CN107446904B - 一种脂肪酶及其生产方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种脂肪酶及其生产方法与应用。所述脂肪酶产自假单胞菌(Pseudomonas sp.)LD‑14，菌株保藏号为CGMCC No.14414。假单胞菌LD‑14发酵生产脂肪酶的发酵液酶活达到25000U/mL至26000U/mL；所产脂肪酶最适pH范围为8.5‑10.0，最适作用温度范围为30℃‑40℃，在20℃保温1d后剩余酶活为80％，具有显著的耐低温性和耐碱性，可广泛应用于工业生产。

Description

一种脂肪酶及其生产方法与应用

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种脂肪酶及其发酵生产方法与应用。

背景技术：

脂肪酶(Triacylglycerol acylhydrolases,EC 3.1.1.3)是能在油水界面上水解甘油三酯的一类酶的总称，其能水解三酰甘油酯为脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯及甘油，其天然底物一般是不溶于水的长链脂肪酸酰基酯。

脂肪酶主要来源于植物、动物、微生物，其中微生物脂肪酶广泛存在于细菌、酵母和霉菌中，具有种类多、周期短、繁殖快、易发生遗传变异的特点，且有比动植物脂肪酶更广的作用温度、作用pH和底物特异性，其可以在不需要辅酶的条件下催化酯类化合物的水解、醇解、酸解、酯交换及合成等，催化条件温和、能耗低、副产物少，具有高效、高选择性、环境友好等特点，改变了传统的酯化或转酯化反应所需要的高温、强酸、强碱等相对苛刻的条件。微生物脂肪酶适合于工业化大生产，可生产出高纯度制品，在基础理论研究和实际应用中都具有重大价值。目前，脂肪酶的生产方法主要包括提取法和微生物发酵法，其中，微生物发酵法以其较高的得率、较低的成本以及来源广泛的菌种资源而成为脂肪酶生产的首选方法。

脂肪酶及其改性制剂由于其本身酶学性质的特殊性，已在食品与营养品加工工业、油脂化工工业、日用化工产业、医药与农业、生物活性剂合成等许多领域得到广泛应用。其广泛的应用范围，丰富的资源，在工业化生产中显示出越来越重要的地位。

而现有技术中的脂肪酶最适反应温度一般在40℃或更高，在30℃以下失活严重，因此，受酶活及酶适用条件的制约，目前现有技术脂肪合酶仍不能满足工业生产的需求，因此筛选一种具有良好的耐碱和耐低温性，生产成本低廉的脂肪酶，对大规模推进各行业的机械化具有重大意义。

发明内容：

为了解决上述问题，本发明将提供一种高产脂肪酶及其发酵产酶方法与应用，在确保假单胞菌发酵高产脂肪酶稳定性的同时，显著提高脂肪酶良好的耐碱和耐低温性。

本发明的目的是通过以下技术方案实现目的：

一株高产脂肪酶的假单胞菌，所述菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)LD-14，菌株保藏号为CGMCC No.14414。

所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)LD-14是通过对假单胞菌原始菌株进行常温常压等离子体诱变的得到的，所述的假单胞菌LD-14已于2017年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.14414，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

所述假单胞菌LD-14的菌落形态特征如下：圆形、乳白色、周边整齐、呈凸透镜状、表面光滑、有色泽、不透明、有臭味。

本发明的另一目的在于提供上述脂肪酶的发酵产酶方法如下：

发酵罐培养：将种子液按照接种量6％(v/v)的比例接入发酵罐培养基，恒温35℃，转速200r/min，设置通风量：0至5h为0.25vvm、5h至20h为0.5vvm、20h至发酵结束为1.0vvm，发酵全程利用补料培养基控制发酵液pH值为6.8，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为150h，得到最终发酵液；

脂肪酶的发酵液酶活可达：25000U/mL至26000U/mL；

将最终发酵液通过提取与精制方法，获得脂肪酶成品液体酶制剂。

进一步地，所述种子液的制备方法如下：将二级种子液按照接种量6％(v/v)的比例接入种子罐培养基中，恒温35℃，转速200r/min条件下培养12-15h；

进一步地，所述二级种子液的制备方法如下：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温35℃，摇床转速200r/min条件下培养48h，得二级种子液；

