CN107449771A - 酶促化学发光底物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种酶促化学发光底物。所述酶促化学发光底物含有以下成分：9‑(4‑氯苯基硫代苯酰氧亚甲基)‑10‑甲基‑9,10‑二氢化吖啶‑二钠盐；5‑(十四酰胺基)荧光素；芳基酰腙‑9,10吖啶衍生物。本发明中，增加芳基酰腙‑9,10吖啶衍生物作为底物增强剂，溶解在底物溶液中，可以与碱性磷酸酶作用而发光，使所述酶促化学发光底物具有发光信号强、进入平台期较快、持续时间长，常温保存期长等优点。

Description

酶促化学发光底物
【技术领域】
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种酶促化学发光底物。
【背景技术】
化学发光是物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象，可以分为直接发光和间接发光。直接发光是最简单的化学发光反应，有两个关键步骤组成：即激发和辐射。如A、B两种物质发生化学反应生成C物质，反应释放的能量被C物质的分子吸收并跃迁至激发态C*，处于激发的C*在回到基态的过程中产生光辐射。这里C*是发光体，此过程中由于C直接参与反应，故称直接化学发光。间接发光又称能量转移化学发光，它主要由三个步骤组成：首先反应物A和B反应生成激发态中间体C*(能量给予体)；当C*分解时释放出能量转移给F(能量接受体)，使F被激发而跃迁至激发态F*；最后，当F*跃迁回基态时，产生发光。
化学发光的最新发展主要在原有发光试剂及体系的基础上,研究合成新的发光试剂,建立新的发光体系,与其它技术,如流动注射技术(FIA)、高效液相色谱(HPLC)、固定化试剂技术、传感器技术以及生化免疫技术等联用,拓宽了化学发光的应用范围。化学发光与生化免疫分析相结合,开创了化学发光分析的新领域。由于其非放射性、灵敏度高和操作方便,已成为生化免疫分析的一个重要手段,对于酶、三磷酸腺苷(ATP)、抗原、抗体、激素等生物活性物质的分析发挥着愈来愈重要的作用。
APS-5是一种新型化学发光底物，其在均相碱性磷酸酶检测中的应用表现出超高的灵敏度，(可以检测到小于10-19mol的碱性磷酸酶)，能迅速达到峰值以减少检测时间，增加通过量，线性校准曲线的斜率是以重对数等于1.0绘制的。一个数量及以上的酶产生一个数量及以上的发光量，持续发光——对测定时间的要求并不高。发光强度可以在任何时间从产生的线性校准曲线上读取，分析结果对温度在22℃—35℃范围内不敏感，降低控制温度所需的精确度。APS-5采用了独特的技术，在化学发光检测过程中，为碱性磷酸酶偶联提供优越的灵敏度和易用性。反应由acr idan(9,10-二氢吖啶)作为底物和碱性磷酸酶标记，生产持续高强度的化学发光。APS-5是溶液分析法测定磷酸酶活性和磷酸酶酶联免疫检测非常理想的解决方案。
相关技术中，APS-5类酶促化学发光底物存在稳定性差的问题，不能长期稳定保存，其存储条件及使用条件的难度在一定程度上限制了其应用。
因此，有必要提供一种新的技术解决上述技术问题。
【发明内容】
本发明的目的是克服上述技术问题，提供一种发光信号强、进入平台期较快、持续时间长，常温保存期长的酶促化学发光底物。
本发明的技术方案是：
一种酶促化学发光底物，所述酶促化学发光底物含有以下成分：
9-(4-氯苯基硫代苯酰氧亚甲基)-10-甲基-9,10-二氢化吖啶-二钠盐；
5-(十四酰胺基)荧光素；
芳基酰腙-9,10吖啶衍生物。
优选的，所述酶促化学发光底物以Tris-Tween20缓冲液为溶剂。
优选的，所述酶促化学发光底物还含有ZnCl2、MgCl2、十六烷基三甲基氯化铵和防腐剂。
