CN107502620A - 一种肉葡萄球菌合成培养基及其发酵液的制备方法与应用 - Google Patents

一种肉葡萄球菌合成培养基及其发酵液的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肉葡萄球菌合成培养基及其发酵液的制备方法及应用。其中肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)合成培养基，是按1L体积计算，由如下重量的原料组成：无水葡萄糖10~50g，赖氨酸0.1~1.5g，缬氨酸1.0~5.0g，甘氨酸0.1~1.5g，精氨酸1.0~5.0g，脯氨酸1.0~5.0g，谷氨酸5~10.0g，色氨酸0.1~0.5g，胱氨酸0.1~1.5g，盐酸硫胺素1.0~3.0mg，泛酸钙1.0~3.0mg，烟酸1.0~3.0mg，硫酸锰1.0~3.0mg，磷酸二氢钾0.1~1.0g，七水硫酸镁0.1~0.8g，七水硫酸亚铁0.005~0.010g，三水磷酸氢二钾1.0~5.0g，3‑(N‑吗啉)丙磺酸6~10g，剩余为水；还公开了肉葡萄球菌发酵液的制备方法。本发明的肉葡萄球菌合成培养基配方搭配合理，营养丰富，适合肉葡萄球菌的生长需求，通过本发明方法获得的肉葡萄球菌的生长量与通常所用的LB（Luria‑Bertani）培养基相比提高了5%。

Description

一种肉葡萄球菌合成培养基及其发酵液的制备方法与应用
技术领域
本发明属于微生物培养基和发酵技术领域，涉及一种肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)合成培养基及其发酵液的制备方法及应用。
背景技术
葡萄球菌（Staphylococcus）为平均直径在0.5-1.0μm的革兰氏阳性菌，因其堆叠起来的形状类似葡萄串珠而得名，一般不具有致病性。代表种有表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）和腐生葡萄球菌（Staphyloccocus saprophyticus）等。长期以来，人们将葡萄球菌用于干肠的发酵。起初，它们被认为是微球菌，但事实证明，这些微球菌被错误分类了，实际上是葡萄球菌。基于DNA/DNA杂交，生化特性和细胞壁组成，这些葡萄球菌形成了一种新的物种，命名为肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus），其可以从肉类发酵产物中分离出来，并于1950年开始被用作发酵起始剂。
肉葡萄球菌（S. carnosus）因为其不产生任何溶血素蛋白、毒素、凝固酶、蛋白质A或凝集因子，被世界公认为是食品级GRAS（generally recognized safe）葡萄球菌。肉葡萄球菌是肉制品发酵行业中形成肉制品风味的关键菌种，在欧洲等地被用作生肉产品起始培养物已经超过80年。在干香肠发酵成熟的过程中，肉葡萄球菌可先将硝酸盐还原为亚硝酸盐。这个反应的优点是硝酸盐的浓度降低，亚硝酸盐可与肌红蛋白（myoglobin,Mb）结合形成亚硝基血红蛋白（hemoglobin,Hb），使肉呈现典型的红色。然后亚硝酸盐进一步还原成氨，从而降低了未结合的亚硝酸盐浓度。在培养基和肉基质中，肉葡萄球菌均可将高铁肌红蛋白转化为红色肌红蛋白衍生物，使肉制品获得较好的色泽。肉葡萄球菌还产生能够水解蛋白质的酶，干香肠发酵过程中酶的分解产物能形成独特的风味。此外，其的胞外蛋白水解能力很低，因此可用做基因克隆技术的宿主菌，这样就可以研究这类菌的相关代谢途径和它们分泌和表达异源蛋白的情况。本研究所用菌种为肉葡萄球菌的重组菌：Staphylococcus carnosus ATCC 51365/pBT2-ET-5R-EGFP，带有增强型绿色荧光蛋白的肉葡萄球菌，一方面提高菌种的生长状况，另一方面制备其发酵液。
绿色荧光蛋白（GFP）在研究方面有很大的价值。EGFP是GFP突变系。目前应用较多的是GFP的突变体：增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)是在绿色荧光蛋白(GFP)的基础上经碱基修饰和人为改造而成的，其中第64位的苯丙氨酸(Phe)替换为亮氨酸(Leu)，第65位的丝氨酸(Ser)替换为苏氨酸(Thr)，发射出的荧光强度比GFP高6倍以上，因此，比GFP更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。
一直以来，培养肉葡萄球菌所用的复合培养基的成分复杂，碳源和氮源丰富，使用这种复合培养基进行发酵，虽然效价较高，但由于其中的酵母提取物成分复杂，不同产地、不同批次存在差异，影响了对实验结果进行定量和定性分析，且在分离蛋白时，杂蛋白的条带比较多，而且对于其他物质的分离纯化产生很大的影响。
