CN107446916A - 一种用于纯化并定向固定化组氨酸标签蛋白的方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纯化并固定化组氨酸标签蛋白的方法及应用。本发明通过在载体表面自组装修饰单宁酸、金属离子和亲水性抗蛋白粘附聚合物，得到与钴离子高效螯合的材料表面，实现对组氨酸标签蛋白的一步纯化固定化，由于三价钴的配基惰性，将二价钴离子氧化为三价，可以提高蛋白固定化后的稳定性。本发明所提供的方法过程简单，价廉，该方法用于组氨酸标签蛋白的分离纯化或固定化操作过程简便有效，因此该技术具有广泛的应用前景。

Description

一种用于纯化并定向固定化组氨酸标签蛋白的方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及生物材料表面修饰技术和用于纯化并定向固定化组氨酸标签蛋白材料的制备方法和应用

背景技术

蛋白质固定化是指利用物理、化学或生物方法将蛋白质固定在材料表面，并保持其活性的过程。蛋白质在材料表面的固载技术有着广泛的应用，比如蛋白分析、药物筛选、和生物催化等等。由于蛋白质分子固有的不稳定性、易变性，使得蛋白质的固定化显得尤其重要。

实现蛋白质固载的方法有很多，可分为定向固载和非定向固载两大类。传统的蛋白质固载多采用非定向固载的方法，比如物理吸附法或利用蛋白质天然存在的基团(氨基或羧基)与材料表面基团反应实现固载的化学方法。然而，蛋白的非定向固载会使蛋白在材料表面随意排列，其活性部位得不到充分的暴露，从而降低蛋白的生物活性。因此蛋白的定向固载越来越受到人们的重视。

蛋白的定向固载主要有以下几种：1)抗原/抗体的特异亲和作用：抗体和抗原之间有特殊亲和性，将先在载体上固定抗体，通过抗体定向固载蛋白。同样的，生物素和亲和素之间高度专一的亲和作用，也是用来实现酶的定向固定的手段之一。2)分子生物学方法：通过分子生物学手段，将蛋白分子本身进行改造后实现定向固定化的方法。如基因融合法(在蛋白的N或C末端融合短肽标签)；定点突变、翻译后修饰(蛋白表面连接生物素)。3)有选择的化学反应：这种方法需要在材料表面和蛋白存在相互反应的基团，两种反应基团具有较高的选择性，并且反应需要在生理条件下完成。比如通过施陶丁格反应(StaudingerLigation Reaction)，点击化学反应(Click Chemistry)可以实现蛋白在材料表面的定向固载。然而，传统方法仍然具有以下一个或多个缺点：(1)蛋白质需要纯化操作；(2)材料表面或/和蛋白分子表面需要引入功能基团；(3)使用外源催化剂或稀有氨基酸。

另一种替代方法是采用固定金属离子亲和层析(IMAC)的方法。原理是用金属离子与螯合剂修饰的表面结合，然后吸附含有组氨酸标签的重组蛋白。然而，金属离子如Ni²⁺，Co²⁺和Zn²⁺离子介导与组氨酸标签的亲和力不足，结合的蛋白质可以在竞争性结合物质(如咪唑)中释放。最近，文献Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,7593-7596中，Seraphine V.Wegner提出了Co³⁺介导的具有良好稳定性组氨酸标签蛋白质固定化方法。在该方法中，金属离子螯合剂如次氮基三乙酸(NTA)用于结合Co²⁺，其可以在组氨酸标签蛋白质吸附后氧化为Co^III，使蛋白分子稳定固定在材料表面。但材料表面修饰的单层螯合剂限制了固定化蛋白质的固载能力，并且需要在材料表面进行多步化学修饰过程以及高昂的合成成本限制其大规模应用。

多酚类化合物是指植物中一组化学物质统称，因含有多个酚基团而得名，存在于许多普通水果和蔬菜中，来源广泛，成本低廉，而且多酚类化合物最近报道能与多种金属离子通过螯合作用在材料表面快速成膜。如文献Science 2013,341,154–157和文献Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,5546-5551中，Frank Caruso等人使用多种金属离子做为螯合交联剂，将多酚类化合物单宁酸和表没食子儿茶素没食子酸酯成功修饰在材料表面。在生物技术领域，组氨酸标签融合蛋白***的应用更加广泛。目前尚未见到将多酚类材料用于组氨酸蛋白纯化和固定化的相关研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于纯化并定向固定化组氨酸标签蛋白质的多酚化合物、金属离子及抗蛋白粘附杂化材料的制备方法和应用，从而解决现有技术中用于组氨酸标签蛋白固定化材料制备过程复杂，产品价格较高，固定化蛋白易解离的缺陷。

