CN107428824A - Pdgf/vegf双重拮抗剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含与PDGF拮抗剂连接的VEGF拮抗剂的VEGF/PDGF双重拮抗剂。VEGF拮抗剂为VEGF的抗体或VEGFR的抗体，或为VEGFR细胞外陷阱段(即来自一个或多个VEGFR受体的胞外区的区段，其抑制至少一种VEGFR与至少一种VEGF的结合)。PDGF拮抗剂为PDGF的抗体或PDGFR的抗体或为PDGFR细胞外陷阱段(即来自一个或多个PDGFR的胞外区的区段，其抑制至少一种PDGFR与至少一种PDGF的结合)。双重拮抗剂优选与半衰期延长部分例如HEMA‑PC聚合物缀合。双重拮抗剂特别用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性。

Description

PDGF/VEGF双重拮抗剂

相关申请的交叉引用

本申请是于2014年6月28日提交的第62/018,579号非临时申请，通过引用将其全部内容并入本文用于所有目的。

背景技术

血管生成(血管的形成)在生物的整个发育过程中都会发生。事实上，胚胎中的第一个器官是血管。血管生成对于伤口愈合、损伤组织的血流恢复也是至关重要的。然而，不适当的血管生成或血管生成失调导致或引起许多疾病，包括癌症、牛皮癣、关节炎和失明(Carmeliet P.2003.Angiogenesis in health and disease.Nature Med 9(6):653-660)。

年龄相关性黄斑变性(AMD)是老年人视力丧失和失明的主要原因。约一千万美国人患有AMD。人群中AMD的患病率随着年龄的增加而稳步增长：在40岁时，只有约2％的人群受到AMD的影响，但是到80岁时，患病率约为25％(Friedman，D.S.etal.2004.Arch.Ophthalmol.122:564-572.)。通常有两种类型的AMD：干性AMD和湿性AMD。

干性AMD是该疾病的最常见形式。在干性AMD中，黄斑中存在视网膜色素上皮细胞层的消耗。干性AMD是慢性的，并且通常引起一些视力丧失。在严重的干性AMD病例中，患者可以发展至接近完全失明。湿性AMD在约10-15％的患有干性AMD的患者中产生。湿性AMD的特征在于血管生成，特别是脉络膜新血管形成(CNV)。CNV的特征在于存在从脉络膜向外部视网膜生长的新的未成熟血管。这些未成熟血管在视网膜下和视网膜中渗漏流体，导致视力丧失和失明。湿性AMD失明通常是急性的。

血管生成在癌症和肿瘤的形成和维持中也发挥了关键作用。新血管的募集是转移途径的重要组成部分。对于许多肿瘤，血管密度可以提供转移潜能的预后指标：血管丰富的肿瘤比血管较少的肿瘤具有更高的转移发生率。

血管生成是生长因子、血管内皮细胞、细胞外基质分子、趋化因子和细胞信号分子之间复杂的相互作用的结果。被鉴定为血管生成调节剂的因子包括：碱性和酸性成纤维细胞生长因子、转化生长因子α和β、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管生成素、血小板衍生内皮细胞生长因子、IL8和血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF在血管生成中的作用已被广泛报道。

已证明VEGF信号传导代表了生理性血管生成中的关键速率限制步骤。VEGF在病理性血管生成(例如肿瘤生长)中也起核心作用(Ferrara N and Davis-Smyth T.1997.Thebiology of vascular endothelial growth factor.Endocr.Rev.18:4-25)。还已知VEGF诱导血管渗漏(Bates DO and Curry FE.1997)。血管内皮生长因子通过Ca(2+)依赖途径增加微血管通透性(Am J Physiol.273:H687-H694；Roberts WG and PaladeGE.1995.Increased microvascular permeability and endothelial fenestrationinduced by vascular endothelial growth factor.J Cell Sci.108:2369-2379)。

VEGF抗体治疗剂已经成功地用于治疗湿性AMD和癌症。2004年Genentech(基因工程科技公司)的VEGF单克隆抗体贝伐单抗获得FDA批准用于治疗癌症。VEGF抗体制剂已被批准用于治疗湿性AMD。2004年FDA批准了Eyetech/PfizerGenentech的在2006年获得批准用于治疗湿性AMD。贝伐单抗也在药品核准标示外用于治疗湿性AMD。2011年Regeneron公司的被批准用于治疗湿性AMD。

尽管VEGF抗体治疗剂获得成功，但它们都不能使病理性新生血管(NV)组织消退。因此，尽管继续进行VEGF抗体治疗，NV组织仍保留且可以阻碍被治疗患者视力显著增加。NV组织由内皮细胞、周细胞和炎性细胞(即临时巨噬细胞)组成。毛细血管上周细胞的存在不仅使NV得到支持并稳定，而且通过化学信号传导和物理相互作用(包括VEGF的周细胞产生)促进内皮细胞存活。通过互相协调的周细胞进行的这种内皮存活信号传导是关键的，并且可以解释NV组织对VEGF消除的抗性，即VEGF抗体治疗单一疗法不会使NV退化。此外，随着时间的推移，病理性NV组织可导致纤维化和瘢痕形成。

在VEGF抗体治疗两年内，在近一半的经治疗的眼中发生视网膜下瘢痕形成(Daniel E，Toth CA，Grunwald JE.2014.Risk of scar in the comparison of age-related macular degeneration in clinical settings.Retina32:1480-1485)。视网膜下纤维化形成可引起黄斑***的永久性功能障碍；这会导致光感受器、视网膜色素上皮和脉络膜血管的破坏(Ishikawa K，Ram K，Hinton DR.2015.Molecular mechanisms ofsubretinal fibrosis in age-related macular degeneration.Eye Res.xxx:1-7)。尽管VEGF抗体治疗通常稳定或改善视敏度，但瘢痕形成已被鉴定为治疗后视敏度丧失的原因之一(Cohen SY，Oubraham H，Uzzan J，et al.2012.Causes of unsuccessful ranibizumabtreatment in exudative age-related macular degeneration in clinicalsettings.Retina 32:1480-1485)。

