CN107432222A - 一种水稻苗期耐冷表型的鉴定方法 - Google Patents

一种水稻苗期耐冷表型的鉴定方法 Download PDF

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刘栋峰
罗伟
徐云远
唐永严
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Abstract

本发明公开了一种水稻苗期耐冷表型的鉴定方法。本发明所提供的方法，依次包括如下步骤：(1)取已催芽的待测水稻种子，将其培养为三叶期阶段的幼苗；(2)取步骤(1)得到的幼苗，对其茎部生长点及以下部分进行低温胁迫；(3)取完成步骤(2)的幼苗，恢复培养；(4)完成步骤(3)后，统计幼苗存活率，根据存活率鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性。所述低温为18℃以下。采用上述方法鉴定籼稻广陆矮4号和粳稻日本晴的水稻耐冷性，结果与预期实验结果完全一致。因此，本发明所提供的方法可以鉴定低温胁迫下水稻苗期耐冷性，在筛选植物耐冷品种中的具有重要的应用价值。

Description

一种水稻苗期耐冷表型的鉴定方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水稻苗期耐冷表型的鉴定方法。
背景技术
温度对植物生长具有重要的影响。目前全球气候变化异常，极端气候发生频繁，低温冷害严重影响了农作物的农业生产活动。
水稻是世界三大粮食作物之一，我国60％以上人口以水稻为主粮。因水稻起源于热带和亚热带地区，相对于其它谷物，较易受到低温冷害的影响。水稻的芽期、苗期、孕穗期、开花期和灌浆期等不同生长发育时期，都可能发生低温冷害，其中苗期和孕穗期的冷害胁迫对水稻的农业生产影响尤其严重。目前，鉴定水稻苗期的耐冷性一般在人工气候室或培养箱中进行低温处理，但都存在着一些不足：人工气候室占地面积较大，实现较低温度制冷比较困难，难以进行长时间的鉴定植物苗期耐冷性实验；培养箱中进行低温处理，因受培养箱体积和密封性等影响，存在处理温度不稳定和效率低的问题。因此，建立操作简单方便、同批次处理数量多、鉴定结果精确可靠、并且适宜于实验室处理操作的方法，从而鉴定不同水稻材料的耐冷性，对水稻育种有着重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定水稻苗期耐冷性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性的方法。
本发明所提供的鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性的方法，具体可为方法一，依次包括如下步骤：
(1)取已催芽的待测水稻种子，将其培养为三叶期阶段的幼苗；
(2)取步骤(1)得到的幼苗，对其茎部生长点及以下部分进行低温胁迫；
(3)取完成步骤(2)的幼苗，恢复培养；
(4)完成步骤(3)后，统计幼苗存活率，根据存活率鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性。
上述方法一的步骤(2)中，所述茎部生长点及以下部分可为根部和根茎结合部以上3厘米的部分。
上述方法一中，所述低温可为18℃以下。
上述方法一中，所述低温具体可为4±0.2℃。
上述方法一的步骤(2)中，所述低温胁迫可为4±0.2℃处理0h-148h(不包含0h)。
上述方法一的步骤(2)中，所述低温胁迫具体可为4±0.2℃处理36h。
上述方法一的步骤(1)中，所述培养的条件可为光暗交替培养12d-20d。上述方法一的步骤(1)中，所述培养的条件具体可为光暗交替培养15d。上述方法一的步骤(3)中，所述恢复培养的条件可为光暗交替培养3d-15d。上述方法一的步骤(3)中，所述恢复培养的条件具体可为光暗交替培养7d。
上述方法一的步骤(1)中，“已催芽的待测水稻种子”的制备方法可为：向待测水稻品种的饱满种子中加入水，25-30℃浸种45-50h；然后在保持种子湿润的条件下，25-30℃催芽20-28h。
上述方法一的步骤(1)中，已催芽的待测水稻种子的制备方法具体可为：向待测水稻品种的饱满种子中加入水，28℃-30℃浸种48h；然后在保持种子湿润的条件下，28℃-30℃催芽24h。
