CN107454848B - 用于诱导针对丝状病毒感染的保护性免疫的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于诱导针对丝状病毒感染的保护性免疫，具体地为针对埃博拉病毒和马尔堡病毒的一种或多种亚型的感染的保护性免疫的组合物、疫苗和方法。

Description

用于诱导针对丝状病毒感染的保护性免疫的方法和组合物
发明领域
本发明涉及用于诱导针对丝状病毒感染的保护性免疫，具体地为针对埃博拉病毒(Ebolaviruses)和马尔堡病毒(Marburg virus)的一种或多种亚型的感染的保护性免疫的组合物、疫苗和方法。
背景技术
埃博拉病毒(诸如扎伊尔(Zaire)埃博拉病毒(EBOV)和苏丹(Sudan)埃博拉病毒(SUDV))和近缘马尔堡病毒(MARV)与北美、欧洲和非洲的人类和灵长类动物中高致死性埃博拉出血热(EHF)的爆发相关联。这些病毒为已知感染人类和非人灵长类动物并伴随严重健康后果(包括死亡)的丝状病毒。丝状病毒感染已在人类中导致高达90％的病例致死率。EBOV、SUDV和MARV感染导致EHF，其中通常在感染后7至10天内发生死亡。EHF表现为急性发热性综合症，其出现突然发热、恶心、呕吐、腹泻、斑状丘疹、不适、虚脱、增加的血管通透性的全身性体征、凝血功能异常以及先天性免疫应答调节障碍。大部分疾病似乎是由对感染的先天性免疫应答的调节障碍以及由血管内皮细胞中的病毒复制引起，所述病毒诱导宿主细胞的死亡和内皮屏障的破坏。丝状病毒可通过小颗粒气溶胶或通过与人类或NHP来源的感染血液、器官和体液直接接触来传播。据报道单个病毒粒子的感染足以在人类中引起埃博拉出血热(EHF)。目前，不存在批准用于治疗或预防EHF的治疗剂或疫苗。支持性护理仍然是感染有丝状病毒的个体的唯一批准的医疗干预。
作为严重人类疾病的原因，丝状病毒作为天然感染的来源并且也作为可能的生物***试剂而获得持续关注。尚未明确鉴别出丝状病毒在野外的储层。已描述引起EHF的四种亚型的埃博拉病毒，即在扎伊尔、苏丹、本迪布焦(Bundibugyo)和象牙海岸地区的埃博拉病毒(Sanchez,A.等1996PNAS USA 93:3602–3607)。这些亚型的埃博拉病毒具有相似的基因结构，例如含有七个线性排列的基因的负链RNA病毒。结构基因产物包括例如以两种替代形式存在的包膜糖蛋白、由RNA编辑产生的分泌的可溶性糖蛋白(ssGP)和介导病毒进入的跨膜糖蛋白(GP)(Sanchez等1996PNAS USA 93:3602–3607).
已表明免疫可适用于针对埃博拉感染进行保护，因为埃博拉亚型内核苷酸多态性似乎比其他RNA病毒更少(Sanchez等1996PNAS USA 93:3602–3607)。直到最近，针对丝状病毒的预防疫苗的发展已具有变化的结果，部分是因为对针对丝状病毒感染的保护性免疫应答的要求知之甚少。另外，在天然储层内循环的大量丝状病毒使得设计针对所有种类的丝状病毒进行保护的疫苗的努力复杂化。
目前，存在若干疫苗抗原递送平台，其在暴露于高感染剂量的丝状病毒的非人灵长类动物(NHP)中证实有多种保护水平。疫苗候选物在发展中是基于多种平台技术，包括具有复制能力的载体(例如水泡性口炎病毒；狂犬病病毒；副流感病毒)；不具有复制能力的载体(腺病毒、改性的安卡拉牛痘病毒)；包括细菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞中表达的病毒样颗粒在内的蛋白质亚基；DNA疫苗；和/或活的和杀死的减毒丝状病毒(Friedrich等，2012)。EBOV糖蛋白GP为针对暴露于相同种类的EBOV进行保护的疫苗的必要组分。此外，包括来自EBOV和SUDV(两种最致命种类的埃博拉病毒)的GP可保护猴子使其免于EBOV和SUDV肌内暴露，以及暴露于远缘本迪布焦病毒(BDBV)、塔伊森林(
Figure BDA0001238052940000021
Forest)埃博拉病毒(TAFV；以前称为象牙海岸或科特迪瓦埃博拉病毒)种类。同样，包括来自MARV的GP可保护猴子使其免于MARV肌内暴露和气溶胶暴露。用于这些病毒的医学防护措施的发展为高度优先的，尤其是PAN-丝状病毒疫苗的发展—所述疫苗为针对全部致病丝状病毒进行保护的一种疫苗。
复制缺陷型腺病毒载体(rAd)为胞内免疫应答的强大诱导物并且因此已经充当基于基因的疫苗的载体，尤其是对于慢病毒属和丝状病毒以及其他非病毒病原体的疫苗(Shiver等，(2002)Nature 415(6869):331-5；(Hill等,Hum Vaccin 6(1):78-83.；Sullivan等,(2000)Nature 408(6812):605-9；Sullivan等,(2003)Nature 424(6949):681-4；Sullivan等,(2006)PLoS Med 3(6):e177；Radosevic等,(2007)；Santra等,(2009)Vaccine 27(42):5837-45。
基于腺病毒的疫苗作为人类疫苗具有若干优势，因为它们在GMP条件下可产生至高滴度并且已证明在人类中为安全的和免疫原性的(Asmuth等,J Infect Dis 201(1):132-41；Kibuuka等,J Infect Dis 201(4):600-7；Koup等,PLoS One 5(2):e9015.；Catanzaro等,(2006)J Infect Dis 194(12):1638-49；Harro等,(2009)Clin VaccineImmunol 16(9):1285-92。尽管由于rAd5在引起广泛的抗体和CD8+T细胞应答中的显著效能而使用所述rAd5进行大多数初始疫苗工作，但是人类中预先存在的对rAd5的免疫可限制功效(Catanzaro,(2006)；Cheng等,(2007)PLoS Pathog 3(2):e25.；McCoy等,(2007)J Virol81(12):6594-604.；Buchbinder等,(2008)Lancet 372(9653):1881-93)。此性质可能限制rAd5在许多疫苗的临床应用中的使用，所述疫苗目前处在发展中并且包括埃博拉病毒(EBOV)和马尔堡病毒(MARV)。
从腺病毒血清型26和血清型35衍生的复制缺陷型腺病毒载体rAd26和rAd35分别具有规避Ad5预先存在的免疫的能力。rAd26可在适于以大范围且以临床等级产生这些载体的Ad5E1互补细胞系中生长至高滴度(Abbink等，2007)，并且已显示此载体在初免-加强疫苗策略中诱导体液介导和细胞介导的免疫应答(Abbink等,2007；Liu,等,(2009)Nature457(7225):87-91)。rAd35载体在适于产生临床等级的疫苗的细胞系上生长至高滴度(Havenga等,(2006)J Gen Virol 87(Pt 8):2135-43)，并且已配制用于注射以及稳定的可吸入粉末(Jin等,Vaccine 28(27):4369-75)。这些载体显示人类树突状细胞的高效转导(de Gruijl等,(2006)J Immunol 177(4):2208-15；Lore等,(2007)J Immunol 179(3):1721-9)，并且因此具有介导高水平的抗原递送和呈递的能力。
改性的安卡拉牛痘(MVA)病毒与牛痘病毒有关，为痘病毒科中正痘病毒属的成员。已知痘病毒因为其胞浆内表达而为CD8T细胞应答的良好诱导物。然而，通常认为痘病毒不擅长于产生CD4MHC II类限制的T细胞(参见，例如Haslett等Journal of InfectiousDiseases 181:1264-72(2000),第1268页)。MVA已被工程化为用作用于重组基因表达的病毒载体或用作重组疫苗。
为开发更安全的产物(诸如疫苗或药物)，具有增强的安全性能的MVA的病毒株已由Bavarian Nordic育出。MVA由Bavarian Nordic进一步传代并且指定为MVA-BN，其代表样品于2000年8月30日以登录号V00083008储存在欧洲细胞培养物保藏所(EuropeanCollection of Cell Cultures，ECACC)。在WO 02/42480(US 2003/0206926)和WO 03/048184(US 2006/0159699)中进一步描述MVA-BN，所述两份专利均以引用的方式整体并入本文。
MVA-BN可连接并进入人类细胞，其中病毒编码的基因非常有效地表达。MVA-BN不具有复制能力，这意味着所述病毒并不在人类细胞中复制。在人类细胞中，表达病毒基因并且不产生感染病毒。根据美国疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control andPrevention in the United States)，MVA-BN被分类为生物安全等级1生物体。MVA-BN和衍生物的制剂已施用至许多类型的动物和超过2000名人类受试者，包括免疫缺陷型个体。所有疫苗接种已证明是总体上安全且耐受良好的。尽管其高减毒作用和减少的毒性，在临床前研究中已显示MVA-BN引发对疫苗和由克隆到MVA基因组中的基因所编码的异源基因产物的体液和细胞免疫应答两者[E.Harrer等(2005),Antivir.Ther.10(2):285-300；A.Cosma等(2003),Vaccine 22(1):21-9；M.Di Nicola等(2003),Hum.Gene Ther.14(14):1347-1360；M.Di Nicola等(2004),Clin.Cancer Res.,10(16):5381-5390]。
针对改良疫苗存在未满足的需要，所述改良疫苗引发针对丝状病毒的免疫应答，尤其是针对更致命的埃博拉病毒和马尔堡病毒的保护性免疫。
发明概述
本发明中发现，不具有复制能力的载体的各种初免-加强组合产生针对丝状病毒感染的有效免疫保护。
因此，本发明的一个总体方面涉及一种组合疫苗，所述疫苗组合包含：
(i)第一组合物，其包含免疫有效量的腺病毒载体和药学上可接受的载体，所述腺病毒载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白或基本上相似的抗原蛋白的核酸；以及
(ii)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体和药学上可接受的载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白或基本上相似的抗原蛋白的核酸；
其中所述组合物中的一种为初免组合物并且所述另一种组合物为加强组合物。
本发明的另一个总体方面涉及以下的用途：
包含免疫有效量的腺病毒载体的第一组合物，所述腺病毒载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白或基本上相似的抗原蛋白的核酸；以及包含免疫有效量的MVA载体的第二组合物，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白或基本上相似的抗原蛋白的核酸；用于产生针对至少一种丝状病毒亚型的保护性免疫应答；其中所述第一组合物和第二组合物用于引发或用于加强所述免疫应答。
在某些实施方案中，第一组合物(i)还包含腺病毒载体，所述腺病毒载体包含编码第二丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。在其他实施方案中，第一组合物(i)还包含腺病毒载体，所述腺病毒载体包含编码第三丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
根据本发明的丝状病毒亚型可为任何丝状病毒亚型。
在一个优选的实施方案中，第一丝状病毒亚型、第二丝状病毒亚型和第三丝状病毒亚型选自下组：扎伊尔、苏丹、雷斯顿(Reston)、本迪布焦、塔伊森林和马尔堡。抗原蛋白可为来自包含抗原决定簇的任何丝状病毒的蛋白质。在一个优选的实施方案中，抗原蛋白为糖蛋白或核蛋白。根据本发明由包含在第一溶液和第二溶液中的腺病毒载体或MVA载体编码的抗原蛋白可为来自任何丝状病毒的任何抗原蛋白。在一个优选的实施方案中，所述第一丝状病毒类型、第二丝状病毒类型和第三丝状病毒类型的抗原蛋白选自下组：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。在一个优选的实施方案中，第一丝状病毒亚型、第二丝状病毒亚型和第三丝状病毒亚型不相同。
在另一个实施方案中，第一组合物(i)中的腺病毒载体包含编码具有选自下组的序列的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5。在一个优选的实施方案中，组合物(i)还包含腺病毒，所述腺病毒包含编码具有选自下组的不同序列的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。优选地，组合物(i)还包含腺病毒，所述腺病毒包含编码具有选自下组的另一不同序列的抗原蛋白的核酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。
在一个优选的实施方案中，第一组合物(i)中的腺病毒载体包含编码具有SEQ IDNO:1的抗原蛋白的核酸。在一个优选的实施方案中，组合物(i)还包含腺病毒，所述腺病毒包含编码具有SEQ ID NO:2的抗原蛋白的核酸。优选地，组合物(i)还包含腺病毒，所述腺病毒包含编码具有SEQ ID NO:3的抗原蛋白的核酸。
在又一个优选的实施方案中，组合物(ii)中的MVA载体包含编码至少四种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。优选地，所述MVA载体包含编码来自四种不同丝状病毒亚型的具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的抗原蛋白的核酸。
可以设想的是本文描述的方法、疫苗和组合物可体现在试剂盒中。例如，在一个实施方案中，本发明可包括一种试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)第一组合物，其包含免疫有效量的腺病毒载体和药学上可接受的载体，所述腺病毒载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白或基本上相似的抗原蛋白的核酸；以及
(ii)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体和药学上可接受的载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白或基本上相似的抗原蛋白的核酸；
其中所述组合物中的一种为初免组合物并且所述另一种组合物为加强组合物。
因此在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种组合疫苗、试剂盒或用途，其中组合物(i)中的腺病毒载体包含编码具有SEQ ID NO:1的抗原蛋白的核酸；并且其中组合物中的MVA载体包含编码来自四种不同丝状病毒亚型的具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5的抗原蛋白的核酸。
在又一个优选的实施方案中，本发明涉及一种组合疫苗、试剂盒或用途，其中第一组合物包含含有编码具有SEQ ID NO:1的第一抗原蛋白的核酸的腺病毒、含有编码具有SEQID NO:2的第二抗原蛋白的核酸的腺病毒、以及含有编码具有SEQ ID NO:3的第三抗原蛋白的核酸的腺病毒；并且其中组合物(ii)中的MVA载体包含编码来自四种不同丝状病毒亚型的具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的抗原蛋白的核酸。
在一个优选的实施方案中，包含在本发明的组合疫苗、试剂盒中的腺病毒载体或用于产生针对至少一种丝状病毒亚型的保护性免疫应答的腺病毒载体为rAd26或rAd35载体。在所述用途的一个优选的实施方案中，在初免组合物之后1-12周施用加强组合物。
本发明的一个另外的总体方面涉及一种在受试者中诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法，所述方法包括：
a.将包含免疫有效量的腺病毒载体的第一组合物施用于受试者，所述腺病毒载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原糖蛋白或基本上相似的抗原蛋白的核酸；以及
b.将包含免疫有效量的MVA载体的第二组合物施用于受试者，所述MVA载体包含编码丝状病毒的至少两种病毒株的抗原蛋白或基本上相似的抗原蛋白的核酸；
其中步骤(a)和步骤(b)以任意顺序进行。
在某些实施方案中，第一组合物还包含腺病毒载体，所述腺病毒载体包含编码第二丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。在其他实施方案中，第一组合物还包含腺病毒载体，所述腺病毒载体包含编码第三丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
在另一个实施方案中，第一组合物中的腺病毒载体包含编码具有SEQ ID NO:1的抗原蛋白的核酸。在一个优选的实施方案中，组合物还包含腺病毒，所述腺病毒包含编码具有SEQ ID NO:2的抗原蛋白的核酸。优选地，组合物还包含腺病毒，所述腺病毒包含编码具有SEQ ID NO:3的抗原蛋白的核酸。
在一个甚至更优选的实施方案中，第二组合物中的MVA载体包含编码至少四种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
优选地，所述MVA载体包含编码来自四种不同丝状病毒亚型的具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的抗原蛋白的核酸。
因此在一个优选的实施方案中，本发明涉及在受试者中诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法，其中第一组合物中的腺病毒载体包含编码具有SEQ ID NO:1的抗原蛋白的核酸；并且其中第二组合物中的MVA载体包含编码来自四种不同丝状病毒亚型的抗原蛋白的具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核酸。
在又一个优选的实施方案中，本发明涉及一种在受试者中诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法，其中第一组合物包含含有编码具有SEQ ID NO:1的第一抗原蛋白的核酸的腺病毒、含有编码具有SEQ ID NO:2的第二抗原蛋白的核酸的腺病毒、以及含有编码具有SEQ ID NO:3的第三抗原蛋白的核酸的腺病毒；并且其中第二组合物中的MVA载体包含编码来自四种不同丝状病毒亚型的具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的抗原蛋白的核酸。