据报道，PDGF在周细胞募集、成熟和对VEGF抗体介导的消退的抗性中起作用。已报道角膜和脉络膜新生血管形成动物模型证明了施用阻断PDGF-B/PDGFR-β相互作用的药剂导致周细胞从病理性新生血管剥离(Jo N，Mailhos C，Ju M，et al.2006.Inhibition ofPlatelet-Derived Growth Factor B Signaling Enhances the Efficacy of Anti-Vascular Endothelial Growth Factor Therapy in Multiple Models of OcularNeovascularization.American J Path.168(6):2036-2053)。

针对两种途径，目前正在进行临床试验，其中患者接受两种药物：由Ophthotech公司生产的(VEGF抗体Fab)和Fovista^TM(一种针对PDGF的聚乙二醇化的适体)。Fovista仅针对单一PDGF配体：PDGF-BB。然而，存在许多其它PDGF配体：PDGF-AA、PDGF-CC和PDGF-DD。例如已经证明PDGF-DD在眼血管生成中起关键作用(Kumar A，Hou X，Chunsik L，et al.2010.Platelet-derived Growth Factor-DD Targeting Arrests PathologicalAngiogenesis by Modulating Glycogen Synthase Kinase-3βPhosphorylation.J BiolChem 285(20):15500-15510)。然而Fovista不与PDGF-DD相互作用。本领域需要更广泛的PDGF抗体疗法。

此外，基于适体的治疗剂通常具有差的药代动力学性质，因为适体要经受肾脏过滤和血清消化。虽然可以通过聚乙二醇化一定程度上克服这些问题，但聚乙二醇化往往会降低与靶的结合。适体通常以比它们的抗体对应物低得多的亲和力与靶结合。聚乙二醇化往往会进一步降低结合。因此，本领域需要基于非适体的PDGF抗体治疗剂。

相对于目前批准的VEGF抗体疗法，当前针对Fovista的临床计划将患者必须接受的用于治疗的注射次数增加了一倍。Fovista与VEGF抗体制剂分开配制，因此患者必须注射两次而不是一次。此外，由于单次注射引起的眼压升高，注射不能同时进行。

从患者和治疗医师的角度来看，玻璃体内注射并不是无关紧要的。许多患者遭受注射引起疼痛和不适，并且患者依从性是严重的问题。玻璃体内注射的常见副作用包括结膜出血、眼痛、玻璃体漂浮物、眼压增加和眼内炎症。玻璃体内注射与相对罕见的严重不良事件相关，包括眼内炎、视网膜脱离和外伤性白内障。

因此，本领域需要不增加患者必须忍受的玻璃体内注射次数的疗法。此外，目前的VEGF抗体疗法通常需要每月注射一次。还需要比每月一次频率更低的疗法。

发明内容

本发明提供了VEGF/PDGF双重拮抗剂，其包含与PDGF拮抗剂连接的VEGF拮抗剂，其中VEGF拮抗剂(a)为VEGF的抗体或VEGFR的抗体，或VEGF拮抗剂(b)为VEGFR细胞外陷阱段，PDGF拮抗剂(a)为PDGF的抗体或PDGFR的抗体，或PDGF拮抗剂(b)为PDGFR细胞外陷阱段，条件是VEGF拮抗剂和PDGF拮抗剂不都是抗体。任选地，所述VEGF拮抗剂是包含重链和轻链的抗体，所述PDGF拮抗剂是PDGFR细胞外陷阱段，所述抗体的重链通过接头与PDGFR细胞外陷阱段的C末端融合，且所述轻链与所述重链形成复合体。任选地，所述抗体为Fab片段。任选地，所述抗体为完整抗体。任选地，所述PDGF拮抗剂为PDGFR-α受体或PDGFR-β受体的细胞外陷阱段，所述VEGF拮抗剂为VEGF的抗体。任选地，所述PDGFR细胞外陷阱段包含PDGFR-β的D1-D5结构域中一个或多个。任选地，所述PDGFR细胞外陷阱段包含PDGFR-β的D1-D3结构域。任选地，所述PDGFR细胞外陷阱段包含SEQ ID NO.11的氨基酸33-314。任选地，所述VEGF拮抗剂包含抗VEGF的抗体。任选地，所述抗VEGF的抗体是抗VEGF-A的抗体。任选地，所述PDGFR细胞外陷阱段位于所述重链或轻链的C末端。任选地，所述PDGFR细胞外陷阱段位于所述重链或轻链的N末端。

任选地，所述VEGF/PDGF双重拮抗剂还包含位于PDGFR陷阱和抗VEGF的抗体重链之间的接头。任选地，所述接头为GGGGSGGGGS、GG或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG。

任选地，所述抗VEGF的抗体重链包含CDR_H1:GYDFTHYGMN、CDR_H2:WINTYTGEPTYAADFKR和CDR_H3:YPYYYGTSHWYFDV。任选地，VEGF抗体轻链包含CDR_L1:SASQDISNYLN、CDR_L2:FTSSLHS和CDR_L3:QQYSTVPWT。

任选地，VEGF抗体重链同种型为包含CH₁结构域、铰链结构域、CH₂结构域和CH₃结构域的IgG1，轻链同种型为κ。任选地，IgG1恒定结构域具有SEQ ID NO.17所示的序列，轻链恒定区具有SEQ ID NO.18所示的序列。

任选地，所述IgG1恒定结构域具有一个或多个突变以降低效应子功能。任选地，所述突变针对一个或多个以下氨基酸位置(EU编号)：E233、L234、L235、G236、G237、A327、A330和P331。任选地，所述突变选自：E233P、L234V、L234A、L235A、G237A、A327G、A330S和P331S。任选地，突变为L234A、L235A和G237A。

任选地，VEGF/PDGF双重拮抗剂包含重链，该重链还包含通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基。任选地，所述半胱氨酸残基选自(EU编号)Q347C和L443C。