本发明所提供的鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性的方法，具体可为方法二，包括如下步骤：取培养至三叶期的待测水稻幼苗，对其茎部生长点及以下部分进行低温胁迫，然后恢复培养，根据存活率鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性。
上述方法二中，所述茎部生长点及以下部分可为根部和根茎结合部以上3厘米的部分。
上述方法二中，所述低温可为18℃以下。
上述方法二中，所述低温具体可为4±0.2℃。
上述方法二中，所述低温胁迫可为4±0.2℃处理0h-148h(不包含0h)。
上述方法二中，所述低温胁迫具体可为4±0.2℃处理36h。
上述方法二中，所述恢复培养的条件可为光暗交替培养3d-15d。上述方法二中，所述恢复培养的条件具体可为光暗交替培养7d。
本发明所提供的鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性的方法，具体可为方法三。方法三为采用植物处理装置鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性的方法；所述植物处理装置由至少一个培养单元组成，每一个培养单元包括支架和可拆卸的放置在支架上的培养板3；所述培养板上贯通设置有若干培育腔4；所述培育腔为仅有侧壁的通腔体。方法三包括如下步骤：
(1)取植物处理装置的支架，置于低温水浴箱中预冷；
(2)取植物处理装置的培养板，将每粒待测水稻种子置于培养板的1个培育腔中，将其培养为三叶期阶段的幼苗；
(3)取完成步骤(2)的所述培养板，置于完成步骤(1)的支架上，对幼苗进行低温胁迫；幼苗的茎部生长点及以下部分没入水浴箱中的液面以下，幼苗的其它部位处于所述液面以上；
(4)取完成步骤(3)的幼苗，恢复培养；
(5)完成步骤(4)后，统计幼苗存活率，根据存活率鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性。
上述方法三的步骤(3)中，所述茎部生长点及以下部分可为根部和根茎结合部以上3厘米的部分。
上述方法三中，所述低温可为18℃以下。
上述方法三中，所述低温具体可为4±0.2℃。
上述方法三的步骤(3)中，所述低温胁迫可为4±0.2℃处理0h-148h(不包含0h)。
上述方法三的步骤(3)中，所述低温胁迫具体可为4±0.2℃处理36h。
上述方法三的步骤(4)中，所述恢复培养的条件可为光暗交替培养3d-15d。上述方法三的步骤(4)中，所述恢复培养的条件具体可为光暗交替培养7d。
上述方法三的步骤(1)中，所述低温水浴箱具体可按照中国专利申请号为201620970857.0的实用新型专利的实施例制备。
上述方法三的步骤(1)中，所述低温水浴箱具体可为杭州三浦精密仪器有限公司生产的型号为HK1104的低温恒温液浴槽。
上述方法三中，所述植物处理装置由至少一个培养单元组成；每一个培养单元包括支架和可拆卸的放置在支架上的培养板3；所述培养板上贯通设置有若干培育腔4；所述培育腔为仅有侧壁的通腔体。所述培育腔可为仅有侧壁的倒圆台状通腔体。所述培育腔的上底面直径可为4.0-8.0mm、下底面直径可为1.0-4.0mm、高度可为18.0-24.0mm。所述培育腔的下底面距用于放置植物处理装置的水平面的垂直距离可为12.0-20.0cm。所述支架可由n个侧板1组成；n为2以上的自然数；n为2时，第1个侧板的内侧面上部具有一条水平凹槽2，第2个侧板的内侧面上部在相应的位置具有一条水平凹槽(即两个侧板上的水平凹槽互为镜像)；n为3时，第1个侧板的内侧面上部具有一条水平凹槽，第2个侧板的两个侧面上部在相应的位置各具有一条水平凹槽，第3个侧板的内侧面上部在相应的位置具有一条水平凹槽(即每相邻两个侧板上相对的水平凹槽互为镜像)；n为4以上的自然数时，第1个侧板的内侧面上部具有一条水平凹槽，第2个侧板直至第n-1个侧板均在两个侧面上部在相应的位置各具有一条水平凹槽，第n个侧板的内侧面上部在相应的位置具有一条水平凹槽(即每相邻两个侧板上相对的水平凹槽互为镜像)；每个培养板，一端插设于某个侧板的水平凹槽中，另一端插设于与该侧板相邻的侧板上的与该水平凹槽相对的水平凹槽中。n为2时，植物处理装置的纵切结构示意图见图1。n为3时，植物处理装置的纵切结构示意图见图2。n为4时，植物处理装置的纵切结构示意图见图3。