不必要的结合。用于此目的的合适的封闭剂的实例包括但不限于例如明胶、牛血清白蛋白、卵清蛋白、酪蛋白和非脂肪乳。封闭处理通常在环境温度条件下进行一段时间，通常约1-4小时。
在一些实施方案中，在包被和封闭后，将待分析的样品(适当稀释的)加入到固定相中。为此目的可用于稀释的示例性缓冲液包括但不限于(a)含有0.5％BSA、0.05％TWEEN洗涤剂(P20)、0.05％300抗生素、5mM EDTA、0.25％3–((3-胆酰胺丙基)二甲基铵)-1-丙磺酸盐(CHAPS)表面活性剂、0.2％β-γ球蛋白和0.35M NaCl的磷酸缓冲盐溶液(PBS)；(b)含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)、0.05％P20和0.05％300的PBS，pH7；(c)含有0.5％BSA、0.05％P20、0.05％300、5mM EDTA和0.35M NaCl的PBS，pH6.35；(d)含有0.5％BSA、0.05％P20、0.05％300、5mM EDTA、0.2％β-γ球蛋白和0.35M NaCl的PBS；和(e)含有0.5％BSA、0.05％P20、0.05％300、5mM EDTA、0.25％CHAPS和0.35M NaCl的PBS。
选择用于孵育样品和固定的捕获试剂的条件以使测定的灵敏性最大化并使解离最小化，并确保样品中存在的任何目的分析物(如DsbA或DsbC)与固定的捕获试剂结合。任选地，将样品从固定的捕获试剂中分离(例如通过洗涤)以除去未捕获的材料。用于洗涤的溶液通常是缓冲液(例如“洗涤缓冲液”)。如果对捕获的目的材料在随后的步骤中可能在一定程度上解离的任何考虑，也可以在该阶段添加交联剂或其它合适的物质，以允许现有结合的目的材料(例如，DsbA或DsbC)共价连接到捕获试剂上。
将具有任何目的结合材料的固定化捕获试剂与检测抗DsbA或抗DsbC抗体接触。在一些实施方案中，检测抗体被生物素化。在一些实施方案中，用于生物素标记的检测手段是抗生物素蛋白或链霉抗生物素-HRP。在一些实施方案中，检测手段的读出是荧光或比色的。
使用用于检测抗体的检测手段来测量或定量来自样品(例如，DsbA或DsbC)的现结合于捕获试剂的任何游离的目的材料的水平。在一些实施方案中，测量或定量包括将作为上述步骤的结果发生的反应与标准曲线进行比较，以确定与已知量相比的目的材料(例如，DsbA或DsbC)的水平。
添加到固定的捕获试剂中的抗体将被直接标记，或者在冲洗掉过量的第一抗体之后，通过添加摩尔过量的针对第一抗体的动物物种的IgG的第二标记抗体间接地检测。在后者间接测定中，将针对第一抗体的标记的抗血清加入到样品中，以便原位产生标记的抗体。
用于第一抗体或第二抗体的标记是不干扰游离目的材料(例如DsbA或DsbC)与第一或第二抗体结合的任何可检测的功能性。合适的标记的实例包括已知用于免疫测定的标记，例如上面列举的那些。
可用常规方法来使这些标记共价结合至蛋白质或多肽。例如，诸如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺、双-亚胺、双-重氮化联苯胺等的偶联剂可以用于用上述荧光标记、化学发光标记和酶标记标记抗体。参见例如美国专利号3,940,475(荧光测定)和美国专利号3,645,090(酶)；Hunter等,Nature,144:945(1962)；David等,Biochemistry,13:1014-1021(1974)；Pain等,J.Immunol.Methods,40:219-230(1981)；及Nygren,J.Histochem.andCytochem.,30:407-412(1982)。在一些实施方案中，标记是使用链霉抗生物素-HRP的生物素用于检测手段。
本文优选的标记是酶，如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。对免疫测定技术领域的普通技术人员而言，这种标记(包括酶)与抗体多肽的缀合是标准操作方法。参见例如Methods in Enzymology,J.J.Langone和H.Van Vunakis编辑,73卷(Academic Press,NewYork,New York,1981),147-166页中的O'Sullivan等“Methods for the Preparation ofEnzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay”。
加入最后标记的抗体后，通过洗涤除去过量的未结合的标记抗体，然后使用适合标记的检测方法测量或定量附着标记的量，并用生物样品中目的抗体的量校正测量量，确定结合的抗体的量。例如，在酶的情况下，显色和测量的颜色的量将是允许定量存在的目的抗体的量的直接测量。在一个实施方案中，HRP是标记，并且使用底物OPD在490nm吸光度检测颜色。
在一个实例中，在针对第一未标记抗体的酶标记的第二抗体从固定相洗涤之后，通过将固定化的捕获试剂与酶的底物孵育来显色并测量颜色或化学发光。然后通过与标准流程平行生成的颜色或化学发光进行比较来计算目的材料的浓度(例如DsbA或DsbC)。
在一些实施方案中，本发明提供用于药物组合物的质量测定法，所述药物组合物包含在包含DsbA和/或DsbC的细菌中制备的重组多肽，以促进蛋白质折叠和组装。在一些实施方案中，细菌细胞过表达DsbA和/或DsbC。在一些实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，细菌细胞是过表达DsbA和/或DsbC的大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，质量测定法包括将包含重组多肽的组合物的样品进行免疫测定以检测DsbA或DsbC，其中某些量以上的DsbA或DsbC的检测表明治疗性多肽的药物组合物不适合施用给动物。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物的样品是细胞裂解物。在一些实施方案中，样品从包含重组多肽的组合物获得，其中重组多肽已进行一个或多个色谱纯化步骤。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物是最终纯化产物。在一些实施方案中，DsbA和/或DsbC的浓度小于大约50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm之任何表明药物组合物适合于施用给动物。
IX.制备品和试剂盒
通过本文所述的方法纯化的多肽和/或包含通过本文所述方法纯化的多肽的制剂可以包含在制备品中。在一些实施方案中，制备品包含使用本文所述的超纯DsbA和/或DsbC多肽产生的抗体。制备品可以包含含有多肽、抗体、多肽制剂和/或抗体制剂的容器。优选地，制备品包括：(a)容器，其包含在容器内的包含本文所述的多肽、抗体、多肽制剂和/或抗体制剂的组合物；和(b)包装插页，具有用于使用多肽和/或抗体的说明书。
制备品包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。容器保持或含有配置品，并且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。制备品可以进一步包括从商业和用户角度所需的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。在一些实施方案中，容器是注射器。在一些实施方案中，注射器还包含在注射装置内。在一些实施方案中，注射装置是自动注射器。
“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于多肽、抗体、多肽制剂和/或抗体制剂的用途的信息。
在一些实施方案中，本发明提供用于检测在包含自细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物中的DsbA的试剂盒，其中所述试剂盒包含本文所述的抗DsbA抗体。在一些实施方案中，本发明提供用于检测在包含自细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物中的DsbC的试剂盒，其中所述试剂盒包含本文所述的抗DsbC抗体。在还其它实施方案中，本发明提供了用于检测在包含从细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物中的DsbA和DsbC的试剂盒，其中所述试剂盒包含本文所述的抗-DsbA抗体和本文所述的抗DsbC抗体。在一些实施方案中，本发明提供用于检测在包含从细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物中的DsbA的试剂盒，其中所述细菌细胞(例如大肠杆菌细胞)过表达DsbA和/或DsbC。在一些实施方案中，试剂盒包括使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包含超纯DsbA和/或DsbC，用于在产生用于定量样品中的DsbA和/或DsbC的标准曲线中用作参照标准。在一些实施方案中，试剂盒还包含超纯DsbA和/或DsbC，用于在检测样品中的DsbA和/或DsbC的测定中用作阳性对照。
本说明书中公开的所有特征可以以任意组合组合。本说明书中公开每一特征可以由用于相同、等同或相似目的的备选特征替换。因此，除非另有明确说明，所公开的每一特征仅是一系列等同或相似的特征的实例。
通过以下非限制性实施例来阐述本发明的其他细节。本说明书中所有参考文献的公开内容在此明确引入作为参考。
实施例
以下实施例旨在单纯示例本发明，因此不应认为以任何方式限制本发明。以下实施例和发明详述以说明的方式而不是以限制的方式提供。
实施例1.大肠杆菌蛋白的测定不能充分测量DsbA或DsbC。
二硫化物氧化还原酶(DsbA)是强氧化剂，其可以通过硫醇二硫化物交换反应来氧化蛋白质中的半胱氨酸以形成二硫键。它是细菌中二硫键形成的主要催化剂，并促进蛋白质的正确蛋白质折叠。类似地，二硫化物氧化还原酶(DsbC)是细胞周质氧化蛋白质折叠期间的二硫键异构酶。DsbA和DsbC通常在大肠杆菌中不以高水平表达，但是过表达DsbA和/或DsbC的大肠杆菌已被用于改进包括抗体(例如多特异性抗体)的异源多聚体真核生物蛋白的正确组装和折叠。
为了确定用于大肠杆菌蛋白质(ECP)的测定法是否能够充分检测并定量DsbA和/或DsbC的存在，将纯化的DsbA或DsbC的样品以不同浓度加入到测定稀释剂(0.15M NaCl/0.1M NaPO4/0.1％鱼明胶/0.05％聚山梨醇酯20/0.05％Proclin 300)，并在ECP测定中进行测试(Zhu-Shimoni，J等人，2014，Biotech和Bioeng.111：2367-2379)。牛血清白蛋白用作阴性对照，因为大肠杆菌蛋白质的测定不应检测该哺乳动物蛋白质。结果示于表3。
