CN107523627B - 一种检测急性肝胰腺坏死病病原的lamp试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP引物组，由外引物、内引物和环引物组成，外引物的序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示，内引物的序列如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示，环引物的序列如SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。本发明还公开了一种检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP试剂盒，该试剂盒包含上述检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP引物组，还包括DNA聚合酶，2×反应缓冲液，荧光染料，密封液，标准阳性模板和阴性对照。本发明提供的试剂盒可直接从复杂样品中检测急性肝胰腺坏死病病原，具有特异性强、灵敏度高、实验重复性好、操作便捷快速的优点，不需要昂贵仪器即可完成检测，可用于急性肝胰腺坏死病病原的现场快速、准确检测。

Description

一种检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP试剂盒

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体地，涉及一种检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP试剂盒。

背景技术

南美白对虾早期死亡综合征(EarlyMortality Syndrome，EMS)在泰国被定义为急性肝胰腺坏死病(Acute HepatopancreaticNecrosis disease，AHPND)。从2009年被发现开始，急性肝胰腺坏死病(AHPND)已经在全球范围内爆发。但在早期这种情况往往被养殖户认为是苗种质量问题而并未引起重视。该病一般在投苗20至30天后，疾病迅速扩散，死亡率显著上升。发病后，对虾通常表现出：昏睡、厌食、生长缓慢、颜色苍白、软壳等症状。由急性肝胰腺坏死病引起的对虾死亡率可高达100%，对养虾业危害极大，2011年上半年，海南、福建、广东和广西部分地区的死亡损失高达80%。国际粮农组织FAO的2011年统计结果显示，马来西亚南美白对虾和斑节对虾产量总产量由2010年的70000吨下降至40000吨，该疾病的区域危害程度已经超过了白斑综合症。在越南，2011年6月，斑节对虾养殖业遭受空前的损失，其中茶荣省6200公顷养殖面积遭受毁灭性打击，死亡的对虾总数约为3.3亿尾，直接经济损失120亿越盾（合计约380万人民币）；朔庄省20000公顷养殖面积受灾，经济损失15000亿越盾（约4.7亿人民币）。

研究资料表明，AHPND的病原为一种携带致病质粒PVA1的急性肝胰腺坏死病病原特异菌株。该PVA1质粒携带了两个编码毒素蛋白基因，分别编码PirA和PirB毒素蛋白。PirA和PirB毒素蛋白能够引起对虾肝胰腺坏死，从而发生AHPND病。目前已有针对PVA1质粒或PirA和PirB毒素蛋白的普通PCR检测方法，但是此类方法对于设备以及人员要求高，成本也高居不下，很难大范围推广。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种新型等温核酸扩增方法，在传统PCR技术的技术上进行了改进，设计了4条或6条不同的特异性引物针对靶基因的6个或8个位点，在一种链置换活性DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，实现DNA在恒温条件（65℃左右）下的快速扩增，在1h内能达到10⁹～10¹⁰靶序列拷贝。该方法操作简单，检测快速、灵敏度高，且特异性强，不需要昂贵仪器即可完成检测，已在临场疾病的诊断、流行性细菌或病毒的定性定量检测、动物胚胎性别鉴定及基因芯片开发等领域得到广泛应用。目前尚未见现有技术中将LAMP技术应用于急性肝胰腺坏死病病原AP2基因的检测中。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一组检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP引物。

本发明的另一个目的是提供一种检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP试剂盒，该试剂盒可直接从基质复杂（指食品安全检测中，背景基质对检测指标存在干扰，通常指宿主基因组核酸对检测靶标的干扰）的样品中检测急性肝胰腺坏死病病原，具有特异性强、灵敏度高、实验重复性好、操作便捷快速的优点。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一组检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP引物组，由外引物、内引物和环引物组成，外引物的序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示，内引物的序列如SEQ ID NO:3～SEQ IDNO:4所示，环引物的序列如SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。