本发明实现以上目的采用的技术方案为：

一种纯化并定向固定化组氨酸标签蛋白的亲和材料，包含以下步骤：

A)分别配置多酚化合物溶液、金属离子溶液、聚合物溶液、钴离子溶液。

B)将载体材料放置于多酚化合物和金属离子的混合溶液中，得到单宁酸和金属离子修饰的材料。

C)重复步骤B)多次，得到多酚化合物和金属离子多层修饰的材料；

D)将C)得到的载体材料置于聚合物溶液中，获得多酚化合物、金属离子和聚合物修饰的材料。

E)将D)中制备的载体材料置于钴离子溶液中，获得所述的组氨酸标签蛋白的亲和材料。

进一步地，在上述技术方案中，在步骤A)中所述的多酚化合物溶液中多酚化合物浓度为0.1～40mg/mL；更为优选的浓度为5.0～10.0mg/mL。

进一步地，在上述技术方案中，在步骤A)中所述的多酚-金属离子的混合溶液中多酚化合物和提供所述金属离子的金属盐的浓度比为1-6:1，更为优选的浓度比为3-4:1。其中所述浓度比是指质量浓度比，浓度单位为mg/mL。

进一步地，步骤A)中所述的多酚化合物为单宁酸、表儿茶素没食子酸酯或表没食子儿茶素没食子酸酯中的一种；所述的多酚化合物溶液是将多酚化合物溶解于能够完全溶解该多酚化合物的溶剂中制备得到；所述溶剂可优选去离子水。

进一步地，步骤A)中所述的金属离子为铁离子(Fe³⁺)、铝离子(Al³⁺)、铜离子(Cu^{2 +})、锰离子(Mn²⁺)、锌离子(Zn²⁺)、镍离子(Ni²⁺)、镉离子(Cd²⁺)、钒离子(V³⁺)、铬(Cr³⁺)、锆离子(Zr⁴⁺)、钼离子(Mo²⁺)、铑离子(Rh³⁺)、钌离子(Ru³⁺)、铈离子(Ce³⁺)、铕离子(Eu³⁺)、钆离子(Gd³⁺)或铽离子(Tb³⁺)中的一种，优选为铁离子(Fe³⁺)；

步骤A)中所述金属离子溶液是将提供该金属离子的金属盐溶解于溶剂中制备得到，对于所述金属离子的金属盐以及溶剂不做特别限定，本领域技术人员可以采用可以提供本发明所述金属离子的盐类，溶解于能够溶解该金属盐的溶剂中，制备得到含有适量金属离子的金属离子溶液，所述金属盐的阴离子的种类不影响本发明的技术效果。所述金属离子溶液是将金属盐溶解于能够完全溶解该金属盐的溶剂中制备得到，所述溶剂可优选为去离子水。具体的，在此列举如下：FeCl₃·6H₂O溶液，Fe₂(SO₄)₃溶液，Fe(NO₃)₃溶液等。

进一步地，步骤A)中所述的聚合物为：聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉或聚甜菜碱中的一种。所述的聚合物溶液是将聚合物溶解于能够完全溶解该聚合物的溶剂中制备得到。所述溶剂可优选去离子水。所述聚合物溶液的浓度为0.5-20mg/mL，更为优选的浓度为0.5-2mg/ml。具体的，本发明实施例中使用的是聚磺基甜菜碱溶液。

进一步地，在上述技术方案中，在步骤A)中，所述的钴离子溶液是将钴盐溶解于能够完全溶解该钴盐溶剂中制备得到。钴离子溶液浓度为0.1-52mg/mL，更为优选的浓度为0.8-2mg/mL。所述钴离子溶液是将提供该钴离子的金属盐溶解于溶剂中制备得到，对于所述钴离子的金属盐不做特别限定，本领域技术人员可以采用可以提供本发明所述钴离子的盐类，溶解于能够溶解该金属盐的溶剂中，制备得到含有适量钴离子的钴离子溶液，所述钴盐的阴离子的种类不影响本发明的技术效果。所述溶剂可优选为pH＝7.4Tris-HCl缓冲液。具体的，本发明实施例中使用的是CoCl₂溶液。