合成培养基的成分明确，通过对合成培养基组分的研究，确定影响菌种生长的主要因子，有利于对菌体生长、遗传育种与发酵代谢机制的研究，以及转录组学与代谢组学等方面的研究。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种重组质粒pBT2-ET-5R-EGFP的构建方法。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种肉葡萄球菌合成培养基。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种肉葡萄球菌发酵液的制备方法。
本发明要解决的第四个技术问题是提供一种肉葡萄球菌发酵液在提高肉葡萄球菌生长量方面的应用。
具体描述如下：
为解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种重组质粒pBT2-ET-5R-EGFP的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：
穿梭载体pBT2-ET-5R-EGFP：以pBT2质粒为骨架，在其KpnI和NheI克隆位点之间***一个tat-egfp融合基因制备得到；该EGFP融合基因的启动子为肉葡萄球菌ATCC 51365的eftu基因的启动子序列（GenBank Accession No: 7551602），信号肽采用肉葡萄球菌ATCC51365的efeB基因的tat信号肽序列（GenBank Accession No: AM295250），并在后续的EGFP基因（GenBank Accession No: AF302837）的N-末端加入一个含有5个连续精氨酸序列（5R）的连接肽linker；其中从tat信号肽起始密码子到EGFP蛋白的碱基序列参照图5，其碱基序列如SEQ ID NO. 1所示，其氨基酸序列参照图6，如SEQ ID NO. 2所示。
质粒pBT2-ET-5R-EGFP从tat信号肽到EGFP的碱基序列：
ATGACACAAGACAAGCATGAAGGTAATGAAGTTTCACGTCGTTTTTTTCTGAAAATGTTAGGTATCGGCGGTGCAGGCGCAGTCATCGGTGCTAGTGGAGTCGGCGGCATTTTTTCTTTCAAGCTTCGTCGCCGTCGCCGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATGAGCTAGC
质粒pBT2-ET-5R-EGFP从tat信号肽到EGFP的氨基酸序列：
MTQDKHEGNEVSRRFFLKMLGIGGAGAVIGASGVGGIFSFKLRRRRRVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKAS
为解决上述第二个技术问题，本发明一种肉葡萄球菌合成培养基，按1L体积计算，是由如下重量的原料组成：
无水葡萄糖10~50g，赖氨酸0.1~1.5g，缬氨酸1.0~5.0g，甘氨酸0.1~1.5g，精氨酸1.0~5.0g，脯氨酸1.0~5.0g，谷氨酸5~10.0g，色氨酸0.1~0.5g，胱氨酸0.1~1.5g，盐酸硫胺素1.0~3.0mg，泛酸钙1.0~3.0mg，烟酸1.0~3.0mg，硫酸锰1.0~3.0mg，磷酸二氢钾0.1~1.0g，七水硫酸镁0.1~0.8g，七水硫酸亚铁0.005~0.010g，三水磷酸氢二钾1.0~5.0g，3-(N-吗啉)丙磺酸6~10g，剩余为水。
优选地，肉葡萄球菌合成培养基的pH=7.2~7.5。
优选地，无水葡萄糖40g，赖氨酸1.0g，缬氨酸3.0g，甘氨酸1.0g，精氨酸2.0g，脯氨酸2.0g，谷氨酸7.0g，色氨酸0.4g，胱氨酸1.0g，泛酸钙2mg，烟酸2mg，盐酸硫胺素2mg，硫酸锰2mg，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.4g，七水硫酸亚铁0.008g，三水磷酸氢二钾3g，3-(N-吗啉)丙磺酸8g。
为解决上述第三个技术问题，本发明一种肉葡萄球菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：
S1、种子培养
种子培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L；pH=6.5~8.0；单菌落接种到装有50mL的种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃摇床中以180rpm恒温连续培养12h，再按照1%接种量将菌液接种到装有50mL的种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃摇床中以180rpm恒温连续培养8h，获得肉葡萄球菌液体种子液。
S2、配制肉葡萄球菌合成培养基