在一个优选的实施方案中，用于本发明的方法中的腺病毒载体为rAd26或rAd35载体。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述方法的步骤(b)在步骤(a)之后1-12周进行。
在另一个优选的实施方案中，初免疫苗接种，即在第0周进行步骤(a)，随后进行加强疫苗接种，即在第1-10周，更优选地在第6-10周，以及甚至更优选地在第8周进行步骤(b)。在另一个优选的实施方案中，初免疫苗接种，即在第0周进行步骤(a)，随后进行加强疫苗接种，即在第1-4周，优选地在第1、2或4周进行步骤(b)。
在另一个优选的实施方案中，初免疫苗接种，即在第0周进行步骤(b)，随后进行加强疫苗接种，即在第1-10周，更优选地在第6-10周，以及甚至更优选地在第8周进行步骤(a)。在另一个优选的实施方案中，初免疫苗接种，即在第0周进行步骤(b)，随后进行加强疫苗接种，即在第1-4周，优选地在第1、2或4周进行步骤(a)。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述方法包括使用免疫有效量的表达一种或多种丝状病毒抗原蛋白的一个或多个rAd26载体进行初免疫苗接种，随后使用免疫有效量的不同于rAd26的一个或多个载体进行加强疫苗接种，所述一个或多个载体优选地为表达一种或多种丝状病毒糖蛋白或基本上相似的糖蛋白的MVA载体。
在本发明的优选的实施方案中，一种或多种丝状病毒为埃博拉病毒或马尔堡病毒。埃博拉病毒可为任何种类，例如，扎伊尔埃博拉病毒(EBOV)和苏丹埃博拉病毒(SUDV)、雷斯顿病毒、本迪布焦病毒、塔伊森林病毒。马尔堡病毒(MARV)可以为任何种类。合适的丝状病毒抗原蛋白的示例性氨基酸序列示出在SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5。
附图简述
当结合附图阅读时，上述概述以及本发明的以下详述将更好地理解。应了解，本发明不限于附图中所示的精确的实施方案。
专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在提出请求并支付必要费用后，本事务所将提供具有一张或多张彩色附图的本专利或专利申请公布的副本。
在附图中：
图1汇总动物研究中的分组；
图2示出研究的实验设计；
图3示出使用攻击性病毒株埃博拉扎伊尔基奎特1995(Ebola Zaire Kikwit1995)进行攻击的结果；
图4示出从动物研究观察到的埃博拉扎伊尔糖蛋白特异性体液免疫应答(通过ELISA评估)：独立于疫苗接种方案获得非常高的抗体滴度(ND＝未分析时间点)；
图5示出从动物研究观察到的苏丹古卢(Sudan Gulu)糖蛋白特异性体液免疫应答(通过ELISA评估)：独立于疫苗接种方案获得非常高的抗体滴度(ND＝未分析时间点)；
图6示出从动物研究观察到的马尔堡安哥拉(Marburg Angola)糖蛋白特异性体液免疫应答(通过ELISA评估)：独立于疫苗接种方案获得非常高的抗体滴度(ND＝未分析时间点)；并且
图7示出通过IFN-γELISPOT分析的对ZEBOV、SEBOV和MARVA GP的特异性细胞免疫应答；
图8示出通过抗EBOV GP ELISA分析的对ZEBOV GP的特异性免疫应答，其中在第50天，在使用MVA作为初免物并使用Ad26作为加强免疫物而非相反顺序的疫苗来免疫的受试者中观察加强免疫后更高的体液免疫应答；
图9示出通过ELISpot测定分析的人类中对ZEBOV GP的特异性T细胞应答；
图10示出通过ICS测定分析的人类中对ZEBOV GP的特异性CD8+细胞免疫应答；
图11示出当使用28天初免加强间隔时，通过ICS测定的人类中EBOV GP-特异性CD8+T细胞应答的功能分布；
图12示出当使用56天初免加强间隔时，通过ICS测定的人类中EBOV GP-特异性CD8+T细胞应答的功能分布；
图13示出通过ICS测定分析的人类中对ZEBOV GP的特异性CD4+细胞免疫应答；
图14示出当使用28天初免加强间隔时，通过ICS测定的人类中EBOV GP-特异性CD4+T细胞应答的功能分布；
图15示出当使用56天初免加强间隔时，通过ICS测定的人类中EBOV GP-特异性CD4+T细胞应答的功能分布；
图16示出通过使用Ad26.ZEBOV进行初免免疫随后在14天后进行MVA-BN-Filo加强来诱导的通过ELISA(A)、ELIspot(B)和ICS(C和D)评估的免疫应答；
图17示出通过抗-EBOV GP ELISA分析的对ZEBOV GP的特异性免疫应答；
图18示出通过ELISpot测定分析的人类中对ZEBOV GP的特异性T细胞应答；
图19示出当使用MVA作为初免物并在14天后使用Ad26作为加強免疫物，通过ICS测定分析的人类中对ZEBOV GP特异的强且平衡的CD4+(A)和CD8+(B)细胞免疫应答以及通过ICS测定的人类中EBOV GP-特异性CD8+(C)和CD4+(D)T细胞应答的功能分布。
图20示出通过用由GP ELISA测定的Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo和MVA-BN-Filo/Ad26.ZEBOV方案进行的疫苗接种所引发的EBOV Mayinga Gp结合的抗体。疫苗接种方案指示于下方x轴。高IM和标准IM是指MVA BN Filo的剂量和路径。水平虚线指示LOD。
发明详述
在背景中和贯穿本说明书中引用或描述各种出版物、文章和专利；这些参考文献各自以引用的方式整体并入本文。对本说明中已包括的文件、法案、材料、装置、物品等的讨论是出于提供本发明的上下文的目的。所述讨论并非承认任何或全部的这些内容形成关于公开的或要求的任何发明的当前技术的部分。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。另外，本文使用的某些术语具有本说明书中阐述的含义。本文引用的所有专利、公开的专利申请和公布以引用的方式并入，就如同完全在本文阐述一样。必需指出，除非上下文另外清楚地指出，否则如本文和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数引用。
除非另外指明，否则在一系列要素前的术语“至少”应当理解为是指系列中的每一要素。本领域的技术人员将认识到，或仅使用常规实验就能够确定，本文中所描述的本发明的具体实施方案的许多等同物。所述等效方案意图由本发明涵盖。
贯穿本说明书和以下权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”和变型诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应理解为暗示包括所陈述的整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含(comprising)”可由术语“含有(containing)”或“包括(including)”替代或者当在本文中使用时经常用术语“具有(having)”替代。无论何时在本文中使用时，前述术语(包含、含有、包括、具有)中的任一种，在本发明的一个方面或实施方案的上下文中可由术语“由…组成”替代，尽管这不太优选。
当在本文中使用时，“由...组成”排除了在权利要求要素中未指明的任何要素、步骤、或成分。当在本文中使用时，“基本上由…组成”不排除本质上并不影响所述权利要求的基本特征和新颖特征的材料或步骤。
如本文所用的，多个引用的要素之间的连接术语“和/或”应理解为包含单独的和组合的选项两者。例如，当两个要素由和/或连接时，第一选项是指在不具有第二要素的情况下第一要素的应用。第二选项是指在不具有第一要素的情况下第二要素的应用。第三选项是指第一要素和第二要素一起的应用。这些选项中的任一个应理解为属于所述含义之内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。所述选项中的多于一个的同时应用也应理解为属于所述含义之内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
如本文所用的，“受试者”意指将或已通过根据本发明的实施方案的方法处理的任何动物，优选地为哺乳动物，最优选地为人类。本文所用的术语“哺乳动物”包括任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴子、人类等，更优选地为人类。
如本文所用的，术语“保护性免疫”或“保护性免疫应答”意指疫苗接种的受试者能够控制关于免疫接种所针对的致病因子的感染。通常，已发展“保护性免疫应答”的受试者仅发展轻度到中度的临床症状或根本无症状。通常，具有针对某一因子的“保护性免疫应答”或“保护性免疫”的受试者将不会因感染有所述因子而死亡。
“腺病毒衣壳蛋白”是指腺病毒(例如，Ad 26或Ad 35)的衣壳上的蛋白质，所述蛋白质涉及决定特定腺病毒的血清型和/或向性。腺病毒衣壳蛋白通常包含纤维、五邻体蛋白和/或六邻体蛋白。如本文所用的，“Ad26衣壳蛋白”或“Ad35衣壳蛋白”可为例如包含Ad26或Ad35衣壳蛋白的至少一部分的嵌合衣壳蛋白。在某些实施方案中，衣壳蛋白为Ad26或Ad35的整个衣壳蛋白。在某些实施方案中，六邻体蛋白、五邻体蛋白和纤维属于Ad26或Ad35。
术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换使用，并且被定义为引起免疫***刺激的一种或多种物质。在此上下文中，佐剂用于增强对本发明的腺病毒载体和/或MVA载体的免疫应答。
当应用到序列中的氨基酸残基的位置时，术语“对应于”意指当序列最佳比对时多个序列中对应的位置。
在两个或更多个核酸或多肽序列(例如，丝状病毒的糖蛋白和编码所述糖蛋白的多核苷酸)的上下文中，术语“同一的”或“同一性”百分百是指在进行比较和比对以获得最大对应性时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查所测量的，相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核酸的两个或更多个序列或子序列。
针对序列比较，通常一个序列充当参比序列，将其与测试序列比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入到计算机中，指定子序列坐标(如果需要的话)，并且指定序列算法的程序参数。随后序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
可进行用于比较的序列的最佳比对，例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法；通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法；通过Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索方法；通过这些算法的计算机化实施方式(GAP,BESTFIT,FASTA,andTFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)，或通过目视检查(通常参见Current Protocols inMolecular Biology,F.M.Ausubel等编辑,Current Protocols,a joint venture betweenGreene Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,(1995Supplement)(Ausubel))。
适于测定序列同一性百分比和序列相似性的算法的实例为BLAST和BLAST 2.0算法，所述算法分别描述于Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschuel等(1977)Nucleic Acids Res.25:3389-3402。用于执行BLAST分析的软件为通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)可公开获得的。这种算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短词来鉴定高评分序列对(HSP)，所述短词在与数据库序列中具有相同长度的词比对时匹配或满足某些正值阈评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字命中充当种子启动搜索，以寻找含有它们的较长HSP。接着该字命中沿着每条序列在两个方向延伸，直到能够提高累积比对评分。
对于核苷酸序列，利用参数M(一对匹配残基的奖励评分；通常>0)和N(非配对残基的处罚评分；通常<0)计算累积评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积评分。字命中在每个方向上的延伸在下列情况时停止：累积比对评分由其达到的最大值降低数量X；由于一个或者多个负评分残基比对的积累而使累积评分降至0或者以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定所述比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用的默认值是字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4并且进行两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认值是字长(W)为3，期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还进行两个序列之间的相似性统计学分析(参见，例如Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量为最小总和概率(P(N))，其提供通过两个核苷酸或者核苷酸序列之间偶然发生配对的概率表示。例如，如果在测试核酸与参比核酸的比较中最小总和概率小于约0.1、更优选地小于约0.01并且最优选地小于约0.001，则认为核酸与参比序列相似。
两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示为：如下所述的，由第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽具有免疫交叉反应。因此，多肽通常与第二多肽基本上相同，例如，在两种多肽仅因保守取代而不同的情况下。两个核酸序列基本上相同的另一个指示为：如下所述的，两个分子在严格条件下互相杂交。
在本发明的丝状病毒抗原蛋白的上下文中术语“基本上相似”指示在10-20个氨基酸的比较窗上，多肽包含与参考序列具有至少90％、优选地至少95％的序列同一性的序列。序列同一性百分比通过在比较窗上比较两个最佳比对的序列来确定，其中比较窗中的多核苷酸序列的部分与参考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)以用于两个序列的最佳比对。所述百分比通过以下进行计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
在本发明中发现，异源初免-加强组合(具体地说，用Ad26进行初免，随后用MVA进行加强并且反之亦然)出人意料地有效于产生针对丝状病毒的一种或多种亚型的保护性免疫应答。
丝状病毒抗原蛋白
埃博拉病毒和遗传相关性马尔堡病毒为与北美、欧洲和非洲的人类和灵长类动物中高致死性出血热的爆发相关联的丝状病毒(Peters,C.J.等，在：Fields Virology编辑Fields,B.N.等1161-1176,Philadelphia,Lippincott-Raven,1996；Peters,C.J.等1994Semin Virol 5:147-154中)。尽管已定义了若干亚型，但这些病毒的基因结构为相似的，各自含有七个线性排列的基因。在所述病毒蛋白之间，包膜糖蛋白以两种替代形式存在，即由RNA编辑产生的50-70千道尔顿(kDa)分泌蛋白(sGP)和介导病毒进入的130kDa跨膜糖蛋白(GP)(Peters,C.J.等，在：Fields Virology编辑Fields,B.N.等1161-1176,Philadelphia,Lippincott-Raven,1996；Sanchez,A.等1996PNAS USA 93:3602–3607中)。其他结构基因产物包括核蛋白(NP)、基质蛋白VP24和VP40、假定非结构蛋白VP30和VP35以及病毒聚合酶(综述于Peters,C.J.等，在：Fields Virology编辑Fields,B.N.等1161-1176,Philadelphia,Lippincott-Raven,1996中)。
包含在腺病毒和MVA载体中的核酸分子可编码任何丝状病毒种类的结构基因产物，诸如扎伊尔亚型(典型种类，在本文中也称为ZEBOV)、苏丹(在本文中也称为SEBOV)、雷斯顿亚型、本迪布焦亚型和象牙海岸亚型。存在单一种类的马尔堡病毒(在本文中也称为MARV)。
本发明的腺病毒载体和MVA载体可用于表达抗原蛋白，所述抗原蛋白为包含多种多样的丝状病毒抗原的抗原决定簇的蛋白质。在一个典型和优选的实施方案中，本发明的载体包含编码跨膜形式的病毒糖蛋白(GP)的核酸。在其他实施方案中，本发明的载体可编码分泌形式的病毒糖蛋白(ssGP)或病毒核蛋白(NP)。
本领域技术人员将认识到，编码丝状病毒抗原蛋白的核酸分子可被改性，例如，只要改性的表达的蛋白质引发针对病原体或疾病的免疫应答，本文阐述的核酸分子就可突变。因此，如本文所用的，术语“抗原蛋白”或“丝状病毒蛋白”是指包含如上所述的丝状病毒蛋白的至少一个抗原决定簇的蛋白质。所述术语包括丝状病毒糖蛋白(即丝状病毒的基因产物)或丝状病毒核蛋白以及包含一个或多个丝状病毒糖蛋白决定簇的重组蛋白。术语抗原蛋白也包括基本上相似的抗原蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质可突变来使得其对细胞的毒性更小(参见，例如WO/2006/037038)或者可在细胞中以增加或降低的水平表达。本发明也包括含有核酸分子的组合的疫苗。例如并且不限于，编码扎伊尔、苏丹、马尔堡和象牙海岸/塔伊森林埃博拉病毒株的GP、ssGP和NP的核酸可以任何组合方式组合在一种疫苗组合物中。
腺病毒
根据本发明的腺病毒属于腺病毒科并且优选地为属于哺乳动物腺病毒属的腺病毒。腺病毒可为人类腺病毒，而且可为感染其他物种的腺病毒，包括但不限于牛腺病毒(例如，牛腺病毒3，BAdV3)、犬腺病毒(例如CAdV2)、猪腺病毒(例如PAdV3或PAdV5)或猿腺病毒(其包括猴腺病毒和猿猴腺病毒，诸如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒)。优选地，腺病毒为人类腺病毒(HAdV或AdHu；在本发明中如果提及Ad而未指示种类则意指人类腺病毒，例如简写符号“Ad5”意指与HAdV5相同，其为人类腺病毒血清型5)或猿腺病毒诸如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒(ChAd、AdCh或SAdV)。