表3.ECP测定检测。
LTR＝小于范围
结果显示，ECP测定法不能充分地检测并定量DsbA或DsbC。此外，作为在大肠杆菌中制备的治疗性蛋白质的释放测定的一部分，检测大肠杆菌残留物(例如，大肠杆菌蛋白质和核酸)的商业测定法不识别DsbA和/或DsbC，因为这些测定通常是通过制备其中DsbA和/或DsbC表达最小的大肠杆菌细胞提取物的多克隆抗体产生的。如此，需要制备超纯DsbA和/或DsbC以产生对Dsb A和/或DsbC高度特异性、对可能干扰DsbA和/或DsbC检测测定的其它大肠杆菌蛋白和/或核酸具有最小反应性的多克隆抗体。此外，DsbA和/或DsbC的超纯制品可用于产生DsbA和/或DsbC标准，用于治疗性多肽制品中DsbA和/或DsbC的准确检测以及产生DsbA和/或DsbC阳性对照以确保用于研究和商业多肽生产的测定质量。
实施例2.超纯DsbA的纯化
材料和方法
提取步骤
在大肠杆菌(W3110衍生物，命名为62A7ΔfhuA(ΔtonA)ptr3，lacIq，lacL8，ompTΔ(nmpc-fepE)ΔdegPilvG修复的)中表达DsbA(Joly，JC和Swartz JR 1994，Biochem.33：4236；Joly，JC和Swartz JR 1997，Biochem.36：10067-10072；US专利号5,789,199)。在10mMMOPS pH 7.1中悬浮细胞浆(50g细胞浆/1L)并混合直到悬浮液均匀。使用Microfluidizer110F在7000psi下进行细胞裂解。将匀浆调理至0.1％PEI(使用10％PEI储备溶液)，并在环境温度(～21℃)下混合30min。将悬浮液以8500rpm离心30min。收集centrate通过0.22umDurapore过滤器过滤。
纯化方法
所有柱色谱步骤在GE的AKTA Explorers上进行。使用匀浆和离心从大肠杆菌细胞浆中提取DsbA。通过使用QFF(QSFF)柱，利用阴离子交换色谱的结合和洗脱模式纯化浓缩物。然后使用Poros 50HS柱，利用阳离子交换色谱的结合和洗脱模式纯化QSFF池。详细的运行条件在表4和5中描述。
步骤
模式：结合和洗脱；树脂：FF(GE)；柱高：20-30cm；流速：150cm/h；加载密度：≤6mg/mL)。
表4：QSFF工艺
合并：通过尺寸排阻色谱法(SEC)测定池，并基于含有最大量DsbA的级分(数据未示出)进行合并。
Poros 50HS步骤
模式：结合和洗脱；树脂：Poros 50HS(Applied Biosystems)；柱高：20-30cm；流速：150cm/h；加载密度：≤6mg/mL)。
表5：Poros 50HS工艺
合并：基于通过SDS-PAGE凝胶和SEC的纯度来分析并合并级分(图3和图4)。
Poros 50HS池的浓缩
使用10kD Centricon膜(Millipore)将池浓缩至～3.0mg/mL，其以3000rpm离心约30min。
分析方法
滴度测定
使用来自GE Healthcare(ID#0619081)的Superdex 200 10/300SEC柱，使用HPLC(Agilent 1100)测定法定量DsbA centrate滴度。该柱在环境温度下以0.5mL/min运行。用0.20M磷酸钾，0.25M氯化钾，pH 6.2±0.1将该柱以0.5mL/min平衡60分钟。在280nm处监测吸光度，并定量洗脱峰面积。使用消光系数1.15(mg/ml)-1*cm-1，在280nm处测量吸光度，减去320nm处的背景吸光度。
尺寸排阻色谱法(SEC)
使用GE Healthcare(ID#0619081)的Superdex 200 10/300SEC柱测定DsbA异质性，高分子量百分比，单体和片段。该柱在室温下在HPLC(Agilent 1100)上以0.5mL/min在0.20M磷酸钾，0.25M氯化钾，pH 6.2±0.1中运行60分钟。靶注射体积为50μg，在280nm监测吸光度。使用Agilent的Chemstation Software计算峰面积。
SDS-PAGE
用4-12％Bis-Tris预制凝胶(Invitrogen目录号#NP0322)进行SDS-PAGE。使用Heukeshoven银染法染色凝胶。
Western印迹
产生纯化的DsbA蛋白。免疫兔，并合并最终的出血并如下所述进行亲和纯化。
对于免疫印迹分析，使用半干转移***(iBlot Invitrogen目录号#SD1000)将蛋白质从SDS凝胶转移到硝酸纤维素膜上。使用1X NET(A3017)，0.5％Gelatin(Bio-Rad目录号170-6539)溶液在室温下封闭硝酸纤维素30分钟。将初级抗DsbA抗体以1:700K在50mL的1×NET中稀释，并加入到封闭的硝化纤维素中并过夜探测。通过用纯化的DsbA免疫兔产生抗DsbA抗体。将兔抗血清合并、亲和纯化并储存在含有0.1％叠氮化钠的PBS(pH7.5)中。将第二抗兔HRP(GE Healthcare目录号#NA934V)抗体以1:100K稀释，并加入到洗涤的硝酸纤维素中2小时。
结果
DsbA能够使用pH 9.0缓冲液与柱结合并加载。QSFF洗脱相具有三个不同的洗脱峰。使用Superdex 200 10/300GL SEC柱分析整个洗脱峰中的所选QSFF池级分(图1)。第一个峰中洗脱LMW杂质(级分3)。第二个峰主要由HMW物质(级分7)组成，第三个峰含有靶DsbA蛋白(级分10和11)。尾洗脱肩部含有另外的LMW物质和痕量的DsbA(级分15)。基于尺寸排阻色谱数据合并含有DsbA蛋白的级分。QSFF步骤提供了部分HMW和LMW物质的降低；然而，实施了另外的下游纯化步骤以进一步提高DsbA的纯度。
实施Poros 50HS树脂以纯化QSFF池。POROS 50HS池(级分4和5)的SDS-PAGE分析显示主峰含有DsbA蛋白(图2，泳道6和7)。代表纯化的DsbA蛋白的单条带具有与先前纯化的DsbA赤(泳道2)一致的分子量。HMW和LMW物质随后在梯度和高盐洗涤中洗脱(泳道9和10)，来自代表性的Poros 50HS运行的SEC数据在图3中示出。合并的Poros 50HS级分(级分4和5)显示HMW和LMW从加载中除去，并且级分主要由DsbA蛋白组成。纯化的DsbA材料没有观察到聚集问题。
色谱法产生超纯DsbA。在图4中示出DsbA为>98％-如SEC所分析的，98.2％主峰，具有0.0％HMW物质和1.8％LMW物质，以及如SEC所分析的，99.2％主峰，具有0.0％HMW物种和0.8％LMW。杂质通过图3中的Poros Load(Q Pool)显示的SEC定量。
实施例3.超纯DsbC的纯化
先前使用两步色谱工艺纯化DsbC(表6；工艺A)。需要蛋白质以产生ELISA(酶联免疫吸附测定)显色的参考标准，并作为免疫原产生用于作为分子探针的DsbC抗体(在兔中)。
通过针对市售兔抗DsbC的Western印迹分析来自两步工艺的纯化的DsbC体积。SDS-PAGE分析揭示，DsbC含有几种较高分子量(HMW)宿主细胞相关蛋白(图5)。由于这些杂质，产生新的DsbC材料以提供更高水平的DsbC纯度，以便最小化针对宿主细胞蛋白质杂质的兔抗体的产生，这可能导致在ELISA中测量的样品中DsbC水平的过度定量。
为了实现这一所需的纯度水平，评估了几种不同的色谱步骤(以及它们在纯化工艺中的相对定位)。评估不同工艺产生适合用作参考和用作免疫原的材料的相对性能(表6)。
表6.DsbC纯化工艺
细胞提取
大肠杆菌(W3110衍生物，命名为62A7ΔfhuA(ΔtonA)ptr3，lacIq，lacL8，ompTΔ(nmpc-fepE)ΔdegP ilvG修复的)(Joly，JC和Swartz JR 1994，Biochem.33：4236；Joly，JC和Swartz JR 1997，Biochem.36：10067-10072；US专利号5,789,199)细胞浆(含有DsbC)悬浮于裂解缓冲液(10mM MOPS，pH7.0；每10mL裂解缓冲液1g细胞浆)中。使用(Microfluidics)进行细胞裂解(在7-8Kpsi下4次通过)。将聚乙烯亚胺(PEI；絮凝剂)加入到裂解液中至终浓度为0.1％(m/v)，然后在室温下混合30min。将PEI悬浮液离心(10Krpm，45min，18℃)并收集上清液以及在色谱之前通过0.22μm过滤器过滤。
纯化：工艺A
如表7所描述的，将总共1.8L澄清的浓缩物(用1.5M Tris碱调理至pH8.0)加载到结合和洗脱模式的含有DEAE Fast Flow(GE Healthcare)的柱中。在该步骤结束时，回收694mg含有DsbC的蛋白质。
表7.工艺A DEAE Fast Flow色谱
DEAE Sepharose的洗脱曲线如图6所示。标记为1、2和3的峰的SDS-PAGE分析(图7)表明峰1中的级分含有对应于预测DsbC的摩尔质量(～24kDa)的主条带。合并峰1级分，然后针对兔抗DsbC进行免疫印迹。该免疫印迹的结果(图8A)证实了DsbC的存在。SDS-PAGE分析揭示了在免疫印迹中不亮的许多较高分子量和较低分子量条带，表明它们与DsbC无关并且是宿主细胞相关的杂质(图8B)。来自原始工艺(工艺A)的尺寸排阻色谱(SEC)将能够除去这些杂质中的一些但不是全部杂质，因为具有接近DsbC的摩尔质量的蛋白质将不会被充分分离。评估用于下游纯化的替代方法，以了解哪些方法和步骤顺序可以有效地将DsbC纯化到靶标指示所需的纯度水平(参见试剂背景部分的概述)。
纯化：工艺B
评估强阳离子交换色谱介质，SPFast Flow(SP-FF；GE Healthcare)的从Fast Flow色谱池中除去宿主细胞蛋白质。
在pH5.0、5.5和6.0下进行SPFF的筛选。加载密度为5mg/mL。缓冲液如下：A.平衡/洗涤缓冲液：pH 5为50mM NaOAc，3.1mS/cm；pH 5.5为50mM NaOAc，3.05mS/cm；pH6为20mM磷酸盐，3.18mS/cm；B.洗脱缓冲液：pH 5为在Equil A中的1M NaCl，94mS/cm；pH5.5为在Equil A中1M NaCl，92mS/cm；pH6为在Equil A中1M NaCl，87mS/cm。设定三个滴注柱，每个含有1mL SPFF树脂，并在适当的pH范围下进行测试。柱(PD10柱，Sephadex 25)用10CV平衡缓冲液平衡。加载是在pH5、5.5和6下用适当的SP平衡缓冲液缓冲交换的DEAE池。用7CV洗涤缓冲液洗涤柱。洗脱使用5CV，各为10％B、20％B、40％B、60％B、80％B和100％B。