进一步地，在步骤B)中所述的载体材料为水不溶性固体材料，具体的本发明实施例中使用的材料为硅片和磁性微球，其他类似的固体材料包括但不限于无机材料，如玻璃、硅、石英、金片、Fe₃O₄纳米微球等；有机高分子材料，如聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯等。

进一步地，在上述技术方案中，在步骤B)中载体材料与多酚化合物和金属离子的混合溶液的反应时间大于5s(优选为3min)。

进一步地，在上述技术方案中，在步骤C)中，优选重复步骤B)次数为5-9次。

进一步地，在上述技术方案中，步骤D)和步骤E)可以调换，其调换后所制备的材料，能达到的效果与调换前一致。

在本发明提供一种用于纯化并定向固定化组氨酸标签蛋白的应用。包括用于组氨酸标签蛋白的纯化，以及组氨酸标签蛋白的定向固定化。

本发明所述的用于组氨酸标签蛋白纯化的应用包括以下步骤：A)将利用本发明上文所述方法制备的组氨酸标签蛋白亲和材料，加入平衡缓冲液平衡后分离除去上清。B)加入细胞裂解上清液，孵育，分离收集上清液标记为流穿液，再用平衡缓冲溶液清洗两次，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集洗涤液和洗脱液。用SDS-PAGE电泳检测纯化程度。其中所述的细胞裂解上清液含有组氨酸标签蛋白。优选地，平衡缓冲液是指含有500mM NaCl的Tris-Hcl缓冲液(pH＝7.4,50mM)，洗脱缓冲液是指在平衡缓冲液中加入300mM咪唑。

本发明所述的用于组氨酸标签蛋白定向固定化的应用包括以下步骤：A)向得到的组氨酸标签蛋白亲和材料中加入含有组氨酸标签蛋白的溶液，孵育，分离收集孵育后的材料，得到定向固定化的蛋白。B)向步骤A)分离的材料加入氧化剂，孵育，分离收集亲和材料，得到稳定的固定化蛋白。

其中，所述的组氨酸标签蛋白溶液须包含组氨酸标签蛋白，也可含有其他非组氨酸标签的杂蛋白。

优选地，所述组氨酸标签蛋白溶液的溶剂为50mM，pH＝7.4Tris-HCl缓冲液。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种用于纯化和定向固定化组氨酸标签蛋白材料的制备方法和应用。所提供的方法，适用于多种固体水不溶性的载体材料。通过在载体材料表面修饰多酚金属离子膜，可以与钴离子高效螯合，并在材料最外层组装亲水性的聚合物层，可以抵抗非组氨酸标签蛋白在材料表面的粘附，实现对组氨酸标签蛋白快速、高效、便捷的纯化。通过将捕获蛋白材料中的二价钴氧化为三价钴，可以实现对组氨酸标签蛋白稳定的定向固定化。该方法操作简单，成本低，对组氨酸标签蛋白选择性好，吸附量高，固定化酶稳定性好，且可以抵抗蛋白水解酶对固定化酶的水解，便于重复利用。因此本发明通过如此简单的方法对载体进行修饰，进而实现对组氨酸标签蛋白的纯化并固定化，在生物催化领域具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明方法的示意图；

图2为利用本发明方法修饰硅片扫描电镜和原子力显微镜照片，a)单宁酸修饰表面；b)单宁酸/聚磺基甜菜碱修饰的表面；c)单宁酸/聚磺基甜菜碱/钴离子修饰的材料表面，d)原子力显微镜高度标尺扫描电镜比例尺为20微米；其中，Ra为材料表面平均粗糙度。

图3为固定化后的FITC标记的组氨酸标签蛋白，钴离子氧化前后，蛋白在300mM咪唑溶液中稳定性结果的荧光图像。

图4是用该方法分离纯化组氨酸标签几丁质酶的电泳结果；M.蛋白Maker；1.细菌破碎液；2.单宁酸/钴离子；3.单宁酸/聚甜菜碱/钴离子；4.单宁酸/聚甜菜碱。

图5是用该方法固定化几丁质酶稳定性结果a)60℃热稳定性；b)4℃保存稳定性；c)重复利用8次后相对活性；d)聚甜菜碱层抵抗蛋白水解酶对固定化酶的水解结果。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。

本发明中使用的重组大肠杆菌菌体为蜡样芽孢杆菌SHS-0903，此菌体为现有技术中的已知菌；参考文献：王杉杉.壳聚糖酶的制备及应用[D].大连理工大学,2016.