任选地，VEGF/PDGF双重拮抗剂具有包含SEQ ID NO.9的氨基酸序列的重链，轻链具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列。

任选地，VEGF/PDGF双重拮抗剂包含PDGFR陷阱细胞外区段，所述PDGFR陷阱细胞外区段包含PDGFR-β的D1-D5结构域中的一个或多个。任选地，所述PDGFR陷阱细胞外区段包含PDGFR-β的D1-D3结构域。任选地，该PDGFR陷阱细胞外区段包含SEQ ID NO.11的氨基酸33-314。

任选地，VEGF/PDGF双重拮抗剂包含VEGF拮抗剂，所述VEGF拮抗剂为抗VEGF的抗体。任选地，所述抗体为VEGF-A抗体Fab片段。任选地，所述PDGFR细胞外陷阱段位于Fab重链或轻链的C末端。任选地，PDGFR细胞外陷阱段位于Fab重链或轻链的N末端。

任选地，VEGF/PDGF双重拮抗剂包含含有VEGF-A抗体Fab片段重链的重链和含有VEGF-A抗体轻链的轻链。任选地，双重拮抗剂还包含位于所述PDGFR陷阱和VEGF抗体Fab片段重链之间的接头。任选地，所述接头选自GGGGSGGGGS、GG和GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG。任选地，所述VEGF抗体Fab片段重链包含CDR_H1:GYDFTHYGMN、CDR_H2:WINTYTGEPTYAADFKR和CDR_H3:YPYYYGTSHWYFDV。任选地，所述VEGF抗体轻链包含CDR_L1:SASQDISNYLN、CDR_L2:FTSSLHS和CDR_L3:QQYSTVPWT。任选地，VEGF抗体重链同种型为包含CH₁结构域的IgG1，轻链同种型为κ。

任一所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂还包含半衰期延长部分。任选地，所述半衰期延长部分包括聚合物，所述聚合物为PEG或两性离子聚合物。任选地，所述两性离子聚合物包含含有磷酰胆碱的单体。任选地，所述单体包含2-(丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯。任选地，所述单体包含2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯(HEMA-PC)。任选地，所述聚合物具有3条或更多条臂。任选地，所述聚合物具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12条臂。任选地，所述聚合物具有3、6或9条臂。任选地，所述聚合物具有9条臂。任选地，缀合物的聚合物部分的峰值分子量在300,000Da和1,750,000Da之间。任选地，缀合物的聚合物部分的峰值分子量在500,000Da和1,000,000Da之间。任选地，缀合物的聚合物部分的峰值分子量在600,000Da和800,000Da之间。任选地，VEGF/PDGF双重拮抗剂与所述聚合物共价键合(covalently bonded to)。任选地，所述聚合物与氨基、羟基、巯基和羧基中的至少一种共价键合。任选地，巯基来自天然存在的半胱氨酸残基。任选地，巯基来自通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基。任选地，所述聚合物与SEQ ID NO.9第731位上的半胱氨酸残基共价键合。

任选地，所述VEGF拮抗剂包含含有VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的一个或多个细胞外区段的VEGFR细胞外陷阱段，所述PDGF拮抗剂为抗PDGF抗体。任选地，VEGFR的细胞外区段包含D1-D7结构域中的一个或多个。任选地，所述细胞外区段包含来自VEGFR-1的D2和来自VEGFR-2的D3。任选地，所述D2连接D3的N-末端并且还包含结构域之间的接头。任选地，所述PDGF拮抗剂是完整抗体。任选地，所述PDGF拮抗剂是Fab片段。任选地，抗PDGFR抗体为人源化2A1E2、HuM4Ts.22、人源化1B3、人源化2C5、PDGF-BB抗体、PDGF-DD抗体、PDGF-BB抗体或PDGF-AB抗体。任选地，重链为IgG1，轻链为κ。任选地，重链序列具有通过重组DNA技术添加的半胱氨酸，该半胱氨酸选自Q347C或L443C。任选地，所述VEGF/PDGF双重拮抗剂还包含与所述半胱氨酸缀合的半衰期延长部分。任选地，所述VEGF/PDGF双重拮抗剂蛋白具有包含两性离子聚合物的半衰期延长部分，该聚合物包含一种或多种单体单元，并且其中至少一种单体单元包含两性离子基团，例如磷酰胆碱。任选地，所述单体包含2-(丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯。任选地，所述单体包含2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯(HEMA-PC)。任选地，所述聚合物具有3条或更多条臂。任选地，所述聚合物具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12条臂。任选地，所述聚合物具有3、6或9条臂。任选地，所述聚合物具有9条臂。任选地，缀合物的聚合物部分的峰值分子量在300,000Da和1,750,000Da之间。任选地，缀合物的聚合物部分的峰值分子量在500,000Da和1,000,000Da之间。任选地，缀合物的聚合物部分的峰值分子量在600,000Da和800,000Da之间。

在一些VEGF/PDGF双重拮抗剂中，所述PDGF拮抗剂包含含有选自PDGFR-α和PDGFR-β的PDGFR的一个或多个细胞外区段的PDGF细胞外陷阱段，所述VEGF拮抗剂为包含选自VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的VEGFR的一个或多个细胞外区段的VEGF细胞外陷阱段。任选地，VEGFR的细胞外陷阱段包含D1-D7结构域中的一个或多个。任选地，所述细胞外陷阱段包含来自VEGFR-1的D2和来自VEGFR-2的D3。任选地，所述D2连接D3的N-末端且还包含所述结构域之间的接头。任选地，PDGFR陷阱包含PDGFR-β的D1-D5结构域中的一个或多个。任选地，PDGFR陷阱包含PDGFR-β的D1-D3结构域。任选地，PDGFR陷阱包含SEQ ID NO.11的氨基酸33-314。任选地，所述VEGF/PDGF双重拮抗剂还包含VEGF拮抗剂和PDGF拮抗剂之间的接头序列。任选地，所述VEGF/PDGF双重拮抗剂还包含半衰期延长部分。任选地，所述半衰期延长部分包含选自PEG和两性离子聚合物的聚合物。任选地，所述半衰期延长部分包含两性离子聚合物。任选地，所述两性离子聚合物包含含有磷酰胆碱的单体。任选地，所述单体包含2-(丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯。任选地，所述单体包含2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯(HEMA-PC)。任选地，所述聚合物具有3条或更多条臂。任选地，所述聚合物具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12条臂。任选地，所述聚合物具有3、6或9条臂。任选地，缀合物的聚合物部分的峰值分子量在300,000Da和1,750,000Da之间。任选地，缀合物的聚合物部分的峰值分子量在500,000Da和1,000,000Da之间。任选地，缀合物的聚合物部分的峰值分子量在600,000Da和800,000Da之间。任选地，所述聚合物具有9条臂。任选地，所述VEGF/PDGF双重拮抗剂与聚合物共价键合(bonded)。任选地，所述聚合物与氨基、羟基、巯基和羧基中的至少一种共价键合。任选地，巯基来自天然存在的半胱氨酸残基。任选地，巯基来自通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基。