n为2时，植物处理装置的俯视图见图4；两个侧板之间插设有两个培养板。n为3时，植物处理装置的俯视图见图5；第1个侧板和第2个侧板之间插设有两个培养板，第2个侧板和第3个侧板支架插设有一个培养板。n为4时，植物处理装置的俯视图见图6；第1个侧板和第2个侧板之间插设有两个培养板，第2个侧板和第3个侧板支架插设有一个培养板，第3个侧板和第4个侧板之间插设有三个培养板。所述侧板的内侧面水平凹槽的上方可设置有若干缺刻区域，便于从缺刻区域***培养板从而将培养板插设于凹槽中(缺刻区域的纵切结构示意图见图7)。所述植物处理装置还可包括用于连接固定相邻侧板的固定部件。所述固定部件可为连接固定相邻侧板的横杆或横板。在不影响培养板放置的前提下，可以位于相邻侧板的任意位置。所述培养板上以均匀的方式贯通设置有若干培育腔。每个培育腔与相邻培育腔的边缘距离可为0.5-1.0cm。
上述方法三中，所述植物处理装置植物处理装置具体包括支架、培养板和固定部件。支架由5个侧板1组成；第1个侧板的内侧面上部具有一条水平凹槽，第2个侧板直至第4个侧板均在两个侧面上部在相应的位置各具有一条水平凹槽，第5个侧板的内侧面上部在相应的位置具有一条水平凹槽(即每相邻两个侧板上相对的水平凹槽互为镜像)。每两个侧板之间插设一个培养板，每个培养板一端插设于某个侧板的水平凹槽中，另一端插设于与该侧板相邻的侧板上的与该水平凹槽相对的水平凹槽中。每个培养板上以均匀的方式贯通设置96个培育腔4，培育腔为仅有侧壁的倒圆台状通腔体，上底面直径为6.0mm、下底面直径为2.5mm、高度为21.0mm，每个培育腔与相邻培育腔的边缘距离为0.6cm，培育腔的下底面距用于放置植物处理装置的水平面的垂直距离为15cm。相邻侧板之间通过连接固定部件(横杆)连接。
上述任一所述的方法中，所述待测水稻耐冷性可为待测水稻苗期耐冷性。
上述任一所述的方法中，所述待测水稻可为水稻品种广陆矮4号、水稻品种日本晴、水稻单片段代换株系C32069或水稻单片段代换株系C32001。
上述任一所述光暗交替培养的参数可为：光照时间为10h、黑暗时间14h，光照的温度为28±1℃、黑暗的温度为25±1℃，光照的强度为31000―35000Lux(由植物补光灯NL-400/230GN1A提供光照)。
上述任一所述低温胁迫时环境条件具体可为：光照时间为10h、黑暗时间14h，光照和黑暗的温度均为20±1℃，光照的强度为1200―1500Lux(由Philips GreenPower LEDProduction Module Deep Red/Blue提供光照)。
实验证明，采用本发明所提供的鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性的方法鉴定籼稻广陆矮4号和粳稻日本晴的水稻耐冷性，结果与预期实验结果完全一致。本发明所提供的方法可以鉴定低温胁迫下水稻苗期耐冷性，在筛选植物耐冷品种中的具有重要的应用价值。
附图说明
图1为植物处理装置的纵切结构示意图。
图2为植物处理装置的纵切结构示意图。
图3为植物处理装置的纵切结构示意图。
图4为植物处理装置的俯视图。
图5为植物处理装置的俯视图。
图6为植物处理装置的俯视图。
图7为植物处理装置的纵切结构示意图。
图8为水稻种子催芽、播种和幼苗的状态；其中A为已催芽的种子，B为已催芽的种子置于横板中的位置和方式，C为三叶期阶段的幼苗的生长状态。
图9为水稻幼苗低温处理；其中A为水稻幼苗通过植物处理装置置于低温水浴箱，B为A中红色方框中的细节放大图。
图10为鉴定水稻苗期耐冷性；其中A为低温处理前水稻幼苗的生长状态，B为4℃低温水浴处理36h，然后恢复1周的水稻幼苗的生长状态，GLA4为水稻广陆矮4号，NIP为水稻日本晴。
图11为存活率统计结果；GLA4为水稻广陆矮4号，NIP为水稻日本晴。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
水稻广陆矮4号记载于如下文献中：黄雨辰.使用水稻广陆矮4号10k cdna芯片进行籼粳稻表达谱差异研究[D].上海：上海交通大学硕士学位论文，2007.。水稻广陆矮4号为典型的籼稻品种，耐冷性弱。在下文中，水稻广陆矮4号简称GLA4。
水稻日本晴记载于如下文献中：连玲，何炜等.水稻日本晴IPA1cDNA的克隆及植物过表达载体的构建[J].福建农业学报，2012，27(9):913-918.。水稻日本晴为典型的粳稻品种，耐冷性强。在下文中，水稻日本晴简称NIP。