合成培养基配方为：无水葡萄糖10~50g，赖氨酸0.1~1.5g，缬氨酸1.0~5.0g，甘氨酸0.1~1.5g，精氨酸1.0~5.0g，脯氨酸1.0~5.0g，谷氨酸5~10.0g，胱氨酸0.1~1.5g，色氨酸0.1~0.5g，盐酸硫胺素1.0~3.0mg，泛酸钙1.0~3.0mg，烟酸1.0~3.0mg，硫酸锰1.0~3.0mg，磷酸二氢钾0.1~1.0g，七水硫酸镁0.1~0.8g，七水硫酸亚铁0.005~0.010g，三水磷酸氢二钾1.0~5.0g，3-(N-吗啉)丙磺酸6~10g。
S3、液体发酵培养
按0.5%~1.5%接种量将液体种子转接于所述合成培养基中，在37℃下180rpm摇床中连续培养12h，即可获得含有绿色荧光蛋白的发酵液。
优选地，步骤S1中，种子培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH=6.5~7.5；取1.0%得菌液接种于装有50mL的250mL的三角瓶中，37℃下180rpm摇床培养12h；
优选地，步骤S3中，按0.5%~1.5%接种量将液体种子转接于所述合成培养基中，在37℃下180rpm摇床中连续培养12h。
为解决上述第四个技术问题，本发明公开了一种肉葡萄球菌发酵液在提高肉葡萄球菌生长量方面的应用。实验结果显示：采用肉葡萄球菌发酵液的制备方法获得的肉葡萄球菌的生长量与通常所用的LB（Luria-Bertani）培养基相比提高了5%，以及后期对于转录组学和代谢组学的研究会有很大的帮助。
本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
如无特殊说明，本发明中的各原料均可通过市售购买获得，本发明中所用的设备可采用所属领域中的常规设备或参照所属领域的现有技术进行。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
本发明公开了一种适合肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)的培养基及其发酵液的制备方法。本发明中的肉葡萄球菌合成培养基配方搭配合理，营养丰富，适合肉葡萄球菌的生长和绿色荧光蛋白的分泌需求，本发明获得的肉葡萄球菌的生长量与通常所用的LB（Luria-Bertani）培养基相比提高了5%。
附图说明
图1 表示胱氨酸浓度对肉葡萄球菌菌体生长的影响；
图2 表示谷氨酸浓度对肉葡萄球菌菌体生长的影响；
图3 表示色氨酸浓度对肉葡萄球菌菌体生长的影响；
图4 表示甘氨酸浓度对肉葡萄球菌菌体生长的影响；
图5 表示穿梭载体pBT2-ET-5R-EGFP从tat信号肽起始密码子到EGFP蛋白的碱基序列；
图6 表示穿梭载体pBT2-ET-5R-EGFP从tat信号肽起始密码子到EGFP蛋白的氨基酸序列；
图7 表示穿梭载体pBT2-ET-5R-EGFP质粒图谱。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。例如氯霉素、氨苄青霉素及其他所用的试验材料均是从常规生化试剂厂商处购买得到的；
用到的肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）ATCC 51365菌株来源：https://www.dsmz.de/catalogues/details/culture/dsm-20501.html。参考文献：Schliefer, K.H.; Fischer, U. Description of a New Species of the Genus Staphylococcus: Staphylococcus carnosus. International Journal of Systematic Bacteriology,1982, 32(2):153–156；
pBT2质粒来源：http://www.biofeng.com/zaiti/qita/pBT2.html。参考文献：Bruckner R. Gene replacement in Staphylococcus carnosus and Staphylococcus xylosus. FEMS Microbiology Letters, 1997, 151(1):1-8。
一种肉葡萄球菌的合成培养基，其组成配方为（L）：无水葡萄糖10~50g，赖氨酸0.1~1.5g，缬氨酸1.0~5.0g，甘氨酸0.1~1.5g，精氨酸1.0~5.0g，脯氨酸1.0~5.0g，谷氨酸5~10.0g，色氨酸0.1~0.5g，胱氨酸0.1~1.5g，盐酸硫胺素1.0~3.0mg，泛酸钙1.0~3.0mg，烟酸1.0~3.0mg，硫酸锰1.0~3.0mg，磷酸二氢钾0.1~1.0g，七水硫酸镁0.1~0.8g，七水硫酸亚铁0.005~0.010g， 三水磷酸氢二钾1.0~5.0g，3-(N-吗啉)丙磺酸6~10g。
一种肉葡萄球菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：