如上所述的任一VEGF/PDGF双重拮抗剂可用于治疗或预防疾病，特别是新生血管性病症，任选地眼部新生血管性病症，例如湿性年龄相关性黄斑变性。

附图说明

图1：人PDGFR-β的蛋白质序列。

图2：VEGFR-1的蛋白质序列。

图3：VEGFR-2的蛋白质序列。

图4：VEGFR-3的蛋白质序列。

图5：贝伐单抗序列(DrugBank DB00112)。

图6：兰尼单抗(ranibizumab)(由Novartis发布)。

图7A、7B：A.PDGFRβ-GS10-VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体重链的蛋白质序列。

图8A、8B：A.PDGFRβ-GG-VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体重链的蛋白质序列。

图9A、9B：A.PDGFRβ-GS10-VEGF-A抗体重链(野生型Fc)的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列。

图10A、10B：A.PDGFRβ-GG-VEGF-A抗体重链(野生型Fc)的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列。

图11A、11B：A.VEGF-A抗体重链(野生型Fc)-GS21-PDGFRβ的蛋白质序列，B.-VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列。

图12A、12B：A.PDGFR-β-GS21-VEGF-A抗体重链(Q347C)的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体轻链(TAF347)的蛋白质序列。

图13A、13B：A.PDGFR-β-GS21-VEGF-A抗体重链(L443C)的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体轻链(TAF443)的蛋白质序列。

图14A、14B：A.PDGFRβ-GS10-VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体Fab的蛋白质序列。

图15A、15B：A.PDGFRβ-GG-VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体Fab的蛋白质序列。

图16A、16B：A.PDGFRβ-GS10-VEGF-A抗体Fab的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列。

图17A、17B：A.PDGFRβ-GG-VEGF-A抗体Fab的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列。

图18A、18B：A.VEGF-A抗体Fab-GS21-PDGFRβ的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列。

图19A、19B：A.具有某些突变的PDGFRβ-GS10-VEGF-A抗体Fab的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列。

图20A、20B：A.PDGFRβ-VEGF-A抗体重链的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体轻链(1a)的蛋白质序列。

图21A、21B：A.PDGFR-β(D2-D3)-VEGF-A抗体重链的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体轻链(1b)的蛋白质序列。

图22A、22B：A.PDGFR-β(D1-D3)-VEGF-A抗体Fab的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体轻链(2b)的蛋白质序列。

图23A、23B：A.PDGFR-β(D2-D3)-6xGS-VEGF-A抗体Fab的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体轻链(2b’)的蛋白质序列。

图24A、24B：A.PDGFR-β-6xGS-VEGF-A抗体Fab的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列。

图25A、25B：A.VEGF-A抗体Fab-6xGS-PDGFR-β(D2-D3)的蛋白质序列，B.VEGF-A抗体轻链(3)的蛋白质序列。

图26示出OG1448的化学结构。

图27示出化合物L。

图28示出化合物K。

图29示出由R3707合成OG1802。

图30示出OG1786。

图31示出由OG1550合成OG1546。

图32示出由OG1546和OG1563合成OG1784。

图33示出由OG1784合成OG1405。

图34示出由OG1405合成OG 1785。

图35示出由OG1785合成OG1786。

图36示出OG1802。

图37示出IV级激光损伤百分比的图表。

图38示出化合物E。

图39描述了OG1448。

图40示出使用OG1448、阿瓦斯汀(Avastin)和抗PDGF-BB抗体及其各种组合时的相对血管生成。

图41示出与第15天相比CNV猴模型中所示化合物的IV级损伤％。

图42示出兔玻璃体中相对于阿柏西普(aflibercept)和兰尼单抗的OG1448眼睛药代动力学。

序列简要说明

SEQ ID NO.1为PDGFRb-GS10-VEGF-A抗体(贝伐单抗)轻链的蛋白质序列。

SEQ ID NO.2为VEGF-A抗体(贝伐单抗)重链。

SEQ ID NO.3为PDGFRb-GG-VEGF-A抗体(贝伐单抗)轻链的蛋白质序列。

SEQ ID NO.4为PDGFRβ-GS10-VEGF-A抗体(贝伐单抗)重链。

SEQ ID NO.5为VEGF-A抗体(贝伐单抗)轻链。

SEQ ID NO.6为PDGFRβ-GG-VEGF-A抗体(贝伐单抗)重链。

SEQ ID NO.7为VEGF-A抗体(贝伐单抗)重链-GS21-PDGFRβ。

SEQ ID NO.8为TAF347的重链陷阱细胞外区段的氨基酸序列:PDGFR-β陷阱-VEGF-A抗体重链(Q347C)。

SEQ ID NO.9为TAF443的重链陷阱细胞外区段的氨基酸序列:PDGFR-β陷阱-VEGF-A抗体重链(L443C)，SEQ ID NO:10为VEGF-A抗体轻链的氨基酸序列。

