CN107442191A - 一种用于油包水液滴生成的离心式微流控芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于油包水液滴生成的离心式微流控芯片。其芯片结构包括通道层和封闭层。其微流控芯片通道结构包括水相储存区、连接通道、液滴生成区和液滴收集区。其操作步骤包括：(1)在水相区加入一定体积的水相样品，在液滴收集区加入一定体积的油相。(2)离心，生成液滴，液滴在液滴储存区自动收集。该发明可应用于生物、化学、医疗诊断等研究应用领域。

Description

一种用于油包水液滴生成的离心式微流控芯片
技术领域
本发明涉及一种用于油包水液滴生成的离心式微流控芯片，应用于微流控理论计算分析，生物、化学检测分析、医疗诊断等领域。
背景技术
微液滴具有体积小、通量高、大小均一、内部稳定、可操控等优点被广泛应用于生物、化学检测分析，医疗诊断，理论计算，材料合成等领域。传统的液滴生成是基于流体聚焦型芯片，这种液滴生成需要精密注射泵对通道流体流速进行严格的控制，操作十分困难。1997年M.Nakajima课题组提出了一种阶梯式芯片结构用于液滴生成，其工作原理是流体流经三维台阶时发生静态不稳定性而破裂生成液滴，这种液滴生成方式虽然减小了流体流速对于液滴的影响，但是液滴生成高度依赖复杂的台阶结构，芯片加工难度大。2015年杜文斌课题组提出了基于毛细管末端微震动的方式来实现液滴生成，这种液滴生成依赖于水相流体的流速以及毛细管震动的频率，相对于微流控芯片更难操控。2016年黄岩谊课题组提出了基于毛细管阵列结合惯性力驱动生成液滴的方式，而毛细管阵列制作批次差异性大，限制了其应用。基于现有液滴生成方式不可避免的结构复杂或操控难的缺点，本发明设计了一种结构简单，操作容易的离心式微流控芯片用于液滴生成。
发明内容
本发明针对现有的十字型或T字型等流体聚焦的液滴生成方法流体不稳定、需要精密注射泵对通道内流体流速进行严格控制的缺点；文献报道的阶梯状液滴生成方法芯片结构复杂，需要通过繁琐加工步骤实现微流体通道三维结构，芯片生产制作成本高昂的问题；以及现有公开或发表的离心式液滴生成微流控芯片，不能适用于需要磁微粒、微球、单细胞等容易受到离心力影响的小颗粒相结合的应用中等问题，发展了一种以离心方式为基础的油包水液滴生成芯片。
本发明的技术方案如下：
一种用于油包水液滴生成的离心式微流控芯片，其特征在于，包括通道层和封闭层，所述的通道层包括水相储存区、连接通道、液滴生成区和液滴收集区，其中，水相储存区远离离心轴端的位置比液滴储存区靠近离心轴端的位置更靠近离心轴；液滴储存区靠近离心轴端的位置比液滴生成区位置更靠近离心轴；
所述连接通道连接水相储存区和液滴生成区，所述的液滴生成区连接液滴收集区和连接通道的一端；水相储存区和液滴收集区之间还连接一压力平衡通道；所述液滴生成区的开口方向轴线和离心力方向成30-150度的夹角。
使用时，在液滴收集区加入一定体积的油相溶液，在水相区加入一定体积水相样品，离心，即可在液滴生成区生成液滴，且液滴在液滴储存区自动收集。
作为优选，所述液滴生成区的开口方向轴线和离心力方向成45-135度的夹角。
进一步优选，所述液滴生成区的开口方向轴线和离心力方向成80-100度的夹角。
在本发明中，液滴生成区可以为多种形状，例如方形。但作为优选，液滴生成区的结构为入口窄出口宽的喷嘴式结构。喇叭口的倾斜角范围可以为15-165度。
所述的密封层可根据实际需要设置上密封层或下密封层或二者同时存在；
所述的密封层与通道层材质为：硅、玻璃、石英或有机聚合物。有机聚合物如聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)、聚氨酯、环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)、聚碳酸酯(polycarbonate，PC)、环烯烃共聚物(cycloolefincoplymer，COC)、聚苯乙烯(polystyrene，PS)、聚乙烯(polyethylene，PE)、丙烯酸、橡胶、氟塑料等中的一种或几种。
