CN107523620A - 包含产ndm耐药菌的pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了包含blaNDM基因的耐药菌的PCR检测试剂盒及其应用，属于生物检测技术领域。本发明的检测用引物及探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑3所示；PCR检测试剂盒，包括荧光PCR检测混合液，所述检测混合液中含有前述的引物和探针。利用本发明的试剂盒和引物探针能快速检测出包括blaNDM1到blaNDM16共16种blaNDM高耐药基因的微生物，具有操作简便、灵敏度高、特异性好、准确度高等优点，能够及时发现和确诊可疑病例，提高对各类感染疾病的监测水平。

Description

包含产NDM耐药菌的PCR检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及包含blaNDM基因的耐药菌的PCR检测试剂盒及其应用，具体涉及一种能够同 时快速检测目前所有已知blaNDM基因型，包括blaNDM1到blaNDM16共16种blaNDM高耐药基因 的微生物的PCR引物、探针及试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术
NDM是新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase)的英文缩写，由英国著 名医学杂志《The Infectious Diseases》首次报道，英国卡迪福大学的蒂姆·沃尔什将该超级细 菌命名为“新德里金属蛋白酶”，由于携带该基因的细菌会产生一种特殊的β-内酰胺酶，且活 性部位为金属离子又首先在印度首都新德里出现所以得名：NDM。产NDM的细菌一般以大 肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主，这些细菌既可引起医院内感染，也有社区感染，包括尿路感 染、血流感染、肺炎、导管相关感染、伤口感染等。迄今，已经有blaNDM1到blaNDM16共16种高 耐药基因的微生物被发现。全球上市的近200种抗生素对这类新型超级细菌几乎束手无策。
到目前为止，临床对产blaNDM耐药菌的了解仍然主要是通过对标本进行选择性培养计数 菌落数后，再通过传统药敏试验和PCR扩增并与标准文库对比。随着分子生物学的发展以及 分子生物学技术在微生物的应用，特别是荧光PCR技术出现，由于其具有省时省力、敏感性 高、特异性强、操作简单快速等特点，且不受试验时间限制，而被广泛应用于临床诊断、疾 病研究和病原体检测等方面。然而，迄今使用PCR鉴别诊断blaNDM耐药菌的方法仍然非常复杂， 不仅耗时、费力，而且准确度并不比传统的药敏试验更佳，特别是，由于blaNDM耐药基因种 类繁多，迄今已经有16种耐药blaNDM被发现，现有的blaNDM耐药菌检测试剂盒都是只能够检测 单一的耐药基因，例如只能够检测blaNDM1耐药基因，导致确切一一鉴别这些不同blaNDM基因 型具有效率低、成本高的缺陷。
因此，寻找一种能有效鉴别产各种NDM的“超级细菌”的方法已经迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴别并诊断各种产blaNDM耐药菌的荧光PCR检测试剂盒及其 制备方法、检测方法，可用于检测并诊断产blaNDM耐药菌的感染，用于临床对可疑感染患者 进行病原学鉴别诊断。本发明的PCR引物、探针及试剂盒能够方便地检测目前已知的所有的 16种blaNDM耐药基因，不仅简便、快速、准确、灵敏，而且目前国内外尚未见类似的技术报 道。
本发明的第一个目的是提供一种针对各种产blaNDM基因耐药菌的检测引物，所述引物包 括序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的两条核苷酸序列。
在一种实施方式中，所述针对产blaNDM基因耐药菌的检测引物的组成如下：
上游引物：5’-GACCGCCCAGATCCTCAA-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物：5’-ATTGGCATAAGTCGCAATCC-3’(SEQ ID NO：2)。
本发明的第二个目的是提供一种包含blaNDM基因耐药菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒 中包括本发明的检测引物。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒中，还包括序列如SEQ ID NO：3所示探针。
在一种实施方式中，所述探针的一端标记有荧光报告基团，探针另一端标记有荧光淬灭 基团。
在一种实施方式中，所述探针的5’端包括荧光报告基团，3’端包括荧光淬灭基团。
在一种实施方式中，所述探针为5’-荧光报告基团-AGATCAACCTGCCGGTCGCG-荧光淬灭基团-3’(SEQ ID NO：3)。