C32069和C32001均记载于如下文献中：王军等.基于染色体单片段代换系的水稻粒形QTL定位[J].作物学报，2013，39(4)：617-625.。C32069和C32001均是以GLA4为受体材料，NIP为供体材料经过多轮回交而形成的单片段代换株系。
木村B培养液记载与如下文献中：Ma JF，Goto S，Tamai K，Ichii M.Role of roothairs and lateral roots in silicon uptake by rice.Plant Physiol.2001；127：1773-1780)，其配方详见表1，pH值为5.6。
表1
实施例1、植物处理装置的制备
制备植物处理装置。植物处理装置包括支架、培养板和固定部件。支架由5个侧板1组成；第1个侧板的内侧面上部具有一条水平凹槽，第2个侧板直至第4个侧板均在两个侧面上部在相应的位置各具有一条水平凹槽，第5个侧板的内侧面上部在相应的位置具有一条水平凹槽(即每相邻两个侧板上相对的水平凹槽互为镜像)。每两个侧板之间插设一个培养板，每个培养板一端插设于某个侧板的水平凹槽中，另一端插设于与该侧板相邻的侧板上的与该水平凹槽相对的水平凹槽中。每个培养板上以均匀的方式贯通设置96个培育腔4，培育腔为仅有侧壁的倒圆台状通腔体，上底面直径为6.0mm、下底面直径为2.5mm、高度为21.0mm，每个培育腔与相邻培育腔的边缘距离为0.6cm，培育腔的下底面距用于放置植物处理装置的水平面的垂直距离为15cm。相邻侧板之间通过连接固定部件(横杆)连接。
实施例2、采用植物处理装置鉴定低温胁迫下水稻苗期耐冷性
采用实施例1制备的植物处理装置鉴定低温胁迫下水稻苗期耐冷性。
本实施例中的低温水浴箱按照中国专利申请号为201620970857.0的实用新型专利的实施例制备。
待测水稻品种为GLA4、NIP、C32069或C32001。
实验重复三次，每次重复的步骤如下：
一、催芽
1、取待测水稻品种的饱满种子150粒，分装种子于牛皮纸袋中，进行浸种，28℃―30℃浸种48h。
2、完成步骤1后，28℃―30℃催芽24h(催芽过程中需保持种子湿润)，获得已催芽的种子(已催芽的种子的生长状态见图8中A)，然后挑选胚芽长度基本一致的已催芽的种子备用。
二、三叶期阶段的幼苗的获得
1、取植物处理装置的培养板，将步骤一中2挑选的32粒已催芽的种子，每粒已催芽的种子胚芽向上、胚根向下的放置于培养板的1个培育腔中(见图8中B)。
2、完成步骤1后，将所述培养板(其上有已催芽的种子)置于盛有木村B培养液的塑料盒上并使已催芽的种子浸于木村B培养液，光暗交替培养15d(具体条件为：光暗交替培养的周期为：光照时间为10h，黑暗时间14h；光照强度为31000―35000Lux(具体由植物补光灯NL-400/230GN1A提供光照)；光暗交替培养的温度为：光照温度为28℃，黑暗温度为25℃；相对湿度60％―70％)，得到生长至三叶期阶段的幼苗(见图8中C)。光暗交替培养期间，每隔7天需更换木村B培养液。
三、低温处理
1、取植物处理装置的支架，置于低温水浴箱，然后注入水。
2、完成步骤1后，将低温水浴箱开启预冷，使水温恒定至4±0.2℃。
3、完成步骤2后，将完成步骤二的所述培养板(其上有生长至三叶期阶段的幼苗)的一端插设于一个侧板的水平凹槽中，另一端插设于与该侧板相邻的侧板上的与该水平凹槽相对的水平凹槽中(见图9中A、B)，20℃光暗交替培养36h(具体条件为：光暗交替培养的周期为：光照时间为10h，黑暗时间14h；光照强度为1200―1500Lux(具体由PhilipsGreenPower LED Production Module Deep Red/Blue提供光照)；相对湿度55％―65％)。处理过程中，水面高于幼苗的茎部生长点(即水面高于幼苗根茎结合部3cm)；整个处理过程中幼苗均处于直立状态。
四、恢复
将完成步骤三的所述培养板(其上有经过低温处理的幼苗)置于盛有木村B培养液的塑料盒上并使根部浸于木村B培养液，28℃光暗交替培养7d(具体条件为：光暗交替培养的周期为：光照时间为10h，黑暗时间14h；光照强度为31000―35000Lux(具体由植物补光灯NL-400/230GN1A提供光照)；光暗交替培养的温度为：光照温度为28℃，黑暗温度为25℃；相对湿度60％―70％)。