所述的通道层包含有用于液滴生成的主体微流体通道，通过与密封层键合形成密封通道；
所述的微流体通道根据通道层材质需要，制作方法可以为：浇筑法、热压法、光刻聚合法和刻蚀法；
所述的压力平衡通道，其一端位于液滴收集区，和液滴生成区距离心转轴相同距离处；另一端位于液相储存区，其和离心转轴的距离小于连接通道和离心转轴的距离。
所述的水相储存区容积为：0.1μL-1mL，用于水相样品储存；
所述的水相储存区靠近离心轴端设有开孔，可用于水相样品溶液的注入；
所述的连接通道长度为1mm-100mm，宽度为10μm-10mm，深度为1μm-1mm，用于连接水相储存区与液滴生成区，使离心时水相溶液可以顺利流入液滴生成区；
所述连接通道的形状可与离心方向相同，也可根据实际需要对通道形状进行调整；
所述的液滴生成区为喷嘴形开口，入口窄，出口宽。优选为入口端宽度为1μm-200μm，喷嘴出口端宽度为10μm-1mm，喷嘴深度为1μm-200μm。所述的液滴储存区直接与液滴生成区末端相连，其深度为1μm-1mm。
所述的液滴储存区其特征在于所述的液滴储存区在离心生成液滴前应充满油相溶液；液滴收集区深度为1μm-200μm。
所述的液滴储存区靠近离心轴端有开孔，可注入油相溶液或排出油相溶液；
所述的水相可以为：纯水、水相缓冲液、血液、体液、唾液、尿液、和细胞裂解液等。
所述的通道层内微流体通道进行超疏水化处理。超疏水化方法可以为化学共价结合法、物理吸附法或两种方法相结合。化学共价法采用的试剂为氟代硅烷如二甲基十八烷基氯硅烷，十八烷基三氯硅烷、三甲氧基丙基硅烷、三甲氧基丙基三氯硅烷、1H,1H,2H,2H-全氟辛基硅烷、1H,1H,2H,2H-全氟辛基二甲基氯硅烷、1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷、1H,1H,2H,2H-全氟十二烷基三氯硅烷、三全氟甲基氯硅烷、三甲基氯硅烷。物理吸附法采用的试剂溶剂挥发的氟油如EGC-1700、EGC-1720、EGC-1702、EGC-1704、FC-722、FC-724、FC-725、FC-732。
在本发明中，使用的油相溶液比重可以大于水相，也可以小于水相。例如，所述的油相为：氟油(如HFE-7100、HFE-7200、HFE-7500、HFE-71DA、HFE-71DE、HFE-72DA、HFE-72DE、HFE-71IPA、FC-3251、FC-3252、FC-3255、FC-3275、FC-3280、FC-3283、FC-3284、FC-40、FC-41、FC-43、FC-5311、FC-5312、FC-5320、FC-6003、FC-6064、FC-6047、FC-70、FC-72、FC-726、FC-75、FC-77、FC-770、FC-8270、FC-84、FC-87、GH135)，矿物油或硅油(如氟代硅氧烷、环戊硅氧烷、脂肪基硅氧烷、低聚二甲基硅氧烷)。为促进油包水界面稳定，可使用的表面活性剂为：全氟化表面活性剂、E2K0660、FS-D、FS-P、Tween和Span。
所述的液滴生成方法主要操作步骤包括：(1)在水相储存区加入水相，在液滴储存区加满油相；(2)离心，自动在液滴储存区捕获储存。
本发明以中低速离心作为液滴生成的驱动力，且在一定范围内液滴大小与离心转速无关，从而确保了利用该芯片生成的液滴均一性和稳定性。同时该方法通过对微流体通道结构的巧妙设计，以一种单一喷嘴式二维微流体通道实现了液滴稳定高速的生成，克服了阶梯状液滴生成方法结构复杂，制作成本高昂的问题。