优选的，所述酶促化学发光底物包含以下成分：
浓度为0.2mol/L的Tris缓冲体系。
优选的，所述酶促化学发光底物包括以下成分：
浓度为0.2mol/L的Tris缓冲体系。
优选的，所述防腐剂为Proclin-300。
优选的，所述芳基酰腙-9,10吖啶衍生物的结构式如下：
其中R表示为9,10-吖啶或者9,10-吖啶衍生物。
与相关技术相比，本发明提供的酶促化学发光底物，有益效果在于：本发明提供的酶促化学发光底物，通过优化发光底物的配方，在配方中增加芳基酰腙-9,10吖啶衍生物作为发光增强剂，增强剂溶液在底物溶液中，可以与碱性磷酸酶作用而发光，其发光强度与碱性连酸梅的量成正比，因此所述酶促发光底物具有发光信号强、进入平台期较快、持续时间长等优点；同时其提高了所述酶促化学发光底物的热稳定性和实时稳定性，使所述酶促发光底物具有常温保存期长的特点。
【附图说明】
图1为本发明提供的酶促发光底物反应动力学研究实验结果示意图。
【具体实施方式】
下面将结合附图和实施方式具体实施方式对本发明作进一步说明。
实施例一
酶促发光底物的制备
(1)材料：5-(十四酰胺基)荧光素，9-(4-氯苯基硫代苯酰氧亚甲基)-10-甲基-9,10-二氢化吖啶-二钠盐，MgCl2，ZnCl2，芳基酰腙-9,10吖啶衍生物，十六烷基三甲基氯化铵均为市购，化学纯；Proclin-300，Tween20，Tris为美国sigma-aldrich的产品。其中，芳基酰腙-9,10吖啶衍生物由芳基酰腙与9,10吖啶衍生物合成。
(2)以Tris-Tween20缓冲液为溶剂，制备不同浓度的酶促化学发光底物，具体如表1.1-表1.4。
表1.1：配方一
表1.2：配方二
表1.3：配方三
表1.4：配方四
在本发明提供的酶促化学发光底物中，芳基酰腙-9,10吖啶衍生物在化学发光缓冲体系中起到荧光探针的作用，使发光增强，当APS-5遇到碱性磷酸酶时，会脱去磷酸基团，生成磷酸根离子，同时发生发光，同时缓冲液中的芳基酰腙-9,10吖啶衍生物会识别生成的磷酸根离子，会形成荧光螯合物，促发荧光之间发生能量的转移，从而使荧光信号大幅度的几十倍的增强，基于磷酸基对荧光探针特异性催化结合反应来实现大幅度的提高发光信号的变化。
实施例二
比较配方一、配方二、配方三、配方四的酶促化学发光底物与市售Lumigen的发光底物测试各梯度浓度AP信号强度及线性关系。具体如表2.1-表2.5：
表2.1
表2.2
表2.3
表2.4
表2.5
通过表2.1-表2.5的检测数据结果可以看出，本发明提供的酶促化学发光底物的空白发光强度不高于300；在相同浓度AP条件下，本发明提供的酶促化学发光底物的信号强度高于市售Lumigen的发光底物的信号强度。
实施例三
比较配方一、配方二、配方三、配方四的酶促化学发光底物与市售Lumigen的发光底物测定癌胚抗原(CEA)定量检测试剂盒的线性。
应用双抗体夹心法检测人血清中CEA含量，实验步骤如下：
步骤S1：在化学发光管中分别加入人血清样本或CEA校准品30ul、稀释的酶标抗体100ul、偶联抗体的磁珠30ul，混匀后37℃反应15min；
步骤S2：加入300ul清洗液清洗3次；
步骤S3：在不同的化学发光管中分别加入配方一、配方二、配方三、配方四的酶促化学发光底物和市售Lumigen的化学发光底物各100ul；
步骤S4：化学发光仪检测发光强度RLU值。
发光强度RLU值的检测结果如表3：
由表3的检测结果可知，在相同条件下进行测定癌胚抗原(CEA)定量检测试剂盒的线性，本发明提供的酶促发光底物的信号强度高于市售Lumigen的发光底物的信号强度。
实施例四
热稳定性研究
对实施例一中按配方一、配方二、配方三、配方四制备得到的化学发光底物分别于37℃放置10天、4℃放置18个月进行热稳定性实验以及实时稳定性实验，实验结果如表4、表5所示：
