CN107509536A - 一种苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法。该方法包括如下步骤：(1)接穗的培养：选取大田中综合性状好且已结商品苦瓜的顶芽或侧芽为外植体，经过诱导、继代培养，自然光炼苗后，将获得的组培苗剪成带至少2个芽的茎段作为接穗；(2)砧木的培养：将丝瓜或南瓜种子播种于消毒后的基质中，待种子萌发后，将获得的幼苗作为砧木；(3)嫁接：将步骤(1)中得到的接穗嫁接到步骤(2)中获得的幼苗中，每天喷洒5％～8％(w/v)的蔗糖水直至接穗成活；(4)嫁接后管理：嫁接后置于小拱棚内进行培养，直至接穗发芽并长出2片新叶。本发明的试管外微嫁接方法周期短，费用低，占地少，成活率高，能大大缩短苦瓜育种年限和降低育种成本。

Description

一种苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术和农作物种植技术领域，特别涉及一种苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法。

背景技术

近年来，随着苦瓜在市场上的销量逐年增加，种植面积也在不断扩大，同时生产上也不可避免地进行重茬连作，从而导致苦瓜枯萎病和疫病等土传病害日趋严重。苦瓜嫁接栽培技术在生产上的应用，大大降低了栽培死亡率，从根本上克服了重茬连作障碍，有效地防止了枯萎病危害。

微嫁接是一种由组织培养的接穗与砧木进行嫁接的技术，它是植物组织培养与嫁接技术的结合。微嫁接分两种情况，即试管内嫁接和试管外嫁接。试管外嫁接接穗为利用组织培养技术获得的无毒的外植体植株，微嫁接砧木为种子培育而成健壮种苗，可为接穗提供充足的营养来源，促进接穗生长。微嫁接技术已被广泛应用于快速检测植物病毒、繁殖保存珍贵育种材料等方面，且已应用于枣、柑橘、苹果、桃、葡萄、龙眼和沙田柚等多种果树的研究和生产中，然而由于蔬菜组培苗的组织幼嫩，操作技术要求高，培养条件严格，尚无报道在蔬菜类乃至苦瓜种植中的应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法，包括如下步骤：

(1)接穗的培养：选取大田中已结商品瓜的苦瓜植株的顶芽或侧芽为外植体，消毒后接种到诱导培养基上，待萌芽后，切取诱导出的芽转入继代培养基中继续培养，每18～20d转接一次，然后将获得的无根组培苗培养成5～7cm高的组培苗，再进行5～7d的自然光炼苗，最后剪成带至少2个芽的茎段作为接穗，接穗下部削成楔形；

(2)砧木的培养：将丝瓜或南瓜种子播种于消毒后的基质中，保持基质的湿润，待种子萌发后，将获得的幼苗作为砧木；

(3)嫁接：待步骤(2)中获得的幼苗刚长出第一片真叶时，切去生长点，仅留2片子叶，然后从2片子叶中间劈开，再将步骤(1)中获得的接穗***其中，并固定嫁接口，每天喷洒5％～8％(w/v)的蔗糖水直至接穗成活；

(4)嫁接后管理：嫁接后置于地面的小拱棚内进行培养，前4天保持小拱棚全封闭，并进行全遮光处理，棚内维持湿度90～95％、温度25～30℃；第5天开始将湿度降低至80％～85％，逐渐通风，并增加光照，温度控制在20～35℃范围内，直至接穗发芽并长出2片新叶。

步骤(1)中所述的外植体为大田综合性状好且已结商品瓜的苦瓜的顶芽或侧芽；优选为大田综合性状好且已结成熟商品瓜的苦瓜的顶芽或侧芽。

步骤(1)中所述的苦瓜的品种包括大顶苦瓜，油瓜和珍珠瓜。

步骤(1)中所述的诱导培养基为MS+6-BA。

所述的培养基中6-BA的浓度为0.3～0.5mg/L。

步骤(1)中所述的继代培养基为MS+6-BA；优选为MS+0.2～0.4mg/L6-BA+30～45g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