本发明生成液滴的优点是：1，生成快速，便捷，无需高精密度进样泵的严格控制。2，液滴生成速度快。3，液滴尺寸均一。4样品体积小，只需2ul样品即可以生成液滴。5.样品无死体积，几乎所有的水相溶液都可以生成均一尺寸的液滴。6.由于液滴生成区域与离心力方向成一定夹角的设计，使得溶液中允许存在磁珠、微球、细胞等颗粒状物质。本发明与其它离心式微流控芯片相比能够适应更多的单分子、单细胞水平的分析和应用。7.液滴生成区域二维尺度上的设计显著降低了芯片生产制作成本。8、在现有技术中，使用的油相必须比水相密度大，而在本发明中，不仅可以使用大于水相密度的油相，还可以使用小于水相密度的油相，扩大了应用范围。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1绘示了实施例1芯片通道结构示意图。
图2绘示了实施例1液滴生成区结构示意图。
图3绘示了实施例1PDMS芯片结构示意图。
图4绘示了实施例2PMMA芯片结构示意图。
图5为实施例3玻璃芯片结构示意图。
图6为实施例4的芯片通道结构示意图。
图7为实施例1的结果图；
图8为实施例2的结果图
图9为实施例3的结果图
图10为实施例4的结果图
1.水相储存区
2.连接通道
3.液滴生成区
4.液滴储存区
5.气压平衡通道
6.喷嘴形通道
7.水相进样口
8.油相进样口
9.上密封层(玻璃)
10.平整PDMS薄膜(通道层，PDMS)
11.含有通道的PDMS薄膜(通道层，PDMS)
12.下密封层(玻璃)
13.上密封层(PMMA)
14.下密封层(PMMA)
15.上密封层(玻璃)
16.通道层(玻璃)
具体实施方式
实施例1PDMS材质微流控芯片制作与应用
参照图1至图3所示，芯片结构包含上密封层9、下密封层12和位于上下密封层之间的通道层10、11，通道结构包含水相储存区1、连接通道2、液滴生成区3、液滴收集区4(液滴储存区)和气压平衡通道5。
在本实施例中，所述的上密封层9和下密封层12都为长方形的玻璃。
通道层10和11材质都为PDMS，通道层10在靠近一端(在图1中为靠近上端)处的背面设水相存储区1，靠近下端处背面设有液滴储存区4，水相存储区1向下延伸设有连接通道2，该连接通道2为竖直向下。连接通道2的末端连接液滴生成区3，其右端横向连接连接通道2，左端连接滴储存区4。
在本实施例中，通道层11为平面形状。在其它实施例中，通道层11也可以在上表面设储存区。
所述的气压平衡通道5，一端连接于水相储存区1，另一端连接于液滴储存区4。在本实施例中，其和水相储存区1的连接位置为左侧最上端，和液滴储存区4的连接位置为和液滴生成区3同一高度的另外一侧。
作为优选，所述的水相储存区1容积为：0.1μL-1mL，用于水相样品储存。
在本实施例中，离心轴端为图1的上端。作为优选，所述的水相储存区1远离离心轴端的位置应比液滴储存区4靠近离心轴端的位置更靠近离心轴；
所述的水相储存区1靠近离心轴端设有开孔，可用于水相样品溶液的注入；
所述的连接通道尺寸优选长度为1mm-100mm，宽度为10μm-10mm，深度为1μm-1mm，用于连接水相储存区与液滴生成区，使离心时水相溶液可以顺利流入液滴生成区；
所述离心通道的形状可与离心方向相同，也可根据实际需要对通道形状进行调整；
所述的液滴生成区3，优选为喷嘴形开口，入口窄，出口宽。入口端宽度优选为1μm-200μm，喷嘴出口端宽度为10μm-1mm，喷嘴深度为1μm-200μm。所述的液滴储存区直接与液滴生成区末端相连。液滴储存区深度优选为1μm-1mm。
所述的液滴储存区靠近离心轴端的位置应比液滴生成区位置更靠近离心轴；
所述的液滴储存区在离心生成液滴前应充满油相溶液；
所述的液滴储存区靠近离心轴端有开孔，可注入油相溶液或排出油相溶液；
所述的水相为：纯水、或水相缓冲液。
