CN107510710A - 一种从甘草残渣中富集2型糖尿病靶点抑制剂的方法和医药用途 - Google Patents
一种从甘草残渣中富集2型糖尿病靶点抑制剂的方法和医药用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药技术领域，提供一种采用复合吸附纯化法，以大孔树脂为主(占50％以上)，辅以聚酰胺、MCI一种或两种以不同比例混合的复合吸附材料，从提取甘草酸后的甘草残渣中吸附、纯化和获取组分明确，结构清楚，有效物质含量高，活性好的甘草残渣总黄酮的方法及其在调节血糖，保护肝损伤、调节血脂、抑制肿瘤生长等方面的医药用途。本发明各种吸附材料组合设计合理，吸附纯化的工艺操作简便易行；溶剂使用安全、环保、经济。甘草残渣总黄酮对防治2型糖尿病的α‑葡萄糖苷酶和PTP1B两个重要的靶点具有明显的抑制作用，特别是对α‑葡萄糖苷酶的抑制作用强度比临床降血糖药物阿卡波糖高10倍以上。
Description
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，涉及一种采用复合吸附法从提取甘草酸后的甘草残渣中富集高纯度的2型糖尿病靶点抑制剂的富集方法和医药用途，具体涉及一种从乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草等不同种的甘草提取甘草酸后的甘草残渣中提取甘草总黄酮的方法及其在制备保健食品、食品添加剂、药品或药品原料方面的应用。
背景技术：
甘草，又名国老、灵通、甜草、美草、蜜草等，为豆科蝶形花亚科多年生草本植物，是一种常用的中药。迄今为止，从甘草的根和茎叶中共分离得到300多种黄酮类化合物及其衍生物，这些黄酮类化合物几乎涵盖了黄酮的大部分母核结构，尤以查耳酮、异黄酮、黄酮(醇)、二氢黄酮含量较多。甘草中的黄酮类化合物具有广泛的药理活性，包括降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌、保肝、对生殖***的作用、抗溃疡、抗心律失常、抗抑郁、保护皮肤等作用，此外，甘草作为甜味剂和抗氧化剂等添加剂广泛用于食品领域。
甘草残渣是甘草提取过甘草酸的残留物，含丰富的黄酮类物质，是一种宝贵的可再利用资源，具有广泛的使用前景和较高的经济价值。杨晓辉、张娟等人通过分离和化学方法鉴定了甘草残渣中的三萜类、黄酮类、糖苷类、氨基酸、有机酸、香豆素及萜类内酯、酚类等十余类有机成分，表明甘草残渣中有机成分与甘草中几乎一样，张娟等、杨琳等人通过HPLC对13个黄酮类化合物分析表明甘草残渣与甘草中黄酮类型相似，但含量存在差异，甘草残渣中甘草查耳酮AR的量高于原药材中甘草查耳酮A的量。高发奎等人用溶剂法和超临界CO2萃取技术用甘草残渣生产甘草浸膏，结果表明超临界萃取技术得到的甘草浸膏仪甘草酸、甘草黄酮为主要成分，气质联用仪鉴定了22种有机化合物，还对甘草残渣中氨基酸进行了研究，检测到18种氨基酸，含量在0.04-0.79％之间，其中有8种人体必需的氨基酸。
甘草黄酮类物质是甘草残渣中主要化学成分，采用紫外分光光度法以芦丁或甘草苷为对照品，采用超声辅助有机溶剂热回流法、复合酶法结合醇提法、微波辅助乙醇浸取、乙醇回流浸提法、闪式法、超声波法、微波法等多种方法对甘草残渣中的总黄酮进行了提取，以黄酮产率、含量或抑制活性为参数对提取溶剂、提取时间、提取温度、固液比、提取次数或酶量、pH等因素进行了考察，优化提取工艺。吴涛等人采用HPLC法以甘草查耳酮A为对照对建立了甘草残渣中黄酮的测定方法，为甘草黄酮含量测定以及相关产品的检验提供了参考。张晓萍用甘草残渣提取甘草总黄酮，考察了甘草黄酮胶囊的成型工艺、质量标准研究和稳定性试验，总黄酮提取率为4.2％，但甘草黄酮含量仅4.02％。李霞等、闵杰等采用HPLC法测定比较不同产地和不同提取方法甘草残渣中光甘草定的含量，结果表明其含量与产地、提取方法和提取溶剂紧密相关。