进一步地，所述一级种子的制备方法如下：挑取一环假单胞菌LD-14接种于固体斜面培养基，35℃下恒温培养36h，得一级种子；

进一步地，所述脂肪酶的提取与精制方法如下：

(1)将最终发酵液加入1～5％珍珠岩助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液；

(2)用20000分子量超滤膜对所述澄清压滤酶液进行超滤浓缩，得到浓缩液；

(3)在上述浓缩液中加入20％(m/v)的稳定剂、0.45％(m/v)的防腐剂，调节pH8.5，然后进行过滤除菌，即得到脂肪酶成品液体酶制剂。

优选地，所述稳定剂为甘油，所述防腐剂为质量比为1：2的山梨酸钾和苯甲酸钠。

所述固体斜面培养基(g/L)：蛋白胨12，酵母膏6，琼脂15，氯化钠1，余量为水，pH7.0，121℃灭菌20min；

所述种子培养基(g/L)：麦芽糖浆40，蛋白胨5，酵母膏5，氯化钠0.8，硫酸镁0.5，氯化钙0.1，磷酸氢二钠0.5，余量为水，pH 6.8，121℃灭菌20min；

所述种子罐培养基(g/L)：葡萄糖80，酵母膏15，玉米浆5，硫酸铵1，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.5，氯化钙0.1，pH 6.8，121-123℃灭菌30min；

所述发酵罐培养基(g/L)：麦芽糖180，蛋白胨10，酵母膏5，硫酸铵1.5，硫酸镁0.5，玉米油20，氯化钙0.1，磷酸氢二钾0.3，pH 6.8，121-123℃灭菌30min；

所述补料培养基(g/L)：麦芽糖浆450，KH₂PO₄ 5，玉米浆7，玉米油40，氯化钙5，pH4.0，121-123℃灭菌30min。

所述脂肪酶具有如下特性：

(1)温度：最适作用温度范围为30℃-40℃；

(2)pH：最适pH范围为8.5-10.0；

(3)耐低温特性：在20℃保温1d后剩余酶活为80％。

有益效果：

本发明通过对假单胞菌原始菌株LA-32进行常温常压等离子体诱变选育了一株高产脂肪酶的突变菌株LD-14，并对假单胞菌LD-14发酵过程进行补料条件优化使其酶活达到25000U/mL至26000U/mL之间，而假单胞菌原始菌株通过液态发酵后最高酶活为19500U/mL。由此可以看出，假单胞菌LD-14显著高于假单胞菌原始菌株LA-32的酶活。

本发明菌株的发酵方法中培养基成分均来源于成本较低的原料，且在提高发酵产能、提升生产效率的同时，大大减少发酵成本，对生产具有极大帮助。

假单胞菌LD-14发酵得到的脂肪酶最适pH范围为8.5-10.0，最适作用温度范围为30℃-40℃，在20℃保温1d后剩余酶活为80％，具有显著的耐低温性和耐碱性，可广泛应用于工业生产中，显著地拓展了脂肪酶的工业应用范围，提高了脂肪酶的应用价值。

附图说明：

图1：不同pH下的相对酶活；

图2：不同温度下的相对酶活；

图3：20℃下保温1d后的相对酶活。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1假单胞菌LD-14的诱变选育

取两株出发菌株LA-32的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，在有玻璃珠的试管振荡使菌体分散，离心收集菌体，以5％甘油重悬菌体，以血球计数板计数直至菌浓为10⁷-10⁸个/mL，以此作为出发菌悬液。

开启常温常压等离子***，以酒精棉擦拭操作室内外，并开启紫外灯灭菌30min。待***操作室内灭菌结束，后取10μL菌悬液点于载片的粗糙面，并在无菌条件下将载片以镊子转移至操作室台面上。开启氦气阀门，设定气流量和诱变时间进行诱变。诱变时间分别设定为90s、120s、150s、180s、210s。每次诱变结束后均将载片置于含990μL无菌生理盐水的EP管中，漩涡震荡1min。稀释涂布后置于30℃培养箱内培养。

富集培养基(g/L)：葡萄糖25，胰蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化钠10，橄榄油30，余量为水，pH值6.8；

平板复筛培养基(g/L)：麦芽糖20，蛋白胨5，牛肉膏2，罗丹明0.5，琼脂20，余量为水，pH 6.8；

产酶培养基(g/L)：麦芽糖20，蛋白胨6，牛肉膏3，橄榄油30，硫酸铵1，硫酸镁0.8，磷酸二氢钾0.3，余量为水，pH 6.8；

菌株的初筛：

配制平板复筛培养基，挑取单菌落进行划线，35度培养36h，在365nm波长的紫外灯下，挑选周围有橙黄色荧光的菌落。

菌株代谢产酶试验(初筛)：利用三丁酸甘油酯平板透明圈法进行初筛，首先，将筛选出的菌株接种在含100mL产酶培养基的500mL三角瓶中，35℃、200r/min摇床培养72h，10000r/min离心20min收集上清液待用；其次用体积比为3％的聚乙二醇(PVA)溶液制备含100g/L三丁酸甘油酯的乳化液，在180mL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)中加入三丁酸甘油酯乳化液20mL，然后加入1.5％琼脂，高压蒸汽灭菌倒平板，然后再每个平板内打直径0.8cm的小孔，取50μL上述上清液于小孔内，于30度反应24h，测透明圈大小，取透明圈大清晰者进行酶活力测定。