实施例1组氨酸标签蛋白纯化并固定化实验

1)以去离子水为溶剂，分别配置浓度为6.4mg/ml的单宁酸溶液和1.6mg/ml的FeCl₃·6H₂O溶液，1mg/ml的聚磺基甜菜碱溶液，2.5mg/ml的CoCl₂溶液；

2)以硅片为载体材料，将1×1cm的硅片放置于5ml离心管中，依次加入1ml单宁酸溶液和1ml FeCl₃溶液，震荡均匀，室温放置3mins，镊子取出硅片，去离子水清洗三遍；

3)将2)中的硅片重新放入5ml离心管中，依次加入1ml FeCl₃溶液和1ml单宁酸溶液，震荡均匀，室温放置3mins，取出硅片，去离子水清洗三遍；

4)重复步骤3)5次，得到多层修饰TA/Fe³⁺的材料表面(图1a)

5)将4)中的硅片放置于5ml离心管中，加入1ml聚磺基甜菜碱溶液，室温放置40mins，取出，去离子水清洗三遍；(图1b)

6)将5)中的硅片放置于5ml离心管中，加入1ml CoCl₂溶液，室温放置15mins，取出，去离子水清新三遍；(图1c)

7)通过发酵技术，诱导表达离心得到重组大肠杆菌菌体，重悬于Tris-HCl缓冲液中，超声破碎离心后得到含有重组组氨酸标签蛋白的几丁质酶上清液，将6)中处理后的硅片加入1ml上清液，4℃孵育1h，Tris-HCl缓冲液清洗三遍(图1d)，SDS-PAGE电泳检测，结果如图4所示，在固定化酶泳道中(泳道3)，观察到单一的蛋白条带。扫描电镜和原子力显微镜观察各步修饰后硅片表面形貌的变化，如图3所示。

8)将7)中捕获组氨酸标签几丁质酶的材料放入2mM H₂O₂中孵育1h，得到稳定固定化的组氨酸标签几丁质酶。

实施例2组氨酸标签蛋白纯化实验

1)以去离子水为溶剂，分别配置浓度为6.4mg/ml的单宁酸溶液和1.6mg/ml的FeCl₃·6H₂O溶液，1mg/ml的聚磺基甜菜碱溶液，2.5mg/ml的CoCl₂溶液；

2)以直径300nm磁性微球为载体材料，将0.1g磁性微球放入5ml离心管中，依次加入2ml单宁酸溶液和2ml FeCl₃溶液，震荡分散均匀，室温搅拌反应5mins，磁分离，去离子水清洗三遍；

3)将2)中的磁性微球重新放入5ml离心管中，依次加入2ml FeCl₃溶液和2ml单宁酸溶液，震荡分散均匀，室温搅拌放置5mins，磁分离取出，去离子水清洗三遍；

4)重复步骤3)3次；

5)将4)中的硅片放置于5ml离心管中，加入2ml聚磺基甜菜碱溶液，室温搅拌反应40mins，磁分离取出，去离子水清洗三遍；

6)将5)中的硅片放置于5ml离心管中，加入2ml CoCl₂溶液，室温搅拌反应15mins，取出去离子水清新三遍；

7)通过发酵技术，诱导表达离心得到重组大肠杆菌菌体，重悬于平衡缓冲液中，超声破碎离心后得到含有重组组氨酸标签蛋白的几丁质酶上清液，将6)中处理后磁性微球加入2ml上清液，4℃搅拌孵育10min，收集上清，标记为流穿液。平衡缓冲液清洗三遍；

8)加入2ml洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，pH＝7.4，500mM NaCl，300mM咪唑)震荡洗脱，收集洗脱液。

9)通过SDS-PAGE电泳检测流穿液和洗脱液。

实施例3二价钴氧化为三价后对固定化蛋白稳定性影响的实验

1)以去离子水为溶剂，分别配置浓度为6.4mg/ml的单宁酸溶液和1.6mg/ml的FeCl₃·6H₂O溶液，1mg/ml的聚磺基甜菜碱溶液，2.5mg/ml的CoCl₂溶液；