甘草黄酮的纯化方法包括最常用的纯化方法如醋酸乙酯萃取法、重结晶法、树脂法和其他一些纯化方法如超滤法和双水相体系法等。
徐清萍、石忠峰等人分别采用XAD-16、AB-8大孔树脂对甘草黄酮进行了最佳分离工艺考察，分别得到了55.10％和66.9％的甘草总黄酮。应雪等人通过甘草总黄酮的静态解析率等参数对D101、Hz-806、AB-8三种大孔吸附树脂进行了比较，结果表明AB-8型大孔树脂可以对甘草总黄酮进行有效的分离，纯度大于50％。廉宜君对D101、S-8、DML30、HPD-300、ADS-7、HPD-100和HPD450大孔树脂比较后发现HPD-300具有较好的吸附效果，纯化工艺为上样浓度2.0mg/mL，上样流速2ml/min，上样量2BV，以80％乙醇洗脱，洗脱流速1.5BV/h，洗脱量3BV，得到黄酮纯度提高2倍以上。吕子明通过对NKA-9，X-5，HPD500，XAD-8，HPD600，AB-8，HPD300，ZG300B，D101，S-8，D301，NKA-2等12种大孔树脂进行了比较，经过静态吸附和动态吸附考察选择AB-8对甘草黄酮的纯化，通过对上样浓度、上样量、吸附流速、pH等参数考察，确定最终纯化工艺，得到甘草总黄酮的纯度为38％，其中XAD-8价格昂贵不适合大规模应用。田彦芳等人采用熵权法对多目标筛选甘草黄酮进行了工艺考察，对12种大孔树脂D101，AB-8，NKA-9，HPD-100，HPD-300，HPD-400，HPD-500，HPD-772，ADS-7，ADS-17、X-5、D301等树脂以甘草苷、甘草素葡萄糖芹糖苷、芹糖异甘草苷、异甘草素葡萄糖芹糖苷、异甘草苷、新异甘草苷等6种黄酮的回收率进行了比较，发现经X-5和HPD-100型大孔树脂后目标产物质量分数较低，ADS-7型大孔树脂对6种黄酮具有较强的富集选择性，不吸附其它成分，所得6种总黄酮的质量分数为81.59％，但是对甘草中含量最大的成分甘草查耳酮A没有做分析。
以上为具有代表性的应用大孔树脂对甘草总黄酮类物质进行提取纯化的例子，其中大孔树脂包括了不同的型号，既有不同极性的，也有廉价和昂贵的，绝大部分的总黄酮类物质的含量达不到80％，即使得到了80％含量，但是对其中的大量成分如甘草查耳酮A没有进行比较说明，或组成成分不清楚。
姜红红等人通过对不同极性的树脂NKA-9、HPD-600、HPD-400、D-101、AB-8、HPD-300和聚酰胺等吸附材料进行吸附性能的比较后，采用有机试剂萃取结合吸附较好的聚酰胺树脂纯化甘草中的总黄酮，确定最佳的纯化工艺为先用石油醚和乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层浸膏水溶后过聚酰胺柱，上样pH为5，流速1ml/min，上样浓度为0.15g/ml，最后得到甘草总黄酮的纯度为90.12％。李俊松采用聚酰胺(60-100目)对甘草饮片中总黄酮进行了纯化，工艺条件为甘草：聚酰胺为2:1，树脂径高比为1：7，用5倍量柱体积70％乙醇洗脱，最后总固物中黄酮含量为45％。刘佳等人对30-60，60-80，80-100，100-200目规格的聚酰胺进行了吸附性能的比较，其中30-60目的规格吸附性能较好，甘草黄酮样品中总黄酮的浓度有3.087g/L提高到5.177g/L。
以上为具有代表性的应用聚酰胺对甘草总黄酮类物质进行提取纯化的例子，其中聚酰胺包括了不同的规格，从结果看大部分的达不到80％的要求，达到80％的纯度也是先采用了有机试剂萃取的步骤进行了萃取，有机试剂的应用不仅提高了成本，同时也造成了污染。
