CN107488610A - 一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，属于植物病原菌检测技术领域。本发明包括以下步骤：a）病原菌的分离、鉴定和纯化；b）病原菌的接种；c）病原菌的再分离；d）病原菌的再分子鉴定。本发明水稻细菌性穗枯病病原菌的鉴定方法简单、快速、准确。

Description

一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法
技术领域
本发明属于植物病原菌检测技术领域，具体涉及一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法。
背景技术
水稻是我国最重要的粮食作物之一，种植面积约4.5亿亩，占粮食总播种面积的27%；产量约2.1亿吨，占粮食总产的34.7%，且超过65%人以稻米为主食。水稻细菌性穗枯病（ Bacterial panicle blight of rice，BPBR）是新上升的世界性的重要水稻病害，主要病原菌为颖壳伯克氏菌（Burkholderia glumae），在水稻的苗期/穗期分别引起秧苗枯萎腐烂和谷粒瘪壳、变褐和腐坏，一般造成产量损失15%-20%。亚洲、非洲、北美和南美洲均有细菌性穗枯病爆发和流行的报道，在美国稻区尤为严重，最高产量损失达80%。
2007年，水稻细菌性穗枯病在中国被列为检疫性病害，但近年来由于气候改变、水稻品种（组合）的更换、耕作栽培制度的变化等因素，该病目前正在中国发生和蔓延。2010年以来的调查发现，东北三省，长江流域的湘、鄂、赣、皖、江、浙及海南岛和两广的稻区均发现疑似穗枯病症状。由于水稻穗部病害，包括真菌性穗枯病，穗腐病，稻粒黑粉等都能引起细菌性穗枯病相似的症状（谷粒的瘪壳，褐化和腐坏），从症状上难以区分；另一方面，由于它目前还被列为检疫性病害，我们没有这个新上升病害的来自中国稻区的菌种资源；这都阻碍了该病原的生物学特性、致病性、药剂筛选、病害防治、抗病育种等深入研究。因此急需建立水稻细菌性穗枯病病原菌的快速准确的分离鉴定方法。
在实现本发明过程中，发明人发现现有技术中至少存在如下问题：
已有的研究表明在伯克氏菌（Burkholderia）中，除了B. glumae，B. gladioli和B. plantarii也能侵染水稻，引起稻穗枯萎和瘪壳。B. glumae，B. gladioli和B. plantarii生物学特性相似，而且基因组序列同源性极高。另一方面，B. glumae致病性的研究一般采取在水稻穗期接种，水稻到抽穗期至少60天，耗时长。这些都为B. glumae引起的水稻细菌性穗枯病的快速精准分离鉴定造成巨大干扰。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法的技术方案。
所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
a）病原菌的分离、鉴定和纯化
采集水稻细菌性穗枯病疑似样品，利用组织分离法选择褐化腐坏谷粒，依次使用酒精溶液和次氯酸钠表面消毒，无菌水冲洗，谷粒细化溢菌，无菌接种环蘸取菌液在NA培养基平板上划线，置于恒温恒湿培养箱培养；挑取不同形态的单菌落，利用Burkholderia通用引物BGGF/BGGR和B. glumae特异引物BGSF/BGSR，进行两次菌落PCR反应，获得目标片段的单菌落扩大培养，保存菌液；
b）病原菌的接种
选取生长约3周的健康水稻幼苗，放入加有步骤a）分离纯化的病原菌液的植物营养液中浸根，在恒温恒湿培养箱中，观察幼苗的生长状况，并以没有加病原菌液的植物营养液中生长的水稻幼苗为对照；
c）病原菌的再分离
待病害症状稳定后，采集病样，再在NA培养基分离病原菌，获取与原分离物一致的分离物；
d）病原菌的再分子鉴定
将步骤c）获取的分离物，挑取单菌落，利用B. glumae的特异性引物BGSF/BGSR，进行菌落PCR,扩增目的片段，对扩增产物进行测序；将获得序列与Genbank中已有序列进行比对，获得分离物种属信息。
所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于所述的步骤a）中酒精溶液为70%酒***溶液，所述次氯酸钠溶液为1%的次氯酸钠水溶液。
所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于所述的步骤a）中恒温恒湿培养箱培养条件为温度30℃，湿度80%，培养24h。
所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于所述的步骤a）中Burkholderia通用引物BGGF的序列如SEQ ID No.1所示，BGGR的序列如SEQ ID No.2所示；B. glumae特异引物BGSF的序列如SEQ ID No.3所示，BGSR的序列如SEQ ID No.4所示。
所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于所述的步骤a）中PCR体系为：单菌落溶于10μL ddH2O，然后加入引物BGGF/BGGR或者BGSF/BGSR1.5μL，2XKOD FX缓冲液10μL，2.5mM dNTPs 3μL，KOD DNA polymerase 0.5μL；反应条件为：95℃5min， 98℃10s，55℃ 30s，68℃ 50s，35个循环，68℃7min。