S1、种子培养：培养基配方为（g/L）：胰蛋白胨10、酵母提取物5、氯化钠10；条件：初始pH=6.5~8.0，37℃下180rpm摇床培养12h；
S2、配制生长肉葡萄球菌菌株的培养基，培养基配方为（L）：无水葡萄糖10~50g，赖氨酸0.1~1.5g，缬氨酸1.0~5.0g，甘氨酸0.1~1.5g，精氨酸1.0~5.0g，脯氨酸1.0~5.0g，谷氨酸5~10.0g，色氨酸0.1~0.5g，胱氨酸0.1~1.5g，盐酸硫胺素1.0~3.0mg，泛酸钙1.0~3.0mg，烟酸1.0~3.0mg，硫酸锰1.0~3.0mg，磷酸二氢钾0.1~1.0g，七水硫酸镁0.1~0.8g，七水硫酸亚铁0.005~0.010g，三水磷酸氢二钾1.0~5.0g，3-(N-吗啉)丙磺酸6~10g；
S3、液体发酵培养：按1.0%接种量将液体种子液转接于所述合成培养基中，在37℃摇床180rpm连续培养12h，即可获得含绿色荧光蛋白的发酵液。
实施例1
菌种：肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus) ATCC 51365/pBT2-ET-5R-EGFP由本发明人团队构建，其方法如下：
穿梭载体pBT2-ET-5R-EGFP：以pBT2质粒为骨架，在其KpnI和NheI克隆位点之间***一个tat-egfp融合基因制备得到；该EGFP融合基因的启动子为肉葡萄球菌ATCC 51365的eftu基因的启动子序列（GenBank Accession No: 7551602），信号肽采用肉葡萄球菌ATCC51365的efeB基因的tat信号肽序列（GenBank Accession No: AM295250），并在后续的EGFP基因（GenBank Accession No: AF302837）的N-末端加入一个含有5个连续精氨酸序列（5R）的连接肽linker；其中从tat信号肽起始密码子到EGFP蛋白的碱基序列参照图5，其碱基序列如SEQ ID NO. 1所示，其氨基酸序列参照图6，如SEQ ID NO. 2所示。
质粒pBT2-ET-5R-EGFP从tat信号肽到EGFP的碱基序列：
ATGACACAAGACAAGCATGAAGGTAATGAAGTTTCACGTCGTTTTTTTCTGAAAATGTTAGGTATCGGCGGTGCAGGCGCAGTCATCGGTGCTAGTGGAGTCGGCGGCATTTTTTCTTTCAAGCTTCGTCGCCGTCGCCGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATGAGCTAGC
质粒pBT2-ET-5R-EGFP从tat信号肽到EGFP的氨基酸序列：
MTQDKHEGNEVSRRFFLKMLGIGGAGAVIGASGVGGIFSFKLRRRRRVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKAS
实施例2
所用发酵合成培养基组成为（L）：无水葡萄糖40g，赖氨酸0.4g，缬氨酸0.4g，甘氨酸0.4g，精氨酸2.0g，脯氨酸2.0g，谷氨酸0.4g，色氨酸0.4g，胱氨酸分别为0.4g、1.0g、1.5g、2.0g、3.0g，泛酸钙2mg，烟酸2mg，盐酸硫胺素2mg，硫酸锰2mg，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.4g，七水硫酸亚铁0.008g，三水磷酸氢二钾3g，3-(N-吗啉)丙磺酸8g。
首先将保藏的肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus) ATCC 51365/pBT2-ET-5R-EGFP菌株活化得到单菌落后，接种到装有50mL的种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃摇床中以180rpm恒温连续培养12h，再按照1%接种量将菌液接种到装有50mL的种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃摇床中以180rpm恒温连续培养8h，获得肉葡萄球菌液体种子并进行清洗悬浮；按照1%接种量将液体种子转接于所述高产液体培养基中，在37℃摇床中以180rpm恒温连续培养12h，即可获得肉葡萄球菌菌株活性物质的发酵液，此合成培养基中肉葡萄球菌的生长量只有LB（Luria-Bertani）培养基发酵液中的37.3%，如图1。
实施例3
所用发酵合成培养基组成为（g/L）：无水葡萄糖40g，赖氨酸0.4g，缬氨酸0.4g，甘氨酸0.4g，精氨酸2.0g，脯氨酸2.0g，胱氨酸0.4g，色氨酸0.4g，谷氨酸分别为0.4g、1.0g、3.0g、5.0g、7.0g，泛酸钙2mg，烟酸2mg，盐酸硫胺素2mg，硫酸锰2mg，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.4g，七水硫酸亚铁0.008g，三水磷酸氢二钾3g，3-(N-吗啉)丙磺酸8g。