专利CN 102526177A采用大孔树脂对甘草中的水溶性和脂溶性黄酮进行了纯化，但是并没有提到纯化后黄酮的纯度。专利CN102204950A对甘草残渣醇提、稀释、过柱吸附、洗脱和浓缩等工艺提取总黄酮，但是该专利的大孔树脂型号确定为D101和AB-8。专利CN1752081A采用乙酸乙酯对甘草残渣进行提取，相对于乙醇试剂成本高，且对环境不利。专利CN1810796A对甘草或甘草残渣采用含有包括乙醇在内的两种或两种以上的有机试剂进行提取，且不经过柱层析纯化，纯度不确定。
综上所述，在对甘草残渣中总黄酮类物质进行提取和纯化时，大部分采用了除乙醇以外的其它有机试剂，对环境不利，含量不能确定，无法保证甘草总黄酮的纯度大于或等于80％，重要的是得到甘草总黄酮的单体成分组成不清晰，也未见有单体黄酮的含量和活性测定的数据，也就没有特定医药用途的表述。
发明内容：
本发明的目的是从乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草等不同种甘草提取甘草酸后的甘草残渣中提取甘草总黄酮类物质的方法。本发明所用各种吸附剂组合设计合理，纯化工艺先进，操作简便易行；溶剂使用安全、环保、经济。且提取纯化后甘草残渣总黄酮(LRTF)含量在总提取物中的含量等于或大于80％，包含甘草查尔酮A、B、C、D、E和甘草黄酮A、B、C，光甘草酮、光甘草定、甘草素、异甘草素等黄酮类化合物，含量占总黄酮的75％，经HPLC同步检测分析后，其中甘草查尔酮C、甘草查尔酮A、甘草查尔酮E、甘草查尔酮D、甘草黄酮A及甘草黄酮B总含量≥50％，LRTF物质组成基本明确。得到的LRTF具有保护肝损伤、调节血脂、抑制肿瘤生长等多种生物活性，在保健食品、食品添加剂、药品或药品原料方面可广泛应用。LRTF对防治2型糖尿病的α-葡萄糖苷酶和PTP1B两个重要的靶点具有明显的抑制作用，特别是对α-葡萄糖苷酶的抑制作用强度比临床降血糖药物阿卡波糖高10倍以上。
本发明是通过如下技术方案实现的：
(1)对甘草残渣进行粉碎后，以一定的乙醇浓度、料液比、在一定的加热回流温度下，提取1-5次；
甘草粉碎到一定程度即可，不可太碎。一定的乙醇浓度指40-90％(V/V)乙醇水，优选为60-80％(V/V)，料液比为1:5-1:50，加热回流的温度为60-90℃，提取时间为1-4h，提取次数为1-5次。
(2)合并提取液到一定的浓度，回收乙醇。一定浓度指甘草提取液浓度为0.1-5.0mg/mL。
(3)将提取液加入复合吸附材料中进行纯化，先用一定比例的乙醇水洗去杂质，然后提高乙醇的浓度进行洗脱，最后将洗脱液干燥即得LRTF。
所述的复合吸附材料以大孔树脂为主(占50％以上)，辅以聚酰胺、MCI中的一种或两种以不同比例混合而成。
当复合吸附材料为大孔树脂与聚酰胺、MCI中的一种混合使用时，其两者比例为：1:1～10:5，优选为5：1-10：1。
所述的复合吸附材料优选大孔树脂-聚酰胺组合或大孔树脂-MCI组合。
当复合吸附材料为大孔树脂与聚酰胺、MCI中的两种混合使用时，其三者的比例为：大孔树脂：聚酰胺：MCI＝10:3:2～5:2:2。
所述的乙醇的洗脱梯度为：20％～100％，优选为50-100％。
将步骤(3)中所述的提取液进行纯化，指的是提取液以0.1-5.0BV/h的流速过吸附树脂柱，完成上样后停留4-24h；用一定比例的乙醇水洗去杂质指的是用1-20BV 5-50％乙醇(优选20-50％乙醇)以0.1-5.0BV/h的流速进行除杂。提高乙醇的浓度进行洗脱是指经过除杂后用50-100％乙醇(优选60-90％乙醇)以0.1-5.0BV/h流速进行洗脱1-30个保留体积；所得到的洗脱液经过浓缩干燥后LRTF的纯度等于或大于80％。