步骤(1)中所述的继代培养优选为在人工光照封闭式培养室中进行继代培养。

步骤(1)中所述的继代培养的条件优选为：温度26±2℃，相对湿度70％～80％，光照强度2000～3000lx，光照时间16h/d。

步骤(1)中所述的将获得的无根组培苗培养至5～7cm高的组培苗的时间为20d左右。

步骤(2)中所述的丝瓜或南瓜种子优选为经催芽处理的丝瓜或南瓜种子。

步骤(2)中所述的丝瓜种子优选为丝瓜银砧1号或丝瓜银砧2号。

步骤(2)中所述的南瓜种子优选为南瓜海砧1号。

步骤(2)中所述的消毒优选为采用多菌灵进行消毒；更优选为采用多菌灵原液稀释200倍液进行消毒。

步骤(2)中所述的基质的主要成分为蛭石、珍珠岩、草炭、有机肥和无机肥。

步骤(3)中所述的固定优选通过如下方法实现：用75％酒精消毒后的小夹子夹住嫁接口。

步骤(3)中所述的蔗糖水优选为浓度5％～7.5％(w/v)的蔗糖水。

步骤(4)中嫁接后的管理优选通过如下步骤实现：接后置于小拱棚内，头4天保持小拱棚全封闭，上面覆盖2～3层遮阳网，全遮光，棚内湿度保持在90～95％，温度25～30℃；第5天使苗床内的湿度下降到80％～85％，早晚拱棚两头掀开透气，温度控制在25～30℃范围内，逐渐增加光照；8～10天后揭去遮阳网，继续培养直至接穗发芽并长出2片或以上新叶。

所述的小拱棚优选为用无滴膜密封的小拱棚。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明中选取大田中生长健壮的、已结商品瓜(结成熟瓜)的成年苦瓜植株的顶芽或侧芽作为外植体，只有在大田种植长出苦瓜表现以后，选取综合性状良好的植株进行嫁接，才能将大田中具有优良性状的苦瓜品种保留下来，从而能大大缩短苦瓜育种年限和降低育种成本。

(2)周期短、费用低，占地少，成活率高(85％以上)。

(3)进行微嫁接后，生长条件可以人为控制，提高了有关科学研究的可信度。

(4)受季节的限制和环境的影响小，可以在实验室常年进行。

(5)苦瓜的试管外微嫁接技术中，由于苦瓜接穗取自无菌的幼嫩的组培苗，操作技术要求高，培养条件严格，国内外迄今尚无研究报道。

(6)本技术进行了大顶苦瓜，油瓜和珍珠瓜等不同类型苦瓜品种的组培苗在试管外微嫁接的影响因素及适合条件的研究，为今后苦瓜乃至其他蔬菜试管外嫁接技术在工厂化育苗的推广和应用、以及缩短苦瓜育种年限(传统育种年限大概是4-5年，而本发明在一年内即可实现)等方面提供理论依据。

附图说明

图1是利用本发明的微嫁接劈接法嫁接当天的照片图，其中，接穗为大顶苦瓜组培苗，砧木为丝瓜银砧1号。

图2是微嫁接一周后照片图。

图3是微嫁接2个月后移栽大田中成活照片图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法，具体的实验方法为：

(1)接穗的培养：选取大田中综合性状好(可根据实际需要选择：如选抗旱的、瓜形好的，或耐热的植株等)且已结商品大顶苦瓜的单株的顶芽或侧芽为外植体，用75％的酒精消毒30秒，无菌水冲洗三遍，再用0.01％的升汞消毒后接种到诱导培养基MS+6-BA0.3mg/L上20天，待顶芽或侧芽萌发后，切取诱导出的侧芽，转入继代培养基MS+6-BA0.2mg/L中继续培养；培养基中添加蔗糖30g/L和琼脂7g/L，pH5.8。继代培养期间，平均每18～20d转接一次，获得大量无根组培苗作为接穗。培养条件：采用人工光照封闭式培养室，温度(26±2)℃，相对湿度70％～80％，光照强度2000～3000lx，光照时间16h/d。将生长健壮，培养20d左右，5～7cm高的组培苗进行5～7d的开瓶自然光炼苗，再剪成带2个芽的茎段作为接穗，接穗下部削成楔形。1株组培苗可获得2～3个接穗(每个接穗约2～4cm)。

(2)砧木的培养：丝瓜银砧1号的种子，经过催芽处理，待种子刚刚露芽，播种于经过多菌灵200倍液消毒处理(基质的含水量在50％～60％)且已装好基质(主要成分是蛭石、珍珠岩、草炭、有机肥、无机肥)的营养钵中。播种后保持基质的湿润，5～7天后发芽，作为砧木。

(3)嫁接方法：采用劈接法。待丝瓜第一片真叶刚刚长出后(播种后10至16天)，切去生长点，仅留2片子叶，从2片子叶中间劈开，将削好的接穗***其中，用75％酒精消毒后的小夹子轻轻夹住嫁接口，每天喷洒浓度为5％(w/v)的蔗糖水直至接穗成活。嫁接当天如图1所示。

(4)嫁接后的管理：嫁接后置于用无滴膜密封的小拱棚内，头4天保持小拱棚全封闭，上面覆盖2～3层遮阳网，全遮光、防止直射阳光，棚内湿度保持在90～95％，温度25～30℃；第5d开始使苗床内的空气湿度下降到80％～85％，早晚小棚两头适当掀开透气，适当去掉部分遮阳网，温度控制在20～35℃范围内，最好保持在25～30℃，逐渐增加光照(散射光)；8～10d后植株基本成活，可以揭去遮阳网(棚内湿度保持在80％～85％，温度25～30℃，早晚小棚两头适当掀开透气)，直至接穗发芽并长出2片或以上新叶。