所述LAMP引物组是针对急性肝胰腺坏死病病原AP2基因设计的特异性引物组，由一对外引物F3（SEQ ID NO:1）、B3（SEQ ID NO:2），一对内引物FIP（SEQ ID NO:3）、BIP（SEQID NO:4）和一对环引物 LF（SEQ ID NO:5）、LB（SEQ ID NO:6）组成。

一种检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP试剂盒，包含如上所述的检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP引物组。

所述试剂盒还包括DNA聚合酶，2×反应缓冲液，荧光染料，密封液，标准阳性模板和阴性对照。

优选地，所述试剂盒中引物组的外引物、内引物和环引物的摩尔比为1～2：4～8：2～4。

更优选地，所述试剂盒中引物组的外引物、内引物和环引物的摩尔比为1：4：2。

优选地，所述的2×反应缓冲液由buffer缓冲液、甜菜碱和dNTPs组成，buffer缓冲液、甜菜碱与dNTPs的体积比为10：8：7。

优选地，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，荧光染料为0.02mM SYTO-9，密封液为矿物油。

优选地，所述标准阳性模板为含有急性肝胰腺坏死病病原检测靶标基因AP2的质粒DNA，所述阴性对照为灭菌超纯水。

更优选地，所述试剂盒的反应体系的成分组成为：引物F3、B3、FIP、BIP、LF、LB在反应体系中的终浓度分别为0.2μM、0.2μM、0.8μM、0.8μM、0.4μM、0.4μM，2×反应液12.5μL，DNA聚合酶8U，0.02mM SYTO-9 0.5μL，待检样品2μL，加灭菌超纯水至25μL；

反应体系的反应条件为63℃反应45～60min，并在80℃持续2min。

优选地，所述试剂盒的检测方法包括以下步骤：

S1.待检样品的处理；

S2.DNA的制备；

S3.环介导等温扩增检测反应；

S4.检测结果判断。

本发明根据扩增曲线来判断检测结果。扩增曲线呈“S”形，检测结果为阳性，即检测样品中含有急性肝胰腺坏死病病原；无“S”形扩增曲线出现，检测结果为阴性，即检测样品不含有急性肝胰腺坏死病病原。

所述试剂盒在对虾急性肝胰腺坏死病病原检测中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）特异性好：本发明用于引物设计的AP2靶标基因是PVA1质粒的一段特异性片段，针对该目的片段设计六条特异引物进行扩增，特异性强，对对虾常见病毒，如传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）、对虾白斑综合症病（WSSV）、斑节对虾杆状病毒（MBV）、虾细菌性肝胰腺坏死病（NHPB）、对虾杆状病毒（BP）、副溶血弧菌DNA（不含PirA和PirB基因）不存在扩增。

（2）灵敏度高：对于含有急性肝胰腺坏死病病原检测靶标基因AP2的阳性质粒，最低检出限可达到10fg/μL；对实际阳性样本，最低检测限可达到1.12×10^-4ng/μL。

（3）实验重复性高：对阴性对照进行20次重复实验，引物没有扩增；对阳性对照（质粒浓度10pg/μL和1pg/μL）分别进行30次重复实验，Ct值变异系数≤5%；对实际阳性样本进行12次重复实验，扩增曲线均呈典型“S”型曲线。

（4）操作便捷：不需要使用昂贵、精密的设备，对仪器要求低，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较简单。

（5）鉴定简单：可直接从复杂样品中检测急性肝胰腺坏死病病原，通过观察扩增曲线直接判断阴阳性，不需要繁琐的电泳等其他任何分析步骤，适合现场快速、准确检测。

附图说明

图1为应用例1中LAMP法检测AHPND病原的阴性对照重复性结果示意图。

图2为应用例2中LAMP法检测AHPND病原的阳性对照灵敏度结果示意图。

图3为应用例3中LAMP法检测AHPND病原的阳性对照稳定性结果示意图。

图4为应用例4中LAMP法检测AHPND病原的实际样品结果示意图。

图5为应用例4中普通PCR检测AHPND病原的实际样品电泳结果示意图。

图6为应用例5中LAMP法检测AHPND病原的实际样品特异性结果示意图。

图7为应用例6中LAMP法检测AHPND病原的实际样品灵敏度结果示意图。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