通过HPLC-MS的离子碎片分析推测LRTF化学成分，经过多种色谱分离纯化并进行理化常数和光谱学鉴定，明确LRTF由甘草查尔酮A、B、C、D、E和甘草黄酮A、B、C，光甘草酮、光甘草定、甘草素、异甘草素等25个黄酮类化合物组成，并进行降血糖体外活性测试方面，特别是对α-葡萄糖苷酶和PTP1B两个重要的2型糖尿病靶点进行活性分析，其中甘草总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制能力比对照药阿卡波糖高出10倍以上。
大孔树脂吸附树脂是吸附性和分子筛原理相结合的分离材料，它的吸附性是由于范德华引力或产生氢键的结果，水溶性或大极性化合物会先流出，极性小的物质后洗出；聚酰胺吸附属于氢键吸附，极性与非极性物质均可适用，但特别适用于分离酚类等黄酮类化合物；MCI是一类聚合物基材填料，以吸附为主，同C18一样，同时MCI是凝胶的一种，主要是反相和分子筛的原理。黄酮类化合物含有酚羟基，易形成氢键，酚羟基的多少，决定了黄酮化合物的极性大小，且具有一定的酸性。本发明采用的复合吸附材料以大孔树脂为主，将分离物质中的大极性糖或其它杂质首先用水进行了纯化除去，少部分的残留的甘草酸和黄酮则被富集，之后用30％乙醇进行除去残甘草残渣中少部分的甘草酸，最后用高浓度的乙醇进行洗脱得到高纯度的LRTF，组合后的吸附材料工艺操作简便易行；溶剂使用安全、环保、经济，最终高效率、低成本地实现从提取甘草酸后的甘草残渣中富集高纯度的2型糖尿病靶点抑制剂，使其开发成为高附加值产品。所述的复合吸附材料以大孔树脂为主(占50％以上)，辅以聚酰胺、MCI一种或两种以不同比例混合而成。复合吸附材料的组成不同其作用原理也不相同，得到的总黄酮的成分也略有不同，但总黄酮的含量均在80％以上。
与其它方法相比本发明的优点十分明显：①提取和纯化过程所用复合吸附材料组合设计合理，纯化的工艺操作简便易行；溶剂使用安全、环保、经济。②采用了大孔树脂辅以其它吸附材料组成的复合吸附法，提取纯化后总黄酮的含量在总提取物中的含量大于或等于80％，甘草查耳酮A的在总提取物中的含量大于或等于10％。③总黄酮物质组成基本清楚，具有调节血糖，保护肝损伤、调节血脂、抑制肿瘤生长等方面等多种生物活性，在保健食品、食品添加剂、药品或药品原料方面均可广泛应用。在降血糖活性尤其是α-葡萄糖苷酶和PTP1B两个重要的2型糖尿病靶点具有明显的活性抑制作用，特别是甘草总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制能力比对照药阿卡波糖高出10倍以上。
附图说明：
图1为上样浓度的考察结果
图2为吸附流速的考察结果
图3为泄漏曲线
图4为除杂洗脱体积的考察结果
图5为洗脱浓度的考察结果
图6为洗脱体积的考察结果
图7为查尔酮A的抗炎活性测试结果
图8为甘草黄酮降血脂作用测试结果
图9为甘草总黄酮的抗肝纤维化测试结果。
具体实施方式：
实施例1：取甘草残渣适量，加入浓度为70％的乙醇，料液比1:30，在90℃提取2小时，提取3次，合并提取液，回收乙醇。使甘草浸膏溶液浓度为4.0mg/mL，然后以1BV/h的流速过大孔树脂：聚酰胺＝1:1吸附树脂柱，完成上样后停留12h，使其充分吸附，用5BV 50％乙醇以2BV/h的流速进行除杂，然后用80％乙醇以3BV/h流速进行洗脱15个保留体积，回收洗脱液，干燥，得到LRTF纯度占总提物含量为80％，甘草查尔酮A含量占总提物含量为10％。应用HPLC-MS进行离子碎片分析推测其化学成分，采用多种色谱分离纯化并进行理化常数和光谱学鉴定，明确其化合物组成，测定甘草查耳酮A的含量，并进行降血糖体外活性α-葡萄糖苷酶和PTP1B两个重要的靶点进行活性分析。
实施例2：