首先将保藏的肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus) ATCC 51365/pBT2-ET-5R-EGFP菌株活化得到单菌落后，接种到装有50mL的种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃摇床中以180rpm恒温连续培养12h，再按照1%接种量将菌液接种到装有50mL的种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃摇床中以180rpm恒温连续培养8h，获得肉葡萄球菌液体种子并进行清洗悬浮；按照1%接种量将液体种子转接于所述高产液体培养基中，在37℃摇床中以180rpm恒温连续培养12h，即可获得肉葡萄球菌菌株活性物质的发酵液，此合成培养基中肉葡萄球菌的生长量只有LB（Luria-Bertani）培养基发酵液中的52.8%，如图2。
实施例4
所用发酵合成培养基组成为（L）：无水葡萄糖40g，赖氨酸1.0g，缬氨酸3.0g，甘氨酸0.4g，精氨酸2.0g，脯氨酸2.0g，胱氨酸1.0g，谷氨酸7.0g，色氨酸分别为0.4g、1.0g、1.5g、2.0g、3.0g，泛酸钙2mg，烟酸2mg，盐酸硫胺素2mg，硫酸锰2mg，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.4g，七水硫酸亚铁0.008g， 三水磷酸氢二钾3g，3-(N-吗啉)丙磺酸8g。
首先将保藏的肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus) ATCC 51365/pBT2-ET-5R-EGFP菌株活化得到单菌落后，接种到装有50mL的种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃摇床中以180rpm恒温连续培养12h，再按照1%接种量将菌液接种到装有50mL的种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃摇床中以180rpm恒温连续培养8h，获得肉葡萄球菌液体种子并进行清洗悬浮；按照1%接种量将液体种子转接于所述高产液体培养基中，在37℃摇床中以180rpm恒温连续培养12h，即可获得肉葡萄球菌菌株活性物质的发酵液，此合成培养基中肉葡萄球菌的生长量只有LB（Luria-Bertani）培养基发酵液中的85.9%，如图3。
实施例5
所用发酵合成培养基组成为（g/L）：无水葡萄糖40g，赖氨酸1.0g，缬氨酸3.0g，色氨酸0.4g，精氨酸2.0g，脯氨酸2.0g，胱氨酸1.0g，谷氨酸7.0g，甘氨酸分别为0.4g、1.0g、2.0g、3.0g、4.0g，泛酸钙2mg，烟酸2mg，盐酸硫胺素2mg，硫酸锰2mg，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.4g，七水硫酸亚铁0.008g，三水磷酸氢二钾3g，3-(N-吗啉)丙磺酸8g。
首先将保藏的肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus) ATCC 51365/pBT2-ET-5R-EGFP菌株活化得到单菌落后，接种到装有50mL的种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃摇床中以180rpm恒温连续培养12h，再按照1%接种量将菌液接种到装有50mL的种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃摇床中以180rpm恒温连续培养8h，获得肉葡萄球菌液体种子并进行清洗悬浮；按照1%接种量将液体种子转接于所述高产液体培养基中，在37℃摇床中以180rpm恒温连续培养12h，即可获得肉葡萄球菌菌株活性物质的发酵液，此合成培养基中肉葡萄球菌的生长量为LB（Luria-Bertani）培养基发酵液中的105%，如图4。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。例如氯霉素、氨苄青霉素及其他所用的试验材料均是从常规生化试剂厂商处购买得到的。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种肉葡萄球菌合成培养基及其发酵液的制备方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 867