一种检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP试剂盒，组成成分为：一组检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP引物组，DNA聚合酶，2×反应缓冲液，荧光染料，密封液，标准阳性模板和阴性对照。

所述检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP引物组，由外引物、内引物和环引物组成，是以急性肝胰腺坏死病病原质粒PAV1的AP2基因作为靶基因，采用引物设计软件PrimerExplorer 4.0设计包括环引物在内的6条LAMP引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，外引物的序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示，内引物的序列如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示，环引物的序列如SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。

所述外引物、内引物和环引物的摩尔比为1：4：2。

所述的2×反应缓冲液由buffer缓冲液、甜菜碱和dNTPs组成，各成分体积比为10：8：7。

所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，荧光染料为0.02mM SYTO-9，密封液为矿物油。

所述标准阳性模板为含有急性肝胰腺坏死病病原检测靶标基因AP2的质粒DNA，所述阴性对照为灭菌超纯水。

所述试剂盒的反应体系的成分组成为：引物F3、B3、FIP、BIP、LF、LB在反应体系中的终浓度分别为0.2μM、0.2μM、0.8μM、0.8μM、0.4μM、0.4μM，2×反应液12.5μL，DNA聚合酶8U，0.02mM SYTO-9 0.5μL，待检样品2μL，加灭菌超纯水至25μL；

反应体系的反应条件为63℃反应45～60min，并在80℃持续2min。

所述试剂盒的检测方法包括以下步骤：

S1.待检样品的处理；

S2.DNA的制备；

S3.环介导等温扩增检测反应；

S4.检测结果判断。

应用例1

实施例1所述的试剂盒检测AHPND病原的阴性对照重复性：

1、待检模板准备：阳性对照和阴性对照。

2、环介导等温扩增检测反应体系及条件：

25μL反应体系含有：引物F3、B3、FIP、BIP、LF、LB在反应体系中的终浓度分别为0.2μM、0.2μM、0.8μM、0.8μM、0.4μM、0.4μM，2×反应液12.5μL，DNA聚合酶8U，0.02mM SYTO-90.5μL，待检样品2μL，加灭菌超纯水至25μL。密封液加入体积为20μL。其中，阴性对照设置20次平行，阳性对照设置2次平行。

将配置好的PCR管混匀后离心，63℃反应45～60min，并在80℃持续2min。

3、检测结果判断：将上述反应管置于荧光PCR仪（BIO-RAD）中，根据扩增曲线来判断检测结果。扩增曲线呈“S”形，检测结果为阳性，即检测样品中含有急性肝胰腺坏死病病原；无“S”形扩增曲线出现，检测结果为阴性，即检测样品不含有急性肝胰腺坏死病病原。

如图1所示，结果表明：建立的检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP试剂盒中，阴性对照重复20次检测没有出现扩增。

应用例2

实施例1所述的试剂盒检测AHPND病原的阳性对照灵敏度：

将阳性对照质粒DNA进行10倍梯度稀释，分别以1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL七个梯度浓度DNA作为模板和阴性对照（灭菌超纯水）按照上述反应体系和条件建立检测方法，以确定试剂盒的灵敏度。

如图2所示，结果表明：将阳性质粒DNA进行10倍梯度稀释后，建立的检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP试剂盒可检测浓度为10fg/μL的阳性质粒DNA。

应用例3

实施例1所述的试剂盒检测AHPND病原的阳性对照稳定性：

以浓度为10pg/μL和1pg/μL的阳性质粒为模板DNA，各自设置30次平行，同时设置阴性对照（灭菌超纯水）按照上述反应体系和条件建立检测方法，以确定试剂盒的稳定性。

如图3所示，结果表明，建立的检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP试剂盒中，阳性质粒两个浓度重复30次进行检测实验，重复性良好，Ct值变异系数≤5%，证明该试剂盒稳定性良好。