SEQ ID NO.11为人PDGFR-β。

SEQ ID NO.12为兰尼单抗轻链。

SEQ ID NO.13为兰尼单抗重链。

SEQ ID NO.14为人VEGFR-1。

SEQ ID NO.15为人VEGFR-2。

SEQ ID NO.16为人VEGFR-3。

SEQ ID NO.17为人IgG1恒定区。

SEQ ID NO.18为人κ轻链恒定区。

SEQ ID NO.19为图7的PDGFR-GS10-VEGF-A抗体轻链。

SEQ ID NO.20为图8的PDGFR-GG-VEGF-A抗体轻链。

SEQ ID NO.21为贝伐单抗Fab。

SEQ ID NO.22为PDGFR-β-GS10-VEGF-A抗体Fab。

SEQ ID NO.23为PDGFR-β-GG-VEGF-A抗体Fab。

SEQ ID NO.24为VEGF-A抗体Fab-GS21-PDGFR-β。

SEQ ID NO.25为具有某些突变的PDGFR-β-GS10-VEGF-A抗体Fab。

SEQ ID NO.26为PDGFRβ-VEGF-A抗体重链(1a)的蛋白质序列。

SEQ ID NO.27为PDGFR-β(D2-D3)-VEGF-A抗体重链(1b)的蛋白质序列。

SEQ ID NO.28为PDGFR-β(D2-D3)-VEGF-A抗体Fab(2b)的蛋白质序列。

SEQ ID NO.29为PDGFR-β(D2-D3)-6xGS-VEGF-A抗体Fab的蛋白质序列。

SEQ ID NO.30为VEGF-A抗体Fab-6xGS-PDGFR-β(D2-D3)的蛋白质序列。

SEQ ID NO.31为编码重链VEGF抗体-PDGFR融合物的核酸。

SEQ ID NO.32为编码轻链VEGF抗体的核酸。

GGGGS(SEQ ID NO.37)、GGGS(SEQ ID NO.38)、GGGES(SEQ ID NO.39)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO.40)和GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG(SEQ ID NO.41)。

兰尼单抗CDR为：CDR_H1:GYDFTHYGMN、CDR_H2:WINTYTGEPTYAADFKR和CDR_H3:YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO:42-44)；CDR_L1:SASQDISNYLN、CDR_L2:FTSSLHS和CDR_L3:QQYSTVPWT(SEQ ID NO:45-47)。贝伐单抗CDR_H1为GYTFTNYGMN(SEQ ID NO.48)，CDR_H3为YPHYYGSSHWYFDV(SEQ ID NO:49)。

定义

“新生血管性病症”是以改变的、失调的或未经调节的血管生成为特征的病症或疾病状态。新生血管性病症的实例包括致瘤性转化(例如癌症)和包括糖尿病性视网膜病和年龄相关性黄斑变性在内的眼部新生血管性病症。

“眼部新生血管性”病症是以患者眼中改变的、失调的或未经调节的血管生成为特征的病症。这些病症包括视神经盘新血管形成、虹膜新血管形成、视网膜新血管形成、脉络膜新血管形成、角膜新血管形成、玻璃体新血管形成、青光眼、血管翳、翼状胬肉、黄斑水肿，糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、血管性视网膜病、视网膜变性、葡萄膜炎，视网膜炎性疾病和增生性玻璃体视网膜病变。

“多肽接头”是用于连接两条多肽(例如VH结构域与VL结构域或VH结构域与细胞外陷阱段)的包含通过肽键连接的两个或多个氨基酸残基的多肽。此类接头多肽的实例是本领域熟知的(参见例如Holliger P，Prospero T，Winter G.1993.PNAS USA.90:6444-6448；Poljak RJ.1994.Production and Structure of Diabodies.Structure 2:1121-1123)。示例性接头包括G、GG、GGGGS、GGGS和GGGES，以及此类接头的寡聚体(例如，GGGGSGGGGS和GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG)。

本文所述的双重拮抗剂或其它生物制剂通常以分离的形式提供。这意味着拮抗剂通常为至少50％w/w纯的，具有干扰蛋白和从其生产或纯化产生的其它污染物，但不排除拮抗剂与过量的旨在方便其使用的药学上可接受的赋形剂组合。有时拮抗剂是至少60％w/w、70％w/w、80％w/w、90％w/w、95％w/w或99％w/w纯的，具有干扰蛋白和来自生产或纯化中的污染物。通常拮抗剂是其纯化后剩余的主要大分子物质。

术语抗体包括完整抗体及其结合片段。结合片段是指完整抗体之外的包含完整抗体的一部分的分子，所述完整抗体的一部分与完整抗体所结合的抗原相结合。结合片段的实例包括Fv、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2，双抗体，线性抗体，单链抗体分子(例如scFv)和由抗体片段形成的多特异性抗体。在Houston JS.1991.Methods in Enzymol.203:46-96中对scFv抗体进行了描述。另外，抗体片段包括具有VH结构域特征(即能够与VL结构域一起组装到功能性抗原结合位点从而提供全长抗体的抗原结合性质)或VL结构域特征(即能够与VH结构域一起组装到功能性抗原结合位点从而提供全长抗体的抗原结合性质)的单链多肽。

抗体、细胞外陷阱段或双重拮抗剂与其靶抗原的特异性结合是指至少10⁶M^-1、10⁷M^-1、10⁸M^-1、10⁹M^-1或10¹⁰M^-1的亲和力。特异性结合是可检测地更高的量值，并可区别于对至少一个不相关靶标发生的非特异性结合。特异性结合可以是特定官能团之间成键的结果或特定空间配合(例如，锁和钥匙类型)的结果，而非特异性结合通常是范德华力的结果。然而，特异性结合不一定意味着抗体或融合蛋白结合一个且仅结合一个靶标。