使用人类腺病毒进行最先进的研究，并且根据本发明的某些方面优选人类腺病毒。在某些优选的实施方案中，根据本发明的重组腺病毒是基于人类腺病毒。在优选的实施方案中，重组腺病毒是基于人类腺病毒血清型5、11、26、34、35、48、49或50。根据本发明的一个特别优选的实施方案，腺病毒为血清型26或35之一的人类腺病毒。
这些血清型的优点为人类群体中的低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体滴度。例如在2007/104792和在Abbink等,(2007)Virol81(9):4654-63中描述了rAd26载体的制备，所述两份文献均以引用的方式整体并入本文。Ad26的示例性基因组序列可见于GenBank登录EF 153474和WO 2007/104792的SEQ ID NO:1中。例如在美国专利号7,270,811中、在WO 00/70071中以及在Vogels等,(2003)J Virol 77(15):8263-71中描述了rAd35载体的制备，所有文献均以引用的方式整体并入本文。Ad35的示例性基因组序列可见于GenBank登录AC_000019和WO 00/70071的图6中。
猿腺病毒通常在人类群体中也具有低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体滴度并且报告了使用黑猩猩腺病毒载体的大量的工作(例如US6083716；WO 2005/071093；WO2010/086189；WO 2010085984；Farina等，2001,J Virol 75:11603-13；Cohen等,2002,JGen Virol 83:151-55；Kobinger等,2006,Virology 346:394-401；Tatsis等,2007,Molecular Therapy 15:608-17；也参见Bangari和Mittal的综述,2006,Vaccine 24:849-62；以及Lasaro和Ertl的综述,2009,Mol Ther 17:1333-39)。因此，在其他优选的实施方案中，根据本发明的重组腺病毒是基于猿腺病毒，例如黑猩猩腺病毒。在某些实施方案中，重组腺病毒是基于猿腺病毒类型1、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50或SA7P。
腺病毒载体rAd26和rAd35
在根据本发明的一个优选的实施方案中，腺病毒载体包含来自以下两种稀有血清型的衣壳蛋白：Ad26和Ad35。在典型的实施方案中，载体为rAd26或rAd35病毒。
因此，可用于本发明的载体包括Ad26或Ad35衣壳蛋白(例如纤维、五邻体或六邻体蛋白)。本领域技术人员将认识到，将整个Ad26或Ad35衣壳蛋白用于本发明的载体中是不必要的。因此，包含Ad26或Ad35衣壳蛋白的至少一部分的嵌合衣壳蛋白可用于本发明的载体中。本发明的载体也可包含衣壳蛋白，其中只要至少一种衣壳蛋白来源于Ad26或Ad35，那么纤维、五邻体蛋白和六邻体蛋白各自来源于不同的血清型。在优选的实施方案中，纤维、五邻体蛋白和六邻体蛋白各自来源于Ad26或各自来源于Ad35。
本领域技术人员将认识到，来源于多种血清型的元件可组合在单个重组腺病毒载体中。因此，可产生组合来自不同血清型的所需性质的嵌合腺病毒。因此，在一些实施方案中，本发明的嵌合腺病毒可将Ad26和Ad35血清型预先存在的免疫的缺乏与各种特性组合，所述特性诸如温度稳定性、组装、锚定、产生率、重定向或改善的感染、目标细胞中DNA的稳定性等等。
在某些实施方案中，适用于本发明的重组腺病毒载体主要或整个来源于Ad35或Ad26(即载体为rAd35或rAd26)。在一些实施方案中，腺病毒为复制缺陷型，例如因为它包含基因组的E1区域中的缺失。对于本发明的腺病毒，在来源于Ad26或Ad35的情况下，典型的是将腺病毒的E4-orf6编码序列与人类亚型C(诸如Ad5)的腺病毒的E4-orf6交换。这允许此类腺病毒在已熟知的表达Ad5的E1基因的互补细胞系中增殖，所述细胞系例如像293细胞、PER.C6细胞等等(参见，例如Havenga等,2006,J Gen Virol 87:2135-43；WO 03/104467)。在某些实施方案中，腺病毒为血清型35的人类腺病毒，其具有已克隆有编码抗原的核酸的E1区域中的缺失，并且具有Ad5的E4orf6区域。在某些实施方案中，腺病毒为血清型26的人类腺病毒，其具有在已克隆有编码抗原的核酸的E1区域中的缺失，并且具有Ad5的E4orf6区域。对于Ad35腺病毒，典型的是在腺病毒中保留E1B 55K开放阅读框的3’末端，例如就在pIX开放阅读框上游的166bp或者就在pIX起始密码子上游的包含它的片段诸如243bp片段，通过Bsu36I限制性位点在5’末端标记，因为这增加腺病毒的稳定性，因为pIX基因的启动子部分停留在此区域中(参见，例如Havenga等,2006,同上；WO 2004/001032)。
重组腺病毒载体的制备在本领域中为已熟知的。
例如在2007/104792和在Abbink等，(2007)Virol 81(9):4654-63中描述了rAd26载体的制备。Ad26的示例性基因组序列可见于GenBank登录EF 153474和WO 2007/104792的SEQ ID NO:1中。例如在美国专利号7,270,811和Vogels等,(2003)J Virol 77(15):8263-71中描述了rAd35载体的制备。Ad35的示例性基因组序列可见于GenBank登录AC_000019中。
在本发明的一个实施方案中，适用于本发明的载体包括描述于WO2012/082918的那些载体，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。
通常，使用包含整个重组腺病毒基因组的核酸产生适用于本发明的载体(例如，质粒、粘粒或杆状病毒载体)。因此，本发明也提供编码本发明的腺病毒载体的分离的核酸分子。本发明的核酸分子可为通过克隆或合成产生的RNA形式或者DNA形式。所述DNA可为双链或单链的。
适用于本发明的腺病毒载体通常为复制缺陷型的。在这些实施方案中，通过使对病毒的复制至关重要的区域诸如E1区域缺失或失活来使得病毒成为复制缺陷型。所述区域可通过例如***目标基因(通常连接到启动子)来基本上缺失或失活。在一些实施方案中，本发明的载体可包含其他区域诸如E2、E3或E4区域中的缺失，或连接到启动子的异源基因的***。对于E2和/或E4突变的腺病毒而言，E2和/或E4互补细胞系通常用于产生重组腺病毒。腺病毒的E3区域中的突变无需由细胞系补充，因为E3对于复制是不需要的。
包装细胞系通常用于产生足够量的本发明的腺病毒载体。包装细胞为包含在复制缺陷型载体中已缺失或失活的那些基因的细胞，因此允许病毒在细胞中复制。合适的细胞系包括例如PER.C6、911、293和E1 A549。
如以上所指出，多种多样的丝状病毒糖蛋白可在载体中表达。如果需要，编码丝状病毒糖蛋白的异源基因可为密码子优化的，以确保在治疗的宿主(例如人类)中的适当表达。密码子优化为本领域中广泛应用的技术。通常，异源基因克隆到腺病毒基因组的E1和/或E3区域。
异源丝状病毒基因可处于腺病毒来源的启动子的控制(即可操作地连接到)下或者可处于异源启动子的控制下。合适的异源启动子的实例包括CMV启动子和RSV启动子。优选地，启动子位于表达盒内目标异源基因的上游。
如以上所指出，适用于本发明的腺病毒载体可包含对本领域技术人员已知的各种各样的丝状病毒糖蛋白。
在本发明的一个优选的实施方案中，rAd载体包含选自由以下组成的组的一个或多个GP：扎伊尔埃博拉病毒(EBOV)的GP、苏丹埃博拉病毒(SUDV)的GP、马尔堡病毒(MARV)的GP以及与它们基本上相似的GP。
MVA载体
适用于本发明的MVA载体利用来源于改性牛痘安卡拉病毒的减毒病毒，其特征在于所述病毒在人类细胞系中进行繁殖性复制的能力的损失。MVA载体表达各种各样的丝状病毒糖蛋白以及其他结构性丝状病毒蛋白，诸如VP40和核蛋白(NP)。
在一方面，本发明提供一种重组改性的安卡拉牛痘病毒(MVA)，所述病毒包含编码丝状病毒糖蛋白(GP)(具体地为包膜糖蛋白)的抗原决定簇的核苷酸序列。在另一方面，本发明提供一种重组MVA载体，所述MVA载体包含编码丝状病毒糖蛋白(具体地为包膜糖蛋白)的抗原决定簇的异源核苷酸序列，以及编码另一丝状病毒蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列。
通过对安卡拉真皮牛痘病毒株的鸡胚胎成纤维细胞进行超过570次连续传代[绒毛膜尿囊牛痘病毒安卡拉病毒，CVA；关于综述参见Mayr等(1975),Infection 3,6-14]来产生MVA，所述安卡拉真皮牛痘病毒株在土耳其安卡拉疫苗接种研究所(VaccinationInstitute,Ankara,Turkey)中保存许多年并且用作人类接种疫苗的基础。然而，由于通常发生与牛痘病毒相关联的严重接种后并发症，所以多次试图产生更加减毒、更加安全的天花疫苗。
在1960至1974时段期间，Anton Mayr教授通过在CEF细胞中超过570次连续传代成功使CVA减毒[Mayr等(1975)]。在多种动物模型中显示，产生的MVA为无毒的[Mayr,A.&Danner,K.(1978),Dev.Biol.Stand.41:225-234]。作为MVA的早期发展的一部分(作为天花前期疫苗的)，存在处于来自疫苗的不良反应的风险下的受试者中使用MVA-517与ListerElstree结合的临床试验[Stickl(1974),Prev.Med.3:97-101；Stickl和Hochstein-Mintzel(1971),Munch.Med.Wochenschr.113:1149-1153]。在1976年，在德国，将来源于MVA-571菌种储备(对应于第571次传代)的MVA登记为两阶段肠胃外天花疫苗接种程序中的初免疫苗(primer vaccine)。随后，MVA-572用于大约120,000个白种人个体中，大部分1岁与3岁之间的儿童中，他们未报告严重的副作用，即使许多受试者为具有与疫苗相关联的并发症的高风险的群体中(Mayr等(1978),Zentralbl.Bacteriol.(B)167:375-390)。MVA-572作为ECACC V94012707储存在欧洲动物细胞培养物保藏所(European Collection ofAnimal Cell Cultures)。
由于传代用于将MVA减毒，根据CEF细胞中进行的传代数目，存在许多不同病毒株或分离物。例如，在德国在天花根治项目期间将MVA-572以小剂量用作前期疫苗，并且MVA-575广泛用作兽医疫苗。与祖CVA病毒相比，MVA以及MVA-BN缺少大约15％(来自六个区域的31kb)的基因组。所述缺失影响许多毒性和宿主范围细胞以及甲型包涵体基因。MVA-575在2000年12月7日在以登录号V00120707储存在欧洲动物细胞培养物保藏所(ECACC)。通过CVA在原代鸡胚胎成纤维细胞上的连续增殖(超过570次传代)获得减毒的CVA-病毒MVA(改性安卡拉牛痘病毒)。
即使Mayr等在20世纪70年代证实，MVA在人类和哺乳动物中为高度减毒的和无毒的，但某些研究员已报告，MVA在哺乳动物和人类细胞系中不是完全减毒的，因为可能在这些细胞中发生残余的复制[Blanchard等(1998),J.Gen.Virol.79:1159-1167；Carroll&Moss(1997),Virology 238:198-211；美国专利号5,185,146；Ambrosini等(1999),J.Neurosci.Res.55:569]。假定这些公开中报告的结果已使用各种已知的MVA病毒株来获得，因为所使用的病毒在其性质方面，尤其是在各种细胞系中的生长行为方面基本不同。出于各种原因，包括与在人类中使用有关的安全考虑，此类残余的复制是不需要的。
为了开发更安全的产品(诸如疫苗或药物)具有增强的安全性能的MVA的病毒株已由Bavarian Nordic育出。MVA由Bavarian Nordic进一步传代并且指定为MVA-BN，其代表样品于2000年8月30日以登录号V00083008储存在欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)。在WO 02/42480(US 2003/0206926)和WO 03/048184(US 2006/0159699)中进一步描述MVA-BN，所述两份专利均以引用的方式整体并入本文。
MVA-BN可连接并进入人类细胞，其中病毒编码的基因非常有效地表达。MVA-BN非常适于初代鸡胚成纤维(CEF)细胞并且不在人类细胞中复制。在人类细胞中，表达病毒基因并且不产生感染病毒。根据美国疾病控制和预防中心，MVA-BN被分类为生物安全等级1生物体。MVA-BN和衍生物的制剂已施用至许多类型的动物和超过2000名人类受试者，包括免疫缺陷型个体。所有疫苗接种已证明是总体上安全且良好耐受的。尽管其高减毒作用和减少的毒性，在临床前研究中已显示MVA-BN引发对疫苗和由克隆到MVA基因组中的基因所编码的异源基因产物的体液和细胞免疫应答两者[E.Harrer等(2005),Antivir.Ther.10(2):285-300；A.Cosma等(2003),Vaccine 22(1):21-9；M.Di Nicola等(2003),Hum.GeneTher.14(14):1347-1360；M.Di Nicola等(2004),Clin.Cancer Res.,10(16):5381-5390]。
MVA的“衍生物”或“变体”是指表现出与如本文所述的MVA基本上相同的复制特性，但在其基因组的一个或多个部分中表现出差异的病毒。MVA-BN以及MVA-BN的衍生物或变体未能在人类和小鼠，甚至在严重免疫抑制小鼠体内繁殖性复制。更具体地，MVA-BN或MVA-BN的衍生物或变体也优选地也具有在鸡胚胎成纤维细胞(CEF)中复制性繁殖的能力，但是不具有在人类角质细胞系HaCat[Boukamp等(1988),J.Cell Biol.106:761-771]、人类骨肉瘤细胞系143B(ECACC储存号91112502)、人类胚胎肾细胞系293(ECACC储存号85120602)和人类***细胞系HeLa(ATCC储存号CCL-2)中复制性繁殖的能力。另外，MVA-BN的衍生物或变体在Hela细胞和HaCaT细胞系中具有比MVA-575少两倍，更优选地少三倍的病毒扩增率。MVA变体的这些性质的测试和测定描述于WO 02/42480(US 2003/0206926)和WO 03/048184(US 2006/0159699)中。
术语“不能繁殖性复制”或“不具有繁殖性复制的能力”描述于例如WO 02/42480中，所述专利也教导如何获得具有如上提及的所需性质的MVA。所述术语适用于使用WO 02/42480或美国专利号6,761,893中描述的测定在感染之后4天具有小于1的病毒扩增率的病毒，所述两份专利均以引用的方式整体并入本文。
术语“未能繁殖性复制”是指在感染之后4天具有小于1的病毒扩增率的病毒。WO02/42480或美国专利号6,761,893中所描述的测定适用于测定病毒扩增率。
病毒的扩增或复制通常表示为由感染细胞产生的病毒(输出)与最初用于首先感染细胞的量(输入)的比率，所述比率称为“扩增率”。“1”的扩增率定义在由感染细胞产生的病毒的量与初始用于感染细胞的量相同的情况下的扩增状态，所述状态意指感染细胞容许病毒感染和复制。相反，小于1的扩增率(即输出与输入水平相比的降低)指示繁殖性复制的缺少并且因此使病毒减毒。
基于MVA的疫苗的优点包括其针对大范围疫苗生产的安全性能以及可用性。临床前测试显示与其他MVA病毒株相比，MVA-BN展示出极好的减毒和功效(WO 02/42480)。MVA-BN病毒株另外的性质是当与DNA初免/牛痘病毒加强方案相比时，在牛痘病毒初免/牛痘病毒加强方案中诱导基本上相同水平的免疫的能力。
重组MVA-BN病毒为本文最优选的实施方案，其被视为安全的，因为它在哺乳动物细胞中有明显的复制缺陷并且它有良好建立的无毒性。此外，除了重组MVA-BN病毒的功效之外，工业规模生产的可行性也可为有利的。另外，基于MVA的疫苗可递送多种异源抗原并且允许同时诱导体液免疫和细胞免疫。
可使用本领域已知的方法，诸如在WO/2002/042480和WO/2002/24224中描述的方法制备适用于本发明的MVA载体，所述专利的相关公开内容以引用的方式并入本文。
在另一方面，复制缺陷型MVA病毒株也可为合适的，诸如病毒株MVA-572、MVA-575或任何相似减毒的MVA病毒株。突变体MVA也可为合适的，诸如缺失的绒毛膜尿囊安卡拉牛痘病毒(dCVA)。dCVA包含MVA基因组的缺失位点del I、del II、del III、del IV、del V以及del VI。所述位点尤其适用于***多个异源序列。dCVA可在人类细胞系(诸如人类293、143B和MRC-5细胞系)中繁殖性复制(以大于10的扩增率)，然后使得通过对基于病毒的免疫策略有用的进一步突变来实现优化(参见WO 2011/092029)。
在本发明的一个优选的实施方案中，MVA载体包含编码选自由以下组成的组的一个或多个抗原蛋白的核酸：扎伊尔埃博拉病毒(EBOV)的GP、苏丹埃博拉病毒(SUDV)的GP、马尔堡病毒(MARV)的GP、塔伊森林病毒的NP以及与它们基本上相似的GP或NP。
丝状病毒蛋白可***到MVA的一个或多个基因间区(IGR)中。在某些实施方案中，IGR选自IGR07/08、IGR 44/45、IGR 64/65、IGR 88/89、IGR 136/137和IGR 148/149。在某些实施方案中，少于5、4、3或2个IGR的重组MVA包含编码丝状病毒包膜糖蛋白和/或另一种丝状病毒蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列。异源核苷酸序列可另外地或可替代地***到一个或多个天然存在的缺失位点中，具体地为***到MVA基因组的主要缺失位点I、II、III、IV、V或VI中。在某些实施方案中，少于5、4、3或2个天然存在的缺失位点的重组MVA包含编码丝状病毒包膜糖蛋白和/或另一种丝状病毒蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列。
包含异源核苷酸序列的MVA的***位点的数目可为1、2、3、4、5、6、7个或更多，所述异源核苷酸序列编码丝状病毒蛋白的抗原决定簇。在某些实施方案中，异源核苷酸序列***到4、3、2或更少个的***位点中。优选地，使用两个***位点。在某些实施方案中，使用三个***位点。优选地，重组MVA包含至少2、3、4、5、6或7个***到2或3个***位点中的基因。