应用例4

使用实施例1所述的试剂盒检测AHPND病原的实际样品，步骤如下：

1、待检样品的处理：取不同批次进境越南草虾活体肝胰腺组织2g放入10mL 3%APW（氯化钠碱性蛋白胨水）培养基中，37℃培养8～18 h进行增菌。

2、DNA的制备：采用水煮法从增菌液中提取DNA。

3、按照上述反应体系和反应条件对提取的DNA进行检测，同时设置阴性对照。

如图4所示，结果表明：对进境的越南对虾用建立的检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP试剂盒进行检测，样品呈现典型的“S”型曲线扩增，为阳性结果，证明样品中检出急性肝胰腺坏死病病原。

同时采用普通PCR检测AHPND病原的实际样品：

以对虾活体肝胰腺增菌液DNA为模板，使用引物AP3进行PCR扩增。其中，AP3引物包括上游引物F（SEQ ID NO:7）和下游引物R（SEQ ID NO:8）。

反应体系为：10×PCR buffer（Mg²⁺ Plus）2.5μL，AP3上下游引物（各10μmol/L）1μL，dNTP（10μmol/L）2μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，抽提的核酸模板5μL，加水补至25μL。

按照以下程序进行扩增：94℃ 5min，然后进行32次循环（94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 40s），72℃ 5min，4℃保温。将PCR产物进行凝胶电泳，与图4结果进行比较，以确定建立的检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP试剂盒检测结果的一致性。

如图5所示，结果表明：采用普通PCR法对实际样品进行检测，电泳结果显示检测样品在336bp处出现条带，与阳线对照条带大小一致，确定样品为含有AHPND病原的阳性样品，普通PCR结果与LAMP试剂盒检测结果一致。

应用例5

实施例1所述的试剂盒检测AHPND病原的实际样品特异性：

用应用例4的方法分别对含传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）、对虾白斑综合症病（WSSV）、斑节对虾杆状病毒（MBV）、虾细菌性肝胰腺坏死病（NHPB）、对虾杆状病毒（BP）、副溶血弧菌DNA（不含PirA和PirB基因）及AHPND病原的样品DNA进行检测。

如图6所示，结果表明，仅含AHPND病原的样品出现扩增曲线，其余样品没有扩增，显示建立的检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP试剂盒特异性良好。

应用例6

实施例1所述的试剂盒检测AHPND病原的实际阳性样品灵敏度：

对已知浓度的含AHPND病原的实际阳性样本DNA原液进行10倍梯度稀释，按照上述反应体系和条件进行检测，同时设置阴性对照，以确定该试剂盒对实际样品的检测灵敏度。如图7所示，结果表明，以起始浓度为1.12×10²ng/μL的阳性样本DNA进行梯度稀释，建立的检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP试剂盒对实际样本的检测灵敏度可达到浓度为1.12×10^-4ng/μL。

Claims (9)

1.一组检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP引物组，其特征在于，由外引物、内引物和环引物组成，外引物的序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示，内引物的序列如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示，环引物的序列如SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。

2.一种检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的检测急性肝胰腺坏死病病原的LAMP引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA聚合酶，2×反应缓冲液，荧光染料，密封液，标准阳性模板和阴性对照。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述外引物、内引物和环引物的摩尔比为1～2：4～8：2～4。

5.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述外引物、内引物和环引物的摩尔比为1：4：2。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的2×反应缓冲液由buffer缓冲液、甜菜碱和dNTPs组成，三者的体积比依次为10：8：7。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，荧光染料为0.02mM SYTO-9，密封液为矿物油。

8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述标准阳性模板为含有急性肝胰腺坏死病病原检测靶标基因AP2的质粒DNA，所述阴性对照为灭菌超纯水。

9.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系的成分组成为：引物F3、B3、FIP、BIP、LF、LB在反应体系中的终浓度分别为0.2μM、0.2μM、0.8μM、0.8μM、0.4μM、0.4μM，2×反应液12.5μL，DNA聚合酶8U，0.02mM SYTO-9 0.5μL，待检样品2μL，加灭菌超纯水至25μL；

反应体系的反应条件为63℃反应45～60min，并在80℃持续2min。

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