基本抗体结构单元是亚单元的四聚体。每个四聚体包括相同的两对多肽链，每对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。该可变区最初表达为与可切割的信号肽连接。没有信号肽的可变区有时被称为成熟可变区。因此，例如，轻链成熟可变区是指没有轻链信号肽的轻链可变区。然而，提到可变区并不意味着信号序列必然存在；事实上一旦本发明的抗体或融合蛋白被表达和分泌，信号序列就被切割。一对重链可变区和轻链可变区限定抗体的结合区。轻链和重链的羧基末端部分分别限定轻链恒定区和重链恒定区。重链恒定区主要负责效应子功能。在IgG抗体中，重链恒定区分为CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。CH1区通过二硫键和非共价键与轻链恒定区结合。铰链区在抗体的结合区和效应子区之间提供柔性，并且还提供四聚体亚单元中两个重链恒定区之间的分子间二硫键形成位点。CH2区和CH3区是效应子功能和FcR结合的主要位点。

轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，并分别将抗体的同种型定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过具有约12个或更多个氨基酸的“J”区段连接，重链还包括具有约10个或更多个氨基酸的“D”区段。(一般参见FundamentalImmunology(Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.，1989)，Ch.7)(其全部内容通过引用并入本文用于所有目的)。

每个轻链/重链对的成熟可变区形成抗体结合位点。因此，完整抗体具有两个结合位点，即是二价的。在天然抗体中，结合位点是相同的。然而，可以制备其中两个结合位点不同的双特异性抗体(参见例如Songsivilai S，Lachmann PC.1990.Bispecific antibody:atool for diagnosis and treatment of disease.Clin Exp Immunol.79:315-321；Kostelny SA，Cole MS，Tso JY.1992.Formation of bispecific antibody by the useof leucine zippers.J Immunol.148:1547-1553)。可变区均具有大体结构相同的、通过三个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)。每对的两条链的CDR通过框架区排列，使得能够结合特定表位。从N末端到C末端，轻链和重链都包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4结构域。为了方便起见，可变重链CDR可以称为CDR_H1、CDR_H2和CDR_H3；可变轻链CDR可以称为CDR_L1、CDR_L2和CDR_L3。每个结构域的氨基酸分配符合KabatEA，et al.的定义(1987and 1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，MD)或Chothia C，Lesk AM.1987.CanonicalStructures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins.J Mol Biol 196:901-917；Chothia C，et al.1989.Conformations of Immunoglobulin HypervariableRegions.Nature 342:877-883.)。Kabat还提供广泛使用的编号惯例(Kabat编号)，其中不同重链可变区之间或不同轻链可变区之间的相应残基被赋予相同的编号。尽管Kabat编号可以用于抗体恒定区，但是EU编号更常用，如本申请中的情况一样。尽管提供了示例性双重拮抗剂的具体序列，但应当理解，在蛋白质链表达后，轻链和/或重链的氨基或羧基末端的一个至数个氨基酸，特别是重链C末端的赖氨酸残基，可以在一定比例的或所有分子中缺失或衍生化。

术语“表位”是指抗体或细胞外陷阱段结合的抗原上的位点。蛋白质上的表位可以由连续氨基酸或通过一个或多个蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在暴露于变性溶剂时得以保持，而由三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在用变性溶剂处理时失去。表位通常包括至少3个，更通常地，至少5个或8-10个呈独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体学和2维核磁共振(参见，例如Epitope Mapping Protocols，in Methods in MolecularBiology，Vol.66，Glenn E.Morris，Ed.(1996))。

识别相同或重叠的表位的抗体可以在简单的免疫测定中鉴定，该免疫测定显示一种抗体与另一种抗体与靶抗原结合相竞争的能力。抗体的表位也可以通过与其抗原结合的抗体(或Fab片段)的X射线晶体学来定义以鉴定接触残基。

或者，如果抗原中减少或消除一种抗体结合的所有氨基酸突变降低或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变降低或消除另一种抗体的结合，则两个抗体具有重叠的表位。

抗体之间的竞争通过试验来测定，其中测试的抗体抑制对照抗体与共同抗原的特异性结合(参见例如Junghans et al.，Cancer Res.50:1495，1990)。如果在竞争性结合试验中测量得到过量的测试抗体(例如，至少2x、5x、10x、20x或100x)抑制至少50％，但优选75％、90％或99％的对照抗体结合，则测试抗体与对照抗体竞争。通过竞争试验鉴定的抗体(竞争性抗体)包括与对照抗体结合相同表位的抗体和与临近表位结合的抗体，该临近表位足够接近对照抗体结合的表位从而产生空间位阻。

术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。

为了将氨基酸取代分类为保守的或非保守的，将氨基酸做如下分组：第I组(疏水侧链)：met、ala、val、leu、ile；第II组(中性亲水侧链)：cys、ser、thr；第III组(酸性侧链)：asp、glu；第IV组(碱性侧链)：asn、gin、his、lys、arg；第V组(影响链取向的残基)：gly、pro；和第VI族(芳族侧链)：trp、tyr、phe。保守取代包括在同一种类的氨基酸之间的取代。将这些种类中一个种类的成员交换为另一个种类的成员构成非保守取代。

通过Kabat编号惯例(用于可变区)或通过EU编号(用于恒定区)用最大程度比对的抗体序列确定序列同一性百分比。在比对之后，如果将受试者抗体区域(例如重链或轻链的整个成熟可变区)与对照抗体的相同区域进行比较，则受试者抗体区域和对照抗体区域之间的序列同一性百分比为受试者抗体区域和对照抗体区域中相同氨基酸占据的位置数除以两个区域的比对位置的总数，并乘以100以转换为百分比，其中未计数空位。其它序列的序列同一性可以通过使用算法(如Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI(威斯康星州麦迪逊575科学博士，基因计算机组，维斯康星基因软件包发布7.0)中的BESTFIT、FASTA和TFASTA)、使用默认空位参数、或通过检查和最佳比对(即，在比较窗口中产生最高序列相似性百分比)确定。序列同一性百分比是通过以下步骤计算的：在比较窗口上比较两个最佳比对的序列，确定在两个序列中出现相同残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(即窗口尺寸)，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比。