菌株代谢产酶试验(复筛)：将初筛中得到的菌株再进行复筛，每株接5瓶，接种在含100mL产酶培养基的500mL三角瓶中，35℃、200r/min摇床培养72h，取发酵液测定酶活力。

通过摇瓶复筛选出5株具有较高酶活的突变株列表如下：

表1原始菌株与具有较高酶活的突变株的酶活对比

菌株	原始菌	LD-05	LD-13	LD-14	LD-85	LD-231
							酶活(U/mL)	2432	2571	2192	3068	2605	2832

经再次的摇瓶发酵后选育出LD-14为稳定的最高酶活菌株。

实施例2假单胞菌LD-14发酵产酶

假单胞菌LD-14的发酵产酶方法，主要包括以下步骤：

斜面培养：挑取一环假单胞菌LD-14接种于固体斜面培养基，35℃下恒温培养36h，得一级种子；

摇瓶培养：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温35℃，摇床转速200r/min条件下培养48h，得二级种子液；

种子罐培养：将二级种子液按照接种量6％(v/v)的比例接入种子罐培养基中，恒温35℃，转速200r/min条件下培养12h；

发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量6％(v/v)的比例接入发酵罐培养基，恒温35℃，转速200r/min，设置通风量：0至5h为0.25vvm、5h至20h为0.5vvm、20h至发酵结束为1.0vvm，发酵全程利用补料培养基控制发酵液pH值为6.8，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为150h，得到最终发酵液；

将最终发酵液通过提取与精制方法，获得脂肪酶成品液体酶制剂。

固体斜面培养基(g/L)：蛋白胨12，酵母膏6，琼脂15，氯化钠1，余量为水，pH 7.0，121℃灭菌20min；

种子培养基(g/L)：麦芽糖浆40，蛋白胨5，酵母膏5，氯化钠0.8，硫酸镁0.5，氯化钙0.1，磷酸氢二钠0.5，余量为水，pH 6.8，121℃灭菌20min；

种子罐培养基(g/L)：葡萄糖80，酵母膏15，玉米浆5，硫酸铵1，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.5，氯化钙0.1，pH 6.8，121-123℃灭菌30min；

发酵罐培养基(g/L)：麦芽糖180，蛋白胨10，酵母膏5，硫酸铵1.5，硫酸镁0.5，玉米油20，氯化钙0.1，磷酸氢二钾0.3，pH 6.8，121-123℃灭菌30min；

补料培养基(g/L)：麦芽糖浆450，KH₂PO₄ 5，玉米浆7，玉米油40，氯化钙5，pH 4.0，121-123℃灭菌30min。

脂肪酶的提取与精制方法如下：

先将最终发酵液，再加入1％珍珠岩助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液；

用20000分子量超滤膜对所述澄清压滤酶液进行超滤浓缩，得到浓缩液；

在浓缩液中加入质量百分比20％(m/v)甘油、0.15％(m/v)山梨酸钾、0.3％(m/v)苯甲酸钠，调节pH 8.5，然后进行过滤除菌，即得到脂肪酶成品液体酶制剂。

实施例3假单胞菌LD-14发酵性能验证

按照实施例2假单胞菌LD-14的发酵产酶方法进行50L发酵罐验证实验，发酵周期150h，其6批次的发酵产酶情况，平均产酶水平为25558U/mL，表2说明菌株不仅高产脂肪酶而且其发酵性能以及其所产的脂肪酶的酶活均具有显著的稳定性。

表2 6批次高产脂肪酶菌株的发酵产酶情况

实施例4脂肪酶酶活测定方法

(1)酶液的制备：发酵液6000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。

(2)酶活定义：以定义为1g固体酶粉或1mL液体酶，在一定温度和pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定脂肪酸，即为一个酶活力单位。

(3)酶活测定：

吸取酶样品1-2mL，用pH 7.5磷酸缓冲液稀释，测定时控制酶液浓度，样品与对照消耗碱量之差控制在1-2mL范围内，吸取样品时，应将酶液摇匀后再取。

电位滴定法：按pH计使用说明书进行仪器校正；

取两个100mL烧杯，于空白杯和样品杯中各加入底物稀释液40mL和磷酸缓冲液5mL，再于空白杯中加入95％乙醇15mL，于40加减0.2度水浴中预热5分钟，然后于空白杯和样品杯中各加待测酶液1mL，立即混匀计时，准确反应15分钟后，于样品杯中立即补入乙醇15mL终止反应，取出；