所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于所述的步骤b）中植物营养液的成分为：1.5mMNH4NO3，0.3mMNaH2PO4，0.5mM K2SO4，1.0mM CaCl2，1.6mMMgSO4，0.5mM NaSiO3，20μM Fe-EDTA, 0.075μM (NH4)6Mo7O24，18.9μM H3BO3，9.5μM MnCl2，0.1μM CuSO4，0.2μM ZnSO4，70.8μM citric acid， pH 5.5。
所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于所述的步骤b）中病原菌液的含量为1×108CFU/mL。
所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于所述的步骤b）中恒温恒湿培养箱条件：温度30℃，光照14小时，黑暗10小时，湿度80%。
所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于所述的步骤d）中PCR体系为：单菌落溶于10μL ddH2O，然后加入引物BGSF/BGSR 1.5μL，2X KOD FX缓冲液10μL，2.5mM dNTPs 3μL，KOD DNA polymerase 0.5μL；反应条件为：95℃ 5min，98℃10s，55℃30s，68℃50s，35个循环，68℃7min。
与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
a）本发明首先采用在NA培养基上分离病原菌，B. glumae在NA培养基上呈现***圆形光滑灰白色菌落。根据生物学形态，能初步分离和筛选B. glumae；再利用Burkholderia通用引物BGGF/R和B. glumae的特异性引物BGSF/BGSR对分离物进行分子鉴定，能快速精准分离鉴定水稻细菌性穗枯病病原菌。
b）本发明采用3周的水稻幼苗作为回接材料，比孕穗期注射接种，大大缩短了试验时间。
c）本发明通过制备均匀的菌液浸根的接种方法，能使水稻快速发病，而且发病均匀稳定，保证鉴定结果的准确性。
d）本发明水稻细菌性穗枯病病原菌的鉴定方法简单、快速、准确。
附图说明
图1是本发明实施例分离的病原菌在NA培养基上的形态图。
图2是本发明实施例分离的病原菌的菌落PCR鉴定；图2中A：引物为BGGF/R，目标片段139bp；B：引物为BGSF/R，目标片段570bp；LaneM：Takara DL2000marker；Lane1：阴性对照；Lane2：分离的病原菌；箭头所指为目标片段 。
图3是分离纯化的病原菌回接在水稻幼苗上的症状；图3中A：分离纯化的病原菌回接在水稻幼苗上的萎蔫表型；1：正常营养液；2、3、4包含1×108CFU/mL分离的病原菌的营养液；幼苗为3周龄，所显症状为浸根后3天；B：分离纯化的病原菌回接在水稻幼苗上的萎蔫比例；每个处理8-10棵水稻苗，3次重复。
图4 是分离纯化的病原菌同源性比对结果。LMG2196为国际通用的B. glumae标准菌株；Fuyang：分离的病原菌。利用特异性引物BGSF/R扩增的来自Fuyang的产物的序列blast结果显示与LMG2196同源性≥99%。
具体实施方式
下面结合一个具体实施例进行说明。
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
水稻细菌性穗枯病是新上升的世界性重要水稻病害。此病在苗期和穗期均可发生，主要引起水稻幼苗枯萎腐烂，谷粒腐坏，造成产量损失最高达80%。本实施例是在早稻抽穗灌浆期，从中国水稻研究所杭州富阳实验基地采集病穗带回实验室进行分离鉴定。
1 病原菌的分离、鉴定和纯化
采用组织分离法选择典型腐坏谷粒，采集水稻细菌性穗枯病疑似样品，利用组织分离法选择褐化腐坏谷粒，依次70%酒精溶液表面消毒30s、1%次氯酸钠表面消毒5min、无菌水冲洗3次，采用无菌的剪刀剪碎谷粒（约5mm*5mm的小块），加500μL无菌水，用无菌的镊子挤压谷粒3-5min，无菌接种环蘸取菌液在NA培养基平板上划线，置于恒温恒湿培养箱30℃、湿度80%培养24h；挑取不同形态的菌落，利用Burkholderia通用引物BGGF/R和和B. glumae特异引物BGSF/R，Burkholderia通用引物BGGF的序列如SEQ ID No.1所示，BGGR的序列如SEQ IDNo.2所示；B.glumae特异引物BGSF的序列如SEQ ID No.3所示，BGSR的序列如SEQ ID No.4所示，先后进行两次PCR反应, 反应体系为：单菌落溶于10μL ddH2O，然后加入引物BGGF/BGGR或者BGSF/BGSR1.5μL，2X KOD FX缓冲液10μL，2.5mM dNTPs 3μL，KOD DNA polymerase0.5μL；反应条件为：95℃ 5min，（98℃10s，55℃ 30s，68℃ 50s）35个循环，68℃ 7min。将分别获得139bp和570bp目标片段的单菌落扩大培养，保存菌液。
2 病原菌的接种
选取生长约3周的健康水稻幼苗，放入加有分离纯化的1×108CFU/mL病原菌液的植物营养液（植物营养液的成分为：1.5mMNH4NO3，0.3mMNaH2PO4, 0.5mM K2SO4，1.0mM CaCl2,1.6mM MgSO4，0.5mM NaSiO3，20μM Fe-EDTA，0.075μM (NH4)6Mo7O24，18.9μM H3BO3， 9.5μMMnCl2，0.1μM CuSO4，0.2μM ZnSO4，70.8μM citric acid，pH 5.5）中浸根，在温度30℃，光照14小时，黑暗10小时，湿度80%的培养箱中，观察幼苗的生长状况。以没有病原菌液的植物营养液中生长的水稻幼苗为对照。每个处理8-10棵幼苗，3个重复，3天后观察幼苗的生长情况。