“包含”一个或多个所记载的要素的组合物或方法可以包括未具体记载的其他要素。例如，包含抗体的组合物可以包含单独的抗体或与其他成分组合的抗体。

术语“抗体依赖性细胞毒性”或ADCC是诱导细胞死亡的机制，其取决于外面覆有抗体靶细胞(即，具有结合的抗体的细胞)与具有细胞溶解活性的免疫细胞(也称为效应细胞)的相互作用。这种效应细胞包括天然杀伤细胞、单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞。ADCC由与细胞结合的抗体的Fc区与免疫效应细胞(例如嗜中性粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞)上的Fcy受体(特别是FcγRI和FcγRIII)之间的相互作用触发。根据介导的效应细胞类型，通过吞噬作用或细胞溶解来消除靶细胞。外面覆有抗体的靶细胞死亡的发生是效应细胞活性的结果。

术语调理作用也称为“抗体依赖性细胞吞噬作用”或ADCP，是指外面覆有抗体的细胞被与免疫球蛋白Fc区结合的吞噬免疫细胞(例如，巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞)完全或部分内化的过程。

术语“补体依赖性细胞毒性”或CDC是指诱导细胞死亡的机制，其中靶结合抗体的Fc效应结构域激活一系列酶促反应，最终在靶细胞膜中形成孔。通常，抗原-抗体复合物(例如外面覆有抗体的靶细胞上的抗原-抗体复合物)结合并激活补体成分Clq，补体成分Clq转而激活导致靶细胞死亡的补体级联反应。补体的激活也可导致补体成分沉积在靶细胞表面上，通过结合白细胞上的补体受体(例如CR3)来促进ADCC。

人源化抗体是基因工程抗体，其中将来自非人“供体”抗体的CDR移植到人“受体”抗体序列中(参见例如Queen，US 5,530,101和US 5,585,089；Winter，US 5,225,539，Carter，US 6,407,213，Adair，US 5,859,205 6,881,557，Foote，US 6,881,557)。受体抗体序列可以是例如成熟人抗体序列、这些序列的复合物、人抗体序列的共有序列或胚系区序列(germline region sequence)。因此，人源化抗体是具有CDR(一些或全部CDR完全或基本上来自供体抗体)以及可变区框架序列和恒定区(如果存在，完全或基本上来自人抗体序列)的抗体。类似地，人源化重链具有完全或基本上来自供体抗体重链的至少一个、两个、通常全部三个CDR以及重链可变区框架序列和重链恒定区(如果存在，基本上来自人重链可变区框架序列和恒定区序列)。类似地，人源化轻链具有完全或基本上来自供体抗体轻链的至少一个、两个、通常全部三个CDR以及轻链可变区框架序列和轻链恒定区(如果存在，基本上来自人轻链可变区框架序列和恒定区序列)。除了纳米抗体和dAb之外，人源化抗体包含人源化重链和人源化轻链。当各CDR之间至少85％、90％、95％或100％的相应残基(如Kabat所定义的)相同时，人源化抗体中的CDR基本上来自非人抗体中的相应CDR。当至少85％、90％、95％或100％的由Kabat定义的相应残基相同时，抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区基本上分别来自人可变区框架序列或人恒定区。

尽管人源化抗体通常并入来自小鼠抗体的所有六个CDR(优选如Kabat所定义)，但它们也可以用少于所有六个CDR制成(例如，来自小鼠抗体的至少3、4或5个CDR)(例如，DePascalis R，Iwahashi M，Tamura M，et al.2002.Grafting“Abbreviated”Complementary-Determining Regions Containing Specificity-Determining Residues Essential forLigand Contact to Engineer a Less Immunogenic Humanized Monoclonal Antibody.JImmunol.169:3076-3084；Vajdos FF，Adams CW，Breece TN，Presta LG，de Vos AM，Sidhu，SS.2002.Comprehensive functional maps of the antigen-binding site of an anti-ErbB2antibody obtained with shotgun scanning mutagenesis.J Mol Biol.320:415–428；Iwahashi M，Milenic DE，Padlan EA，et al.1999.CDR substitutions of ahumanized monoclonal antibody(CC49):Contributions of individual CDRs toantigen binding and immunogenicity.Mol Immunol.36:1079-1091；Tamura M，MilenicDE，Iwahashi M，et al.2000.Structural correlates of an anticarcinoma antibody:Identification of specificity-determining regions(SDRs)and development of aminimally immunogenic antibody variant by retention of SDRs only.JImmunol.164:1432-1441)。

嵌合抗体是其中非人抗体(例如小鼠)的轻链和重链的成熟可变区与人轻链恒定区和重链恒定区组合的抗体。这样的抗体基本上或完全保留小鼠抗体的结合特异性，并且为约三分之二的人序列。

镶嵌抗体(veneered antibody)是一类人源化抗体，其保留非人抗体的一些但通常是所有的CDR和一些非人抗体的非人可变区框架残基，但将可能构成B细胞表位或T细胞表位的其他可变区框架残基例如暴露的残基(Padlan EA.1991.A possible procedurefor reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preservingtheir ligand-binding properties.Mol Immunol.28:489-98)替换为来自人抗体序列相应位置的残基。结果得到这样的抗体：CDR完全或基本来自非人抗体，且通过取代使非人抗体的可变区框架与人更加相似。人抗体可以从人中分离，或者由人免疫球蛋白基因的表达(例如，在转基因小鼠中，体外或通过噬菌体展示)产生。用于制备人抗体的方法包括三体杂交瘤(trioma)法( L，Pursch E.1983.Human x(mouse x human)hybridomasstably producing human antibodies.Hybridoma 2:361-367；美国专利第4,634,664号；和Engleman et al.，US专利第4,634,666号，use of transgenic miceincluding human immunoglobulin genes(参见,例如，Lonberg et al.，WO 93/12227(1993)；US 5,877,397，US 5,874,299，US 5,814,318，US 5,789,650，US 5,770,429，US 5,661,016，US 5,633,425，US 5,625,126，US 5,569,825，US 5,545,806，Nature 148，1547-1553(1994)，Nature Biotechnology 14，826(1996)，Kucherlapati，WO 91/10741(1991))和噬菌体展示方法(参见例如Dower et al.，WO 91/17271和McCafferty et al.，WO 92/01047，US 5,877,218，US 5,871,907，US 5,858,657，US 5,837,242，US 5,733,743和US 5,565,332)。