本文提供的重组MVA病毒可通过本领域已知的常规方法产生。获得重组痘病毒或将外源编码序列***到痘病毒基因组中的方法为本领域技术人员所熟知的。例如，标准分子生物技术方法，诸如DNA克隆、DNA和RNA分离、蛋白质印迹分析、RT-PCR和PCR扩增技术描述于Molecular Cloning,A laboratory Manual(第二版)[J.Sambrook等,Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)]，并且病毒的处理和操作技术描述于Virology MethodsManual[B.W.J.Mahy等(编辑),Academic Press(1996)]。相似地，MVA的处理、操作和遗传工程的技术和技能知识描述于Molecular Virology:A Practical Approach[A.J.Davison&R.M.Elliott(编辑),The Practical Approach Series,IRL Press at OxfordUniversity Press,Oxford,UK(1993)(参见，例如，第9章：Expression of genes byVaccinia virus vectors)]和现代分子生物学方法[John Wiley&Son,Inc.(1998)(参见，例如，第16章，第IV章节：Expression of proteins in mammalian cells using vacciniaviral vector)]。
对于本文公开的各种重组MVA的产生，不同的方法可为适用的。待***到病毒中的DNA序列可放入到大肠杆菌质粒构建体中，与MVA的DNA区段同源的DNA已***到所述质粒构建体。单独地，可将待***的DNA序列连接至启动子。启动子基因连锁可定位在质粒构建体中，以使得启动子-基因连锁两断侧接有与含有非必需基因座的MVA DNA区侧接的DNA序列同源的DNA。所得质粒构建体可通过在大肠杆菌细菌内增殖来扩增并分离。包含待***的DNA基因序列的分离质粒可转染到细胞培养物中，例如鸡胚胎成纤维细胞(CEF)的细胞培养物，同时用MVA感染所述培养物。质粒中同源MVA DNA与病毒基因组之间的重组可分别产生通过外源DNA序列的存在来改性的MVA。
根据一个优选的实施方案，合适的细胞培养物的细胞诸如CEF细胞可用痘病毒感染。随后可用包含单个或多个外源或异源基因的第一质粒载体转染感染的细胞，优选地在痘病毒表达控制元件的转录控制下。如上文所说明的，质粒载体也包含能够引导外源序列***到痘病毒基因组的选择部分中的序列。任选地，质粒载体也含有包含可操作地连接到痘病毒启动子的标记基因和/或选择基因的盒。
合适的标记基因或选择基因为例如编码绿色荧光蛋白、β半乳糖苷、新霉素磷酸核糖基转移酶或其他标记的基因。选择基因盒或标记基因盒的使用简化了所产生的重组痘病毒的鉴定和分离。然而，重组痘病毒也可通过PCR技术来鉴定。随后，可以将另一种细胞用如上所述地获得的重组痘病毒感染并且用包含单个或多个第二外源或异源基因的第二载体转染。如果此基因应引入到痘病毒基因组的不同***位点中，则第二载体在引导单个或多个第二外源基因整合到痘病毒基因组的痘病毒同源序列中有所不同。在发生同源重组后，可分离包含两个或更多个外源或异源基因的重组病毒。为将另外的外源基因引入到重组病毒，可通过使用在先前的步骤中分离的重组病毒用于进行感染并且通过使用包含另一种单个或多个外源基因的另一种载体用于进行转染来重复感染和转染的步骤。
可替代地，如上所述的感染和转染的步骤为可互换的，即合适的细胞可首先通过包含外源基因的质粒载体转染并且然后用痘病毒感染。作为另一替代方案，可以将各个外源基因引入到不同病毒，使用所有获得的重组病毒共同感染细胞并筛选包含全部外源基因的重组体。第三替代方案为将DNA基因组与外源序列体外连接并且使用辅助病毒重建重组牛痘病毒DNA基因组。第四替代方案为在大肠杆菌或另一种菌种内在克隆为细菌人工染色体(BAC)的牛痘病毒基因组(诸如MVA)与线性外源序列之间的同源重组，所述线性外源序列侧接有与侧接牛痘病毒基因组中所需的整合位点的序列同源的DNA序列。
异源丝状病毒基因可在一个或多个痘病毒启动子的控制下(即，可操作地连接到所述启动子)。在某些实施方案中，痘病毒启动子为Pr7.5启动子、杂合早期/晚期启动子或PrS启动子、PrS5E启动子、合成或天然的早期或晚期启动子或牛痘病毒ATI启动子。
免疫原性组合物
免疫原性组合物为包含免疫有效量的纯化或部分纯化的用于本发明的腺病毒或MVA载体的组合物。根据本领域已熟知的方法，所述组合物可配制为疫苗(也称为“免疫原性组合物”)。所述组合物可包含增强免疫应答的佐剂。鉴于本公开，可通过本领域技术人员已熟知的技术确定制剂中各种组分的最佳比率。
所述免疫原性组合物的制备和用途为本领域技术人员所熟知的。液态药物组合物通常包含液态载体诸如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可包含生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇类诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
本发明的组合物可包含其他丝状病毒抗原或者引发或加强接种可包含其他抗原。与本发明的腺病毒载体结合使用的其他抗原对本发明不是至关重要的并且可为例如丝状病毒抗原或表达所述抗原的核酸。
适用于本发明的免疫原性组合物可包含佐剂。
适于根据本发明共同施用的佐剂应为在人群中潜在安全的、良好耐受的且有效的佐剂，其包括包括QS-21、Detox-PC、MPL-SE、MoGM-CSF、TiterMax-G、CRL-1005、GERBU、TERamide、PSC97B、Adjumer、PG-026,GSK-I、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax、CpGODN、Betafectin、Alum以及MF59。
可施用的其他佐剂包括凝集素、生长因子、细胞因子和淋巴因子诸如α干扰素、γ干扰素、血小板衍化生长因子(PDGF)、粒细胞集落刺激因子(gCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gMCSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、IL-I、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-IO和IL-12或因此的编码核酸。
本发明的组合物可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员所熟知的其他物质。所述物质应为无毒的并且应不干扰活性成分的功效。载体或其他物质的确切性质可取决于施用路径，例如肌内、皮下、口服、静脉内、皮肤、黏膜内(例如肠内)、鼻内或腹腔路径。
用于诱导针对丝状病毒感染的保护性免疫的方法
本发明提供一种使用腺病毒载体与另一种腺病毒载体和/或MVA载体的组合在个体中引发和加强对一种或多种丝状病毒的免疫应答的方法。
根据本发明的一个总体方面，在受试者中诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法包括：
a.将包含免疫有效量的腺病毒载体的第一组合物施用于受试者，所述腺病毒载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸；以及
b.将包含免疫有效量的MVA载体的第二组合物施用于受试者，所述MVA载体包含编码丝状病毒的至少两种病毒株的抗原蛋白的核酸
其中步骤(a)和步骤(b)以任意顺序进行。在一个优选的实施方案中，在第一步骤后1-12周进行后面的步骤。
在本发明的某些另外的方面，第一组合物还包含一个或多个腺病毒载体，所述腺病毒载体包含编码第二丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。在其他实施方案中，第一组合物还包含一个或多个另外的腺病毒载体，所述腺病毒载体包含编码第三丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
在所公开的方法的一个实施方案中，腺病毒载体用于引发免疫应答，并且另一种腺病毒和/或MVA载体用于在初免疫苗接种约1-12周后加强免疫应答。通常在施用初免组合物数周或数月后施用加强组合物，例如，在施用初免组合物后约1或2周、或3周、或4周、或6周、或8周、或12周、或16周、或20周、或24周、或28周、或32周或一到两年。
在本发明的一个优选的实施方案中，本文公开的腺病毒载体包括rAd26或rAd35载体。在一个示例性实施方案中，rAd26或rAd35载体用于引发免疫应答，MVA载体用于加强免疫应答，或反之亦然。
在根据所述方法的一个更优选的实施方案中，rAd26载体用于初免，随后用MVA载体加强。优选地，在初免1-12周后，更优选地在初免1、2、4或8周后施用加强组合物。在一个优选的实施方案中，在初免8周后施用加强组合物。在另一个优选的实施方案中，在初免1周后施用加强组合物。在另一个优选的实施方案中，在初免2周后施用加强组合物。在另一个优选的实施方案中，在初免4周后施用加强组合物。
在根据所述方法的一个更优选的实施方案中，MVA载体用于初免，随后用rAd26载体加强。优选地，在初免1-12周后，更优选地在初免1、2、4或8周后施用加强组合物。在一个优选的实施方案中，在初免8周后施用加强组合物。在另一个优选的实施方案中，在初免1周后施用加强组合物。在另一个优选的实施方案中，在初免2周后施用加强组合物。在另一个优选的实施方案中，在初免4周后施用加强组合物。
本发明也涉及优选地用异源载体的组合通过初免和加强免疫应答来诱导针对超过一种亚型的丝状病毒的免疫应答的方法。
根据本发明的另一个方面，在受试者中诱导针对多种亚型的丝状病毒的免疫应答的方法包括：
a.将免疫有效量的多个rAd26或rAd35载体施用于受试者，所述载体包含编码多种亚型的丝状病毒的糖蛋白或基本上相似的糖蛋白的多个核酸；以及
b.将免疫有效量的多个MVA载体施用于受试者，所述MVA载体包含编码糖蛋白或基本上相似的糖蛋白的多个核酸，
其中步骤(a)和步骤(b)以任意顺序进行。
在所述方法的一个或多个实施方案中，多个rAd26或rAd35载体用于引发免疫应答，并且多个MVA载体用于加强免疫应答，或反之亦然。
在根据本文方法的一个优选的实施方案中，多个rAd26载体用于初免，随后用多个MVA载体加强。优选地，在初免1-12周后，更优选地在初免1、2、4或8周后给予加强接种。
在相应初免和加强组合物中的抗原(然而采用许多加强组合物)无需相同，但是应共享抗原决定簇或彼此基本上相似。
包含载体的免疫原性组合物的施用通常为肌内的或皮下的。然而也可设想其他施用方式诸如静脉内、皮肤、皮内或经鼻施用。可通过使用针注射腺病毒载体的悬浮液来实现免疫原性组合物的肌内施用。一种替代方案为使用无针注射装置施用含有疫苗的组合物(使用，例如，Biojector(TM))或冻干粉末。
对于静脉内、皮肤或皮下注射或在患病位点注射，载体将为胃肠外可接受的水溶液形式，所述水溶液不含热源并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域的技术人员能够很好地使用例如等渗赋形剂诸如氯化钠注射液、林格式注射液、乳酸林格式注射液制备合适的溶液。在需要时可包含防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他添加剂。也可采用缓慢释放的制剂
通常，施用将具有在感染或症状发展之前产生针对丝状病毒抗原的免疫应答的预防目的。可根据本发明治疗或预防的疾病和病症包括免疫应答可起保护或治疗作用的疾病和病症。在其他实施方案中，腺病毒和MVA载体可施用来用于暴露后预防。
将含有腺病毒载体的免疫原性组合物施用于受试者，在受试者中产生抗丝状病毒免疫应答。组合物足以诱导可检测免疫应答的量被定义为“免疫有效剂量”。如下所示的，本发明的免疫原性组合物诱导体液免疫应答以及细胞介导的免疫应答。在一个典型的实施方案中，免疫应答为保护性免疫应答。
施用的实际量以及施用的速率和时间过程将取决于所治疗的疾病的性质和严重性。治疗的处方(例如，剂量的确定等)在全科医师和其他医生或在兽医背景的兽医的职责内，并且通常考虑待治疗的病症、个体患者的病状、递送的部位、施用的方法和医师已知的其他因素。上文提及的技术和协议的实例可见于Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A编辑，1980。
在腺病毒和MVA载体以及所述颗粒的任选制剂产生为组合物后，载体可施用到个体，具体地为人类或灵长类动物。可施用到人类或另一种哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、绵羊、山羊、猪、马、牛、鸭、猴子、狗或猫。递送到非人哺乳动物无需出于治疗目的，也可用于实验内容，例如用于研究对腺病毒或MVA载体的免疫应答的机制。
在一个示例性方案中，以含有约104至1012个病毒颗粒/ml的浓度的约100μl至约10ml之间范围的体积施用(例如，肌内地)腺病毒载体。优选地，以0.25与约1.0ml之间范围的体积施用腺病毒载体。更优选地，以0.5ml的体积施用腺病毒载体。
通常，在一个施用期间以约109至约1012个病毒颗粒(vp)的量，更通常地以约1010至约1012vp的量将腺病毒施用到人类受试者。在一个优选的实施方案中，以约5x1010vp的量施用腺病毒载体。在另一个优选的实施方案中，以约0.8x1010vp的量施用腺病毒载体。在另一个优选的实施方案中，以约2x1010vp的量施用腺病毒载体。在另一个优选的实施方案中，以约4x1010vp的量施用腺病毒载体。在某些实施方案中，腺病毒被配制为三价组合物，其中各自具有不同***点的三种腺病毒混合在一起。在三价组合物中，各种不同的腺病毒优选地以约4x1010vp的量存在。在所述三价组合物中，每剂量腺病毒颗粒的总数达到约1.2x1011vp。在另一个优选的实施方案中，三价组合物中各种不同的腺病毒优选地以约1x1011vp的量存在。在所述三价组合物中，然后每剂量腺病毒颗粒的总数达到约3x1011vp。在初始疫苗接种后为如上所述的加强疫苗接种。
在另一个示例性方案中，以包含约1x107TCID50至1x109TCID50(50％组织培养感染剂量)或Inf.U.(感染单位)的剂量的约100μl至约10ml之间范围的体积的盐溶液施用MVA载体。优选地，以0.25与1.0ml之间范围的体积施用MVA载体。更优选地，以0.5ml的体积施用MVA载体。
通常，在一个施用期间以约1x107TCID50至1x109TCID50(或Inf.U.)的剂量将MVA载体施用于人类受试者。在一个优选的实施方案中，以约5x107TCID50至5x108TCID50(或Inf.U.)的量施用MVA载体。在一个更优选的实施方案中，以约5x107TCID50(或Inf.U.)的量施用MVA载体。在一个更优选的实施方案中，以约1x108TCID50(或Inf.U.)的量施用MVA载体。在另一个优选的实施方案中，以约1.9x108TCID50(或Inf.U.)的量施用MVA载体。在又一个优选的实施方案中，以约4.4x108TCID50(或Inf.U.)的量施用MVA载体。在一个更优选的实施方案中，以约5x108TCID50(或Inf.U.)的量施用MVA载体
组合物在需要时可存在于试剂盒、包装或分配器中，其可含有包含活性成分的一个或多个单位剂型。试剂盒例如可包括金属或塑料箔，诸如泡罩包装。试剂盒、包装或分配器可随附施用说明书。
本发明的组合物可单独施用或与其他治疗组合施用，同时或依次施用取决于待治疗的病状。
实施例
提供以下实施例来说明，但并非限制所要求保护的发明。
实施例1
以鉴定针对多种[例如，马尔堡、埃博拉(又称扎伊尔)和苏丹]丝状病毒具有≥80％的实际功效的多价丝状病毒疫苗为目标进行动物研究，以用于继续推进发展。研究使用两或三种疫苗接种测试延长的疫苗接种时间表并且测试使用异源(与同源相反)疫苗组合对于随后对目标丝状病毒的NHP免疫应答的影响。使用埃博拉病毒基奎特攻击疫苗接种的NHP以测试所应用的疫苗接种的功效。
动物操作
这些研究符合动物福利法规最终条例(Final Rules of the Animal WelfareAct regulations)的所有适用章节(CFR第9篇，第1、2和3部分)和实验室动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)–National Academy Press,WashingtonD.C.第八版(theGuide)。
总计16只短尾猕猴(食蟹猴)(NHP)(12只雄性和4只雌性)，毛里求斯来源，短尾猕猴，4-5岁，每只大约4-8kg，购自PrimGen(Hines,IL)。动物在疫苗接种之前通过ELISA在实验上首次接种雷斯顿病毒(RESTV)。排除先前暴露于分枝杆菌肺结核、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猿T淋巴细胞病毒-1(STLV-1)、恒河猴疱疹病毒1(B型疱疹病毒)和猿逆转录病毒(SRV1和SRV2)的动物，测试沙门氏菌和志贺氏菌的活性感染并且确认对结核杆菌呈阴性。
丝状病毒为危险组4(高度封闭的)病原体；因此在CDC认可的生物安全水平(BSL)-4/动物生物安全水平(ABSL-4)封闭设施下进行涉及扎伊尔埃博拉病毒、苏丹埃博拉病毒或马尔堡病毒的全部操作。
疫苗材料
通过Crucell Holland B.V.生产rAd载体。所述载体为包含在E1位点***的腺病毒糖蛋白(GP)基因的纯化的E1/E3缺失的复制缺陷型重组腺病毒类型26或类型35疫苗载体(分别为Ad26和Ad35)。这些载体在
Figure BDA0001238052940000371
细胞中得以复苏，噬斑纯化，放大并且然后通过两步CsCl显带程序来纯化，并且随后在基于TRIS的制剂缓冲液中配制并且储存在-65℃之下。这些载体的体内使用释放包括生物载量测试、低内毒素水平(<5EU/ml)和转基因的表达和完整的确认。
具体地，rAd载体表达EBOV Mayinga GP(SEQ ID NO:1)、SUDV古卢GP(SEQ ID NO:2)和MARV安哥拉GP(SEQ ID NO:3)。各种rAd载体表达一种单一抗原蛋白(GP)。
MVA载体由Bavarian Nordic生产。具体地，MVA多重载体(MVA-BN-Filo)表达4种不同的抗原蛋白：EBOV Mayinga GP(SEQ ID NO:1)；SUDV古卢GP(SEQ ID NO:2)；MARV莫索克(Musoke)GP(SEQ ID NO:4)；以及塔伊森林病毒(TAFV)NP(SEQ ID NO:5)。
疫苗材料储存在-80℃温控冷冻机中。
疫苗接种和实验设计
关于研究分组和实验设计，参见图1和图2。
已使用两种不同的疫苗平台对短尾猕猴(食蟹猴)(NHP)进行疫苗接种，每组2只动物，此外对照组由两个首次(空载体)攻击对照组成。在图1所示的组中首先用重组载体对动物进行疫苗接种。将每只猕猴麻醉并且接受疫苗到左后大腿的肌内(IM)注射。间隔4周或8周给予初免和加强剂量(图1)。各个剂量的腺病毒由到左后大腿的单一IM注射组成。皮下施用MVA载体。