在烧杯中加入一枚转子，置于电磁搅拌器上，边搅拌，边用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定直至pH 10.3，为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积。

X1:样品的酶活力U/mL；

V1:滴定样品时消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(mL)；

V2：滴定空白时消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(mL)；

c：氢氧化钠标准溶液浓度，单位摩尔每升(mol/L)；

50：0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00mL相当于脂肪酸50μmol；

n1：样品的稀释倍数；

0.05：氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；

反应时间15min，以1分钟计；

实施例5脂肪酶的最适作用pH范围

以本发明所产的发酵液酶活力25500U/mL的脂肪酶为样品，在35℃条件下，分别在不同pH值(7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0)下，测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图1所示，酶的最适作用pH范围为8.5-10.0。

实施例6脂肪酶的最适作用温度范围

以本发明所产的发酵液酶活力25500U/mL的脂肪酶为样品，在pH值为9.7条件下，分别在不同温度(20、25、30、35、40、45、50)下，测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图2所示，酶的最适作用温度范围为30℃-40℃。

实施例7脂肪酶的耐低温性

以本发明所产的发酵液酶活力25500U/mL的脂肪酶为基准，在pH值为9.7条件下，20℃下保温后测定剩余酶活力，如图3所示，20℃保温1d后剩余酶活为80％，具有良好的耐低温保存活性，可广泛应用于低温工业生产中，显著地拓展了脂肪酶的工业应用范围，提高了脂肪酶的应用价值。

Claims (5)

1.一种脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶来自假单胞菌(Pseudomonas sp.)LD-14，菌株保藏编号为CGMCC No.14414；

采用假单胞菌LD-14发酵制备所述脂肪酶的方法如下：将种子液按照接种量6％的比例接入发酵罐培养基，恒温35℃，转速200r/min，设置通风量：0至5h为0.25vvm、5h至20h为0.5vvm、20h至发酵结束为1.0vvm，发酵全程利用补料培养基控制发酵液pH值为6.8，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为150h，发酵液通过提取与精制方法，获得脂肪酶成品液体酶制剂；

所述脂肪酶的提取与精制方法如下：

(1)将最终发酵液加入1～5％珍珠岩助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液；

(2)用20000分子量超滤膜对所述澄清压滤酶液进行超滤浓缩，得到浓缩液；

(3)在上述浓缩液中加入20％的稳定剂、0.45％的防腐剂，调节pH 8.5，然后进行过滤除菌，即得到脂肪酶成品液体酶制剂；

所述发酵罐培养基为：麦芽糖180g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，硫酸铵1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，玉米油20g/L，氯化钙0.1g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，pH 6.8，121-123℃灭菌30min；

所述补料培养基为：麦芽糖浆450g/L，KH₂PO₄ 5g/L，玉米浆7g/L，玉米油40g/L，氯化钙5g/L，pH 4.0，121-123℃灭菌30min。

2.权利要求1所述的脂肪酶，其特征在于，所述种子液的制备方法如下：将二级种子液按照接种量6％的比例接入种子罐培养基中，恒温35℃，转速200r/min条件下培养12-15h；

所述二级种子液的制备方法如下：将一级种子取一环接入种子培养基中，恒温35℃，摇床转速200r/min条件下培养48h，得二级种子液；

所述一级种子的制备方法如下：挑取一环假单胞菌LD-14接种于固体斜面培养基，35℃下恒温培养36h，得一级种子。

3.权利要求2所述的脂肪酶，其特征在于，所述固体斜面培养基为：蛋白胨12g/L，酵母膏6g/L，琼脂15g/L，氯化钠1g/L，余量为水，pH 7.0，121℃灭菌20min；

所述种子培养基为：麦芽糖浆40g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，氯化钠0.8g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L，磷酸氢二钠0.5g/L，余量为水，pH 6.8，121℃灭菌20min；

所述种子罐培养基为：葡萄糖80g/L，酵母膏15g/L，玉米浆5g/L，硫酸铵1g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，氯化钙0.1g/L，pH 6.8，121-123℃灭菌30min。

4.权利要求1所述的脂肪酶，其特征在于，所述稳定剂为甘油，所述防腐剂为质量比为1：2的山梨酸钾和苯甲酸钠。

5.权利要求1所述脂肪酶在食品与营养品加工工业、油脂化工工业、日用化工产业、医药与农业、生物活性剂合成领域中的非治疗目的的应用。

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