表4：热稳定性实验结果
表5：实时稳定性实验结果
由表4、表5的信号保留率数据可知，本发明提供的酶促化学发光底物热稳定性实验和实时稳定性实验的信号保留率均大于95％，结果表明本发明的酶促化学发光底物能够长期稳定保存，可以满足化学发光仪器检测的需求。
实施例五
反应动力学研究
对照实施例一中按配方一、配方二、配方三、配方四制备得到的酶促化学发光底物和市售Lumigen的化学发光底物以及未添加芳基酰腙-9,10吖啶衍生物的发光底物，进行反应动力学研究。请参阅图1，为本发明提供的酶促发光底物反应动力学研究实验结果示意图。其中，曲线a表示市售Lumigen的化学发光底物反应动力学曲线图；曲线b表示配方一的酶促化学发光底物反应动力学曲线图；曲线c表示配方二的酶促化学发光底物反应动力学曲线图；曲线d表示配方三的酶促化学发光底物反应动力学曲线图；曲线e表示配方四的酶促化学发光底物反应动力学曲线图；曲线f表示未添加芳基酰腙-9,10吖啶衍生物的发光底物反应动力学曲线图。
由附图1可知，本发明提供的酶促化学发光底物在1min可达到平台期(附图中横坐标单位为秒)，本发明提供的酶促化学发光底物中，由于添加了芳基酰腙-9,10吖啶衍生物作为发光增强剂，明显提高了APS-5底物的化学发光效率。配方一、配方二、配方四对应的酶促化学发光底物的信号强度与市售Lumigen的化学发光底物的信号强度相当，然而配方三对应的酶促化学发光底物的信号强度明显高于市售Lumigen的化学发光底物的信号强度。
与相关技术相比，本发明提供的酶促化学发光底物，有益效果在于：本发明提供的酶促化学发光底物，通过优化发光底物的配方，在配方中增加芳基酰腙-9,10吖啶衍生物作为增强剂，增强剂溶液在底物溶液中，可以与碱性磷酸酶作用而发光，其发光强度与碱性连酸梅的量成正比，因此所述酶促发光底物具有发光信号强、进入平台期较快、持续时间长等优点；同时其提高了所述酶促化学发光底物的热稳定性和实时稳定性，使所述酶促发光底物具有常温保存期长的特点。
以上所述的仅是本发明的实施方式，在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出改进，但这些均属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种酶促化学发光底物，其特征在于，所述酶促化学发光底物含有以下成分：
9-(4-氯苯基硫代苯酰氧亚甲基)-10-甲基-9,10-二氢化吖啶-二钠盐；
5-(十四酰胺基)荧光素；
芳基酰腙-9,10吖啶衍生物。
2.根据权利要求1所述的酶促化学发光底物，其特征在于，所述酶促化学发光底物以Tris-Tween20缓冲液为溶剂。
3.根据权利要求2所述的酶促化学发光底物，其特征在于，所述酶促化学发光底物还含有ZnCl2、MgCl2、十六烷基三甲基氯化铵和防腐剂。
4.根据权利要求3所述的酶促化学发光底物，其特征在于，所述酶促化学发光底物包含以下成分：
浓度为0.2mol/L的Tris缓冲体系。
5.根据权利要求4所述的酶促化学发光底物，其特征在于，所述酶促化学发光底物包括以下成分：
浓度为0.2mol/L的Tris缓冲体系。
6.根据权利要求3所述的酶促化学发光底物，其特征在于，所述防腐剂为Proclin-300。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的酶促化学发光底物，其特征在于：所述芳基酰腙-9,10吖啶衍生物的结构式如下：
其中R表示为9,10-吖啶或者9,10-吖啶衍生物。
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