在第28天、第56天和第63天在室温下将EDTA或肝素全血连夜运输到TexasBiomed。另外，当在Texas Biomed饲喂动物时，在第77天收集肝素或EDTA全血。在所有这些时间点，将在Texas Biomed处理EDTA全血以获得PBMC和血浆。
使用埃博拉扎伊尔肽库1和2、苏丹古卢肽库1和2、埃博拉病毒共有肽库、马尔堡安哥拉肽库1和2以及马尔堡病毒共有肽库，连同仅DMSO阴性对照和抗CD3刺激阳性对照，将PBMC用于IFN-g ELISPOT测定。一式两份进行全部刺激，合计每NHP20个孔。
另外，在第0天、第28天、第56天和第68天在Bioqual处理不具有抗凝剂的全血以获得血清并且在第77天在Texas Biomed处理以获得血清。在Bioqual收集的等分试样的血清将在第68天冷冻发送到Texas Biomed。在ZEBOV GP特异性ELISA中测定各个血清。另外，在SEBOV GP和MARVA GP特异性ELISA(两种不同的测定)中测定来自第0天、第56天和第77天的血清。
表1：在用埃博拉病毒攻击之前测量的参数
Figure BDA0001238052940000391
用于动物攻击的丝状病毒接种体
如图2所示，在加强疫苗接种约4周后，用EBOV攻击动物。具体地，EBOV基奎特-9510621用于动物攻击并且由Texas Biomed供应。EBOV基奎特-9510621的第二次细胞培养传代(P2)在2012年获自Tom Ksiazek博士(在UTMB健康加尔维斯顿国家实验室的NIAID的WRCEVA)并且在Vero E6细胞中在Texas Biomed第三次增殖并且具有2.1x 105PFU/ml的滴度。EBOV基奎特9510621。产品目录号2012099171。
在收获时的滴度：2.1x 105PFU/ml用于研究。
通过在与基因库P2共有序列的仅有1个SNP差异的情况下进行深测序来确认攻击储备物为野生型EBOV基奎特9510621。攻击储备物作为包含含有10％FBS的培养基的500±50μl等分试样储存在液态氮蒸汽相中。对于100PFU攻击，将丝状病毒攻击剂以磷酸缓冲盐水稀释至200PFU/ml的目标剂量。简言之，通过以PBS进行三次连续的1:10稀释来稀释储备病毒以获得200PFU/ml攻击材料浓度。给予每只动物合计0.5ml的攻击材料。
在病毒注射之前，通过肌内注射Telazol(2至6mg/kg；5至8mg/kg***IM prn，以用于辅助麻醉)来使猴子镇静。在研究的第0天，收集血液并且随后通过在臂右三角肌中进行肌内注射来用0.5ml体积中的100PFU目标剂量的EBOV攻击每只猴子。记录攻击位点。
在施用病毒之后，将每只猴子返回居住笼并且观察猴子直到其从麻醉中恢复(胸骨横卧/维持直立姿势的能力)。此研究中的终点为存活/未存活。通过患有终端疾病或处在濒死状态的动物来定义未存活。通过每日临床观察评分表来评估动物的健康。
抗EBOV GP IgG ELISA
通过改性的酶联免疫吸附测定(ELISA)在表1描述的时间点测定丝状病毒特异性体液应答，如先前Sulivan等(2006)(Immune protection of nonhuman primates againstEbola virus with single low-dose adenovirus vectors encoding modifiedGPs.PLoS Medicine 3,e177)所述，所述文献以引用的方式整体并入本文。简言之，用10μg/ml雪花莲(Galanthus Nivalis)凝集素过夜涂覆ELISA板。然后，在封端后，用埃博拉或马尔堡病毒株特异性GP上清液涂覆所述板。通过用编码缺失跨膜区和胞质尾区的丝状病毒糖蛋白的表达质粒瞬时转染Hek293T来产生这些上清液。在以1:50开始的4倍稀释系列中测试猴子血清样品。通过在492nm处的比色法检测结合IgG。计算针对丝状病毒糖蛋白病毒株特异性参考血清的相对血清滴度。在图4-图6中示出Elisa测定的结果。
IFN-g ELISPOT测定
通过干扰素γ酶联免疫吸附测定(ELISA)在表1描述的时间点测定丝状病毒特异性细胞免疫应答，如先前Ophorst等2007(Increased immunogenicity of recombinantAd35-based malaria vaccine through formulation with aluminium phosphateadjuvant.Vaccine 25,6501-6510)所述，所述文献以引用的方式整体并入本文。用于各种埃博拉和马尔堡病毒株糖蛋白的刺激的肽库由通过11个氨基酸重叠的15聚体组成。为将库中太高数目的肽的不需要的影响最小化，将各个糖蛋白肽库分成两半，一个N末端和一个C末端。将与三种埃博拉病毒(扎伊尔、苏丹和塔伊大森林)或两种马尔堡病毒(马尔堡和Ravn病毒)内超过九种连续氨基酸重叠的肽组合在共有库中。在每种单一肽1μg/ml最终浓度下使用肽库和单一肽。在图7中示出ELISPOT测定的结果。
如图3-7中汇总的结果所示，本文的动物研究显示rAd和MVA载体在用于预防灵长类动物中丝状病毒感染的初免-加强组合中的实用性。具体地，一种或多种表达一种或多种类型的丝状病毒的GP的rAd26载体或者表达多重丝状病毒抗原的MVA载体的施用引起对一种或多种类型的丝状病毒的体液应答的高效初免。在第8周用异源载体加强免疫后，全部疫苗方案对一种或多种类型的丝状病毒诱导了相似的体液和细胞免疫应答并且提供针对高度致病的埃博拉扎伊尔攻击的100％保护。
实施例2
进行第二个NHP研究，以确认在0-4周和0-8周间隔2个初免加强方案的免疫原性和保护功效。一个方案包括将单价Ad26.ZEBOV疫苗作为初免物并且将MVA-BN-Filo作为加强免疫物；另一个方案包括将MVA-BN-Filo作为初免物并且将Ad26.ZEBOV作为加强免疫物。全部免疫军为肌内免疫。将Ad26.ZEBOV(5x1010vp)用作0-8周方案的初免物，并且将其与1x108TCID50MVA-BN-Filo(4只NHP)和5x108TCID50MVA-BN-Filo(4只NHP)的加强免疫物组合，以评定所述方案中标准剂量和高剂量的MVA的影响。分别用1x108TCID50MVA-BN-Filo和5x108TCID50MVA-BN-Filo初免两个另外组的4只NHP；随后在两种情况下在4周后用Ad26.ZEBOV(5x1010vp)加强，以测试4-周方案中MVA-BN-Filo剂量作为初免物的影响。另外，先用Ad26.ZEBOV(5x1010vp)随后通过1x108TCID50MVA-BN-Filo初免2只NHP。最终，用空Ad26载体(不表达任何丝状病毒抗原，5x1010vp IM)免疫2只NHP并且TBS作为研究的阴性免疫对照。在最后用100pfu的EBOV基奎特1995野生型P3攻击病毒进行免疫的4周后攻击全部动物。此研究的分组汇总在表2中。
表2：用EBOV攻击的非人灵长类动物中的保护研究的实验分组
Figure BDA0001238052940000421
缩写：TBS:Tris-缓冲盐水；TCID50：50％组织培养感染剂量；vp：病毒颗粒。粗体表示100％存活。
免疫原性
NHP中的免疫应答特征为与丝状病毒GP结合和中和抗体(ELISA)以及产细胞因子T细胞(ELISpot)有关。
ELISA：
通过针对全部时间点的GP特异性ELISA来分析EBOV Mayinga GP反应抗体(参见图20)。
如实验1中所述地进行抗EBOV GP IgG ELISA。在对照疫苗接种的动物中未观察到ELISA滴度。疫苗方案在全部动物中均为免疫原性的。在B组中观察到最高滴度，该组以8-周间隔接受Ad26.ZEBOV和高剂量的MVA-BN-Filo。
保护功效
8-周Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo初免/加强方案两者使得在EBOV攻击之后能完全存活，而不论MVA-BN-Filo的剂量(1×108TCID50或5×108TCID50)如何。另外，Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo的4-周方案在2只NHP的2只中给予保护。4-周MVA-BN-Filo/Ad26.ZEBOV方案两者在4只NHP的2只中给予保护。
实施例3
在人类中使用1x108TCID50剂量的MVA-BN-Filo和5x1010vp剂量的Ad26.ZEBOV进行临床研究以评估方案的安全性、耐受性和免疫原性。研究由两部分组成。
主要的研究为在72位健康成人受试者中进行的随机的、安慰剂对照的、观察者双盲的研究，所述受试者之前未接受过实验性埃博拉候选疫苗并且不具有已知的对埃博拉病毒的暴露或埃博拉疾病的诊断。在此研究中测试4种方案：2种方案以28或56天间隔将MVA-BN-Filo作为初免物并将Ad26.ZEBOV作为加强免疫物，并且2个方案以28或56天间隔将Ad26.ZEBOV作为初免物并将MVA-BN-Filo作为加强免疫物。
子研究由评估方案的安全性、耐受性和免疫原性的开放性、无对照的非随机化治疗臂组成，所述方案用5x1010vp剂量的Ad26.ZEBOV作为初免物并在14天后用1x108TCID50剂量的MVA-BN-Filo作为增强免疫物，并且在15位健康成人受试者中进行所述子研究。
研究由疫苗接种周期组成，其中在基线(第1天)处疫苗接种受试者，随后在第15天、第29天或第57天进行加强，并且进行加强后随访，直到全部受试者已进行其21天加强后访问(第36天、第50天或第78天)或更早中断。
主要研究中的受试者加入各有18位健康受试者的4个不同组。总之，在组内以5:1比率随机分配受试者，以如下通过IM注射(0.5ml)接受活性疫苗或安慰剂(0.9％生理盐水)：
·在第1天注射MVA-BN-Filo(1x108TCID50)，随后在第29天(组1)或第57天(组2)进行Ad26.ZEBOV(5x1010vp)的加强注射，或者
·在第1天注射Ad26.ZEBOV(5x1010vp)，随后在第29天(组3)或第57天(组4)进行MVA-BN-Filo(1x108TCID50)的加强注射。
子研究中的15位受试者如下通过IM注射(0.5ml)接受活性疫苗：
·在第1天注射Ad26.ZEBOV(5x1010vp)，随后在第15天(组5)进行MVA-BN-Filo(1x108TCID50)的加强注射。
示例性研究疫苗接种时间表汇总在表3中。
表3：研究疫苗接种时间表
Figure BDA0001238052940000441
Figure BDA0001238052940000451
N：接受研究疫苗的受试者的数目；TCID50：50％组织培养感染剂量；vp：病毒颗粒
通过收集诉求的局部和全身性不良事件、未诉求的不良事件和严重不良事件并且通过身体检查来评定安全性。另外，在多个时间点评定标准化学参数、血液学参数(包括凝血参数)和尿分析参数。
使用汇总在表4和表5中的免疫学测定评定免疫原性。探索性测定包可包括但不限于列出的测定。
表4：免疫学测定的汇总(血清学)
Figure BDA0001238052940000452
EBOV：埃博拉病毒；ELISA：酶联免疫吸附测定；GP：糖蛋白；IgG：免疫球蛋白G；MARV：马尔堡病毒；MVA：改性的安卡拉牛痘；NP：核蛋白；SUDV：苏丹病毒；TAFV：塔伊森林病毒
表5：免疫学测定的汇总(细胞)
Figure BDA0001238052940000453
Figure BDA0001238052940000461
细胞因子染色；IFN：干扰素；IL：白介素；MARV：马尔堡病毒；NP：核蛋白；PBMC：外周血单核细胞；SUDV：苏丹病毒；TAFV：塔伊森林病毒；TNF：肿瘤坏死因子
临床研究正在进行。如下描述一些初始结果。
安全性测定
通过收集诉求的局部和全身性不良事件、未诉求的不良事件和严重不良事件并通过身体检查来评定安全性。另外，在多个时间点评定标准化学参数、血液学参数(包括凝血参数)和尿分析参数。
首先来自人类的这些参数的安全性数据显示，两种疫苗在具有通常预期来自疫苗接种的瞬时反应的阶段似乎为良好耐受的。无显著不良事件与疫苗方案相关联。大多数事件为温和的,发生在疫苗接种后一至两天并且平均持续一至两天。观察到非常少的发热情况。
免疫应答的评定
加强免疫达21天后使用ELISA测定分析结合到EBOV GP的抗体，使用ELISpot测定分析EBOV GP特异性T细胞应答，并且使用ICS测定检测对EBOV GP的CD4+和CD8+T细胞应答，从而评定免疫原性。在第1天、第8天、第29天、第36天和第50天在组1和组3中并且在第1天、第8天、第29天、第57天、第64天和第78天为组2和组4收集用于分析由研究疫苗诱导的体液和细胞免疫应答的样品。
体液免疫应答的评定
通过抗EBOV GP ELISA测定来评定研究疫苗诱导的结合抗体应答(图8)。重要的是，接受疫苗方案的全部受试者在加强免疫21天后显示血清转化。在全部免疫的受试者中观察到激烈的免疫原性应答。
当在7％至40％的受试者中仅观察到用MVA-BN-Filo初免后产生的低水平的EBOVGP特异性免疫应答时，通过在初免28天或56天后施用的Ad26.ZEBOV进行加强后观察到强抗原特异性应答。出乎意料地，所述应答的强度高于加强免疫21天后在相同的初免-加强时间间隔由相反的疫苗方案诱导的应答的强度(组3和组4分别用Ad26.ZEBOV初免，随后在28或56天后用MVA-BN-Filo加强)[对于组1和组3分别为具有EU/mL 10573(6452；17327)和4274(2350；7775)的95％置信区间的几何平均滴度，并且对于组2和组4分别为具有EU/mL 18729(12200；28751)和7553(511；1115)的95％置信区间的几何平均滴度]。
必须指出，在非人灵长类动物(NHP)中，加强用Ad26进行的MVA初免引起EBOV GP特异性免疫应答，所述应答在强度上相当于在相同的初免-加强时间间隔时由相反的疫苗方案(Ad/MVA)诱导的应答(参见图4)，或者在强度上更低(图20)。因此，对于NHP的一个特异性初免-加强方案观察到的免疫应答不预测在人类中在相同的初免-加强方案后观察到的免疫应答。
细胞免疫应答的评定
通过干扰素γ(IFN-γ)ELISpot和ICS测量EBOV GP特异性细胞免疫应答。为评定细胞免疫应答，将储存的PBMC(外周血单核细胞)解冻并用2个库(库1和库2)中组织的肽刺激。在图9中示出每个库中刺激的T细胞应答的总和。
通过ELISpot分析(图9)，在用Ad26.ZEBOV引发免疫后第29天在50％至60％受试者中可容易地检测IFN-γ应答(对于组3和组4，平均IFN-γ应答分别为103个和58个斑点形成单位/每百万PBMC)并且在Ad26.ZEBOV引发免疫后第57天在86％受试者中可容易地检测IFN-γ应答(组4，平均IFN-γ应答为283个斑点形成单位/百万(SFU/106)PBMC)。通过在第29天或第57天用MVA-BN-Filo进行免疫来进一步加强这些应答(对于组3，87％的应答者，平均IFN-γ应答为463SFU/106PBMC；对于组4，86％的应答者，648SFU/106PBMC)并且这些应答维持在加强后第21天的水平(对于组3，79％应答者，平均IFN-γ应答为390SFU/106PBMC并且对于组4，100％应答者，464SFU/106PBMC)。
图10-图15中示出通过ICS进行的测量特异性CD4+和CD8+T细胞应答的细胞测定的结果。
正如预期的，在安慰剂免疫的个体中未观察到EBOV GP特异性CD8+或CD4+T细胞应答(图10和图13)。在用MVA-BN-Filo引发免疫后第29天或第57天未观察到CD8+细胞因子应答(组1和组2)。然而，在用Ad26.ZEBOV加强7天后在53％的受试者中观察到疫苗诱导的CD8+T细胞应答(当分别在第29天或第57天施用Ad26加强免疫时，平均总细胞因子应答为：0.08％和0.07％；图10)。在加强免疫后第21天维持此应答(当分别在第29天或第57天施用Ad26来加强免疫时，平均总细胞因子应答为：0.1％和0.06％；图10)。相比之下，接受使用Ad26.ZEBOV引发免疫(组3和组4)的57％受试者在第29天显示CD8+T细胞应答(平均总细胞因子应答：分别为0.12％和0.05％)，在Ad26.ZEBOV引发免疫(组4)后第57天86％的受试者显示CD8+T细胞应答(平均总细胞因子应答：0.19％)。在第29天用MVA-BN-Filo加强免疫后进一步增强此应答，在加强的7和21天后分别有67％和73％的受试者应答(平均应答：两天皆为0.27％)。
出乎意料地，虽然与组3(Ad26-MVA初免-加强0-28天时间表)相比，在组1中观察到更小百分比的应答者(MVA-Ad26初免-加强0-28天时间表)，但是在这些应答者中由MVA-Ad26初免-加强方案诱导的多功能CD8+T细胞(表达超过一种细胞因子的CD8+T细胞)的比例相比于由Ad26-MVA初免-加强方案诱导的多功能CD8+T细胞的比例在加强后更高(图11)。在第57天施用初免物和加强免疫物时，未观察到此差异。使用此时间表，MVA初免Ad26加强方案(组2)和Ad26初免MVA加强(组4)方案两者相似地诱导高比例的多功能CD8+T细胞(图12)。
出乎意料地，先用MVA-BN-Filo引发免疫，随后以28天间隔用Ad26.ZEBOV加强免疫(组1)来诱导非常激烈的CD4+T细胞应答，所述应答在加强免疫7天后达到峰值(93％应答者，平均总细胞因子应答为0.37％；图13)。在峰值处，所述CD4+T细胞应答的强度比先用Ad26.ZEBOV引发免疫随后以28天间隔用MVA-BN-Filo加强免疫后(67％应答者，平均总细胞因子应答为0.11％)的组3中可见的强度更高。在加强21天后，由两种方案诱导的CD4+T细胞应答为相当的。将MVA-BN-Filo/Ad26.ZEBOV方案的间隔时间延长到56天，这引起更低的CD4+T细胞应答。Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo方案在28天间隔时诱导略低的CD4+T细胞应答并且在56天间隔时诱导相当的应答。由两种疫苗组合诱导的CD4+T细胞主要为多功能的(图14和图15)。
评定先用5x1010vp的Ad26.ZEBOV初免随后在14天后用1x108TCID50MVA-BN-Filo加强的免疫原性的子研究的结果汇总如下。
总之，使用初免和加强之间的14天间隔的此相对短的方案已显示为免疫原性的。通过ELISA评定对疫苗接种的体液免疫应答。当对更长的间隔进行观察时，全部受试者通过加强免疫21天后显示血清转化(图16A)。此外，加强免疫21天后在92％的受试者中通过ELISpot观察到细胞免疫应答(图16B)。此细胞免疫应答由CD4+(67％应答者，加强后第21天平均应答为0.08％)和CD8+(64％应答者，加强后第7天平均应答为0.15％)特异性T细胞两者组成。使用在初免与加强之间的2周间隔诱导的免疫应答比在使用更长间隔时诱导的应答略低(参考之前的章节)。
实施例4