在一种实施方式中，所述荧光报告基团为FAM、VIC、ROX、Cy5、JOE或者Quasar705荧光基团中的任意一种。
在一种实施方式中，所述荧光淬灭基团为BHQ或者ECLIPSE系列。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒中还包括普通PCR或者荧光PCR扩增用的PCRbuffer 和H2O。
在一种实施方式中，所述PCR buffer中含有优化的双阳离子缓冲液、dNTPS、PCR增强剂、 PCR稳定剂。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒中还包括PCR酶、阴性对照品及阳性对照品中的至 少一种。
在一种实施方式中，所述酶为DNA聚合酶，比如taq DNA聚合酶。
在一种实施方式中，所述阳性对照品为灭活或减毒阳性菌株的DNA或相应的对照质粒。
在一种实施方式中，所述阴性对照品为DEPC-H2O。
在一种实施方式中，所述检测试剂盒为荧光检测试剂盒，包括本发明的引物、探针、qPCR master mix、taq DNA聚合酶。优选地，还包括水或TE。
本发明的第三个目的是提供所述的检测引物在制备包含blaNDM基因的耐药菌检测试剂中 的应用。
本发明的第四个目的是包含blaNDM基因耐药菌的检测方法，是利用本发明的所述引物或 者检测试剂盒进行检测。
在一种实施方式中，所述耐药菌为以下任意一种或多种：鲍氏不动杆菌Acinetobacterbaumannii，产气肠杆菌Enterobacteraerogenes，阴沟肠杆菌Enterobactercloacae， 大肠杆菌Escherichiacoli，奥克西托克雷白杆菌KlebsiellaOxytoca，臭鼻克雷白氏杆菌 Klebsiellaozaenae，肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae，摩根(氏)菌Morganellamorganii， 奇异变形杆菌Proteusmirabilis，雷氏普罗威登斯菌Providenciarettgeri，铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa，粘质沙雷氏菌Serratiamarcescens，念珠菌Candidaspecies。
在一种实施方式中，所述检测方法，是采用荧光PCR进行检测。
在一种实施方式中，荧光PCR扩增体系包括(20μl体系)：8～12μl的qPCR mastermix(2X)、 一定浓度的引物和探针、0.1～1μl的taqDNA聚合酶、一定浓度的待测品、其余为水。
在一种实施方式中，荧光PCR扩增体系为：10μl的qPCR master mix(2X)，1μl的引物 探针混合液，0.3μl的taqDNA聚合酶，待检DNA模板5μl，加灭菌去离子水补足体积到20μl。
在一种实施方式中，荧光PCR扩增体系制备方法如下：取10μl的qPCR master mix(2X)， 与1μl的NDM引物探针混合液和3.7μl的H2O混合，再加入0.3μl的taqDNA聚合酶，取15μl上述 混合液加入5μl待测DNA样本，获得反应总体系为20μl的PCR反应液。
在一种实施方式中，所述PCR酶由0.3μl Taq酶(5U/μl)，无尿嘧啶-N-糖基化酶制成。
在一种实施方式中，所述的NDM引物探针混合液由等体积的10pmol/μl的NDM上游引物、 10pmol/μl的NDM下游引物和5pmol/μl探针组成。
在一种实施方式中，所述待测品为样本的DNA模板溶液、阳性对照品或阴性对照品(DEPC-H2O)。
在一种实施方式中，所述阳性对照品中，对照质粒可以单独包装也可以混合包装。
本发明针对鉴别并诊断产blaNDM基因耐药菌的荧光PCR检测的试剂盒所用的方法，采用的 是Taqman荧光定量PCR原理，分别针对blaNDM耐药基因设计特异性引物，扩增特异性核酸序 列，同时分别设计Taqman探针，并标记不同的荧光报告基团，并位于上下游引物之间。探针 5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。当探针完整的时候，报告基团所发射的 荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到 与模板结合的探针，其5’→3’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其 能量不能被吸收，即产生荧光信号。因此，本发明采用的荧光定量PCR技术具有实时检测、 定量和高通量检测等特点，且操作简便、灵敏度高、特异性好等优点。
使用本发明针对产blaNDM基因耐药菌的荧光PCR检测试剂盒检测时，其使用方法如下：
1)提取待测样本的DNA，获得DNA模板溶液；
2)加入本发明制备的检测混合溶液，制备反应体系；
3)PCR扩增并检测。