在本实施例中，所述的油相的比重大于水。作为优选，所述的油相为：氟油(如HFE-7100、HFE-7200、HFE-7500、HFE-71DA、HFE-71DE、HFE-72DA、HFE-72DE、HFE-71IPA、FC-3251、FC-3252、FC-3255、FC-3275、FC-3280、FC-3283、FC-3284、FC-40、FC-41、FC-43、FC-5311、FC-5312、FC-5320、FC-6003、FC-6064、FC-6047、FC-70、FC-72、FC-726、FC-75、FC-77、FC-770、FC-8270、FC-84、FC-87、GH135)，矿物油或硅油(如氟代硅氧烷、环戊硅氧烷、脂肪基硅氧烷、低聚二甲基硅氧烷)。为促进油包水界面稳定，可使用的表面活性剂为：E2K0660、FS-D、FS-P、Tween和Span。
各层芯片制备好之后，1)在上密封层9指定位置以打孔机钻取水相储存区进样孔与液滴储存区油相进样孔。2)超声清洗上封闭层与下封闭层(玻璃材质)，去除表面杂质。3)135度烘干1h后，将通道层打孔位置与上封闭层打孔位置对准后贴合，完成共价键和，再将下封闭层进行贴合，完成芯片结构的制作。4)在通道层注入1720全氟化溶剂，75℃烘干，完成通道层全氟化处理。
4.液滴生成
1)通过移液枪在液滴储存区加满含有2％E2K0660的HFE 7500全氟化油，在水相储存区加入10μL PCR Mix。2)以2800r/min，60s条件离心，生成液滴并在油相储存区储存。
其结果见图7。
实施2PMMA材质芯片
本实施例芯片参照图4所示，其基本结构和实施例1相同，所不同的是，在本实施例中，芯片仅为上下两层。包括位于上层的上密封层13(PMMA材质)和位于下层的下密封层14(PMMA材质)，其中下密封层14在上表面设微流体通道结构(同样包含水相储存区、连接通道、液滴生成区、液滴收集区等)。
具体芯片制作步骤如下：
1.通道层热压印
以带有通道团的电铸铜模板对1mm厚的PMMA板进行热压印，压印条件为：140度，600ppsi压力，3min热压印，95度脱模，模板抗粘层为1720全氟化溶剂。
2.封闭层与通道层的热键合
以105度，2Mpa条件热压3min，自然冷却至室温，完成封闭层与通道层的热键合。
3.通道表面全氟化处理
在通道层注入1720全氟化溶剂，75℃烘干，重复3次，完成通道层全氟化处理。
4.液滴生成
1)通过移液枪在液滴储存区加满含有2％E2K0660的HFE 7500全氟化油，在水相储存区加入10μL PCR Mix。2)以2800r/min，60s条件离心，生成液滴并在油相储存区储存。
其结果见图8。
实施例3玻璃材质微流控芯片
本芯片参照图5所示，其基本结构和实施例1相同，所不同的是，在本实施例中，芯片仅为上下两层：上密封层15(玻璃材质)和通道层16(玻璃材质)，通道层16上表面设微流体通道(通道结构包含水相储存区、连接通道、液滴生成区、液滴收集区等)。具体芯片制作步骤如下：
1.微流体通道刻蚀与制作
1)匀胶铬版置于单面光刻机升降台上，并将菲林片至于匀胶铬板上。
2)设置曝光时间8-12s，吸片，升降，接触，密着，曝光位。(滑动芯片时，菲林片应对准玻璃)
3)取下菲林片，将匀胶铬版置于NaOH(1.6g至400ml)浸泡2min。---显影
4)取出铬板，超纯水洗净，N2吹干，重复两次。
5)吹干后，放入硝酸铈铵-高氯酸溶液(强腐蚀性)，侵蚀铬层2min左右，至铬层图案侵蚀完全。清水清洗，吹干，重复两次。
6)85℃烘干20min左右，烘去光刻胶中溶剂。
7)取铬板放入混合酸中(HF 8.7ml，HNO3 16.875ml，NH3F 9.25g，总500ml/6.9：7.4：13.5-400ml，40℃腐蚀速度约1.5-2um/min)，水浴加热(根据加热温度及刻蚀深度定时间)，稍冷，水洗净，显微镜下观察芯片表面侵蚀情况。(侵蚀宽度和深度成比例，各向同性侵蚀，温度40-45℃下，10min刻蚀15um)