进行随机的、安慰剂对照的、观察者双盲的研究(在合计6名标记研究受试者的初始开放性疫苗接种之前)，以评估如下异源方案的安全性、耐受性和免疫原性：(a)将单一剂量的MVA-BN-Filo(1x108TCID50)或安慰剂(0.9％生理盐水)作为初免物随后在不同时间点(初免后14、28或56天；组1至组3)用单一剂量的Ad26.ZEBOV(5x1010vp)或安慰剂作为加强免疫物，以及(b)将单一剂量的Ad26.ZEBOV(5x1010vp)或安慰剂作为初免物随后在初免28天后用单一剂量的MVA-BN-Filo(1x108TCID50)或安慰剂作为加强免疫物后(组4)。
为独立评定2种疫苗的安全性，包括组5和组6，其中2个单一剂量的MVA-BN-Filo(1x108TCID50)或安慰剂或2个单一剂量的Ad26.ZEBOV(5x1010vp)或安慰剂的同源方案以1和15天的更短初免-加强时间表来施用。在大约92位年龄在18岁与50岁(包括50岁)之间的健康受试者的目标中进行所述研究，所述受试者之前未接受过实验性埃博拉候选疫苗并且不具有已知的对埃博拉疾病的暴露或诊断。
研究由疫苗接种时段组成，其中受试者在其基线访问(第1天)时进行疫苗接种，随后在第15天、第29天或第57天进行加强，并且加强后随访直到全部受试者已进行其21天加强后访问或更早中断。此时，研究将为非盲的。
受试者加入6个不同组，各组包含18位(组1至组4)或10位(组5和组6)健康受试者。在组1至组4内，在整个研究中以5:1的比率随机分配患者以接受活性疫苗或安慰剂。组5和组6各自以按开放方式接受活性疫苗的3位受试者的标记群组开始，随后为以6:1比率随机分配以接受活性疫苗或安慰剂的7位受试者的双盲群组。不同组中的研究疫苗接种时间表汇总在表6中。
通过收集诉求的局部和全身性不良事件、未诉求的不良事件和严重不良事件并且通过身体检查来评定安全性。另外，在多个时间点评定标准化学参数、血液学参数(包括凝血参数)和尿分析参数。
使用汇总在表7和表8中的免疫学测定评定免疫原性。探索性测定包可包括但不限于列出的测定。
表6：研究疫苗接种时间表
Figure BDA0001238052940000511
N：接受研究疫苗的受试者的数目
在全部组中MVA-BN-Filo剂量水平为1x108TCID50(50％组织培养感染剂量)；在全部组中Ad26.ZEBOV剂量水平为5x1010vp(病毒颗粒)；安慰剂为0.9％生理盐水
表7：免疫学测定的汇总(血清学)
Figure BDA0001238052940000512
EBOV：埃博拉病毒；ELISA：酶联免疫吸附测定；GP：糖蛋白；IgG：免疫球蛋白G；MARV：马尔堡病毒；MVA：改性的安卡拉牛痘；NP：核蛋白；SUDV：苏丹病毒；TAFV：塔伊森林病毒
表8：免疫学测定的汇总(细胞)
Figure BDA0001238052940000521
EBOV：埃博拉病毒；ELISpot：酶联免疫斑点法；GP：糖蛋白；ICS：细胞内细胞因子染色；IFN：干扰素；IL：白介素；MARV：马尔堡病毒；NP：核蛋白；PBMC：外周血单核细胞；SUDV：苏丹病毒；TAFV：塔伊森林病毒；TNF：肿瘤坏死因子
临床研究正在进行。如下描述一些初始结果。
体液免疫应答的评定
当任一疫苗用作初免物并且另一疫苗用作加强免疫物时，初始结果证实5x1010vp的Ad26.ZEBOV和1x108TCID50的MVA-BN-Filo的组合的免疫原性。
如图17所示，当通过ELISA评定时，全部受试者在加强免疫21天后显示血清转化。与先前的实验相似，当将MVA用作初免物并且在28天后将Ad26作为加强免疫物施用时(组2，几何平均浓度EU/mL 6987)，与相反的疫苗免疫顺序(组4，几何平均浓度EU/mL 2976)相比，在加强免疫21天后观察到更高的免疫反应。
体液免疫应答的强度和初免与加强之间的间隔相关联，与更短时间表相比(组1，14天间隔，几何平均浓度EU/mL 4418，以及组2，28天间隔，几何平均浓度EU/mL 6987)，当使用MVA初免与Ad26加强之间的56天间隔时(组3，几何平均浓度EU/mL 14048)观察到更高抗体浓度。
出乎意料地，当将MVA-BN-Filo用作初免物并且随后在14天后用Ad26.ZEBOV加强免疫时，观察到激烈的体液免疫应答，如由ELISA评定的。接受疫苗方案的全部受试者在加强免疫21天后显示血清转化，并且比起当使用28天间隔的Ad26初免MVA加强组合，在此时间点的抗体浓度达到相似或更高的水平(几何平均浓度分别为EU/mL 4418和2976)。出乎意料地，由14天间隔的此MVA/Ad26初免加强组合诱导的抗体浓度明显高于由相同初免加强时间间隔的相反疫苗方案诱导的应答(参考实施例2，图16A，几何平均浓度EU/mL 915)。这确认MVA初免Ad26加强组合诱导激烈的免疫应答以及当使用短初免加强间隔时(14天)所述组合的优势。
细胞免疫应答的评定
通过干扰素γ(IFN-γ)ELISpot和ICS测量EBOV GP特异性细胞免疫应答。为评定细胞免疫应答，将储存的PBMC(外周血单核细胞)解冻并用2个库(库1和库2)中组织的肽刺激。在图18-图19中示出每库中刺激的T细胞应答的总和。
ELISpot分析(图18)确认先使用Ad26.ZEBOV进行初免随后用MVA-BN-Filo进行加强的方案或相反的疫苗方案两者可诱导IFN-γ应答。对于全部初免加强间隔方案，在加强免疫后增强细胞应答。当使用Ad26作为初免物随后在28天后用MVA作为加强免疫物时，IFN-γ应答最高(87％应答者，对于组4在加强后第7天和第21天分别有平均IFN-γ应答687和600SFU/106PBMC)。出人意料地，当使用MVA-BN-Filo作为初免物随后用Ad26.ZEBOV作为加强免疫物时，与由28天间隔(组2，73％和67％应答者，在加强后第7天和第21天的平均IFN-γ应答为427和375SFU/106PBMC)或56天间隔(组3，47％应答者，在加强后第7天和第21天的平均IFN-γ应答为118和153SFU/106PBMC)诱导的应答相比，当使用初免与加强之间更短的14天间隔时(对于组1，87％和93％应答者，在加强后第7天和第21天分别为395和577SFU/106PBMC)观察到更强的IFN-γ应答。
显著地，由14天间隔的MVA-BN-Filo初免Ad26.ZEBOV加强诱导的细胞免疫应答与EBOV GP特异性CD8+和CD4+T细胞应答两者取得良好平衡(对于CD4+和CD8+T细胞两者有73％应答者，在加强后第7天和第21天CD4+平均总细胞因子应答分别为0.15％和0.19％；在加强后第7天和第21天CD8+平均总细胞因子应答分别为0.19％和0.34％；图19A和图19B)。由此疫苗组合诱导的CD8+和CD4+T细胞两者主要为多功能的(图19C和图19D)。
以下表9-12呈现为本文表现的临床研究的汇总。在实施例3和4中呈现的研究分别为编号的研究1001和1002。
表9为实施例3和4所述的研究期间在ELISA测定中确定的体液免疫应答的汇总。
表9：临床研究中ELISA滴度的概况
Figure BDA0001238052940000541
Figure BDA0001238052940000551
数据呈现为以ELISA/mL计的几何平均浓度(GMC)。各个时间点应答者的百分比指示在括号中；Ad26：用Ad26.ZEBOV进行免疫；MVA：用MVA-BN-Filo进行免疫；初免加强时间表指示在表头中。0，14：初免与加强免疫之间的14天间隔；0，28：初免与加强免疫之间的28天间隔；0，56：初免与加强免疫之间的56天间隔；*：加强的天数；GMC：几何平均浓度。研究1001描述于实施例3并且研究1002描述于实施例4。
表10为实施例3和4所述的研究期间在ELISpot测定中确定的细胞免疫应答的汇总。
表10：在临床研究中通过ELISpot测定的细胞免疫应答的概况
Figure BDA0001238052940000552
Figure BDA0001238052940000561
数据呈现为平均SFU/106PBMC。各个时间点应答者的百分比指示在括号中；Ad26：用Ad26.ZEBOV进行免疫；MVA：用MVA-BN-Filo进行免疫；初免加强时间表指示在表头中。0，14：初免与加强免疫之间的14天间隔；0，28：初免与加强免疫之间的28天间隔；0，56：初免与加强免疫之间的56天间隔；加强的天数；SFU：斑点形成单位；PBMC：外周血单核细胞。研究1001描述于实施例3并且研究1002描述于实施例4。研究1001描述于实施例3并且研究1002描述于实施例4。
表11为实施例3和4所述的研究期间通过细胞内细胞因子染色(ICS)确定的CD4+T细胞应答的汇总。
表11：临床研究中通过ICS测定的CD4+T细胞免疫应答的概况
Figure BDA0001238052940000562
Figure BDA0001238052940000571
数据呈现为以％计的平均总体CD4+细胞因子应答。各个时间点应答者的百分比指示在括号中；Ad26：用Ad26.ZEBOV进行免疫；MVA：用MVA-BN-Filo进行免疫；初免加强时间表指示在表头中。0，14：初免与加强免疫之间的14天间隔；0，28：初免与加强免疫之间的28天间隔；0，56：初免与加强免疫之间的56天间隔；*：加强的天数。研究1001描述于实施例3并且研究1002描述于实施例4。
表12为实施例3和4所述的研究期间通过细胞内细胞因子染色(ICS)确定的CD8+T细胞应答的汇总。
表12：临床研究中通过ICS测定的CD8+T细胞免疫应答的概况
Figure BDA0001238052940000572
Figure BDA0001238052940000581
数据呈现为以％计的平均总体CD8+细胞因子应答。各个时间点应答者的百分比指示在括号中；Ad26：用Ad26.ZEBOV进行免疫；MVA：用MVA-BN-Filo进行免疫；初免加强时间表指示在表头中。0，14：初免与加强免疫之间的14天间隔；0，28：初免与加强免疫之间的28天间隔；0，56：初免与加强免疫之间的56天间隔；*：加强的天数。研究1001描述于实施例3并且研究1002描述于实施例4。
应该理解本文所描述的实施例和实施方案仅出于说明目的，并且将建议本领域技术人员根据它们进行各种修改或变化，并且它们被包括在本申请的精神和范围以及随附权利要求书的范围之内。
序列表
SEQ ID NO：1
糖蛋白埃博拉扎伊尔病毒，Mayinga病毒株(氨基酸序列)：
MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSIPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGQSPARTSSDPGTNTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREAAVSHLTTLATISTSPQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHRRTDNDSTASDTPSATTAAGPPKAENTNTSKSTDFLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQWIPAGIGVTGVIIAVIALFCICKFVF
SEQ ID NO：2
糖蛋白埃博拉苏丹病毒，古卢病毒株(氨基酸序列)：
MGGLSLLQLPRDKFRKSSFFVWVIILFQKAFSMPLGVVTNSTLEVTEIDQLVCKDHLASTDQLKSVGLNLEGSGVSTDIPSATKRWGFRSGVPPKVVSYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPPPPDGVRGFPRCRYVHKAQGTGPCPGDYAFHKDGAFFLYDRLASTVIYRGVNFAEGVIAFLILAKPKETFLQSPPIREAVNYTENTSSYYATSYLEYEIENFGAQHSTTLFKIDNNTFVRLDRPHTPQFLFQLNDTIHLHQQLSNTTGRLIWTLDANINADIGEWAFWENKKNLSEQLRGEELSFEALSLNETEDDDAASSRITKGRISDRATRKYSDLVPKNSPGMVPLHIPEGETTLPSQNSTEGRRVGVNTQETITETAATIIGTNGNHMQISTIGIRPSSSQIPSSSPTTAPSPEAQTPTTHTSGPSVMATEEPTTPPGSSPGPTTEAPTLTTPENITTAVKTVLPQESTSNGLITSTVTGILGSLGLRKRSRRQTNTKATGKCNPNLHYWTAQEQHNAAGIAWIPYFGPGAEGIYTEGLMHNQNALVCGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTYTILNRKAIDFLLRRWGGTCRILGPDCCIEPHDWTKNITDKINQIIHDFIDNPLPNQDNDDNWWTGWRQWIPAGIGITGIIIAIIALLCVCKLLC
SEQ ID NO：3
糖蛋白马尔堡安哥拉病毒(氨基酸序列)：
MKTTCLLISLILIQGVKTLPILEIASNIQPQNVDSVCSGTLQKTEDVHLMGFTLSGQKVADSPLEASKRWAFRAGVPPKNVEYTEGEEAKTCYNISVTDPSGKSLLLDPPTNIRDYPKCKTIHHIQGQNPHAQGIALHLWGAFFLYDRIASTTMYRGKVFTEGNIAAMIVNKTVHKMIFSRQGQGYRHMNLTSTNKYWTSSNGTQTNDTGCFGTLQEYNSTKNQTCAPSKKPLPLPTAHPEVKLTSTSTDATKLNTTDPNSDDEDLTTSGSGSGEQEPYTTSDAATKQGLSSTMPPTPSPQPSTPQQGGNNTNHSQGVVTEPGKTNTTAQPSMPPHNTTTISTNNTSKHNLSTPSVPIQNATNYNTQSTAPENEQTSAPSKTTLLPTENPTTAKSTNSTKSPTTTVPNTTNKYSTSPSPTPNSTAQHLVYFRRKRNILWREGDMFPFLDGLINAPIDFDPVPNTKTIFDESSSSGASAEEDQHASPNISLTLSYFPKVNENTAHSGENENDCDAELRIWSVQEDDLAAGLSWIPFFGPGIEGLYTAGLIKNQNNLVCRLRRLANQTAKSLELLLRVTTEERTFSLINRHAIDFLLARWGGTCKVLGPDCCIGIEDLSRNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG
SEQ ID NO：4
糖蛋白马尔堡莫索克病毒(氨基酸序列)：
MKTTCFLISLILIQGTKNLPILEIASNNQPQNVDSVCSGTLQKTEDVHLMGFTLSGQKVADSPLEASKRWAFRTGVPPKNVEYTEGEEAKTCYNISVTDPSGKSLLLDPPTNIRDYPKCKTIHHIQGQNPHAQGIALHLWGAFFLYDRIASTTMYRGKVFTEGNIAAMIVNKTVHKMIFSRQGQGYRHMNLTSTNKYWTSSNGTQTNDTGCFGALQEYNSTKNQTCAPSKIPPPLPTARPEIKLTSTPTDATKLNTTDPSSDDEDLATSGSGSGEREPHTTSDAVTKQGLSSTMPPTPSPQPSTPQQGGNNTNHSQDAVTELDKNNTTAQPSMPPHNTTTISTNNTSKHNFSTLSAPLQNTTNDNTQSTITENEQTSAPSITTLPPTGNPTTAKSTSSKKGPATTAPNTTNEHFTSPPPTPSSTAQHLVYFRRKRSILWREGDMFPFLDGLINAPIDFDPVPNTKTIFDESSSSGASAEEDQHASPNISLTLSYFPNINENTAYSGENENDCDAELRIWSVQEDDLAAGLSWIPFFGPGIEGLYTAVLIKNQNNLVCRLRRLANQTAKSLELLLRVTTEERTFSLINRHAIDFLLTRWGGTCKVLGPDCCIGIEDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG
SEQ ID NO：5
核蛋白埃博拉塔伊森林/象牙海岸病毒(氨基酸序列)：
MESRAHKAWMTHTASGFETDYHKILTAGLSVQQGIVRQRVIQVHQVTNLEEICQLIIQAFEAGVDFQESADSFLLMLCLHHAYQGDYKQFLESNAVKYLEGHGFRFEVRKKEGVKRLEELLPAASSGKSIRRTLAAMPEEETTEANAGQFLSFASLFLPKLVVGEKACLEKVQRQIQVHSEQGLIQYPTAWQSVGHMMVIFRLMRTNFLIKFLLIHQGMHMVAGHDANDAVIANSVAQARFSGLLIVKTVLDHILQKTEHGVRLHPLARTAKVKNEVNSFKAALSSLAQHGEYAPFARLLNLSGVNNLEHGLFPQLSAIALGVATAHGSTLAGVNVGEQYQQLREAATEAEKQLQKYAESRELDHLGLDDQEKKILKDFHQKKNEISFQQTTAMVTLRKERLAKLTEAITSTSLLKTGKQYDDDNDIPFPGPINDNENSEQQDDDPTDSQDTTIPDIIVDPDDGRYNNYGDYPSETANAPEDLVLFDLEDGDEDDHRPSSSSENNNKHSLTGTDSNKTSNWNRNPTNMPKKDSTQNNDNPAQRAQEYARDNIQDTPTPHRALTPISEETGSNGHNEDDIDSIPPLESDEENNTETTITTTKNTTAPPAPVYRSNSEKEPLPQEKSQKQPNQVSGSENTDNKPHSEQSVEEMYRHILQTQGPFDAILYYYMMTEEPIVFSTSDGKEYVYPDSLEGEHPPWLSEKEALNEDNRFITMDDQQFYWPVMNHRNKFMAILQHHK
序列表
<110> Bavarian Nordic A/S c/o Bavarian Nordic有限公司
Crucell Holland B.V.
美国，如由***(DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES)部长所表示的
<120> 用于诱导针对丝状病毒感染的保护性免疫的方法和组合物
<130> BN0088PCT-I
<150> US 62/045,522
<151> 2014-09-03
<150> US 62/116,021
<151> 2015-02-13
<150> US 62/159,823
<151> 2015-05-11
<150> US 62/189,109
<151> 2015-07-06
<160> 5
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖蛋白埃博拉扎伊尔病毒(Ebola virus Zaire)，Mayinga病毒株
<400> 1
Met Gly Val Thr Gly Ile Leu Gln Leu Pro Arg Asp Arg Phe Lys Arg