本发明针对鉴别并诊断产blaNDM耐药菌的荧光PCR检测的试剂盒所用的方法，采用的是 Taqman荧光定量PCR原理，分别针对blaNDM耐药基因设计特异性引物，扩增特异性核酸序列， 同时分别设计Taqman探针，并标记不同的荧光报告基团，并位于上下游引物之间。探针5’端 标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光 能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模 板结合的探针，其5’→3’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量 不能被吸收，即产生荧光信号。因此，本发明采用的荧光定量PCR技术具有实时检测、定量 和高通量检测等特点，且操作简便、灵敏度高、特异性好等优点。
使用本发明针对产blaNDM耐药菌的荧光PCR检测试剂盒检测时，其使用方法如下：
1)提取待测样本的DNA，得到DNA模板溶液；
2)加入本发明制备的检测混合溶液，制备反应体系；
3)PCR扩增并检测。
本发明PCR检测的待测样本来自ATCC定性清楚菌株、疾控中心(CDC)、本公司实验室 从获得的患者标本，包括，但不限于粪便、尿液、痰、血液、组织液、分泌物等获取的菌株。样本的核酸提取为现有细菌DNA提取技术，具体可根据取样方式不同，按各核酸提取说明书操作进行。
检测加样的方法为：每个反应取10μl的qPCR master mix(2X)与0.3μlTaq酶(Taq酶5U/μl)， 混合，再加入1μl的NDM引物探针混合液和3.7μlddH2O，振荡混匀数秒，3000rpm离心5秒，获 得混合液。取前述混合液15μl置于PCR管中，然后将5μl的DNA模板溶液、阳性对照品、或者 阴性对照品加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，立即进行PCR扩增反应。
本发明推荐的PCR扩增反应条件：
ABI7500fastdx仪器：95℃2min，(95℃15s，60℃30s)40个循环
博日9600plus仪器：94℃2min，(94℃10s，60℃40s)40个循环。
PCR反应阈值设定：阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线的最高点。
本发明荧光PCR质量控制：阴性对照品检测结果在Ct栏显示Undetermined(ABI7500)或 N/A(CFX96)或No Ct(SLAN)；阳性对照品检测结果应为：VIC通道Ct值均≤35(其它荧 光标记结果判断依据同VIC)，否则实验视为无效。具体见表1。
表1 试验结果的判断标准
若待检样本Ct值在38～40之间，需重复测定，如重复测定得到的Ct值仍在38～40之间， 则判为低于检测限，报告为阴性。
本发明最后公开了前述针对产blaNDM耐药菌的荧光PCR检测用引物及探针、前述产blaNDM耐药菌的荧光PCR检测试剂盒在制备和/或检测试剂中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的试剂盒及其应用大大缩短检测时间，操作简便。特异性引物和和探针的设计保 证了引物和探针的高度保守和特异性，避免了两对引物和探针之间无互补配对或交叉扩增的 情况。
附图说明
图1实施例8第一天的检测灵敏度的扩增曲线图；
图2实施例8第二天检测灵敏度的扩增曲线图；
图3实施例8第三天检测灵敏度的扩增曲线图；
图4实施例10的批内重复性的扩增曲线图；
图5实施例10的批间重复性第一天的扩增曲线图；
图6实施例10的批间重复性第二天的扩增曲线图；
图7实施例10的批间重复性第三天的扩增曲线图；
图8实施例11的线性度的扩增曲线图；
图9实施例11的检测革兰氏阴性菌株中blaNDM基因的线性度的标准曲线；
图10实施例12的特异性的扩增曲线图；
图11实施例13Cy3、JOE、ROX三种荧光标记对PCR的影响。
具体实施方案
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的保护范围。
实施例1
核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成1
在探针的5’标记FAM荧光基团，探针的3’标记BHQ1荧光基团。
合成针对产各种NDM耐药菌的PCR检测的引物、探针：
上游引物：5’-GACCGCCCAGATCCTCAA-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物：5’-ATTGGCATAAGTCGCAATCC-3’(SEQ ID NO：2)
探针：5’-FAM-AGATCAACCTGCCGGTCGCG-BHQ1-3’(SEQ ID NO：3)
实施例2
核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成2