取甘草残渣适量，加入浓度为70％的乙醇，料液比1:30，在90℃提取2小时，提取3次，合并提取液，回收乙醇。使甘草浸膏溶液浓度为4.0mg/mL，然后以1BV/h的流速过大孔树脂：聚酰胺＝5:1吸附树脂柱，完成上样后停留12h，使其充分吸附，用5BV 50％乙醇以2BV/h的流速进行除杂，然后用80％乙醇以3BV/h流速进行洗脱15个保留体积，回收洗脱液，干燥，得到LRTF含量占总提取物含量为85％，甘草查尔酮A含量占总提物含量为12％。应用HPLC-MS进行离子碎片分析推测其化学成分，采用多种色谱分离纯化并进行理化常数和光谱学鉴定，明确其化合物组成，测定甘草查耳酮A的含量，并进行降血糖体外活性α-葡萄糖苷酶和PTP1B两个重要的靶点进行活性分析。
实施例3：
取甘草残渣适量，加入浓度为70％的乙醇，料液比1:30，在90℃提取2小时，提取3次，合并提取液，回收乙醇。使甘草浸膏溶液浓度为4.0mg/mL，然后以1BV/h的流速过大孔树脂：聚酰胺＝10:1吸附树脂柱，完成上样后停留12h，使其充分吸附，用5BV 50％乙醇以2BV/h的流速进行除杂，然后用80％乙醇以3BV/h流速进行洗脱15个保留体积，回收洗脱液，干燥，得到LRTF含量占总提物含量为90％，甘草查尔酮A含量占总提物含量为18％。应用HPLC-MS进行离子碎片分析推测其化学成分，采用多种色谱分离纯化并进行理化常数和光谱学鉴定，明确其化合物组成，测定甘草查耳酮A的含量，并进行降血糖体外活性测定与分析。
实施例4：
取甘草残渣适量，加入浓度为80％的乙醇，料液比1:40，在90℃提取3小时，提取3次，合并提取液，回收乙醇。使甘草浸膏溶液浓度为5.0mg/mL，然后以2BV/h的流速过大孔树脂：MCI＝1:1吸附树脂柱，完成上样后停留24h，使其充分吸附，用6BV 50％乙醇以4BV/h的流速进行除杂，然后用85％乙醇以5BV/h流速进行洗脱20个保留体积，回收洗脱液，干燥，得到LRTF含量占总提物含量为83％，查尔酮A含量占总提物含量为11％。应用HPLC-MS进行离子碎片分析推测其化学成分，采用多种色谱分离纯化并进行理化常数和光谱学鉴定，明确其化合物组成，测定甘草查耳酮A的含量，并对α-葡萄糖苷酶和PTP1B抑制活性进行测定和分析。
实施例5：
取甘草残渣适量，加入浓度为80％的乙醇，料液比1:40，在90℃提取3小时，提取3次，合并提取液，回收乙醇。使甘草浸膏溶液浓度为5.0mg/mL，然后以2BV/h的流速过大孔树脂：聚酰胺：MCI＝5:3:2吸附树脂柱，完成上样后停留24h，使其充分吸附，用6BV 50％乙醇以4BV/h的流速进行除杂，然后用85％乙醇以5BV/h流速进行洗脱20个保留体积，回收洗脱液，干燥，得到甘草总黄酮LRTF含量占总提物含量为83％，查尔酮A占总提物含量为14％。应用HPLC-MS进行离子碎片分析推测其化学成分，采用多种色谱分离纯化并进行理化常数和光谱学鉴定，明确其化合物组成，测定甘草查耳酮A的含量，并进行α-葡萄糖苷酶和PTP1B抑制活性测定和分析。
实施例6：
取甘草残渣适量，加入浓度为80％的乙醇，料液比1:40，在90℃提取3小时，提取3次，合并提取液，回收乙醇。使甘草浸膏溶液浓度为5.0mg/mL，然后以2BV/h的流速过大孔树脂：聚酰胺：MCI＝10:3:2吸附树脂柱，完成上样后停留24h，使其充分吸附，用6BV 50％乙醇以4BV/h的流速进行除杂，然后用85％乙醇以5BV/h流速进行洗脱20个保留体积，回收洗脱液，干燥，得到甘草总黄酮LRTF含量占总提物含量为87％，查尔酮A含量占总提物含量为15％。应用HPLC-MS进行离子碎片分析推测其化学成分，采用多种色谱分离纯化并进行理化常数和光谱学鉴定，明确其化合物组成，测定甘草查耳酮A的含量，并进行降血糖活性测定与分析。
实施例7：