1 5 10 15
Thr Ser Phe Phe Leu Trp Val Ile Ile Leu Phe Gln Arg Thr Phe Ser
20 25 30
Ile Pro Leu Gly Val Ile His Asn Ser Thr Leu Gln Val Ser Asp Val
35 40 45
Asp Lys Leu Val Cys Arg Asp Lys Leu Ser Ser Thr Asn Gln Leu Arg
50 55 60
Ser Val Gly Leu Asn Leu Glu Gly Asn Gly Val Ala Thr Asp Val Pro
65 70 75 80
Ser Ala Thr Lys Arg Trp Gly Phe Arg Ser Gly Val Pro Pro Lys Val
85 90 95
Val Asn Tyr Glu Ala Gly Glu Trp Ala Glu Asn Cys Tyr Asn Leu Glu
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Ile Lys Lys Pro Asp Gly Ser Glu Cys Leu Pro Ala Ala Pro Asp Gly
115 120 125
Ile Arg Gly Phe Pro Arg Cys Arg Tyr Val His Lys Val Ser Gly Thr
130 135 140
Gly Pro Cys Ala Gly Asp Phe Ala Phe His Lys Glu Gly Ala Phe Phe
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Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Ser Thr Val Ile Tyr Arg Gly Thr Thr Phe
165 170 175
Ala Glu Gly Val Val Ala Phe Leu Ile Leu Pro Gln Ala Lys Lys Asp
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Phe Phe Ser Ser His Pro Leu Arg Glu Pro Val Asn Ala Thr Glu Asp
195 200 205
Pro Ser Ser Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr Ile Arg Tyr Gln Ala Thr Gly
210 215 220
Phe Gly Thr Asn Glu Thr Glu Tyr Leu Phe Glu Val Asp Asn Leu Thr
225 230 235 240
Tyr Val Gln Leu Glu Ser Arg Phe Thr Pro Gln Phe Leu Leu Gln Leu
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Asn Glu Thr Ile Tyr Thr Ser Gly Lys Arg Ser Asn Thr Thr Gly Lys
260 265 270
Leu Ile Trp Lys Val Asn Pro Glu Ile Asp Thr Thr Ile Gly Glu Trp
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Gln Ser Pro Ala Arg Thr Ser Ser Asp Pro Gly Thr Asn Thr Thr Thr
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675
<210> 2
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖蛋白埃博拉苏丹病毒(Ebola virus Sudan)，古卢(Gulu)病毒株
<400> 2
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Leu Ala Asn Glu Thr Thr Gln Ala Leu Gln Leu Phe Leu Arg Ala Thr
565 570 575
Thr Glu Leu Arg Thr Tyr Thr Ile Leu Asn Arg Lys Ala Ile Asp Phe
580 585 590
Leu Leu Arg Arg Trp Gly Gly Thr Cys Arg Ile Leu Gly Pro Asp Cys
595 600 605
Cys Ile Glu Pro His Asp Trp Thr Lys Asn Ile Thr Asp Lys Ile Asn
610 615 620
Gln Ile Ile His Asp Phe Ile Asp Asn Pro Leu Pro Asn Gln Asp Asn
625 630 635 640
Asp Asp Asn Trp Trp Thr Gly Trp Arg Gln Trp Ile Pro Ala Gly Ile
645 650 655
Gly Ile Thr Gly Ile Ile Ile Ala Ile Ile Ala Leu Leu Cys Val Cys
660 665 670
Lys Leu Leu Cys
675
<210> 3
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖蛋白马尔堡安哥拉病毒(Marburg virus Angola)
<400> 3
Met Lys Thr Thr Cys Leu Leu Ile Ser Leu Ile Leu Ile Gln Gly Val
1 5 10 15
Lys Thr Leu Pro Ile Leu Glu Ile Ala Ser Asn Ile Gln Pro Gln Asn
20 25 30
Val Asp Ser Val Cys Ser Gly Thr Leu Gln Lys Thr Glu Asp Val His
35 40 45
Leu Met Gly Phe Thr Leu Ser Gly Gln Lys Val Ala Asp Ser Pro Leu
50 55 60
Glu Ala Ser Lys Arg Trp Ala Phe Arg Ala Gly Val Pro Pro Lys Asn
65 70 75 80
Val Glu Tyr Thr Glu Gly Glu Glu Ala Lys Thr Cys Tyr Asn Ile Ser
85 90 95
Val Thr Asp Pro Ser Gly Lys Ser Leu Leu Leu Asp Pro Pro Thr Asn
100 105 110
Ile Arg Asp Tyr Pro Lys Cys Lys Thr Ile His His Ile Gln Gly Gln
115 120 125
Asn Pro His Ala Gln Gly Ile Ala Leu His Leu Trp Gly Ala Phe Phe
130 135 140
Leu Tyr Asp Arg Ile Ala Ser Thr Thr Met Tyr Arg Gly Lys Val Phe
145 150 155 160
Thr Glu Gly Asn Ile Ala Ala Met Ile Val Asn Lys Thr Val His Lys
165 170 175
Met Ile Phe Ser Arg Gln Gly Gln Gly Tyr Arg His Met Asn Leu Thr
180 185 190
Ser Thr Asn Lys Tyr Trp Thr Ser Ser Asn Gly Thr Gln Thr Asn Asp
195 200 205
Thr Gly Cys Phe Gly Thr Leu Gln Glu Tyr Asn Ser Thr Lys Asn Gln
210 215 220
Thr Cys Ala Pro Ser Lys Lys Pro Leu Pro Leu Pro Thr Ala His Pro
225 230 235 240
Glu Val Lys Leu Thr Ser Thr Ser Thr Asp Ala Thr Lys Leu Asn Thr
245 250 255
Thr Asp Pro Asn Ser Asp Asp Glu Asp Leu Thr Thr Ser Gly Ser Gly
260 265 270
Ser Gly Glu Gln Glu Pro Tyr Thr Thr Ser Asp Ala Ala Thr Lys Gln
275 280 285
Gly Leu Ser Ser Thr Met Pro Pro Thr Pro Ser Pro Gln Pro Ser Thr
290 295 300
Pro Gln Gln Gly Gly Asn Asn Thr Asn His Ser Gln Gly Val Val Thr
305 310 315 320
Glu Pro Gly Lys Thr Asn Thr Thr Ala Gln Pro Ser Met Pro Pro His
325 330 335
Asn Thr Thr Thr Ile Ser Thr Asn Asn Thr Ser Lys His Asn Leu Ser
340 345 350
Thr Pro Ser Val Pro Ile Gln Asn Ala Thr Asn Tyr Asn Thr Gln Ser
355 360 365
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370 375 380
Leu Pro Thr Glu Asn Pro Thr Thr Ala Lys Ser Thr Asn Ser Thr Lys
385 390 395 400
Ser Pro Thr Thr Thr Val Pro Asn Thr Thr Asn Lys Tyr Ser Thr Ser
405 410 415
Pro Ser Pro Thr Pro Asn Ser Thr Ala Gln His Leu Val Tyr Phe Arg
420 425 430
Arg Lys Arg Asn Ile Leu Trp Arg Glu Gly Asp Met Phe Pro Phe Leu
435 440 445
Asp Gly Leu Ile Asn Ala Pro Ile Asp Phe Asp Pro Val Pro Asn Thr
450 455 460
Lys Thr Ile Phe Asp Glu Ser Ser Ser Ser Gly Ala Ser Ala Glu Glu
465 470 475 480
Asp Gln His Ala Ser Pro Asn Ile Ser Leu Thr Leu Ser Tyr Phe Pro
485 490 495
Lys Val Asn Glu Asn Thr Ala His Ser Gly Glu Asn Glu Asn Asp Cys
500 505 510
Asp Ala Glu Leu Arg Ile Trp Ser Val Gln Glu Asp Asp Leu Ala Ala
515 520 525
Gly Leu Ser Trp Ile Pro Phe Phe Gly Pro Gly Ile Glu Gly Leu Tyr
530 535 540
Thr Ala Gly Leu Ile Lys Asn Gln Asn Asn Leu Val Cys Arg Leu Arg
545 550 555 560
Arg Leu Ala Asn Gln Thr Ala Lys Ser Leu Glu Leu Leu Leu Arg Val
565 570 575
Thr Thr Glu Glu Arg Thr Phe Ser Leu Ile Asn Arg His Ala Ile Asp
580 585 590
Phe Leu Leu Ala Arg Trp Gly Gly Thr Cys Lys Val Leu Gly Pro Asp
595 600 605
Cys Cys Ile Gly Ile Glu Asp Leu Ser Arg Asn Ile Ser Glu Gln Ile
610 615 620
Asp Gln Ile Lys Lys Asp Glu Gln Lys Glu Gly Thr Gly Trp Gly Leu
625 630 635 640
Gly Gly Lys Trp Trp Thr Ser Asp Trp Gly Val Leu Thr Asn Leu Gly
645 650 655
Ile Leu Leu Leu Leu Ser Ile Ala Val Leu Ile Ala Leu Ser Cys Ile
660 665 670
Cys Arg Ile Phe Thr Lys Tyr Ile Gly
675 680
<210> 4
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 糖蛋白马尔堡莫索克病毒(Marburg virus Musoke)
<400> 4
Met Lys Thr Thr Cys Phe Leu Ile Ser Leu Ile Leu Ile Gln Gly Thr
1 5 10 15
Lys Asn Leu Pro Ile Leu Glu Ile Ala Ser Asn Asn Gln Pro Gln Asn
20 25 30
Val Asp Ser Val Cys Ser Gly Thr Leu Gln Lys Thr Glu Asp Val His
35 40 45
Leu Met Gly Phe Thr Leu Ser Gly Gln Lys Val Ala Asp Ser Pro Leu
50 55 60
Glu Ala Ser Lys Arg Trp Ala Phe Arg Thr Gly Val Pro Pro Lys Asn
65 70 75 80
Val Glu Tyr Thr Glu Gly Glu Glu Ala Lys Thr Cys Tyr Asn Ile Ser
85 90 95
Val Thr Asp Pro Ser Gly Lys Ser Leu Leu Leu Asp Pro Pro Thr Asn
100 105 110
Ile Arg Asp Tyr Pro Lys Cys Lys Thr Ile His His Ile Gln Gly Gln
115 120 125
Asn Pro His Ala Gln Gly Ile Ala Leu His Leu Trp Gly Ala Phe Phe
130 135 140
Leu Tyr Asp Arg Ile Ala Ser Thr Thr Met Tyr Arg Gly Lys Val Phe
145 150 155 160
Thr Glu Gly Asn Ile Ala Ala Met Ile Val Asn Lys Thr Val His Lys
165 170 175
Met Ile Phe Ser Arg Gln Gly Gln Gly Tyr Arg His Met Asn Leu Thr
180 185 190
Ser Thr Asn Lys Tyr Trp Thr Ser Ser Asn Gly Thr Gln Thr Asn Asp
195 200 205
Thr Gly Cys Phe Gly Ala Leu Gln Glu Tyr Asn Ser Thr Lys Asn Gln
210 215 220
Thr Cys Ala Pro Ser Lys Ile Pro Pro Pro Leu Pro Thr Ala Arg Pro
225 230 235 240
Glu Ile Lys Leu Thr Ser Thr Pro Thr Asp Ala Thr Lys Leu Asn Thr
245 250 255
Thr Asp Pro Ser Ser Asp Asp Glu Asp Leu Ala Thr Ser Gly Ser Gly
260 265 270
Ser Gly Glu Arg Glu Pro His Thr Thr Ser Asp Ala Val Thr Lys Gln
275 280 285
Gly Leu Ser Ser Thr Met Pro Pro Thr Pro Ser Pro Gln Pro Ser Thr
290 295 300
Pro Gln Gln Gly Gly Asn Asn Thr Asn His Ser Gln Asp Ala Val Thr
305 310 315 320
Glu Leu Asp Lys Asn Asn Thr Thr Ala Gln Pro Ser Met Pro Pro His
325 330 335
Asn Thr Thr Thr Ile Ser Thr Asn Asn Thr Ser Lys His Asn Phe Ser
340 345 350
Thr Leu Ser Ala Pro Leu Gln Asn Thr Thr Asn Asp Asn Thr Gln Ser
355 360 365
Thr Ile Thr Glu Asn Glu Gln Thr Ser Ala Pro Ser Ile Thr Thr Leu
370 375 380
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385 390 395 400
Gly Pro Ala Thr Thr Ala Pro Asn Thr Thr Asn Glu His Phe Thr Ser
405 410 415
Pro Pro Pro Thr Pro Ser Ser Thr Ala Gln His Leu Val Tyr Phe Arg
420 425 430
Arg Lys Arg Ser Ile Leu Trp Arg Glu Gly Asp Met Phe Pro Phe Leu
435 440 445
Asp Gly Leu Ile Asn Ala Pro Ile Asp Phe Asp Pro Val Pro Asn Thr
450 455 460
Lys Thr Ile Phe Asp Glu Ser Ser Ser Ser Gly Ala Ser Ala Glu Glu
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485 490 495
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500 505 510