微嫁接一周后如图2所示，微嫁接2个月后移栽到大田中(图3)，说明利用试管外微嫁接方法，能够成功获得苦瓜植株。

实施例2

一种苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法，具体的实验方法为：

(1)接穗的培养：选取大田中综合性状好且已结商品瓜的油瓜品种的单株的顶芽或侧芽为外植体，用75％的酒精消毒30秒，无菌水冲洗四遍，再用0.01％的升汞消毒后接种到诱导培养基MS+6-BA0.4mg/L上20天，待顶芽或侧芽萌发后，切取诱导出的侧芽，转入继代培养基MS+6-BA 0.3mg/L中继续培养；培养基中添加蔗糖40g/L和琼脂7g/L，pH5.8。继代培养期间，平均每18～20d转接一次，获得大量无根组培苗作为接穗。培养条件：采用人工光照封闭式培养室，温度(26±2)℃，相对湿度70％～80％，光照强度2000～3000lx，光照时间16h/d。将生长健壮，培养20d左右，5～7cm高的组培苗进行5～7d的开瓶自然光炼苗，再剪成带2个芽的茎段作为接穗，接穗下部削成楔形。1株组培苗可获得2～3个接穗(每个接穗约2～4cm)。

(2)砧木的培养：丝瓜银砧1号的种子，经过催芽处理，待种子刚刚露芽，播种于经过多菌灵200倍液消毒处理(基质的含水量在50％～60％)且已装好基质(主要成分是蛭石、珍珠岩、草炭、有机肥、无机肥)的营养钵中。播种后保持基质的湿润，5～7天后发芽，作为砧木。

(3)嫁接方法：采用劈接法。待丝瓜第一片真叶刚刚长出后(播种后10至16天)，切去生长点，仅留2片子叶，从2片子叶中间劈开，将削好的接穗***其中，用75％酒精消毒后的小夹子轻轻夹住嫁接口，每天喷洒浓度为6％(w/v)的蔗糖水直至接穗成活。

(4)嫁接后的管理：嫁接后置于用无滴膜密封的小拱棚内，头4天保持小拱棚全封闭，上面覆盖2～3层遮阳网，全遮光、防止直射阳光，棚内湿度保持在90～95％，温度25～30℃；第5d开始使苗床内的空气湿度下降到80％～85％，早晚小棚两头适当掀开透气，适当去掉部分遮阳网，温度控制在20～35℃范围内，最好保持在25～30℃，逐渐增加光照(散射光)，8～10d后植株基本成活，可以揭去遮阳网，直至接穗发芽并长出2片或以上新叶。

实施例3

一种苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法，具体的实验方法为：

(1)接穗的培养：选取大田中综合性状好且已结商品瓜的珍珠苦瓜品种的单株的顶芽或侧芽为外植体，用75％的酒精消毒30秒，无菌水冲洗四遍，再用0.015％的升汞消毒后接种到诱导培养基MS+6-BA0.5mg/L上20天，待顶芽或侧芽萌发后，切取诱导出的侧芽，转入继代培养基MS+6-BA 0.4mg/L中继续培养；培养基中添加蔗糖45g/L和琼脂7g/L，pH5.8。继代培养期间，平均每18～20d转接一次，获得大量无根组培苗作为接穗。培养条件：采用人工光照封闭式培养室，温度(26±2)℃，相对湿度70％～80％，光照强度2000～3000lx，光照时间16h/d。将生长健壮，培养20d左右，5～7cm高的组培苗进行5～7d的开瓶自然光炼苗，再剪成带2个芽的茎段作为接穗，接穗下部削成楔形。1株组培苗可获得2～3个接穗(每个接穗约2～4cm)。

(2)砧木的培养：丝瓜银砧1号的种子，经过催芽处理，待种子刚刚露芽，播种于经过多菌灵200倍液消毒处理(基质的含水量在50％～60％)且已装好基质(主要成分是蛭石、珍珠岩、草炭、有机肥、无机肥)的营养钵中。播种后保持基质的湿润，5～7天后发芽，作为砧木。

(3)嫁接方法：采用劈接法。待丝瓜第一片真叶刚刚长出后(播种后10至16天)，切去生长点，仅留2片子叶，从2片子叶中间劈开，将削好的接穗***其中，用75％酒精消毒后的小夹子轻轻夹住嫁接口，每天喷洒浓度为7.5％(w/v)的蔗糖水直至接穗成活。