通过SDS-PAGE评估测试的每个pH值的柱级分。在pH5.0下观察到最佳的结合条件。增加pH值导致流经该柱的一些至全部的缓冲液交换的DEAE-FF池。一些但不是全部的宿主细胞杂质在pH5.0下被去除：在柱加载期间，去除约20kDa的单个较低分子量带。
将NaCl浓度增加至100mM导致DsbC的不完全洗脱，但除去了几个更高的MW带。将NaCl增加至200mM洗脱大部分剩余的DsbC，但也洗脱了几种其他蛋白质杂质。
SP-FF的初始结果保证了在pH5.0进一步评估。为了评估SP-FF去除残留的宿主细胞蛋白杂质的潜力。使用以下参数进行小规模纯化：如表8所示，将澄清的centrate加载到以结合和洗脱模式的、包含SPFast Flow的柱中。SP-FF柱级分的分析显示在初始评估中看到的20kDa杂质的相同去除以及在梯度中较早洗脱的37kDa条带的去除(图9)。DsbC级分显示从该色谱步骤提高的纯度，但仍含有残留的较高MW杂质和痕量的较低MW杂质(图9)。通过HPLC-SEC对合并的SP-FF级分的分析显示95.2％主峰，0.8％HMW物质和4.0％LMW物质。由于SP-FF凝胶没有以足够的水平去除剩余的杂质，所以评估其他纯化方法。
表8.SP Sepharose Fast Flow色谱
纯化：工艺C
评估疏水相互作用色谱(HIC)以除去SP-FF池中的剩余杂质。在显色工艺C中，使用五种潜在的HIC培养基(Hi Propyl，Phenyl6Fast Flow(低取代)，苯基6 Fast Flow(高取代)，丁基4 Fast Flow和辛基4Fast Flow)，使用与初始评估SP-FF(上述工艺B)所述相同的1.0mL色谱柱进行评估。色谱条件详见表9。
表9.工艺C：DEAE-SPFF-HIC
通过SDS-PAGE分析柱级分显示，对于评估的大多数HIC培养基，大多数宿主细胞杂质不结合凝胶，并且在加载和洗涤步骤期间除去。另外的杂质显示与这些HIC培养基结合的差异，但是使用降低的盐梯度(0.5M硫酸钠至0.1M硫酸钠，在50mM磷酸钠中，pH 7.0；(图10))成功除去。随后从每个HIC培养基中用纯化水(PW)洗脱DsbC。SDS-PAGE结果显示，在苯基FF(低取代)池中发现最大量的纯化的DsbC(图10)。
纯化：工艺D
工艺C中的三个色谱步骤的顺序对于除去存在于初始DEAE-FF步骤中的残留宿主细胞杂质以产生非常超纯的DsbC是非常有效的。进行进一步的评估，以了解HIC步骤是否足够稳健以从DEAE-FF池中除去宿主细胞杂质，消除SP-FF步骤并有效地使得DsbC的纯化工艺流线化。
为了评估第二位置的HIC步骤，使用显色的HIC条件对DEAE-FF池的等分试样进行调理和处理(表6，工艺C)。对HIC工艺的进一步改进包括用较长的0.1M硫酸钠，50mM磷酸钠洗涤步骤替代中间洗涤步骤。在用PW洗脱DsbC之前，实施额外的洗涤体积以从柱中除去杂质。
为了评估第三位置的HIC步骤，使用强SP-FF池而不是DEAE-FF池如上所列的进行相同的实验策略。这些实验如下进行：
实验方案：位置2的HIC-DEAE池>HIC
位置3的HIC-DEAE池>SPFF池>HIC
格式：重力(滴注法)
HIC树脂：苯基Sepharose 6 Fast Flow(低取代)
加载密度：5mg/ml
缓冲液：
平衡/洗涤1：0.6M硫酸钠+50mM磷酸盐，pH7
洗涤2：0.1M硫酸钠+50mM磷酸盐，pH7
洗脱：PW(纯化水)
设置两个滴注柱，每个含有1mL HIC树脂
平衡(柱)：10个柱体积(CV)
加载：位置2的HIC：取5mg DEAE池并稀释至含最终浓度为0.6M硫酸钠/50mM磷酸盐，pH7。调节至最终pH 7；～68mS/cm。
位置3处的HIC：取5mg SPFF池并稀释至含最终浓度为0.6M硫酸钠/50mM磷酸盐，pH7。调节至最终pH 7；～68mS/cm。
洗涤1：5CV
洗涤2：5CV
洗脱：3CV
额外3CV
碱再生：0.1N NaOH(2CV)
收集级分并进行SDS-PAGE以评估杂质去除。
该两步工艺如三步工艺同样有效地从DsbC中除去不想要的杂质(图11)。
纯化：工艺E(最终工艺)
使用苯基Fast Flow(低取代)将DEAE-FF池的纯化扩大。表10列出了操作参数。HIC步骤的主峰级分为7、8、9、10和11。
该柱为结合和洗脱模式的苯基(LS)。加载到柱的质量为536mg。
表10.苯基Sepharose Fast Flow色谱法(低取代)
柱级分的SDS-PAGE分析显示通过HIC步骤非常好地除去杂质。在一些单个HIC级分上观察到两个微弱条带(15kDa和50kDa)。然而，当组合主要级分中的一些或全部时，仅观察到对应于DsbC的一个带主带(图12)。使用HPLC-SEC分析主要的DsbC级分(7-11)显示出97.0％的主峰、1.0％的低MW和2.0％的高MW的分布。采取较窄的截留(级分8-10)，给出了98.2％主峰、1.7％低MW和0.1％高MW物质的分布。
使用Superdex 75(GE Healthcare)的尺寸排阻色谱法(SEC)去除任何残留的高MW和低MW物质并配制DsbC。选择Superdex 75作为其分级范围(5kDa至70kDa)更适合于较小的蛋白质(～24kDa)，如DsbC。SEC柱的操作参数如表11所示。
在制备尺寸排阻色谱中，使用Amicon Ultra-3离心过滤器(Millipore)将HIC池(级分7-11)浓缩至≤16mL的体积(≤5％的SEC CV)。使用临床离心机(Eppendorf)以4000rpm离心这些单位20min间隔，直到达到靶体积。
表11.Superdex 75尺寸排阻色谱
将浓缩的HIC池加载到SEC柱中，并用平衡缓冲液追赶加载。用平衡缓冲液显色柱，并收集代表SEC CV(6.4mL)的2％的级分。总共执行了两个尺寸排除运行。通过SDS-PAGE分析主要级分(47-56)(图13)，显示对应于DsbC(～24kDa)的1个主条带。在HPLC-SEC测定中也测试相同的级分。最终配制的DsbC批量显示出单一的、高度对称的峰，在后侧稍微拖尾(图14)。制备型SEC步骤成功地进一步除去杂质并将DsbC体积进行缓冲液更换为最终制剂缓冲剂；使用HPLC-SEC显示99.85％主峰、0.10％低MW、0.05％高MW的分布。
冻融稳定性和分析
通过在≤-80℃的温度下对其进行三次冻融循环来评估配制体积的稳定性。使用SDS-PAGE和HPLC-SEC分析冻融样品。
将总共600μL的配制体积用于本研究，每个时间点分为四×150μL等分试样。将一等份置于冷室(2-8℃)(“0”冻融)。将剩余的三个等分试样置于≤-80℃冷冻箱中。4小时后，将样品在室温下解冻约1小时并轻轻混合。将样品之一转移到冷室(“1”冻融)，其余样品放回到≤80℃冷冻箱。重复该过程，产生“2”冻融样品。将剩余的样品(“3”冻融液)在≤-80℃冷冻箱中放置过夜。将“3”冻融样品在第二天解冻。非还原和还原的SDS-PAGE结果显示在纯化的体积和所有冻融样品上对应于DsbC(～24kDa)的一个条带(数据未示出)。HPLC-SEC测定显示所有样品是可比较的，具有0.1％HMW物质，99.9％主峰并且没有检测到LMW物质的重叠轮廓。在三次冷冻/融化循环后，该分子保留其物理和功能特性。
SDS-PAGE和SyproRuby染色
为了确保在最终配制的体积中不存在其他非DsbC杂质，进行SDS-PAGE并使用SyproRuby染色成像(Bio-Rad；图15)。
功能测试
通过一组特征测定(N末端序列分析、肽质量指纹(PMF)、CHIP TOF的完整/还原质量)来证实DsbC分子的身份)。该测定证实了分子的正确身份。
对纯化的DsbC体积和产生的冻融样品的等分试样进行功能测试，并证明了四种样品之间的可比性，表明蛋白质在三种冻融中是稳定和有功能的(数据未示出)。纯化的DsbC被认为是对于兔免疫以产生抗DsbC抗体，并且随后用作亲和色谱的配体以从兔抗血清纯化抗DsbC是可接受的。
实施例4.抗DsbA和抗DsbC抗体的产生和纯化
产生针对超纯DsbA和DsbC产生的多克隆抗体用于测定以测量在制备治疗性多肽中从DsbA和DsbC中的去除。以下的实施例描述了用于产生多克隆DsbA和DsbC抗体的纯化方法。这些关键试剂与DsbA和DsbC免疫原一起是特异性DsbA和DsbC ELISA显色所必需的。
用DsbA或DsbC免疫三只兔子(每免疫原)。在第42天，从个体兔子抽取血液，并使用DsbA和DsbC抗血清来纯化抗DsbA和抗DsbC抗体。
分析方法
使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定DsbA和DsbC抗体的相对纯度，并确认蛋白质的摩尔质量。用或不用二硫键还原进行电泳以评估抗体的共价聚集。
使用Bio-Rad CriterionTM 4-20％TGX(Tris-Glycine eXtended)Stain-FreeTM胶进行SDS-PAGE，并用Bio-Rad Criterion Stain FreeTM Imager(Bio-Rad Laboratories)成像。
使用高效液相色谱-尺寸排阻色谱(HPLC-SEC)，使用TSK Gel 3000SWx1柱(TosohBioscience)来监测DsbA和DsbC抗体在天然条件下的尺寸异质性，以分离高分子量(HMW)物质、主峰(单体)和低分子量(LMW)物质。
DsbA和DsbC抗体的纯化
使用相同的提取和色谱步骤并行进行DsbA和DsbC抗体的纯化。该工艺包括以下：
盐沉淀：在抗血清上进行60％硫酸铵(AS)分级化步骤。在亲和色谱之前，将60％硫酸铵沉淀溶解在磷酸盐缓冲液中。
固定化(免疫原)亲和色谱：设计亲和色谱步骤以将靶抗体与60％硫酸铵沉淀中的剩余杂质分离。使用纯化的DsbA和DsbC(用于免疫兔的相同批次的试剂)作为配体来构建分离的亲和支撑物。通过还原性胺化化学将特异性免疫原固定化成活化的Glyceryl-CPG(Controlled Pore Glass；Millipore)来制备每个亲和支撑物。这种亲和色谱给出对靶抗体的高度的选择性。
尺寸排阻色谱(SEC)：制备型SEC用于从靶抗体分离较高分子量(MW)和较低分子量(MW)物质，并将其配制成合适的储存缓冲液。随后通过其各自的ELISA来测定抗体池的功能性，以确认靶标测定性能。
执行并评估色谱步骤以产生适用于特定DsbA和DsbC ELISA显影的材料。
抗血清的沉淀和靶抗体的确认