Asp Ala Glu Leu Arg Ile Trp Ser Val Gln Glu Asp Asp Leu Ala Ala
515 520 525
Gly Leu Ser Trp Ile Pro Phe Phe Gly Pro Gly Ile Glu Gly Leu Tyr
530 535 540
Thr Ala Val Leu Ile Lys Asn Gln Asn Asn Leu Val Cys Arg Leu Arg
545 550 555 560
Arg Leu Ala Asn Gln Thr Ala Lys Ser Leu Glu Leu Leu Leu Arg Val
565 570 575
Thr Thr Glu Glu Arg Thr Phe Ser Leu Ile Asn Arg His Ala Ile Asp
580 585 590
Phe Leu Leu Thr Arg Trp Gly Gly Thr Cys Lys Val Leu Gly Pro Asp
595 600 605
Cys Cys Ile Gly Ile Glu Asp Leu Ser Lys Asn Ile Ser Glu Gln Ile
610 615 620
Asp Gln Ile Lys Lys Asp Glu Gln Lys Glu Gly Thr Gly Trp Gly Leu
625 630 635 640
Gly Gly Lys Trp Trp Thr Ser Asp Trp Gly Val Leu Thr Asn Leu Gly
645 650 655
Ile Leu Leu Leu Leu Ser Ile Ala Val Leu Ile Ala Leu Ser Cys Ile
660 665 670
Cys Arg Ile Phe Thr Lys Tyr Ile Gly
675 680
<210> 5
<211> 739
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核蛋白埃博拉塔伊森林/象牙海岸病毒(Ebola virus Tai Forest /Ivory coast)
<400> 5
Met Glu Ser Arg Ala His Lys Ala Trp Met Thr His Thr Ala Ser Gly
1 5 10 15
Phe Glu Thr Asp Tyr His Lys Ile Leu Thr Ala Gly Leu Ser Val Gln
20 25 30
Gln Gly Ile Val Arg Gln Arg Val Ile Gln Val His Gln Val Thr Asn
35 40 45
Leu Glu Glu Ile Cys Gln Leu Ile Ile Gln Ala Phe Glu Ala Gly Val
50 55 60
Asp Phe Gln Glu Ser Ala Asp Ser Phe Leu Leu Met Leu Cys Leu His
65 70 75 80
His Ala Tyr Gln Gly Asp Tyr Lys Gln Phe Leu Glu Ser Asn Ala Val
85 90 95
Lys Tyr Leu Glu Gly His Gly Phe Arg Phe Glu Val Arg Lys Lys Glu
100 105 110
Gly Val Lys Arg Leu Glu Glu Leu Leu Pro Ala Ala Ser Ser Gly Lys
115 120 125
Ser Ile Arg Arg Thr Leu Ala Ala Met Pro Glu Glu Glu Thr Thr Glu
130 135 140
Ala Asn Ala Gly Gln Phe Leu Ser Phe Ala Ser Leu Phe Leu Pro Lys
145 150 155 160
Leu Val Val Gly Glu Lys Ala Cys Leu Glu Lys Val Gln Arg Gln Ile
165 170 175
Gln Val His Ser Glu Gln Gly Leu Ile Gln Tyr Pro Thr Ala Trp Gln
180 185 190
Ser Val Gly His Met Met Val Ile Phe Arg Leu Met Arg Thr Asn Phe
195 200 205
Leu Ile Lys Phe Leu Leu Ile His Gln Gly Met His Met Val Ala Gly
210 215 220
His Asp Ala Asn Asp Ala Val Ile Ala Asn Ser Val Ala Gln Ala Arg
225 230 235 240
Phe Ser Gly Leu Leu Ile Val Lys Thr Val Leu Asp His Ile Leu Gln
245 250 255
Lys Thr Glu His Gly Val Arg Leu His Pro Leu Ala Arg Thr Ala Lys
260 265 270
Val Lys Asn Glu Val Asn Ser Phe Lys Ala Ala Leu Ser Ser Leu Ala
275 280 285
Gln His Gly Glu Tyr Ala Pro Phe Ala Arg Leu Leu Asn Leu Ser Gly
290 295 300
Val Asn Asn Leu Glu His Gly Leu Phe Pro Gln Leu Ser Ala Ile Ala
305 310 315 320
Leu Gly Val Ala Thr Ala His Gly Ser Thr Leu Ala Gly Val Asn Val
325 330 335
Gly Glu Gln Tyr Gln Gln Leu Arg Glu Ala Ala Thr Glu Ala Glu Lys
340 345 350
Gln Leu Gln Lys Tyr Ala Glu Ser Arg Glu Leu Asp His Leu Gly Leu
355 360 365
Asp Asp Gln Glu Lys Lys Ile Leu Lys Asp Phe His Gln Lys Lys Asn
370 375 380
Glu Ile Ser Phe Gln Gln Thr Thr Ala Met Val Thr Leu Arg Lys Glu
385 390 395 400
Arg Leu Ala Lys Leu Thr Glu Ala Ile Thr Ser Thr Ser Leu Leu Lys
405 410 415
Thr Gly Lys Gln Tyr Asp Asp Asp Asn Asp Ile Pro Phe Pro Gly Pro
420 425 430
Ile Asn Asp Asn Glu Asn Ser Glu Gln Gln Asp Asp Asp Pro Thr Asp
435 440 445
Ser Gln Asp Thr Thr Ile Pro Asp Ile Ile Val Asp Pro Asp Asp Gly
450 455 460
Arg Tyr Asn Asn Tyr Gly Asp Tyr Pro Ser Glu Thr Ala Asn Ala Pro
465 470 475 480
Glu Asp Leu Val Leu Phe Asp Leu Glu Asp Gly Asp Glu Asp Asp His
485 490 495
Arg Pro Ser Ser Ser Ser Glu Asn Asn Asn Lys His Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Thr Asp Ser Asn Lys Thr Ser Asn Trp Asn Arg Asn Pro Thr Asn Met
515 520 525
Pro Lys Lys Asp Ser Thr Gln Asn Asn Asp Asn Pro Ala Gln Arg Ala
530 535 540
Gln Glu Tyr Ala Arg Asp Asn Ile Gln Asp Thr Pro Thr Pro His Arg
545 550 555 560
Ala Leu Thr Pro Ile Ser Glu Glu Thr Gly Ser Asn Gly His Asn Glu
565 570 575
Asp Asp Ile Asp Ser Ile Pro Pro Leu Glu Ser Asp Glu Glu Asn Asn
580 585 590
Thr Glu Thr Thr Ile Thr Thr Thr Lys Asn Thr Thr Ala Pro Pro Ala
595 600 605
Pro Val Tyr Arg Ser Asn Ser Glu Lys Glu Pro Leu Pro Gln Glu Lys
610 615 620
Ser Gln Lys Gln Pro Asn Gln Val Ser Gly Ser Glu Asn Thr Asp Asn
625 630 635 640
Lys Pro His Ser Glu Gln Ser Val Glu Glu Met Tyr Arg His Ile Leu
645 650 655
Gln Thr Gln Gly Pro Phe Asp Ala Ile Leu Tyr Tyr Tyr Met Met Thr
660 665 670
Glu Glu Pro Ile Val Phe Ser Thr Ser Asp Gly Lys Glu Tyr Val Tyr
675 680 685
Pro Asp Ser Leu Glu Gly Glu His Pro Pro Trp Leu Ser Glu Lys Glu
690 695 700
Ala Leu Asn Glu Asp Asn Arg Phe Ile Thr Met Asp Asp Gln Gln Phe
705 710 715 720
Tyr Trp Pro Val Met Asn His Arg Asn Lys Phe Met Ala Ile Leu Gln
725 730 735
His His Lys

Claims (33)

1.一种疫苗组合产品，所述疫苗组合产品包含
(i)第一组合物，其包含免疫有效量的腺病毒载体和药学上可接受的载体，所述腺病毒载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸；以及
(ii)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体和药学上可接受的载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸；
其中所述第一组合物为初免组合物并且所述第二组合物为加强组合物。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合产品，其中所述第一组合物(i)还包含腺病毒载体，所述腺病毒载体包含编码第二丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合产品，其中所述第一组合物(i)还包含腺病毒载体，所述腺病毒载体包含编码第三丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
4.根据权利要求1所述的疫苗组合产品，其中所述第一组合物(i)中的所述腺病毒载体包含编码具有SEQ ID NO:1的抗原蛋白的核酸。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合产品，其中组合物(i)还包含腺病毒，所述腺病毒包含编码具有SEQ ID NO:2的抗原蛋白的核酸。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合产品，其中组合物(i)还包含腺病毒，所述腺病毒包含编码具有SEQ ID NO:3的抗原蛋白的核酸。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的疫苗组合产品，其中组合物(ii)中的所述MVA载体包含编码至少四种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的疫苗组合产品，其中组合物(ii)中的所述MVA载体包含编码来自四种不同丝状病毒亚型的具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的抗原蛋白的核酸。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的疫苗组合产品，其中所述腺病毒载体为rAd26或rAd35载体。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的疫苗组合产品，其用于产生针对至少一种丝状病毒亚型的保护性免疫应答，其中所述第一组合物用于引发所述免疫应答并且所述第二组合物用于加强所述免疫应答。
11.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)第一组合物，其包含免疫有效量的腺病毒载体和药学上可接受的载体，所述腺病毒载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸；以及
(ii)第二组合物，其包含免疫有效量的MVA载体和药学上可接受的载体，所述MVA载体包含编码至少两种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸；
其中所述第一组合物为初免组合物并且所述第二组合物为加强组合物。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述第一组合物(i)还包含腺病毒载体，所述腺病毒载体包含编码第二丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述第一组合物(i)还包含腺病毒载体，所述腺病毒载体包含编码第三丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
14.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述第一组合物(i)中的所述腺病毒载体包含编码具有SEQ ID NO:1的抗原蛋白的核酸。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中组合物(i)还包含腺病毒，所述腺病毒包含编码具有SEQ ID NO:2的抗原蛋白的核酸。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中组合物(i)还包含腺病毒，所述腺病毒包含编码具有SEQ ID NO:3的抗原蛋白的核酸。
17.根据权利要求11-16中任一项所述的试剂盒，其中组合物(ii)中的所述MVA载体包含编码至少四种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的试剂盒，其中组合物(ii)中的所述MVA载体包含编码来自四种不同丝状病毒亚型的具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQID NO:5的抗原蛋白的核酸。
19.根据权利要求11-18中任一项所述的试剂盒，其中所述腺病毒载体为rAd26或rAd35载体。
20.根据权利要求11-19中任一项所述的试剂盒，用于产生针对至少一种丝状病毒亚型的保护性免疫应答，其中所述第一组合物用于引发所述免疫应答并且所述第二组合物用于加强所述免疫应答。
21.根据权利要求1-9中任一项所述的疫苗组合产品或根据权利要求11-20中任一项所述的试剂盒，用于制备药物组合物或药剂，其中所述第一组合物用于引发所述免疫应答并且所述第二组合物用于加强所述免疫应答。
22.第一组合物和第二组合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于在受试者中诱导针对丝状病毒的免疫应答的方法，
其中所述第一组合物包含免疫有效量的腺病毒载体，所述腺病毒载体包含编码第一丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸，
所述第二组合物包含免疫有效量的MVA载体，所述MVA载体包含编码丝状病毒的至少两种病毒株的抗原蛋白的核酸，
并且所述方法包括：
a.首先，将所述第一组合物施用于所述受试者；以及
b.随后，将所述第二组合物施用于所述受试者。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述第一组合物还包含腺病毒载体，所述腺病毒载体包含编码第二丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述第一组合物还包含腺病毒载体，所述腺病毒载体包含编码第三丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
25.根据权利要求22所述的用途，其中所述第一组合物中的所述腺病毒载体包含编码具有SEQ ID NO:1的抗原蛋白的核酸。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述第一组合物还包含腺病毒，所述腺病毒包含编码具有SEQ ID NO:2的抗原蛋白的核酸。
27.根据权利要求26所述的用途，其中所述第一组合物还包含腺病毒，所述腺病毒包含编码具有SEQ ID NO:3的抗原蛋白的核酸。
28.根据权利要求22-27中任一项所述的用途，其中所述第二组合物中的所述MVA载体包含编码至少四种丝状病毒亚型的抗原蛋白的核酸。
29.根据权利要求22-28中任一项所述的用途，其中所述第二组合物中的所述MVA载体包含编码来自四种不同丝状病毒亚型的具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的抗原蛋白的核酸。
30.根据权利要求22-29中任一项所述的用途，其中所述腺病毒载体为rAd26或rAd35载体。
31.根据权利要求22-30中任一项所述的用途，其中步骤(b)在步骤(a)之后1-12周进行。
32.根据权利要求11-19中任一项所述的试剂盒在制备用于产生针对至少一种丝状病毒亚型的保护性免疫应答的药物组合物中的用途，其中所述第一组合物用于引发所述免疫应答并且所述第二组合物用于加强所述免疫应答。
33.根据权利要求1-9中任一项所述的疫苗组合产品或根据权利要求11-20中任一项所述的试剂盒在用于制备药物组合物或药剂中的用途，其中所述第一组合物用于引发所述免疫应答并且所述第二组合物用于加强所述免疫应答。
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