3 病原菌的再分离
待病害症状稳定后，采集病样，再分离病原菌，获取与原分离物一致的分离物：NA培养基上***圆形光滑灰白色菌落。
4 病原菌的再分子鉴定
将步骤c）获取到的病原菌接种至NA培养基平板，30度培养24h后，挑取单菌落，利用B. glumae的特异性引物BGSF/BGSR, 进行菌落PCR，PCR体系为：单菌落溶于10μL ddH2O，然后加入引物BGSF/BGSR 1.5μL，2X KOD FX缓冲液10μL，2.5mM dNTPs 3μL， KOD DNApolymerase 0.5μL；反应条件为：95℃ 5min，（98℃10s，55℃ 30s，68℃ 50s）35个循环，68℃ 7min。对PCR产物进行测序；将测序的序列与Genbank中已有序列进行比对，获得分离物种属信息。
对采集的腐坏谷粒样品，通过分离和纯化培养，都得到一种优势菌落，在NA培养基上呈***圆形光滑灰白色状（图1）。将此优势菌落，经BGGF/RBGSF和/BGSR两对引物的PCR检测，获得139bp（图2A）和570bp目标片段（图2B）。将获得的目标片段回收纯化测序，将测出的序列与GENEBANK中序列进行了比对。BLAST结果表明分离物与B. glumae的同源性≥99%。
按照柯赫氏法验证，将NA培养基上***圆形光滑灰白色的菌落扩大培养的菌液回接水稻的幼苗，引起幼苗萎蔫（图3A），数据统计结果显示水稻幼苗经1×108CFU/mL分离的病原菌液浸根3天后，萎蔫比例达80%，而没有被菌液浸根的对照萎蔫比例只有10%（图3B）。这说明分离到的病原菌具有很强的致病性，而且症状与B. glumae引起水稻的苗期症状相似。
利用B. glumae的特异性引物BGSF/BGSR，对从萎蔫的幼苗上分离的病原菌进行PCR特异性扩增，扩增产物经琼脂糖电泳检测在570bp左右处均能扩增出特异性较好的DNA片段。对特异扩增的片段进行回收并进行双向测序。将测出的序列与GENEBANK中序列进行了比对，BLAST结果表明分离物与B. glumae LMG2196的同源性≥99%（图4）。
以上的结果充分说明我们发明了一种快速精准的分离鉴定水稻细菌性穗枯病病原的方法。
水稻细菌性穗枯病虽在中国列为检疫性病害，但它的实际发生面积和区域却在逐年增加，不得不引起我们的重视，急需对其进行快速和精准的分离和鉴定。
本实施例对来自杭州富阳地区的水稻细菌性穗枯病病原菌进行分离鉴定，采用NA培养基从形态上初步判定、PCR特异性检测再结合回接水稻幼苗和再分离实验，缩短了时间，提高了准确性，能快速精准分离鉴定B. glumae，证实B. glumae引起了水稻的穗枯病，是其主要病原菌，要采取对应的防治方法。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水稻研究所
<120> 一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ctctgcaact cgagtgcatg agc 23
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cggttagact agccacttct ggtaaa 26
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
acctgatcgt gttgggagac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ccatgaagca gtcgatgaga 20

Claims (9)

1.一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
a）病原菌的分离、鉴定和纯化
采集水稻细菌性穗枯病疑似样品，利用组织分离法选择褐化腐坏谷粒，依次使用酒精溶液和次氯酸钠表面消毒，无菌水冲洗，谷粒细化溢菌，无菌接种环蘸取菌液在NA培养基平板上划线，置于恒温恒湿培养箱培养；挑取不同形态的单菌落，利用Burkholderia通用引物BGGF/BGGR和B. glumae特异引物BGSF/BGSR，进行两次菌落PCR反应，获得目标片段的单菌落扩大培养，保存菌液；
b）病原菌的接种
选取生长约3周的健康水稻幼苗，放入加有步骤a）分离纯化的病原菌液的植物营养液中浸根，在恒温恒湿培养箱中，观察幼苗的生长状况，并以没有加病原菌液的植物营养液中生长的水稻幼苗为对照；
c）病原菌的再分离
待病害症状稳定后，采集病样，再在NA培养基分离病原菌，获取与原分离物一致的分离物；
d）病原菌的再分子鉴定
将步骤c）获取的分离物，挑取单菌落，利用B. glumae的特异性引物BGSF/BGSR，进行菌落PCR,扩增目的片段，对扩增产物进行测序；将获得序列与Genbank中已有序列进行比对，获得分离物种属信息。
2.如权利要求1所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于所述的步骤a）中酒精溶液为70%酒***溶液，所述次氯酸钠溶液为1%的次氯酸钠水溶液。