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atgacacaag acaagcatga aggtaatgaa gtttcacgtc gtttttttct gaaaatgtta 60
ggtatcggcg gtgcaggcgc agtcatcggt gctagtggag tcggcggcat tttttctttc 120
aagcttcgtc gccgtcgccg tgtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc 180
atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 240
gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 300
cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 360
taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc 420
caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag 480
ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac 540
ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 600
gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac 660
ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 720
ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 780
aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 840
gacgagctgt acaagtaatg agctagc 867
<210> 2
<211> 287
<212> PRT
<213> 氨基酸序列()
<400> 2
Met Thr Gln Asp Lys His Glu Gly Asn Glu Val Ser Arg Arg Phe Phe
1 5 10 15
Leu Lys Met Leu Gly Ile Gly Gly Ala Gly Ala Val Ile Gly Ala Ser
20 25 30
Gly Val Gly Gly Ile Phe Ser Phe Lys Leu Arg Arg Arg Arg Arg Val
35 40 45
Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu
50 55 60
Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly
65 70 75 80
Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr
85 90 95
Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His
115 120 125
Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr
130 135 140
Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys
145 150 155 160
Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp
165 170 175
Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr
180 185 190
Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile
195 200 205
Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln
210 215 220
Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val
225 230 235 240
Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys
245 250 255
Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr
260 265 270
Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ala Ser