合并兔抗血清A、B、C(体积＝72mL(抗DsbA)，76mL(抗-DsbC))，将52mL硫酸铵调理溶液(上述)缓慢加入到抗-DsbA溶液和将55mL加入到抗DsbC中，贯穿添加过程轻轻搅拌。将溶液以13,000rpm，18℃的温度离心45分钟，将硫酸铵沉淀(含有DsbA和DsbC抗体)冷冻在≤-60℃直到准备好进行亲和色谱。
硫酸铵悬浮液、上清液和沉淀的SDS-PAGE分析证实了上清液已经耗尽抗体，并且沉淀含有所有的兔抗体。兔抗DsbA和抗DsbC抗体显示出～130kDa的摩尔质量。还原后，～130kDa的主条带还原成重链(～50kDa)和轻链(～25kDa)。
亲和色谱
在加载到它们各自的DsbA-CPG或DsbC-CPG亲和柱之前，将抗DsbA和抗DsbC 60％硫酸铵沉淀在pH7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重构。
亲和色谱步骤如表12所述进行。
树脂是DsbA-CPG或DsbC-CPG。色谱处于结合和洗脱模式。床高度为6.0cm(DsbA-CPG)或5.0cm(DsbC-CPG)。直径为1.6cm，并且体积为12.0或10.0mL。
表12.亲和色谱操作条件
用5CV的洗脱缓冲液洗脱来自每个柱的结合的DsbA和DsbC抗体，将抗体收集到浓缩的Tris缓冲液中(以便保持7.0-7.5的pH，这将使由于非常低的洗脱pH而造成的抗体聚集最小化)。将洗脱池收集到含有17mL 1.0M Tris，pH7.5的烧杯中。
抗-DsbC亲和池的SDS-PAGE分析显示出在～130kDa的显著条带，对应于靶兔抗-DsbC抗体和其他可能的与产物相关的较高MW物质和较低MW(<75kDa)物质。在还原条件下，～130kDa的主条带还原成2个条带：～50kDa和～25kDa，分别对应于重链和轻链。还使用抗DsbA亲和池观察到类似的SDS-PAGE条带模式(数据未示出)。
抗-DsbA池的HPLC-SEC分析显示出79％的主峰，19％的高MW物质和2％的低MW物质的分布。对于抗DsbC池，观察到78％的主峰，16％的高MW物质和6％的低MW物质。该步骤实现了总体纯度为79％(主峰)。在对池进行功能测试之前，将池的一等分进一步分级化以富集主峰的数量。在ELISA中评估尺寸排阻色谱前后的池的测定性能。
尺寸排阻色谱：SEC
为了获得更高水平的纯度，使用Superdex 200柱(GE Healthcare)进行尺寸排阻色谱(SEC)。由于抗DsbA亲和池的数量有限，首先将等分的抗DsbC亲和池分级化。SEC柱的操作参数如下。柱体积为1120mL，并且加载体积≤6mL(1CV的≤5％)。将柱用PBS平衡，pH 7.2，3CV，流速为0.5mL/min。每个循环的加载≤6.0mL。对抗DsbA进行一个循环，并对抗DsbC进行两个循环。该柱用PBS，pH7.2，1CV以0.5mL/min显影。对于每个循环，使用Amicon Ultra10kDa过滤器将来自兔血清的pH调节的亲和池浓缩至终体积为6.0mL。
使用Amicon Ultra-3离心过滤器(Millipore)，将10mg等分的抗DsbC亲和池浓缩至≤6.0mL(≤1.5％的CV)的体积。
将浓缩的抗DsbC亲和池加载到SEC柱上，并用平衡缓冲液追赶加载。用平衡缓冲液培养柱，并收集2.4mL级分(2％的SEC CV)。主峰池级分为34-37。
在HPLC-SEC测定中评估几个模拟池，以确定哪个级分的系列产生最高的纯度(表13)。较窄的截留(级分35-36)显示分布为主峰95.1％，1.0％的HMW，和3.9％的LMW物质，而较宽的截留(级分为34-37)显示93.9％的主峰，1.4％的高MW和4.7％低MW物质。由于较窄的合并并没有显著提高纯度以及具有有较低的蛋白质质量回收，因此选择较宽的合并方案(表13)。
表13.抗DsbC模拟池的HPLC-SEC
基于模拟池预测浓度。
TSK柱：QC Pak GFC 300，流速＝0.5mL/min；运行时间＝15min
SEC步骤将单体的量从79％(亲和步骤)增加到94％。
功能测试结果
以直接结合ELISA形式评估抗DsbC亲和池(未分级和分级的)，以确定是否需要较高的纯度来提供更好的测定性能。在两个池中实现了相当的剂量应答曲线，表明不需要去除高MW物质(图16)。
上述结果促使追求更灵敏的ELISA夹心测定法，其需要将DsbC抗体与辣根过氧化物酶(HRP)缀合。这种类型的成功缀合(生物素化)通常需要抗体池的高MW物质(聚集体)较低。
为了评估该步骤，将低聚集体亲和池与HRP缀合。使用作为外层的低聚集体亲和池和与HRP缀合的低聚集体亲和池用于检测，低聚集体抗DsbC池被认为是适合用于夹心ELISA来检测DsbC(图17)。
最终的决定是使用Superdex 200抗DsbC池(低MV在聚集体中，高MW富含在主峰中)。有了这个决定，剩下的一半的抗DsbC池和整个抗DsbA池进一步使用SEC进行分级化。
工艺B
将SEC步骤作为最终色谱步骤加入到最终纯化工艺(B)中，以确保具有较低水平的聚集体的较高程度的纯度。
使用如前所述的Superdex 200柱，并使用上述相同的操作参数，通过SEC完成抗DsbA亲和池和剩余的抗DsbC亲和池的分级。
用于抗DsbA的最终合并截留是级分35-38，并且用于抗DsbC的是级分34-37。进行这些合并截留以便获得高纯度水平(主峰)和最大产品产量。通过HPLC-SEC测定的最终分级化池含有87.3％的主峰(抗DsbA)和92.5％的主峰(抗-DsbC)。SEC步骤通过去除高和低MW物质并将池进行缓冲液更换成最终制剂缓冲液(PBS，pH 7.0±0.2)来富集主峰。
DsbA和DsbC的纯化导致DsbA和DsbC ELISA的成功显影。
实施例5.DsbA和DsbC的ELISA检测
试剂
将包被抗体(多克隆抗DsbA或多克隆抗DsbC)用PBS稀释至约1.2mg/mL并储存在-60℃或更低。解冻后，将包被抗体从解冻之日起在2-8℃储存长达一周。将标准材料(DsbA或DsbC)稀释至100μg/mL，并储存在-60℃或更低。用测定稀释剂将测定对照源稀释至落入标准曲线的低和高的区域，并储存于-60℃或更低。HRP-缀合物(缀合辣根过氧化物酶的DsbA或DsbC的抗体)。解冻后，HRP-缀合物抗体从解冻之日起在2-8℃储存长达一周。用甘油将HRP-缀合物抗DsbA储备液I以约1：1稀释，储存于-10℃至-30℃。用测定稀释剂将HRP-缀合物抗DsbC储备液I以约1:20稀释，储存在-60℃。
测定稀释剂：0.15M氯化钠[NaCl]/0.1M磷酸钠[NaPO4]/0.1％鱼明胶/0.05％聚山梨醇酯20/0.05％Proclin 300。
洗涤缓冲液：PBS/0.05％聚山梨醇酯20。
包被缓冲液：0.05M碳酸钠缓冲液。
底物溶液：SureBlue ReserveTMTMB微孔过氧化物酶底物(Kirkegaard&Perry Labs[KPL]，目录号#53-00-00或等同物)。
终止溶液：0.6N硫酸。
标准、对照和样品制备
制备标准曲线(1000、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.781、0ng/mL)。每个对照的对照制品的等分试样在使用当天解冻。未经解冻的对照被丢弃。用测定稀释剂稀释的测试样品落在标准曲线的范围内。
程序
用包被缓冲液稀释包被抗体储备液I，得到标准曲线浓度和所需的响应范围。将100μL稀释的包被抗体储备液I移液到微量滴定板的每个孔中，并在2-8℃下孵育12至72小时。每个孔用洗板器洗涤并用大约400μL洗涤缓冲液抽吸3次，并且彻底清除。通过在废水库上翻转板，从孔中没有移除溶液。向每个孔中加入约200μL的测定稀释液，并在环境温度下搅拌孵育1至2小时。重复洗涤步骤。
将每孔100μL稀释的标准(一式两份)、对照(一式两份)和样品移液到适当的孔中。在环境温度下搅拌孵育2小时±10分钟。将孔如上所述洗涤，将板旋转，并重复洗涤步骤。
用测定稀释剂稀释HRP缀合物储备液I，以在最高和最低标准之间产生靶向1.5-2.0OD的最大OD值的显著的OD范围。将100μL稀释的HRP-缀合物储备液I移液到每个孔中，并在环境温度下搅拌孵育2小时±10分钟。将孔如上所述洗涤，将板旋转，并重复洗涤步骤。
将每孔100μL的底物溶液移液到孔中，并在环境温度下在黑暗中孵育足够的时间以允许最佳的标准曲线颜色显影。吸取每孔100μL的0.6N硫酸。
使用读板器，用两个滤光片读取OD，450nm用于检测吸光度，620-630nm用于参考吸光度(参考波长是任选的)。
计算和数据分析
通过使用具有最小5参数逻辑曲线拟合程序的数据处理软件来确定样品浓度。
如实施例4所述，ELISA用于评估纯化期间的DsbA和DsbC去除。
实施例5.单克隆抗体纯化期间DsbA和DsbC去除的评估。
在大肠杆菌细胞中产生MAb1，其过表达DsbA和DsbC以有助于二硫键的适当折叠和产生。简言之，将表达MAb1、DsbA和DsbC的大肠杆菌细胞裂解并离心以澄清裂解物。然后将centrate施用于MabSelect Sure蛋白A柱(MSS)。随后将含有MAb 1的洗脱的MSS级分施用于CaptoAdhere(Capto)混合模式色谱、Poros 50HS阳离子交换色谱和QSFF阴离子交换色谱，全部处于结合和洗脱模式。然后使用超滤和渗滤将含有MAb1的合并的QSFF级分浓缩并配制。
测定来自每个纯化步骤的级分(浓缩物、MSS蛋白A、CaptoAdhere、Poros 50HS、QSFF、UFDF)的蛋白质浓度，大肠杆菌蛋白质的去除(如下所述)，以及如实施例3所述的DsbA和DsbC的存在。得六项合格运行的结果。
宿主细胞蛋白(ECP)的去除
已经评估了用于纯化抗体的回收工艺的降低宿主细胞蛋白(大肠杆菌蛋白质或ECP)水平的能力。使用下述ELISA测定对工艺中和过滤的体积样品进行ECP的定量。这些数据证明临床抗体材料中的ECPs通过恢复工艺显著降低至<50ng/mg抗体水平。
使用大肠杆菌蛋白质的多产物夹心ELISA来定量池样品中的ECP水平。将亲和纯化的山羊抗全ECP抗体固定在微量滴定板上。将池样品的稀释在孔中孵育，随后用与辣根过氧化物酶缀合的亲和纯化的山羊抗全ECP孵育。用邻苯二胺二盐酸盐检测辣根过氧化物酶酶活性。通过在微量滴定板读数器中读取490nm处的吸光度来定量ECP。使用四参数计算机曲线拟合程序生成标准曲线并自动计算样品浓度。对于DsbA，ELISA的测定范围通常为1.56ng/mL至50ng/mL，并且对于DsbC为1.09ng/mL至35ng/mL。
结果
每个级分中发现的蛋白质的总量在表14中呈现。
表14.纯化级分的总蛋白浓度(mg/ml)。
池 运行1 运行2 运行3 运行5 运行6
Centrate 1.06 1.05 0.93 0.91 1.05
MSS 12.57 12.57 13.71 12.64 12.47