8)将上步处理好的玻璃芯片放入丙酮洗去表面胶层，再用硝酸铈铵溶液洗去铬层(至玻璃完全透明，若有铬层残余，可能光刻胶未洗净，可放于丙酮再洗)，最后用水洗去残余硝酸铈铵溶液。
9)水洗净芯片后N2吹干，另找一同样大小玻璃芯片，表面撒层松香，将实验用的芯片无通道面压在松香上，两芯片放于大于120℃的加热板加热融化松香。
10)取出玻璃芯片，装好打孔器和打孔针，用记号笔将需要打孔的位置标出，其上均匀喷洒一层超纯水，调整好位置打孔。打孔时保证中间层存在松香，否则应再去加热融化松香均匀。
11)打孔后用丙酮洗去松香。
2.玻璃芯片键合
将通道层与密封层用超纯水洗净，用模具固定，在马弗炉中以650度键合6小时，自然冷却至室温后取出。
3.通道表面全氟化处理
在通道层注入1720全氟化溶剂，75℃烘干，重复3次，完成通道层全氟化处理。
4.液滴生成
1)通过移液枪在液滴储存区加满含有2％E2K0660的HFE 7500全氟化油，在水相储存区加入10μL PCR Mix。2)以2800r/min，60s条件离心，生成液滴并在油相储存区储存。
其结果见图9。
实施例4
参见图6，本实施例的基本结构和实施例1相同，所不同的是，在本实施例中，液滴储存区4的下半部分(液滴生成区3之下的部位，图6中A部)更长，使用的油相是比水相密度更轻的轻矿物油，使用的表面活性剂是5％Span 80。
其结果见图10。

Claims (10)

1.一种用于油包水液滴生成的离心式微流控芯片，其特征在于，包括通道层和封闭层，所述的通道层包括水相储存区、连接通道、液滴生成区和液滴收集区，其中，水相储存区远离离心轴端的位置比液滴储存区靠近离心轴端的位置更靠近离心轴；液滴储存区靠近离心轴端的位置比液滴生成区位置更靠近离心轴；
所述连接通道连接水相储存区和液滴生成区，所述的液滴生成区连接液滴收集区和连接通道的一端；水相储存区和液滴收集区之间还连接一压力平衡通道；所述液滴生成区的开口方向轴线和离心力方向成30-150度的夹角。
2.如权利要求1所述的一种用于油包水液滴生成的离心式微流控芯片，其特征在于，所述液滴生成区的开口方向轴线和离心力方向成45-135度的夹角。
3.如权利要求1所述的一种用于油包水液滴生成的离心式微流控芯片，其特征在于，所述液滴生成区的开口方向轴线和离心力方向成80-100度的夹角。
4.如权利要求1至3任一项所述的一种用于油包水液滴生成的离心式微流控芯片，其特征在于，液滴生成区的结构为入口窄出口宽的喷嘴式结构。
5.如权利要求4所述的一种用于油包水液滴生成的离心式微流控芯片，其特征在于，喷嘴入口端宽度为1μm-200μm，喷嘴出口端宽度为10μm-1mm，喷嘴深度为1μm-200μm。
6.如权利要求1所述的一种用于油包水液滴生成的离心式微流控芯片，其特征在于，所述的压力平衡通道，其一端位于液滴收集区，和液滴生成区距离心转轴相同距离处；另一端位于液相储存区，其和离心转轴的距离小于连接通道和离心转轴的距离。
7.如权利要求1所述一种用于油包水液滴生成的离心式微流控芯片，其特征在于，所述水相储存区容积为0.1μL-1mL。
8.如权利要求1所述一种用于油包水液滴生成的离心式微流控芯片，其特征在于，连接通道长度为1mm-100mm，宽度为10μm-10mm，深度为1μm-1mm。
9.如权利要求1所述一种用于油包水液滴生成的离心式微流控芯片，其特征在于，液滴收集区深度为1μm-500μm。
10.如权利要求1所述一种用于油包水液滴生成的离心式微流控芯片，其特征在于，油相溶液比重大于水相溶液，或是小于水相溶液。
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