在探针的5’标记VIC荧光基团，探针的3’标记BHQ1荧光基团。
合成针对产各种NDM耐药菌的PCR检测的引物、探针：
上游引物：5’-GACCGCCCAGATCCTCAA-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物：5’-ATTGGCATAAGTCGCAATCC-3’(SEQ ID NO：2)
探针：5’-VIC-AGATCAACCTGCCGGTCGCG-BHQ1-3’(SEQ ID NO：3)
实施例3
核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成3
在探针的5’标记ROX荧光基团，探针的3’标记BHQ2荧光基团。
合成针对产各种NDM耐药菌的PCR检测的引物、探针：
上游引物：5’-GACCGCCCAGATCCTCAA-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物：5’-ATTGGCATAAGTCGCAATCC-3’(SEQ ID NO：2)
探针：5’-ROX-AGATCAACCTGCCGGTCGCG–BHQ2-3’(SEQ ID NO：3)
实施例4
核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成4
在探针的5’标记Cy5荧光基团，探针的3’标记BHQ2荧光基团。
合成针对产各种NDM耐药菌的PCR检测的引物、探针：
上游引物：5’-GACCGCCCAGATCCTCAA-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物：5’-ATTGGCATAAGTCGCAATCC-3’(SEQ ID NO：2)
探针：5’-Cy5-AGATCAACCTGCCGGTCGCG–BHQ2-3’(SEQ ID NO：3)
实施例5
核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成5
在探针的5’标记Quasar705荧光基团，探针的3’标记BHQ3荧光基团。
合成针对产各种NDM耐药菌的PCR检测的引物、探针：
上游引物：5’-GACCGCCCAGATCCTCAA-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物：5’-ATTGGCATAAGTCGCAATCC-3’(SEQ ID NO：2)
探针：5’-Quasar705-AGATCAACCTGCCGGTCGCG–BHQ3-3’(SEQ ID NO：3)
实施例6
核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成6
在探针的5’标记JOE荧光基团，探针的3’标记DAB荧光基团。
合成针对产各种NDM耐药菌的PCR检测的引物、探针：
上游引物：5’-GACCGCCCAGATCCTCAA-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物：5’-ATTGGCATAAGTCGCAATCC-3’(SEQ ID NO：2)
探针：5’-JOE-AGATCAACCTGCCGGTCGCG–DAB-3’(SEQ ID NO：3)
实施例7
核酸测定试剂盒的制备及使用
1、核酸荧光PCR检测混合液的制备：
制备方法如下：配制10pmol/μl的上游引物、下游引物以及5pmol/μl的探针，再取等体积 的上述引物探针混匀制成一管引物探针混合液。取qPCR master mix(2X)10μl，与1μl的引物 探针混合液、0.3μl的taq DNA聚合酶、工艺用水3.7μl混合，获得体积为15μl的核酸荧光PCR 检测混合液。制备n×15μl核酸荧光PCR检测混合液(n为反应管数)。
2、加样
每支PCR管中取上述混合液15μl，然后向每支PCR管中再分别加入待测样品DNA制备液 5μl，盖好PCR管盖，立即进行PCR扩增反应。
3、PCR扩增
反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：
ABI7500fastdx仪器：95℃2min，(95℃15s，60℃30s)40个循环
博日9600plus仪器：94℃2min，(94℃10s，60℃40s)40个循环。
实施例8
核酸测定试剂盒的灵敏度分析
根据美国临床实验室标准化研究所的规程确定了本PCR检测灵敏度实验方案。
(1)制备一管106cfu/ml浓度的菌悬液：blaNDM基因采用菌株CDC88。
(2)将上述菌悬液逐级稀释成8个浓度梯度的稀释液，各稀释浓度分别见下表2。将稀 释浓度约100CFU/ml浓度的菌混合液液按照标准微生物学方法进行细菌计数。
(3)提取上述8个浓度梯度稀释液的菌混合液DNA，备用。