(4)嫁接后的管理：嫁接后置于用无滴膜密封的小拱棚内，头4天保持小拱棚全封闭，上面覆盖2～3层遮阳网，全遮光、防止直射阳光，棚内湿度保持在90～95％，温度25～30℃；第5d开始使苗床内的空气湿度下降到80％～85％，早晚小棚两头适当掀开透气，适当去掉部分遮阳网，温度控制在20～35℃范围内，最好保持在25～30℃，逐渐增加光照(散射光)，8～10d后植株基本成活，可以揭去遮阳网，直至接穗发芽并长出2片或以上新叶。

对比例1

实验方法：参考实施例1、2、3的嫁接方法，保持其他步骤及参数不变，区别在于步骤(3)中嫁接后不喷洒蔗糖水。

实验结果：不喷洒蔗糖水获得的苦瓜组培苗的嫁接成活率分别为大顶苦瓜49％，油瓜35％，珍珠瓜30％，而实施例1、2、3的嫁接成活率分别为92％，88％和87％。说明喷洒蔗糖水有利于提高嫁接的成活率。

对比例2

实验方法：参考实施例1、2、3的嫁接方法，保持步骤(1)(2)和(3)的步骤及参数不变，区别在于步骤(4)的嫁接后管理为：嫁接后置于放入用无滴膜密封的小拱棚内，嫁接后头6天保持小拱棚全封闭，上面覆盖2～3层遮阳网，全遮光、防止直射阳光，棚内湿度保持在100％；第7d开始使苗床内的空气湿度下降到80％～85％，早晚小棚两头适当掀开透气，适当去掉部分遮阳网，温度控制在20～35℃范围内，最好保持在25～30℃，逐渐增加光照(散射光)，8～10d后可以揭去遮阳网，直至接穗发芽并长出2片或以上新叶。

实验结果：棚内湿度达到100％，封闭时间超过6天，嫁接成活率分别为大顶苦瓜33％，油瓜21％，珍珠瓜19％，而实施例1、2、3中嫁接后头4天保持小拱棚全封闭，棚内湿度保持在90～95％，第5d使苗床内的空气湿度下降到80％～85％，可使嫁接成活率达到85％以上。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)接穗的培养：选取大田中已结商品瓜的苦瓜植株的顶芽或侧芽为外植体，消毒后接种到诱导培养基上，待萌芽后，切取诱导出的芽转入继代培养基中继续培养，每18～20d转接一次，然后将获得的无根组培苗培养成5～7cm高的组培苗，再进行5～7d的自然光炼苗，最后剪成带至少2个芽的茎段作为接穗，接穗下部削成楔形；

(2)砧木的培养：将丝瓜或南瓜种子播种于消毒后的基质中，保持基质的湿润，待种子萌发后，将获得的幼苗作为砧木；

(3)嫁接：待步骤(2)中获得的幼苗刚长出第一片真叶时，切去生长点，仅留2片子叶，然后从2片子叶中间劈开，再将步骤(1)中获得的接穗***其中，并固定嫁接口，每天喷洒5％～8％(w/v)的蔗糖水直至接穗成活；

(4)嫁接后管理：嫁接后置于地面的小拱棚内进行培养，前4天保持小拱棚全封闭，并进行全遮光处理，棚内维持湿度90～95％、温度25～30℃；第5天开始将湿度降低至80％～85％，逐渐通风，并增加光照，温度控制在20～35℃范围内，直至接穗发芽并长出2片新叶。

2.根据权利要求1所述的苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的继代培养基为MS+0.2～0.4mg/L6-BA+30～45g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

3.根据权利要求1所述的苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的诱导培养基为MS+6-BA；所述的培养基中6-BA的浓度为0.3～0.5mg/L。

4.根据权利要求1所述的苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的外植体为大田综合性状好且已结商品苦瓜的顶芽或侧芽。

5.根据权利要求1所述的苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的继代培养的条件为：温度26±2℃，相对湿度70％～80％，光照强度2000～3000lx，光照时间16h/d。

6.根据权利要求1所述的苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的固定通过如下方法实现：用75％酒精消毒后的小夹子夹住嫁接口。

7.根据权利要求1所述的苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的消毒为采用多菌灵原液稀释200倍液进行消毒。

8.根据权利要求1所述的苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的苦瓜的品种为大顶苦瓜，油瓜或珍珠瓜。

9.根据权利要求1所述的苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的丝瓜或南瓜种子为经催芽处理的丝瓜或南瓜种子；

步骤(2)中所述的丝瓜种子为丝瓜银砧1号或丝瓜银砧2号；

步骤(2)中所述的南瓜种子为南瓜海砧1号。

10.根据权利要求1所述的苦瓜组培苗的试管外微嫁接方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的基质的主要成分为蛭石、珍珠岩、草炭、有机肥和无机肥。