取甘草残渣适量，加入浓度为60％的乙醇，料液比1:20，在90℃提取1小时，提取2次，合并提取液，回收乙醇。使甘草浸膏溶液浓度为3.0mg/mL，然后以0.5BV/h的流速过大孔树脂：MCI＝5:1吸附树脂柱，完成上样后停留6h，使其充分吸附，用3BV 20％乙醇以1BV/h的流速进行除杂，然后用60％乙醇以2BV/h流速进行洗脱10个保留体积，回收洗脱液，干燥，得到甘草总黄酮LRTF含量占总提物含量为83％，查尔酮A含量占总提物含量为14％。应用HPLC-MS进行离子碎片分析推测其化学成分，采用多种色谱分离纯化并进行理化常数和光谱学鉴定，明确其化合物组成，测定甘草查耳酮A的含量，并进行降血糖体外活性测定与分析。
实施例8：
取甘草残渣适量，加入浓度为80％的乙醇，料液比1:40，在90℃提取3小时，提取3次，合并提取液，回收乙醇。使甘草浸膏溶液浓度为5.0mg/mL，然后以2BV/h的流速过大孔树脂：聚酰胺：MCI＝5:2:2吸附树脂柱，完成上样后停留24h，使其充分吸附，用6BV 50％乙醇以4BV/h的流速进行除杂，然后用85％乙醇以5BV/h流速进行洗脱20个保留体积，回收洗脱液，干燥，得到甘草总黄酮LRTF含量占总提物含量为82％，查尔酮A含量占总提物含量为16％。应用HPLC-MS进行离子碎片分析推测其化学成分，采用多种色谱分离纯化并进行理化常数和光谱学鉴定，明确其化合物组成，测定甘草查耳酮A的含量，并进行降血糖体外活性测定和分析。
实施例9：
取甘草残渣适量，加入浓度为70％的乙醇，料液比1:25，在90℃提取3小时，提取3次，合并提取液，回收乙醇。使甘草浸膏溶液浓度为5.0mg/mL，然后以2BV/h的流速过大孔树脂：聚酰胺＝10:5吸附树脂柱，完成上样后停留24h，使其充分吸附，用6BV 50％乙醇以4BV/h的流速进行除杂，然后用85％乙醇以5BV/h流速进行洗脱20个保留体积，回收洗脱液，干燥，得到甘草总黄酮LRTF含量占总提物含量为81％，查尔酮A含量占总提物含量为13％。应用HPLC-MS进行离子碎片分析推测其化学成分，采用多种色谱分离纯化并进行理化常数和光谱学鉴定，明确其化合物组成，测定甘草查耳酮A的含量，并进行降血糖体外活性测定和分析。
实施例10：
取甘草残渣适量，加入浓度为70％的乙醇，料液比1:40，在90℃提取3小时，提取3次，合并提取液，回收乙醇。使甘草浸膏溶液浓度为5.0mg/mL，然后以2BV/h的流速过大孔树脂：MCI＝10:5吸附树脂柱，完成上样后停留24h，使其充分吸附，用6BV 50％乙醇以4BV/h的流速进行除杂，然后用85％乙醇以5BV/h流速进行洗脱18个保留体积，回收洗脱液，干燥，得到甘草总黄酮LRTF含量占总提物含量为83％，查尔酮A占总提物含量为15％。应用HPLC-MS进行离子碎片分析推测其化学成分，采用多种色谱分离纯化并进行理化常数和光谱学鉴定，明确其化合物组成，测定甘草查耳酮A的含量，并进行降血糖体外活性测定和分析。
以实施例1为例，实验结果如下：
上样浓度的考察
甘草浸膏溶液分别以4.0mg/mL，2.0mg/mL，0.5mg/mL的浓度通过HPD-100：聚酰胺＝1:1吸附树脂柱(600mm×15mm i.d.)，以1BV/h的流速进行动态吸附。流出液每3mL接收1份，当流出液浓度经检测大于原液的10％时停止上样，记录上样体积。结果见图1。
吸附流速考察
取甘草浸膏溶液以C＝4.0mg/mL过HPD-100：聚酰胺＝5:1吸附树脂柱，分别以0.5、1和2BV/h的流速进行动态吸附。流出液每3mL接收1份，当流出液浓度大于原液的10％时停止上样。结果见图2。
泄漏曲线的考察
取HPD-100：聚酰胺＝1:1吸附树脂柱(600mm×15mm i.d.)，湿法装柱，取甘草浸膏溶液浓度为4.0mg/mL的上样液适量，以1BV/h的流速上样，收集流出液，每3ml为1份，计算黄酮浓度比。结果见图3。
50％乙醇除杂洗脱体积考察