(4)实时PCR分析本实时PCR检测的灵敏度。每个稀释度三个重复，重复三天，故每个稀释度一共得到9个数据，利用SPSS统计软件版本22.0(95％阳性率水平)统计本实时PCR检测blaNDM基因的灵敏度，结果见下表2，三天检测灵敏度的扩增曲线见附图1，2和3。 通过SPSS软件分析，95％阳性率水平上本实时荧光定量PCR检测blaNDM基因的灵敏度为829CFU/mL，事实上，本试剂盒对60cfu/ml的极低浓度菌悬液的检出率已经高达三分之二，即67％。
表2 PCR对blaNDM灵敏度分析结果
实施例9
核酸测定试剂盒的精确度分析
根据美国临床实验室标准化研究所的规程确定了本PCR检测灵敏度实验方案。通过检测 以下类型的样本，对本实时PCR检测的准确性进行了评估，菌株的来源：
参考菌株从ATCC、CDC(n＝88)或者本实验室收集的患者样本(n＝200)，以及单个或多个 外添加目标基因的标本((n＝13)，共301株样本，其中包括283株革兰氏阴性菌株和5种念珠 菌，如下：
鲍氏不动杆菌Acinetobacterbaumannii(n＝17)，弗罗因德(氏)枸橼酸杆菌Citrobacterfreundii(n＝1)，产气肠杆菌Enterobacteraerogenes(n＝2)，阴沟肠杆菌Enterobactercloacae(n＝12)，大肠杆菌Escherichiacoli(n＝165)，催产克雷白(氏)杆菌KlebsiellaOxytoca(n＝1)，臭鼻克雷白氏杆菌Klebsiellaozaenae(n＝2)，肺炎克雷伯氏菌 Klebsiellapneumoniae(n＝55)，摩根(氏)菌Morganellamorganii(n＝1)，奇异变形杆菌 Proteusmirabilis(n＝1)，雷氏普罗威登斯菌Providenciarettgeri(n＝1)，绿浓杆菌Pseudomonasaeruginosa(n＝21)，灵杆菌Serratiamarcescens(n＝4)和念珠菌Candidaspecies(n＝5)。
从ATCC或CDC获得的菌株是否含有blaNDM基因，在菌株说明书中都有详细的说明；而对于临床菌株，采用Illumina MiSeq或HiSeq对菌株全基因组测序，再在全基因组序列的基础上，采用基因从头组装技术来确定临床菌株中是否含有blaNDM基因，301份样本中，其中确定的blaNDM阳性样本共39份。
提取这301份样本的DNA，采用本实时荧光定量PCR检测这301份样本blaNDM基因。结果见表3，其中39份阳性，本PCR对blaNDM基因的敏感性为100％，特异性为100％，总 体精度为100％。
表3 本PCR对blaNDM基因精确度的检测结果
实施例10
核酸测定试剂盒的重复性分析
1、批内重复性
以美国临床和实验室标准协会(CLSI)的定性分析方法为指南检测本PCR实验的批内重 复性。准备含blaNDM基因浓度为108cfu/ml菌悬液，制备高中低三个稀释度(稀释度分别为 107、105、103cfu/ml)的菌悬液提取DNA备用。实时PCR分析本实时PCR检测的批内重复性，每个稀释度每次三个重复，计算得到的三个Ct值的平均值和标准差(SD)，结果见表4，
扩增曲线见附图4。结果表明，本PCR检测blaNDM基因批内重复性达到了100％。
表4 本PCR检测blaNDM基因批内重复性结果
2、批间重复性
以美国临床和实验室标准协会(CLSI)的定性分析方法为指南检测本PCR实验的批间重 复性。准备含blaNDM基因的菌悬液，制备4个浓度的菌悬液提取DNA备用。每个浓度每次两个重复，连续做三天，则每个浓度得到6个数据。计算得到的6个Ct值的平均值和标准差(SD)。结果见表5，扩增曲线见附图5，6和7。结果表明，本PCR检测blaNDM基因批间 重复性为100％(24/24)。
表5 本PCR检测blaNDM基因批间重复性结果
实施例11
核酸测定试剂盒的线性分析
制备含blaNDM靶基因10cfu/ml到108cfu/ml的8个浓度的稀释液，提取各稀释液DNA备 用。运用本PCR检测对耐药基因blaNDM的线性度，线性度的扩增曲线见附图8，线性度的标准曲线见附图9。
如图8、9所示，本PCR对blaNDM基因的线性度检测结果跨度超过七个对数单位。
实施例12
本核酸测定试剂盒的特异性分析
为了研究本PCR的分析特异性，本实验分析了88株参考菌株的耐药性，其中包括了常 见的多重耐药革兰氏阴性菌，如鲍氏不动杆菌Acinetobacterbaumannii(n＝14)，产气肠杆菌 Enterobacteraerogenes(n＝2)，阴沟肠杆菌Enterobactercloacae(n＝9)，大肠杆菌 Escherichiacoli(n＝15)，奥克西托克雷白杆菌KlebsiellaOxytoca(n＝1)，臭鼻克雷白氏杆菌 Klebsiellaozaenae(n＝2)，肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae(n＝23)，摩根(氏)菌Morganellamorganii(n＝1)，奇异变形杆菌Proteusmirabilis(n＝1)，雷氏普罗威登斯菌 Providenciarettgeri(n＝1)，铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa(n＝12)，粘质沙雷氏菌 Serratiamarcescens(n＝2)，念珠菌Candidaspecies(n＝5)。