Capto 6.83 7.06 7.65 6.36 6.29
Poros 6.58 6.44 6.48 5.91 6.25
QSFF 4.34 4.52 4.22 3.85 3.89
UFDF 76.818 77.452 72.07 68.189 67.411
大肠杆菌蛋白质的去除示于表15中。
表15.纯化级分的总大肠杆菌蛋白(ng ECP/mg总蛋白)。
池 运行1 运行2 运行3 运行5 运行6
Centrate 3761682.4 3829524 4510806 4610109.9 3362492.1
MSS 893.9 928.6 1116 1385 969.7
Capto 63.7 67.6 79.80 77.2 55.9
Poros 14.7 18.3 29.5 20.6 13.7
QSFF 5.1 6.9 10 8 5.8
UFDF 8.7 9.6 13.2 11.1 8.4
在每个级分中检测到的DsbA的总量示于表16中。
表16.纯化级分的总DsbA浓度(ng/mL)。
通过对每个级分中的总蛋白质(表14)归一化每个级分中的总DsbA(表16)来确定每个级分中的DsbA的相对量。标准化DsbA含量的结果示于表17中。结果以ng/ml DsbA/蛋白浓度表示。
表17.纯化级分的总相对DsbA含量(ng DsbA/mg总蛋白)。
池 运行1 运行2 运行3 运行5 运行6
Centrate 125177.3585 161226.6667 168086.0215 168070.3297 143702.8571
MSS 51.5 48.3 61.8 92.6 58.8
Capto 0.2 0.4 0.5 0.3 0.4
Poros <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1
QSFF <0.2 <0.2 <0.2 <0.2 <0.2
UFDF <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
每个级分中检测到的DsbC的总量示于表18中。
表18.纯化级分的总DsbC浓度(ng/mL)
池 运行1 运行2 运行3 运行5 运行6
Centrate 223328 283116 179370 218864 232976
MSS 4594 5792 5896 7765 5305
Capto <1.09 <1.09 <1.09 <1.09 <1.09
Poros <1.09 <1.09 <1.09 <1.09 <1.09
QSFF <1.09 <1.09 <1.09 <1.09 <1.09
UFDF <1.09 <1.09 <1.09 <1.09 <1.09
通过对每个级分中的总蛋白质(表14)归一化每个级分中的总DsbC(表18)来确定每个级分中DsbC的相对量。标准化DsbC含量的结果示于表19中。结果以ng/ml DsbA/蛋白浓度表示。
表19.纯化级分的总相对DsbC含量(ng DsbC/mg总蛋白)。
DsbA和DsbC测定的结果显示，在超滤/渗滤步骤之前，DsbA和DsbC都被清除。在CaptoAdhere步骤之后，DsbA被清除，并且在MabSelect Sure步骤之后DsbC被清除。
序列
大肠杆菌Ds bA
氨基酸序列-无前导序列
AQYEDGKQYTTLEKPVAGAPQVLEFFSFFCPHCYQFEEVLHISDNVKKKLPEGVKMTKYHVNFMGGDLGKDLTQAWAVAMALGVEDKVTVPLFEGVQKTQTIRSASDIRDVFINAGIKGEEYDAAWNSFVVKSLVAQQEKAAADVQLRGVPAMFVNGKYQLNPQGMDTSNMDVFVQQYADTVKYLSEKK(SEQ ID NO：1)
氨基酸序列-具有前导序列(黑体)
核酸序列
ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGCGCAGTATGAAGATGGTAAACAGTACACTACCCTGGAAAAACCGGTAGCTGGCGCGCCGCAAGTGCTGGAGTTTTTCTCTTTCTTCTGCCCGCACTGCTATCAGTTTGAAGAAGTTCTGCATATTTCTGATAATGTGAAGAAAAAACTGCCGGAAGGCGTGAAGATGACTAAATACCACGTCAACTTCATGGGTGGTGACCTGGGCAAAGATCTGACTCAGGCATGGGCTGTGGCGATGGCGCTGGGCGTGGAAGACAAAGTGACTGTTCCGCTGTTTGAAGGCGTACAGAAAACCCAGACCATTCGTTCTGCTTCTGATATCCGCGATGTATTTATCAACGCAGGTATTAAAGGTGAAGAGTACGACGCGGCGTGGAACAGCTTCGTGGTGAAATCTCTGGTCGCTCAGCAGGAAAAAGCTGCAGCTGACGTGCAATTGCGTGGCGTTCCGGCGATGTTTGTTAACGGTAAATATCAGCTGAATCCGCAGGGTATGGATACCAGCAATATGGATGTTTTTGTTCAGCAGTATGCTGATACAGTGAAATATCTGTCCGAGAAAAAATAA
(SEQ ID NO：2)
大肠杆菌Ds bC
氨基酸序列-无前导序列
DDAAIQQTLAKMGIKSSDIQPAPVAGMKTVLTNSGVLYITDDGKHIIQGPMYDVSGTAPVNVTNKMLLKQLNALEKEMIVYKAPQEKHVITVFTDITCGYCHKLHEQMADYNALGITVRYLAFPRQGLDSDAEKEMKAIWCAKDKNKAFDDVMAGKSVAPASCDVDIADHYALGVQLGVSGTPAVVLSNGTLVPGYQPPKEMKEFLDEHQKMTSGK
(SEQ ID NO：3)
氨基酸序列-具有前导序列(黑体)
核酸序列
ATGAAGAAAGGTTTTATGTTGTTTACTTTGTTAGCGGCGTTTTCAGGCTTTGCTCAGGCTGATGACGCGGCAATTCAACAAACGTTAGCCAAAATGGGCATCAAAAGCAGCGATATTCAGCCCGCGCCTGTAGCTGGCATGAAGACAGTTCTGACTAACAGCGGCGTGTTGTACATCACCGATGATGGTAAACATATCATTCAGGGGCCAATGTATGACGTTAGTGGCACGGCTCCGGTCAATGTCACCAATAAGATGCTGTTAAAGCAGTTGAATGCGCTTGAAAAAGAGATGATCGTTTATAAAGCGCCGCAGGAAAAACACGTCATCACCGTGTTTACTGATATTACCTGTGGTTACTGCCACAAACTGCATGAGCAAATGGCAGACTACAACGCGCTGGGGATCACCGTGCGTTATCTTGCTTTCCCGCGCCAGGGGCTGGACAGCGATGCAGAGAAAGAAATGAAAGCTATCTGGTGTGCGAAAGATAAAAACAAAGCGTTTGATGATGTGATGGCAGGTAAAAGCGTCGCACCAGCCAGTTGCGACGTGGATATTGCCGACCATTACGCACTTGGCGTCCAGCTTGGCGTTAGCGGTACTCCGGCAGTTGTGCTGAGCAATGGCACACTTGTTCCGGGTTACCAGCCGCCGAAAGAGATGAAAGAATTCCTCGACGAACACCAAAAAATGACCAGCGGTAAATAA
(SEQ ID NO：4)

Claims (255)

1.一种从包含DsbA多肽的细胞裂解物中纯化DsbA多肽的方法，所述方法包括：
a)向包含DsbA多肽的细胞裂解物中加入聚乙烯亚胺(PEI)至约0.01％至约1.0％的终浓度，
b)通过离心澄清细胞裂解物，
c)将包含DsbA多肽的澄清的细胞裂解物施用于阴离子交换色谱材料，
d)从阴离子交换色谱材料洗脱DsbA多肽以产生包含DsbA多肽的阴离子交换洗脱物，
e)将包含DsbA多肽的阴离子交换洗脱物施用于阳离子交换色谱材料，
f)从阳离子交换色谱材料洗脱DsbA多肽以产生包含纯化的DsbA多肽的阳离子交换洗脱物。
2.根据权利要求1的方法，其中包含DsbA多肽的细胞裂解物在阴离子交换色谱之前保持在PEI中至少约16小时。
3.根据权利要求1或2的方法，其中裂解物中的PEI的最终浓度为约0.1％。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中包含DsbA多肽和PEI的裂解物的pH为约7.0。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中阴离子交换色谱材料是强阴离子交换剂。
6.根据权利要求5的方法，其中强阴离子交换剂包含季胺。
7.根据权利要求5或6的方法，其中季胺与交联的琼脂糖连接。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中DsbA是使用盐梯度从阴离子色谱材料中洗脱。
9.根据权利要求8的方法，其中盐梯度是不连续梯度。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中澄清的裂解物包含10mM MOPS，pH 7.1。
11.根据权利要求10的方法，其中DsbA是利用以下步骤从阴离子交换色谱材料中洗脱：
约15％的约25mM Tris和约250mM NaCl，在约pH9.2下，约4个柱体积，
约20％的约25mM Tris和约250mM NaCl，约pH9.2，约4个柱体积，
约25％的约25mM Tris和约250mM NaCl，约pH 9.2直至DsbA从柱中洗脱出来。
12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中将步骤b)的包含DsbA多肽的澄清裂解物在阴离子交换色谱之前通过0.22μm过滤器。
13.根据权利要求1-12中任一项的方法，其中将步骤b)的包含DsbA多肽的澄清裂解物在阴离子交换色谱之前调节至pH约9.0。
14.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中阴离子交换洗脱物以级分收集。
15.根据权利要求13的方法，其中在阳离子交换色谱之前通过尺寸排阻色谱分析级分。
16.根据权利要求15的方法，其中选择包含至少约55％DsbA的级分用于进一步纯化。
17.根据权利要求1-16中任一项的方法，其中阳离子交换材料包含磺丙基部分。