观察完成步骤四后幼苗的生长状态并统计幼苗的存活率(存活率＝存活的幼苗数/总幼苗数×100％)。幼苗存活的判断标准为：如果幼苗的心叶枯黄、则幼苗死亡，如果幼苗的心叶不枯黄、则幼苗存活。
完成步骤四后幼苗的生长状态见图10。幼苗的存活率的统计结果见图11。
结果表明，低温处理36h后，GLA4的存活率仅为3％，NIP的存活率为100％，二者达到显著差异。这一实验结果与预期实验结果(即粳稻的耐冷性高于籼稻)完全一致。
结果还表明，低温处理36h后，C32069和GLA4的存活率无显著差异，可见C32069中来自于NIP的片段不具有耐冷性；C32001和GLA4的存活率达到显著差异，可见C32001中来自于NIP的片段具有耐冷性，其存在耐冷QTL位点，C32001可作为候选的耐冷品种进行深入的研究。
因此，上述方法可以鉴定低温胁迫下水稻苗期耐冷性，该方法在筛选植物耐冷品种中的具有重要的应用价值。
按照上述方法，将低温水浴箱替换为杭州三浦精密仪器有限公司生产的型号为HK1104的低温恒温液浴槽，其它步骤均不变，从而鉴定低温胁迫下水稻苗期耐冷性。实验结果与采用低温水浴箱获得的实验结果基本一致。

Claims (10)

1.一种鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性的方法，依次包括如下步骤：
(1)取已催芽的待测水稻种子，将其培养为三叶期阶段的幼苗；
(2)取步骤(1)得到的幼苗，对其茎部生长点及以下部分进行低温胁迫；
(3)取完成步骤(2)的幼苗，恢复培养；
(4)完成步骤(3)后，统计幼苗存活率，根据存活率鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述茎部生长点及以下部分为根部和根茎结合部以上3厘米的部分。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述低温为18℃以下。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述低温胁迫为4±0.2℃处理0h-148h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，“已催芽的待测水稻种子”的制备方法为：向待测水稻品种的饱满种子中加入水，25-30℃浸种45-50h；然后在保持种子湿润的条件下，25-30℃催芽20-28h。
6.一种鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性的方法，包括如下步骤：取培养至三叶期的待测水稻幼苗，对其茎部生长点及以下部分进行低温胁迫，然后恢复培养，根据存活率鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性。
7.一种采用植物处理装置鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性的方法；
所述植物处理装置由至少一个培养单元组成，每一个培养单元包括支架和可拆卸的放置在支架上的培养板(3)；所述培养板上贯通设置有若干培育腔(4)；所述培育腔为仅有侧壁的通腔体；
采用植物处理装置鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性的方法包括如下步骤：
(1)取植物处理装置的支架，置于低温水浴箱中预冷；
(2)取植物处理装置的培养板，将每粒待测水稻种子置于培养板的1个培育腔中，将其培养为三叶期阶段的幼苗；
(3)取完成步骤(2)的所述培养板，置于完成步骤(1)的支架上，对幼苗进行低温胁迫；幼苗的茎部生长点及以下部分没入水浴箱中的液面以下，幼苗的其它部位处于所述液面以上；
(4)取完成步骤(3)的幼苗，恢复培养；
(5)完成步骤(4)后，统计幼苗存活率，根据存活率鉴定低温胁迫下待测水稻耐冷性。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述茎部生长点及以下部分为根部和根茎结合部以上3厘米的部分。
9.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述低温为18℃以下。
10.如权利要求1至9任一所述的方法，其特征在于：所述待测水稻耐冷性为待测水稻苗期耐冷性。
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