取甘草浸膏溶液C＝4.0mg/mL的溶液，以1BV/h的流速过HPD-100：聚酰胺＝1:1吸附树脂柱，完成上样后停留4h，待其充分吸附，后用足量50％乙醇洗脱，分段收集洗脱液(以1BV计)，计算结果见图4。
洗脱浓度的考察
取甘草浸膏溶液浓度为4.0mg/mL的上样溶液4份，每份42.0mL，分别以1BV/h的流速过HPD-100：聚酰胺＝1:1吸附树脂柱，完成上样后停留4h，使其充分吸附，用5BV 50％乙醇以2BV/h的流速进行除杂。分别60％、70％、80％和90％乙醇进行洗脱(流速3BV/h)，洗脱至流出液基本无颜色，收集洗脱液，将洗脱液减压干燥得固形物，用70％乙醇溶解并定容至250mL，测量吸光值。结果见图5。
洗脱体积的考察
取甘草浸膏溶液浓度为4.0mg/mL的上样液42.0mL，以1BV/h过HPD-100：聚酰胺＝1:1吸附树脂柱，完成上样后停留2h，使其充分吸附，用5BV50％乙醇以2BV/h的流速洗脱除杂，用80％乙醇以3BV/h的流速洗脱，每1BV洗脱液搜集1份，以洗脱体积(V/mL)为横坐标，黄酮浓度为纵坐标做图，结果见图6。
HPLC-MS分析
色谱柱：Agilent HC-C18(250mm×4.6mm,5μm,)，流动相：0.2％乙酸水(A)，甲醇(B)，检测波长：310nm，流速：1mL/min，柱温：25℃，进样量：10μL。0-10min，55％A；10-32min,55％-38％A；32-45min,38％-30％A；45-60min,30％-10％A。在此条件上采用甘草查尔酮C、甘草查而酮A、甘草查尔酮E、甘草查尔酮D、甘草黄酮A及甘草黄酮B为对照品进行分析，结果表明总含量≥50％。
α-葡萄糖苷酶和PTP1B靶点体外活性分析结果(α-葡萄糖苷酶阳性药为阿卡波糖，PTP1B的阳性药为钒酸钠)
实施例9：LRTF及其查尔酮A的抗炎活性
高纯度LRTF抗炎活性：采用LPS(100ng/mL)不同时间段对鼠主动脉内皮细胞进行刺激，使得细胞中VCAM-1,IL-6和COX-2高度表达，接着加入高纯度LRTF中重结晶得到的甘草查尔酮A(LA)测试其抗炎活性及抗粘附作用。在LPS刺激后的鼠主动脉内皮细胞中加入查尔酮A(LA)后，VCAM-1,IL-6的基因表达呈现剂量依赖性的减少趋势，同时查尔酮A抑制了COX-2的基因表达。查尔酮抗炎活性测试结果见图7。
实施例10：LRTF的降血脂活性
将ApoE-/-基因敲除小鼠分为模型组，高纯度LRTF高、中、低剂量组(120mg/kg/day,60mg/kg/day,30mg/kg/day)以及银杏叶阳性对照组，C57BL/6J小鼠作为空白对照组。每组10只小鼠，饲养一周后进行灌胃给药。试验结束后测定小鼠血清中TC，TG，HDL-C，LDL-C水平。
测定结果显示给予LRTF高剂量组小鼠血清中TC，TG，LDL-C水平较模型组明显降低，具有显著性差异。TG水平在低、中剂量组中明显低于模型组。HDL-C水平在3个剂量组中均明显增加。
LRTF降血脂作用测试结果如图8。
实施例11：LRTF及其查尔酮A的抗肿瘤活性
高纯度LRTF抗肿瘤活性研究：采用MTT法测试高纯度LRTF(50、100μg/mL)以及甘草查尔酮A(100、75、50、25、12.5μmol/L)对人***癌细胞PC-3、结肠癌细胞HT-29、乳腺癌细胞MCF-7、人子宫癌细胞Hela 4种细胞的抑制活性。结果表明，高纯度LRTF在浓度为50和100μg/mL，查尔酮A在50、75、100μmol/L均有很好的抑制癌细胞生长的作用，并且呈现剂量依赖性。测试结果如下：
实施例12：LRTF的抗肝纤维化作用