18.根据权利要求17的方法，其中磺丙基部分连接到交联的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基质或其等同物。
19.根据权利要求1-18中任一项的方法，其中将步骤d)的阴离子交换洗脱物在阳离子交换色谱之前调节至pH约5.0。
20.根据权利要求1-19中任一项的方法，其中DsbA是使用盐梯度从阳离子色谱材料中洗脱。
21.根据权利要求20的方法，其中阳离子色谱材料用5个柱体积的12.5mM MES洗涤。
22.根据权利要求20或21的方法，其中盐梯度是15个柱体积以上的约0％至约60％的12.5mM MES和1M NaCl的梯度。
23.根据权利要求20-22中任一项的方法，其中阳离子交换洗脱物以级分收集。
24.根据权利要求23的方法，其中通过尺寸排阻色谱分析级分。
25.根据权利要求24的方法，其中合并包含至少约95％DsbA的级分。
26.根据权利要求1-25中任一项的方法，其中DsbA多肽是大肠杆菌DsbA多肽。
27.根据权利要求26的方法，其中DsbA多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
28.根据权利要求27的方法，其中DsbA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少约80％相同。
29.根据权利要求1至28中任一项的方法，其中DsbA在细胞中表达。
30.根据权利要求29的方法，其中细胞是原核细胞。
31.根据权利要求29或30的方法，其中细胞是大肠杆菌细胞。
32.根据权利要求29-31中任一项的方法，其中细胞被改造，以比DsbA的内源表达更高的水平表达DsbA。
33.根据权利要求1-32中任一项的方法，其中使用微流化器裂解细胞。
34.一种组合物，包含通过权利要求1至33中任一项所述的方法纯化的DsbA多肽。
35.一种包含纯化的DsbA多肽的组合物，其中组合物包含至少约95％的单体DsbA多肽。
36.根据权利要求35的组合物，其中组合物包含少于约2％的低分子量物质。
37.根据权利要求35或36的组合物，其中组合物包含小于约1％的高分子量物质。
38.根据权利要求35-37中任一项的组合物，其中通过尺寸排阻色谱法检测单体DsbA多肽的百分比。
39.根据权利要求35的组合物，其中组合物包含小于约5％的杂质。
40.根据权利要求39的组合物，其中杂质是相对于天然DsbA的高分子量和/或低分子量多肽物质。
41.根据权利要求39或40的组合物，其中杂质是大肠杆菌蛋白(ECP)、DsbA的聚集体、DsbA的片段、核酸或细胞培养基组分中的一种或多种。
42.根据权利要求34-41中任一项的组合物，其中DsbA对于一个或多个冻融循环是稳定的。
43.根据权利要求42的组合物，其中DsbA对三个冻融循环是稳定的。
44.根据权利要求34-37或39-43中任一项的组合物，其中通过色谱法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳或Western印迹分析中的一种或多种测量组合物中DsbA多肽的纯度。
45.根据权利要求34-44中任一项的组合物，其中通过高效液相色谱(HPLC)测量组合物中DsbA多肽的纯度。
46.根据权利要求34-45中任一项的组合物，其中通过尺寸排阻色谱法(SEC)测量组合物中DsbA多肽的纯度。
47.根据权利要求34-37或39-44中任一项的组合物，其中通过使用荧光蛋白染色或银染色的SDS凝胶电泳测量组合物中DsbA多肽的纯度。
48.根据权利要求47的组合物，其中组合物中非DsbA多肽的存在通过由凝胶电泳鉴定的与抗DsbA抗体无免疫反应的物质的存在来鉴定，该与抗DsbA抗体无免疫反应是通过Western印迹分析显示的。
49.根据权利要求48的组合物，其中组合物中DsbA多肽的聚集体的存在通过Western印迹分析的具有分子量大于天然DsbA的物质的存在来鉴定。
50.根据权利要求48的组合物，其中组合物中DsbA多肽的片段的存在通过Western印迹分析的具有分子量小于天然DsbA的物质的存在来鉴定。
51.一种用于产生特异性结合DsbA的抗体的方法，包括将动物暴露于权利要求34-50中任一项所述的组合物。
52.根据权利要求51的方法，还包括从动物收集血清，其中血清包含特异性结合DsbA的抗体。
53.根据权利要求52的方法，其中血清包含特异性结合DsbA的多克隆抗体。
54.根据权利要求52或53的方法，其中从血清中分离出一种或多种单克隆抗体。
55.根据权利要求51-54中任一项的方法，其中动物是山羊、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、驴或鸡。
56.一种用于纯化特异性结合DsbA的抗体的方法，包括将包含抗DsbA抗体的组合物与包含结合到支持材料的超纯DsbA的色谱材料接触，洗涤色谱材料以除去未结合的化合物和洗脱抗DsbA抗体。
57.根据权利要求56的方法，其中包含超纯DsbA的组合物包含至少约95％的单体DsbA多肽。
58.根据权利要求56或57的方法，其中通过权利要求1-33中任一项所述的方法制备超纯DsbA。
59.根据权利要求56-58中任一项的方法，其中抗体是多克隆抗体。
60.根据权利要求56-59中任一项的方法，其中根据权利要求51-53中任一项所述的方法制备抗体。
61.根据权利要求60的方法，其中少于约1％的抗体特异性结合非DsbA化合物。
62.一种包含特异性结合DsbA的多克隆抗体的组合物，其中通过将动物暴露于权利要求34-50中任一项所述的组合物而产生多克隆抗体。
63.根据权利要求62的组合物，其中从动物血清中收集多克隆抗体。
64.一种包含特异性结合DsbA的单克隆抗体的组合物，其中通过将动物暴露于权利要求34-50中任一项所述的组合物而产生单克隆抗体。
65.根据权利要求62-64中任一项的组合物，其中通过权利要求56-61中任一项所述的方法纯化抗体。
66.根据权利要求62-65中任一项的组合物，其中动物是山羊、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、驴或鸡。
67.一种用于定量样品中DsbA的方法，包括使用检测***检测样品中的DsbA并将样品中检测的DsbA的量与一种或多种浓度的超纯DsbA参考标准的检测进行比较。
68.根据权利要求67的方法，其中超纯DsbA参考标准包含至少约95％的单体DsbA多肽。
69.根据权利要求67或68的方法，其中通过权利要求1-33中任一项所述的方法制备超纯DsbA参考标准。
70.根据权利要求67-69中任一项的方法，其中检测***是免疫测定。
71.根据权利要求70的方法，其中免疫测定包括特异性结合超纯DsbA的抗体。
72.一种用于分析重组多肽样品中DsbA的存在和/或量的方法，包括使用免疫测定检测样品中的DsbA并将样品中检测到的DsbA的量与一种或多种浓度的超纯DsbA参考标准的检测相比较。
73.根据权利要求72的方法，其中超纯DsbA参考标准包含至少约95％的单体DsbA多肽。
74.根据权利要求72或73的方法，其中通过权利要求1-33中任一项所述的方法制备超纯DsbA参考标准。
75.根据权利要求72-73中任一项的方法，其中免疫测定包括特异性结合超纯DsbA的抗体。
76.根据权利要求75的方法，其中特异性结合超纯DsbA的抗体是多克隆抗体。
77.根据权利要求75或76的方法，其中特异性结合超纯DsbA的抗体在免疫测定中用作捕获抗体。
78.根据权利要求75-77中任一项的方法，其中特异性结合超纯DsbA的抗体用作检测抗体。
79.根据权利要求78的方法，其中检测抗体与检测剂缀合。
80.根据权利要求75-79中任一项的方法，其中检测剂是辣根过氧化物酶。
81.根据权利要求75-80中任一项的方法，其中根据权利要求40-42中任一项的方法制备特异性结合DsbA的抗体。
82.根据权利要求72-81中任一项的方法，其中DsbA是大肠杆菌DsbA。
83.根据权利要求72-82中任一项的方法，其中在宿主细胞中制备重组多肽。
84.根据权利要求83的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌细胞。
85.根据权利要求83或84的方法，其中宿主细胞过表达DsbA。
86.根据权利要求72-85中任一项的方法，其中样品是细胞裂解物。
87.根据权利要求72-86中任一项的方法，其中样品是从重组多肽制品获得的，并且其中重组多肽制品已进行一个或多个色谱纯化步骤。
88.根据权利要求87的方法，其中重组多肽制品是最终纯化产物。
89.根据权利要求72-88中任一项的方法，其中重组多肽样品中所含的重组多肽是抗体或免疫黏附素。
90.根据权利要求89的方法，其中抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。
91.根据权利要求89或90的方法，其中重组多肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
92.一种用于检测样品中的DsbA的免疫测定方法，其中样品是从重组多肽制品或宿主细胞系获得的，所述方法包括：
(a)使结合DsbA的捕获抗体与样品接触，从而产生样品-捕获抗体组合材料；
(b)将结合DsbA的检测抗体与样品-捕获抗体组合材料接触；和
(c)检测与样品捕获-抗体组合材料结合的检测抗体。
93.根据权利要求92的方法，还包括使用标准滴定曲线定量检测抗体结合水平。
94.根据权利要求93的方法，还包括基于所结合的检测抗体的水平计算样品中存在的DsbA的量。
95.根据权利要求94的方法，其中通过将标准滴定曲线与用超纯DsbA组合物生成的标准滴定曲线进行比较来确定样品中存在的DsbA的量。
96.根据权利要求95的方法，其中超纯DsbA组合物包含至少约95％的单体DsbA多肽。
97.根据权利要求95或96的方法，其中组合物中的超纯DsbA通过权利要求1-33中任一项所述的方法制备。
98.根据权利要求92-97中任一项的方法，其中捕获抗体特异性结合超纯DsbA。
99.根据权利要求92-98中任一项的方法，其中检测抗体特异性结合超纯DsbA。
100.根据权利要求98或99的方法，其中特异性结合超纯DsbA的抗体是多克隆抗体。
101.根据权利要求92-100中任一项的方法，其中结合DsbA的检测抗体与辣根过氧化物酶缀合。
102.根据权利要求92-101中任一项的方法，其中多克隆抗体是根据权利要求51-53中任一项所述的方法产生的。
103.根据权利要求92-102中任一项的方法，其中免疫测定是夹心测定。