275 280 285

Claims (8)

1.一种重组质粒pBT2-ET-5R-EGFP的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：
穿梭载体pBT2-ET-5R-EGFP：以pBT2质粒为骨架，在其KpnI和NheI克隆位点之间***一个tat-egfp融合基因制备得到；该EGFP融合基因的启动子为肉葡萄球菌ATCC 51365的eftu基因的启动子序列（GenBank Accession No: 7551602），信号肽采用肉葡萄球菌ATCC51365的efeB基因的tat信号肽序列（GenBank Accession No: AM295250），并在后续的EGFP基因（GenBank Accession No: AF302837）的N-末端加入一个含有5个连续精氨酸序列（5R）的链接肽linker；其中从tat信号肽起始密码子到EGFP蛋白的碱基序列参照图5，其碱基序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列参照图6，如SEQ ID NO. 2所示。
2.一种肉葡萄球菌合成培养基，其特征在于，按1L体积计算，是由如下重量的原料组成：
无水葡萄糖10~50g，赖氨酸0.1~1.5g，缬氨酸1.0~5.0g，甘氨酸0.1~1.5g，精氨酸1.0~5.0g，脯氨酸1.0~5.0g，谷氨酸5~10.0g，胱氨酸0.1~1.5g色氨酸0.1~0.5g，盐酸硫胺素1.0~3.0mg，泛酸钙1.0~3.0mg，烟酸1.0~3.0mg，硫酸锰1.0~3.0mg，磷酸二氢钾0.1~1.0g，七水硫酸镁0.1~0.8g，七水硫酸亚铁0.005~0.010g，三水磷酸氢二钾1.0~5.0g，3-(N-吗啉)丙磺酸6~10g，剩余为水。
3.根据权利要求2所述的肉葡萄球菌合成培养基，其特征在于：所述肉葡萄球菌合成培养基的pH=6.5~8.0。
4.根据权利要求2所述的肉葡萄球菌合成培养基，其特征在于：
无水葡萄糖40g，赖氨酸1.0g，缬氨酸3.0g，甘氨酸1.0g，精氨酸2.0g，脯氨酸2.0g，谷氨酸7.0g，色氨酸0.4g，胱氨酸1.0g，泛酸钙2mg，烟酸2mg，盐酸硫胺素2mg，硫酸锰2mg，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.4g，七水硫酸亚铁0.008g，三水磷酸氢二钾3g，3-(N-吗啉)丙磺酸8g。
5.利用如权利要求2所述合成培养基制备肉葡萄球菌发酵液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、种子培养基，种子培养基配方为：
胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH=7.5；单菌落接种到装有50mL的种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃摇床中以180rpm恒温连续培养12h，再按照1%接种量将菌液接种到装有50mL的种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃摇床中以180rpm恒温连续培养8h，获得肉葡萄球菌液体种子液；
S2、配制肉葡萄球菌合成培养基：
合成培养基配方为：无水葡萄糖10~50g，赖氨酸0.1~1.5g，缬氨酸1.0~5.0g，甘氨酸0.1~1.5g，精氨酸1.0~5.0g，脯氨酸1.0~5.0g，谷氨酸5~10.0g，色氨酸0.1~0.5g，胱氨酸0.1~1.5g，盐酸硫胺素1.0~3.0mg，泛酸钙1.0~3.0mg，烟酸1.0~3.0mg，硫酸锰1.0~3.0mg，磷酸二氢钾0.1~1.0g，七水硫酸镁0.1~0.8g，七水硫酸亚铁0.005~0.010g， 三水磷酸氢二钾1.0~5.0g，3-(N-吗啉)丙磺酸6~10g；
S3、液体发酵培养：
按0.5%~1.5%接种量将液体种子转接于所述合成培养基中，在30~38℃、150~200rpm摇床中连续培养10~12h，即可获得含有绿色荧光蛋白的肉葡萄球菌发酵液。
6.权利要求5所述的制备肉葡萄球菌发酵液的方法，其特征在于：步骤S1中，种子培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH=7.5；单菌落接种于37℃下180rpm摇床中培养12h。
7.权利要求5所述的制备肉葡萄球菌发酵液的方法，其特征在于：步骤S3中，按1%接种量将液体种子转接于所述合成培养基中，在37℃、180rpm摇床中连续培养12h。
8.采用权利要求5所述方法制备的肉葡萄球菌发酵液在提高肉葡萄球菌生长量、代谢组学以及转录组学方面的应用。
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