高纯度LRTF对小鼠肝纤维化的保护作用：将30只雄性昆明种小鼠随机分为3组：对照组、模型组以及甘草黄酮组。模型组和甘草黄酮组动物腹腔注射二甲基亚硝胺8mg/kg(2mL/kg)，对照组组腹腔注射同容量生理盐水，每周三次，给药三周。LRTF组灌胃给予高纯度甘草总黄酮悬浮液15mg/kg(0.1mL/10g)，对照组和模型组灌胃给予同容量生理盐水，从造模开始时同时给药，每天一次，连续给药6周。最后一次给药结束后禁食24h，门静脉取血，留取肝脏标本。静脉血离心取血清，肝脏标本根据不同的检测手段保存在不同的环境下，病理标本固定于10％***溶液中，进行HE染色。血液样本进行离心，取上清液，得到血清，测定各组血清中AST和ALT水平。
实验结果的到：与对照组相比，模型组动物血清中的ALT、ALT含量明显上升(P＜0.01)。与模型组相比，高纯度LRTF的动物血清中的AST、ALT含量均有所下降(P＜0.05)，表明高纯度LRTF具有改善二甲基亚硝胺引起的肝脏损伤的作用。
病理切片观察结果显示：对照组肝细胞排列整齐、有序，汇管区结构以及肝小叶结构正常。模型组肝细胞排列紊乱，有气球性样变，能够观察到明显的肝损伤。高纯度LRTF组肝细胞结构较模型组正常，有极少量的气球性样变。结果见图9。
。
Claims (10)
1.一种从甘草残渣中富集2型糖尿病靶点抑制剂的方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)对甘草残渣进行粉碎后，用乙醇加热回流提取1-5次；
(2)合并提取液到一定的浓度，回收乙醇；
(3)将提取液加入复合吸附材料中进行纯化，先用一定比例的乙醇水洗去杂质，然后提高乙醇的浓度进行洗脱，最后将洗脱液干燥即得甘草残渣总黄酮；
所述的复合吸附材料以大孔树脂为主，辅以聚酰胺、MCI中的一种或两种混合而成。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的乙醇浓度为体积比为40-90％的乙醇水，优选为60-80％(V/V)，料液比为1:5-1:50，加热回流的温度为60-90℃，提取时间为1-4h，提取次数为1-5次。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，复合吸附材料为大孔树脂与聚酰胺、MCI中的一种混合使用时，其两者比例为：1:1～10:5。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，复合吸附材料为大孔树脂与聚酰胺、MCI中的两种混合使用时，其三者的比例为：大孔树脂：聚酰胺：MCI＝10:3:2～5:2:2。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甘草为：乌拉尔甘草、光果甘草或胀果甘草。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的甘草提取液浓度为0.1-5.0mg/mL。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于,以0.1-5.0BV/h的流速过树脂柱，完成上样后停留4-24h，再用1-20BV 5-50％乙醇以0.1-5.0BV/h的流速进行除杂。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：经过除杂后用50-100％乙醇以0.1-5.0BV/h流速进行洗脱1-30个保留体积。
9.如权利要求1-8任何一项所述的方法，其特征在于：所得到的LRTF的纯度等于或大于80％，其中甘草查尔酮C、甘草查尔酮A、甘草查尔酮E、甘草查尔酮D、甘草黄酮A及甘草黄酮B总含量≥50％。
10.权利要求1-9任何一项所述的方法制备的甘草残渣总黄酮在制备降糖、降脂、抗肿瘤药物中的应用。
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