104.根据权利要求103的方法，其中夹心测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。
105.根据权利要求92-104中任一项的方法，其中DsbA是大肠杆菌DsbA。
106.根据权利要求92-105中任一项的方法，其中重组多肽制品或宿主细胞系从大肠杆菌获得。
107.根据权利要求106的方法，其中宿主细胞系过表达DsbA。
108.根据权利要求92-107中任一项的方法，其中样品是细胞裂解物。
109.根据权利要求92-107中任一项的方法，其中样品是从重组多肽制品获得的，并且其中重组多肽制品已进行一个或多个色谱纯化步骤。
110.根据权利要求109的方法，其中重组多肽制品是最终纯化产物。
111.根据权利要求92-110中任一项的方法，其中重组多肽制品中所含的重组多肽是抗体或免疫黏附素。
112.根据权利要求111的方法，其中抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。
113.根据权利要求111或112的方法，其中重组多肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
114.一种用于包含从细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物的质量测定法，释放测定包括使药物组合物的样品进行权利要求92-113中任一项所述的免疫测定方法，其中组合物中检测的DsbA的量确定药物组合物是否适合于施用给动物。
115.根据权利要求114的质量测定法，其中药物组合物中DsbA的量小于约1ppm表明所述药物组合物适于施用给动物。
116.根据权利要求114或115中任一项的质量测定法，其中细菌细胞是大肠杆菌细胞。
117.根据权利要求114-116中任一项的质量测定法，其中细菌细胞过表达DsbA。
118.根据权利要求114-117中任一项的质量测定法，其中样品是细胞裂解物。
119.根据权利要求114-118中任一项的质量测定法，其中样品是从重组多肽制品获得的，并且其中重组多肽制品已进行一个或多个色谱纯化步骤。
120.根据权利要求119的质量测定法，其中重组多肽制品是最终纯化产物。
121.根据权利要求114-120中任一项的质量测定法，其中重组多肽制品中所含的重组多肽是抗体或免疫黏附素。
122.根据权利要求121的质量测定法，其中抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。
123.根据权利要求122的质量测定法，其中重组多肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
124.一种从包含DsbC多肽的细胞裂解物中纯化DsbC多肽的方法，所述方法包括：
a)将聚乙烯亚胺(PEI)加入至包含DsbC多肽的细胞裂解物中，至终浓度约0.01％至约1.0％，
b)通过离心来澄清细胞裂解物，
c)将包含DsbC多肽的澄清细胞裂解物施用于阴离子交换色谱材料，
d)从阴离子交换色谱材料洗脱DsbC多肽以产生包含DsbC多肽的阴离子交换洗脱物，
e)将包含DsbC多肽的阴离子交换洗脱物施用于疏水相互作用色谱(HIC)材料，
f)从HIC材料洗脱DsbC多肽以产生HIC洗脱物，
g)将包含DsbC多肽的HIC洗脱物施用于尺寸排阻色谱，
h)从包含纯化的DsbC多肽的尺寸排阻色谱收集级分。
125.根据权利要求124的方法，其中包含DsbC多肽的细胞裂解物在阴离子交换色谱之前保持在PEI中至少约16小时。
126.根据权利要求124或125的方法，其中裂解物中的PEI的最终浓度为约0.1％。
127.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中包含DsbC多肽和PEI的裂解物的pH为约7.0。
128.根据权利要求124-127中任一项的方法，其中阴离子交换色谱材料是弱阴离子交换剂。
129.根据权利要求128的方法，其中弱阴离子交换剂包含季胺。
130.根据权利要求128或129的方法，其中季胺与交联的琼脂糖连接。
131.根据权利要求124-130中任一项的方法，其中使用盐梯度从阳离子色谱材料中洗脱DsbC。
132.根据权利要求131的方法，其中盐梯度是线性梯度。
133.根据权利要求132的方法，其中阴离子交换材料在10mM MOPS中洗涤。
134.根据权利要求133的方法，其中盐梯度是15个柱体积以上的约0％至约60％的10mMMOPS和250mM NaCl的梯度。
135.根据权利要求124-134中任一项的方法，其中将步骤b)的包含DsbC多肽的澄清裂解物在阴离子交换色谱之前通过0.22μm过滤器。
136.根据权利要求124-135中任一项的方法，其中将步骤b)的包含DsbC多肽的澄清裂解物在阴离子交换色谱之前调节至pH约8.0。
137.根据权利要求124至136中任一项的方法，其中阴离子交换洗脱物以级分收集。
138.根据权利要求137的方法，其中在疏水相互作用色谱之前通过尺寸排阻色谱分析级分。
139.根据权利要求138的方法，其中选择包含至少约25％DsbC的级分用于进一步纯化。
140.根据权利要求124-139中任一项的方法，其中HIC材料包含苯基部分。
141.根据权利要求140的方法，其中苯基部分与交联的琼脂糖连接。
142.根据权利要求124-141中任一项的方法，其中阴离子交换洗脱物在HIC色谱之前调理为含有约0.54M硫酸钠和约50mM PO4，约pH 7。
143.根据权利要求124-142中任一项的方法，其中使用水从HIC材料中洗脱DsbC。
144.根据权利要求140-143中任一项的方法，其中HIC洗脱物以级分收集。
145.根据权利要求144的方法，其中合并包含DsbC的级分。
146.根据权利要求124-145中任一项的方法，其中尺寸排阻色谱材料包含交联的琼脂糖和葡聚糖的球形复合物。
147.根据权利要求146中任一项的方法，其中尺寸排阻流通以级分收集。
148.根据权利要求146或147的方法，其中HIC洗脱物在尺寸排阻色谱之前被超滤。
149.根据权利要求146-148中任一项的方法，其中合并包含DsbC的级分。
150.根据权利要求124-149中任一项的方法，其中DsbC多肽是大肠杆菌DsbC多肽。
151.根据权利要求150的方法，其中DsbC多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
152.根据权利要求151的方法，其中DsbC多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少约80％相同。
153.根据权利要求124至152中任一项的方法，其中DsbC在细胞中表达。
154.根据权利要求153的方法，其中细胞是原核细胞。
155.根据权利要求153或154的方法，其中细胞是大肠杆菌细胞。
156.根据权利要求153-155中任一项的方法，其中细胞被改造，以比DsbC的内源表达更高的水平表达DsbC。
157.根据权利要求124-156中任一项的方法，其中细胞使用微流化器裂解。
158.一种组合物，包含通过权利要求124-157中任一项所述的方法纯化的DsbC多肽。
159.一种包含纯化的DsbC多肽的组合物，其中组合物包含至少约95％的单体DsbC多肽。
160.根据权利要求159的组合物，其中组合物包含小于约2％的低分子量物质。
161.根据权利要求159或160的组合物，其中组合物包含小于约1％的高分子量物质。
162.根据权利要求159-161中任一项的组合物，其中通过尺寸排阻色谱法检测单体DsbC多肽的百分比。
163.根据权利要求159的组合物，其中组合物包含小于约5％的杂质。
164.根据权利要求163的组合物，其中杂质是相对于天然DsbC的高分子量和/或低分子量多肽物质。
165.根据权利要求163或164的组合物，其中杂质是大肠杆菌蛋白(ECP)、DsbA的聚集体、DsbC的片段、核酸或细胞培养基组分中的一种或多种。
166.根据权利要求162-165中任一项的组合物，其中DsbC对于一个或多个冻融循环是稳定的。
167.根据权利要求166的组合物，其中DsbC对于三个冻融循环是稳定的。
168.根据权利要求158-161或163-167中任一项的组合物，其中通过色谱法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳或Western印迹分析中的一种或多种测量组合物中DsbC多肽的纯度。
169.根据权利要求158-168中任一项的组合物，其中通过高效液相色谱(HPLC)测量组合物中DsbC多肽的纯度。
170.根据权利要求158-169中任一项的组合物，其中通过尺寸排阻色谱法(SEC)测量组合物中DsbC多肽的纯度。
171.根据权利要求158-161或163-168中任一项的组合物，其中通过使用荧光蛋白染色或银染色的SDS凝胶电泳测量组合物中DsbC多肽的纯度。
172.根据权利要求171的组合物，其中组合物中非DsbC多肽的存在通过由凝胶电泳鉴定的与抗DsbC抗体无免疫反应的物质的存在来鉴定，该与抗DsbC抗体无免疫反应是通过Western印迹分析显示的。
173.根据权利要求172的组合物，其中组合物中DsbC多肽的聚集体的存在通过Western印迹分析的具有分子量大于天然DsbC的物质的存在来鉴定。
174.一种用于产生特异性结合DsbC的抗体的方法，包括将动物暴露于权利要求158-173中任一项所述的组合物。
175.根据权利要求174的方法，还包括从动物收集血清，其中血清包含特异性结合DsbC的抗体。
176.根据权利要求175的方法，其中血清包含特异性结合DsbC的多克隆抗体。
177.根据权利要求175或176的方法，其中从血清中分离出一种或多种单克隆抗体。
178.根据权利要求174-177中任一项的方法，其中动物是山羊、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、驴或鸡。
179.一种纯化特异性结合DsbC的抗体的方法，包括将包含抗DsbC抗体的组合物与包含结合支持材料的超纯DsbC的色谱材料接触，洗涤色谱材料以除去未结合的化合物和洗脱抗DsbC抗体。
180.根据权利要求179的方法，其中超纯DsbC包含至少约95％的单体DsbC多肽。
181.根据权利要求179或180的方法，其中通过权利要求66-99中任一项所述的方法制备超纯DsbC。
182.根据权利要求179-181中任一项的方法，其中抗体是多克隆抗体。