3.如权利要求1所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于所述的步骤a）中恒温恒湿培养箱培养条件为温度30℃，湿度80%，培养24h。
4.如权利要求1所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于所述的步骤a）中Burkholderia通用引物BGGF的序列如SEQ ID No.1所示，BGGR的序列如SEQID No.2所示；B. glumae特异引物BGSF的序列如SEQ ID No.3所示，BGSR的序列如SEQ IDNo.4所示。
5.如权利要求1所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于所述的步骤a）中PCR体系为：单菌落溶于10μL ddH2O，然后加入引物BGGF/BGGR或者BGSF/BGSR1.5μL，2X KOD FX缓冲液10μL，2.5mM dNTPs 3μL，KOD DNA polymerase 0.5μL；反应条件为：95℃ 5min，98℃10s，55℃ 30s，68℃ 50s，35个循环，68℃7min。
6.如权利要求1所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于所述的步骤b）中植物营养液的成分为：1.5mMNH4NO3，0.3mMNaH2PO4，0.5mM K2SO4，1.0mMCaCl2, 1.6mM MgSO4，0.5mM NaSiO3，20μM Fe-EDTA，0.075μM (NH4)6Mo7O24，18.9μM H3BO3，9.5μM MnCl2，0.1μM CuSO4，0.2μM ZnSO4，70.8μM citric acid，pH 5.5。
7.如权利要求1所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于所述的步骤b）中病原菌液的含量为1×108CFU/mL。
8.如权利要求1所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于所述的步骤b）中恒温恒湿培养箱条件：温度30℃，光照14小时，黑暗10小时，湿度80%。
9.如权利要求1所述的一种水稻细菌性穗枯病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于所述的步骤d）中PCR体系为：单菌落溶于10μL ddH2O，然后加入引物BGSF/BGSR 1.5μL，2X KODFX缓冲液10μL，2.5mM dNTPs 3μL，KOD DNA polymerase 0.5μL；反应条件为：95℃ 5min，98℃10s，55℃30s，68℃50s，35个循环，68℃7min。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108410778A (zh) * 2018-05-11 2018-08-17 中国水稻研究所 一种水稻细菌性穗枯病菌快速高效分离方法
CN112195217A (zh) * 2020-10-30 2021-01-08 宁夏农林科学院农作物研究所（宁夏回族自治区农作物育种中心） 一种杂草稻病原菌致病性测定方法及鉴定装置
CN113186314A (zh) * 2021-05-19 2021-07-30 浙江大学 一种用于检测水稻细菌性穗枯病菌的引物探针组合及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103864498A (zh) * 2014-04-04 2014-06-18 北京天食和谷农业科技有限公司 水稻营养液及其制作方法
CN106222097A (zh) * 2016-08-27 2016-12-14 四川省农业科学院土壤肥料研究所 一种高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103864498A (zh) * 2014-04-04 2014-06-18 北京天食和谷农业科技有限公司 水稻营养液及其制作方法
CN106222097A (zh) * 2016-08-27 2016-12-14 四川省农业科学院土壤肥料研究所 一种高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
徐丽慧: "水稻细菌性谷枯病菌的分子检测及细菌性褐条病病原鉴定研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑（电子期刊）》 *
李路等: "水稻穗腐病和穗枯病的研究进展", 《中国水稻科学》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108410778A (zh) * 2018-05-11 2018-08-17 中国水稻研究所 一种水稻细菌性穗枯病菌快速高效分离方法
CN112195217A (zh) * 2020-10-30 2021-01-08 宁夏农林科学院农作物研究所（宁夏回族自治区农作物育种中心） 一种杂草稻病原菌致病性测定方法及鉴定装置
CN113186314A (zh) * 2021-05-19 2021-07-30 浙江大学 一种用于检测水稻细菌性穗枯病菌的引物探针组合及应用

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