这88株菌株中，blaNDM阳性株为14株，其余为耐药基因阴性菌株。
提取这88份样本的DNA，研究本实时PCR的对blaNDM特异性，结果扩增曲线如附图10所示，阳性结果为14株，与已知的一致，其余为耐药基因阴性菌株，本PCR正确检测所 有的blaNDM靶基因，无交叉反应。
对于干扰物质的研究中，本实验采用了高水平的人类血红蛋白和粪便标本进行了分析， 均不会干扰本PCR检测。
实施例13
不同的荧光标记对荧光定量PCR的影响
将blaNDM的探针由VIC标记改为JOE、Cy3、ROX标记，利用浓度相同的菌悬液，提取DNA，比较者三种不同的荧光标记对荧光定量PCR的影响。扩增曲线如附图11所示。
从图中可以看出，三种荧光标记的PCR结果的敏感性和特异性都很好，Ct值相当，本试 剂盒的探针适合不同的荧光标记，均能得到较好的结果。
结论
本研究中的PCR同时检测包括blaNDM1到blaNDM16共16种blaNDM高耐药基因，具有良好的灵敏度、精确度和可重复性，这是目前其他的同类PCR试剂盒无法做到的。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京紫萌医药科技有限公司
<120> 包含blaNDM基因的耐药菌的PCR检测试剂盒及其应用
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
attggcataa gtcgcaatcc 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tggagcatgt ggtttaattc ga 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agatcaacct gccggtcgcg 20

Claims (10)

1.一种检测引物，其特征在于，所述引物包括序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的两条核苷酸序列。
2.一种包含blaNDM基因耐药菌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括权利要求1所述的检测引物。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括序列如SEQ ID NO：3所示的探针。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针的一端标记有荧光报告基团，探针另一端标记有荧光淬灭基团。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、VIC、ROX、Cy5、JOE或者Quasar705荧光基团中的任意一种；所述荧光淬灭基团为BHQ或者ECLIPSE系列。
6.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还含有PCR MIX和H2O。
7.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括PCR酶、阴性对照品及阳性对照品中的至少一种。
8.权利要求1所述的检测引物在制备包含blaNDM基因的耐药菌检测试剂中的应用。
9.一种包含blaNDM基因耐药菌的检测方法，其特征在于，是利用权利要求1所述的引物、权利要求2-7任一所述的检测试剂盒或者权利要求8所述的检测试剂进行检测。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述耐药菌为以下任意一种或多种：鲍氏不动杆菌Acinetobacterbaumannii，产气肠杆菌Enterobacteraerogenes，阴沟肠杆菌Enterobactercloacae，大肠杆菌Escherichiacoli，奥克西托克雷白杆菌KlebsiellaOxytoca，臭鼻克雷白氏杆菌Klebsiellaozaenae，肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae，摩根(氏)菌Morganellamorganii，奇异变形杆菌Proteusmirabilis，雷氏普罗威登斯菌Providenciarettgeri，铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa，粘质沙雷氏菌Serratiamarcescens，念珠菌Candidaspecies。
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