183.根据权利要求179-182中任一项的方法，其中根据权利要求174-176中任一项的方法制备抗体。
184.根据权利要求183的方法，其中少于约1％的抗体特异性结合非DsbC化合物。
185.一种包含特异性结合DsbC的多克隆抗体的组合物，其中通过将动物暴露于权利要求158-173中任一项所述的组合物而产生多克隆抗体。
186.根据权利要求185的组合物，其中从动物血清中收集多克隆抗体。
187.一种包含特异性结合DsbC的单克隆抗体的组合物，其中通过将动物暴露于权利要求158-173中任一项所述的组合物而产生单克隆抗体。
188.根据权利要求185-187中任一项的组合物，其中抗体通过权利要求179-184中任一项的方法纯化。
189.根据权利要求185-187中任一项的组合物，其中动物是山羊、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、驴或鸡。
190.一种用于定量样品中的DsbA的方法，包括使用检测***检测样品中的DsbC，并将样品中检测到的DsbC的量与超纯DsbC参考标准的一种或多种浓度的检测进行比较。
191.根据权利要求190的方法，其中超纯DsbC参考标准包含至少约95％的单体DsbC多肽。
192.根据权利要求190或191的方法，其中通过权利要求124-157中任一项所述的方法制备超纯DsbC参考标准。
193.根据权利要求190-192中任一项的方法，其中检测***是免疫测定。
194.根据权利要求193的方法，其中免疫测定包括特异性结合超纯DsbC的抗体。
195.一种用于分析重组多肽样品中DsbC的存在和/或量的方法，包括使用免疫测定检测样品中的DsbC并将样品中检测到的DsbC的量与超纯DsbC参考标准的一种或多种浓度的检测进行比较。
196.根据权利要求195的方法，其中超纯DsbC参考标准包含至少约95％的单体DsbC多肽。
197.根据权利要求195或196的方法，其中通过权利要求124-157中任一项所述的方法制备超纯DsbC参考标准。
198.根据权利要求195-197中任一项的方法，其中免疫测定包括特异性结合超纯DsbC的抗体。
199.根据权利要求198的方法，其中特异性结合超纯DsbC的抗体是多克隆抗体，
200.根据权利要求198或199的方法，其中特异性结合超纯DsbC的抗体在免疫测定中用作捕获抗体。
201.根据权利要求198-200中任一项的方法，其中特异性结合超纯DsbC的抗体用作检测抗体。
202.根据权利要求201的方法，其中检测抗体与检测剂缀合。
203.根据权利要求198-202中任一项的方法，其中检测剂是辣根过氧化物酶。
204.根据权利要求198-203中任一项的方法，其中根据权利要求106-108中任一项的方法制备特异性结合DsbC的抗体。
205.根据权利要求195-204中任一项的方法，其中DsbC是大肠杆菌DsbC。
206.根据权利要求195-205中任一项的方法，其中在宿主细胞中制备重组多肽。
207.根据权利要求206的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌细胞。
208.根据权利要求206或207的方法，其中宿主细胞过表达DsbC。
209.根据权利要求195-208中任一项的方法，其中样品是细胞裂解物。
210.根据权利要求195-209中任一项的方法，其中样品是从重组多肽制品获得的，并且其中重组多肽制品已进行一个或多个色谱纯化步骤。
211.根据权利要求210的方法，其中重组多肽制品是最终纯化产物。
212.根据权利要求195-211中任一项的方法，其中重组多肽样品中所含的重组多肽是抗体或免疫黏附素。
213.根据权利要求212的方法，其中抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。
214.根据权利要求212或213的方法，其中重组多肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
215.一种用于检测样品中的DsbC的免疫测定方法，其中样品是从重组多肽制品或宿主细胞系获得的，所述方法包括：
(a)将结合DsbC的捕获抗体与样品接触，从而产生样品-捕获抗体组合材料；
(b)将结合DsbC的检测抗体与样品-捕获抗体组合材料接触；和
(c)检测与样品-捕获抗体组合材料结合的抗体。
216.根据权利要求215的方法，还包括使用标准滴定曲线定量所结合的检测抗体的水平。
217.根据权利要求216的方法，还包括基于所结合的检测抗体的水平计算样品中存在的DsbC的量。
218.根据权利要求217的方法，其中通过将标准滴定曲线与用超纯DsbC组合物生成的标准滴定曲线进行比较来确定样品中存在的DsbC的量。
219.根据权利要求218的方法，其中超纯DsbC组合物包含至少约95％的单体DsbC多肽。
220.根据权利要求218或219的方法，其中通过权利要求66-99中任一项所述的方法制备组合物中的超纯DsbC。
221.根据权利要求215-220中任一项的方法，其中捕获抗体特异性结合超纯DsbC。
222.根据权利要求215-221中任一项的方法，其中检测抗体特异性结合超纯DsbC。
223.根据权利要求221或222的方法，其中特异性结合超纯DsbC的抗体是多克隆抗体。
224.根据权利要求215-217中任一项的方法，其中结合DsbC的第二检测抗体与辣根过氧化物酶缀合。
225.根据权利要求215-224中任一项的方法，其中多克隆抗体是根据权利要求174-176中任一项所述的方法产生的。
226.根据权利要求215-225中任一项的方法，其中免疫测定是夹心测定。
227.根据权利要求226的方法，其中夹心测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。
228.根据权利要求215-227中任一项的方法，其中DsbC是大肠杆菌DsbC。
229.根据权利要求215-228中任一项的方法，其中重组多肽制品或宿主细胞系从大肠杆菌获得。
230.根据权利要求219的方法，其中宿主细胞系过表达DsbA。
231.根据权利要求215-230中任一项的方法，其中样品是细胞裂解物。
232.根据权利要求215-231中任一项的方法，其中样品是从重组多肽制品获得的，并且其中重组多肽制品已进行一个或多个色谱纯化步骤。
233.根据权利要求232的方法，其中重组多肽制品是最终纯化产物。
234.根据权利要求215-233中任一项的方法，其中重组多肽制品中所含的重组多肽是抗体或免疫黏附素。
235.根据权利要求234的方法，其中抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。
236.根据权利要求234或235的方法，其中重组多肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
237.一种包含从细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物的质量测定法，包括使药物组合物的样品进行权利要求49-56中任一项所述的免疫测定方法，其中在免疫测定中DsbC的检测表示药物组合物不适合用于对动物的治疗施用。
238.根据权利要求237的质量测定法，其中DsbC在药物组合物中的量小于约1ppm表示所述药物组合物适合于施用给动物。
239.根据权利要求237或238中任一项的质量测定法，其中细菌细胞是大肠杆菌细胞。
240.根据权利要求237-239中任一项的质量测定法，其中细菌细胞过表达DsbC。
241.根据权利要求237-240中任一项的质量测定法，其中样品是细胞裂解物。
242.根据权利要求237-241中任一项的质量测定法，其中样品是从重组多肽制品获得的，并且其中重组多肽制品已进行一个或多个色谱纯化步骤。
243.根据权利要求242的质量测定法，其中重组多肽制品是最终纯化产物。
244.根据权利要求237-243中任一项的质量测定法，其中重组多肽制品中所含的重组多肽是抗体或免疫黏附素。
245.根据权利要求244的质量测定法，其中抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。
246.根据权利要求245的质量测定法，其中重组多肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
247.一种用于检测在包含从细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物中的DsbA的试剂盒，所述试剂盒包含通过权利要求51-55中任一项所述的方法制备的抗DsbA抗体或权利要求56-61中任一项的抗DsbA抗体的组合物。
248.根据权利要求247的试剂盒，其中试剂盒还包含超纯DsbA，用作产生用于定量样品中DsbA的标准曲线中的参考标准和/或用作阳性对照。
249.根据权利要求248的试剂盒，其中超纯DsbA是根据权利要求1-33中任一项的方法制备的。
250.一种用于检测在包含从细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物中的DsbC的试剂盒，所述试剂盒包含通过权利要求174-178中任一项所述的方法制备的抗DsbC抗体或权利要求185-189中任一项的抗DsbC抗体的组合物。
251.根据权利要求250的试剂盒，其中试剂盒还包含超纯DsbC，用作产生用于定量样品中DsbC的标准曲线中的参考标准和/或用作阳性对照。
252.根据权利要求251的试剂盒，其中根据权利要求124-157中任一项所述的方法制备超纯DsbC。
253.一种用于检测在包含从细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物中的DsbA和DsbC的试剂盒，所述试剂盒包含a)通过权利要求51-55中任一项所述的方法制备的抗DsbA抗体或权利要求56-61中任一项的抗-DsbA抗体的组合物；和b)通过权利要求174-178中任一项所述的方法制备的抗DsbC抗体或权利要求185-189中任一项的抗DsbC抗体的组合物。
254.根据权利要求253的试剂盒，其中试剂盒还包含超纯DsbA和超纯DsbC，用作产生用于定量样品中DsbA和/或DsbC的标准曲线中的参考标准和/或用作阳性对照。
255.根据权利要求254的试剂盒，其中根据权利要求1-33中任一项的方法制备超纯DsbA和/或根据权利要求124-157中任一项的方法制备超纯DsbC。
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