2)以硅片为载体材料，将1×1cm的硅片放置于5ml离心管中，依次加入1ml单宁酸溶液和1ml FeCl₃溶液，震荡均匀，室温放置3mins，镊子取出硅片，去离子水清洗三遍；

3)将2)中的硅片重新放入5ml离心管中，依次加入1ml FeCl₃溶液和1ml单宁酸溶液，震荡均匀，室温放置3mins，取出硅片，去离子水清洗三遍；

4)重复步骤3)5次，得到多层修饰TA/Fe³⁺的材料表面(图1a)

5)将4)中的硅片放置于5ml离心管中，加入1ml聚磺基甜菜碱溶液，室温放置40mins，取出，去离子水清洗三遍；(图1b)

6)将5)中的硅片放置于5ml离心管中，加入1ml CoCl₂溶液，室温放置15mins，取出，去离子水清洗三遍；(图1c)

7)将6)中的硅片放置于5ml离心管中，加入1ml 1mg/ml FITC标记的组氨酸标签几丁质酶。4℃孵育1h；

8)将7)中的硅片放置于5ml离心管中，加入1ml 2mM H₂O₂水溶液，反应1h；对照组加入1ml去离子水。

9)将8)中的硅片放置于5ml离心管中，加入4ml 300mM咪唑水溶液，孵育不同时间，荧光显微镜观察荧光强度变化(如图3)。结果显示经过H₂O₂处理后，固定化后的蛋白与材料结合的更加牢固。

实施例4固定化几丁质酶活性评价

在本实施例中考察了实施例1中制备的固定化几丁质酶的稳定性和重复使用性，通过将该固定化酶在60℃中孵育不同时间后测其残余活性，考察其热稳定性。结果显示与游离的几丁质酶相比，固定化酶展现出更好的稳定性(图5a)。将该固定化酶在4℃保存，测保存不同时间后残余酶的活性，结果也显示出于游离酶相比，固定化酶展现出更好的保存稳定性(图5b)。

固定化酶重复使用性的考察采用了实施例1所述的反应体系，在每批次反应结束后，回收固定化酶，用于下一批次的反应，实验结果如图5c所示，在反复使用8次之后，其活力仍保留在80％以上。

以上所述的仅为本发明较佳的实施例，并非以限定本发明的范围，本发明以上的实施例可以作出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所做的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (10)

1.一种纯化并定向固定化组氨酸标签蛋白的方法，包含以下步骤：

A)分别配制多酚化合物溶液、金属离子溶液、聚合物溶液、钴离子溶液；

B)将载体材料重复多次放置于多酚化合物和金属离子的混合溶液中；

C)再将步骤B)所得材料依次置于聚合物溶液、钴离子溶液中；或者依次置于钴离子溶液、聚合物溶液中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A)所述的金属离子为Fe³⁺、Al³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、V³⁺、Cr³⁺、Zr⁴⁺、Mo²⁺、Rh³⁺、Ru³⁺、Ce³⁺、Eu³⁺、Gd³⁺或Tb³⁺中的一种；所述的聚合物为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉或聚甜菜碱中的一种；所述的多酚化合物为单宁酸、表儿茶素没食子酸酯或表没食子儿茶素没食子酸酯中的一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B)中所述的载体材料为水不溶性固体材料。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合物溶液的聚合物浓度为0.5-20mg/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述钴离子溶液的钴离子浓度为0.1-52mg/mL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A)中所述的多酚化合物溶液中多酚化合物浓度为0.1～40mg/mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B)中所述的多酚化合物和金属离子的混合溶液中多酚化合物与提供所述金属离子的金属盐的质量浓度比为1～6:1。

8.根据权利要求1所述的亲和材料用于组氨酸标签蛋白的分离纯化或组氨酸标签蛋白的定向固定化。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述组氨酸标签蛋白的定向固定化，包括以下步骤：A)向用权利要求1所述方法得到的组氨酸标签蛋白的亲和材料中加入组氨酸标签蛋白溶液，孵育，分离收集孵育后的材料，得到定向固定化的蛋白；B)向步骤A)分离的材料中加入氧化剂，孵育，分离收集亲和材料，得到稳定的固定化蛋白。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的细胞裂解上清液为重组大肠杆菌裂解上清液；所述重组大肠杆菌表达带有组氨酸标签的几丁质酶。