“聚合物”是指连接在一起的一系列单体基团。聚合物由多个单元的单一单体(均聚物)或不同单体(杂聚物)组成。高分子量(High MW)聚合物由包括但不限于丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、苯乙烯、乙烯基吡啶、乙烯基吡咯烷酮和乙烯基酯(如乙酸乙烯酯)的单体制备。另外的单体可用于本发明的高MW聚合物。当使用两种不同的单体时，这两种单体被称为“共聚单体”，这意味着不同的单体共聚形成单一聚合物。聚合物可以是线性的或支化的。当聚合物是枝化聚合物时，每条聚合物链被称为“聚合物臂”。与引发剂部分连接的聚合物臂的末端为近端，聚合物臂的增长链端为远端。在聚合物臂的增长链端上，聚合物臂端基团可以为自由基清除剂或另一基团。

“引发剂”是指能够引发本发明的单体或共聚单体聚合的化合物。聚合可以是常规的自由基聚合或优选为可控/“活性”自由基聚合，例如原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成-断裂-终止(RAFT)聚合或氮氧自由基调控的聚合(NMP)。聚合可以是“假”可控聚合，例如退化转移。当引发剂适用于ATRP时，其包含不稳定键，该键可以被均匀裂解以形成引发剂片段I—能够引发自由基聚合的基团，以及自由基清除剂I’，其与增长聚合物链的自由基反应以可逆地终止聚合。自由基清除剂I’通常是卤素，但也可以是有机部分，例如腈。在本发明的一些实施方案中，引发剂含有一个或多个2-溴异丁酸酯基团作为ATRP聚合的位点。

“化学接头”是指将两个基团连接在一起的化学部分，例如半衰期延长部分和蛋白质。接头可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解接头可以是可水解的、可酶解的、pH敏感的、光不稳定的或二硫化物接头等。其它接头包括同双功能接头和异双功能接头。“连接基团”为能够形成由一个或多个与生物活性剂连接的键组成的共价连接的官能团。非限制性实例包括WO2013059137的表1中所示的那些(通过引用并入本文)。

术语“反应性基团”是指在合适的反应条件下能够与另一化学基团反应以形成共价键(即共价反应)的基团，并且通常表示与另一种物质的连接点。反应性基团为一部分，例如马来酰亚胺或琥珀酰亚胺酯，能够与不同部分上的官能团进行化学反应以形成共价键。反应性基团通常包括亲核体、亲电体和可光活化基团。

“磷酰胆碱”，也表示为“PC”，是指以下结构：

其中*表示连接点。磷酰胆碱为两性离子基团且包括盐(如内盐)及其质子化和脱质子化形式。

“含磷酰胆碱的聚合物”是含有磷酰胆碱的聚合物。“含两性离子的聚合物”是指含有两性离子的聚合物。

含有聚(丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)的聚合物是指含有2-(丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基铵)乙基磷酸酯(HEA-PC，示于下面实施例51中)作为单体的聚合物。

含有聚(甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)的聚合物是指含有2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基铵)乙基磷酸酯(HEMA-PC)作为单体的聚合物。

在聚合物的上下文中，“分子量”可以表示为数均分子量或重均分子量或峰值分子量。除非另有说明，本文中所有提及的分子量是指峰值分子量。这些分子量测定，即数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)和峰值分子量(Mp)的测定，可以使用尺寸排阻色谱或其它液相色谱技术测量。也可以使用测量分子量值的其它方法，例如使用端基分析或测量依数性(colligative property)(例如凝固点降低、沸点升高或渗透压)以确定数均分子量，或使用光散射技术、超速离心或粘度测定法来确定重均分子量。在本发明的优选实施方案中，通过SEC-MALS(尺寸排阻色谱-多角度光散射)测量分子量。本发明的聚合物试剂通常是多分散的(即聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)，优选具有例如小于约1.5的低多分散性值(例如通过从SEC-MALS测量结果推导出的PDI值)。在其它实施方案中，多分散性(PDI)更优选在约1.4至约1.2的范围内，更优选小于约1.15，更优选小于约1.10，更优选小于约1.05，最优选小于约1.03。

短语“一个/种”(“a”或“an”)实体是指一个或多个该实体；例如，一种化合物是指一种或多种化合物或至少一种化合物。因此，术语“一个/种”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可以互换使用。

“约”是指在不同仪器、样品和样品制备物之间进行的测量中可能看到的变化。

“受保护的”、“保护形式”、“保护基团”和“保护性基团”是指存在防止或阻断分子中特定化学反应性官能团在某些反应条件下的反应的基团(即保护基团)。保护基团根据所保护的化学反应基团的类型以及要使用的反应条件和分子中其他的反应性基团或保护基团的存在(如果有的话)而变化。合适的保护基团包括例如以下专著中记载的那些：Greeneet al.，“Protective Groups In Organic Synthesis”3^rd Edition，John Wiley andSons，Inc.，New York，1999。

“烷基”是指具有指定碳原子数的直链或支链的饱和脂族基团。例如，C₁-C₆烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。其它烷基包括但不限于：庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可包括任何数目的碳，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6。烷基通常是一价的，但可以是二价的，例如当烷基将两个部分连接在一起时。

上文和下文中提及的与有机基团或化合物相连的术语“低级”分别定义可以为支链或无支链的化合物或基团，其具有至多且包括7个碳原子，优选至多且包括4个碳原子和(作为无支链的化合物或基团)一个或两个碳原子。

“亚烷基”是指如上定义连接至少两个其它基团的烷基，即二价烃基。连接到亚烷基的两个部分可以连接到亚烷基的相同原子或不同原子。例如，直链亚烷基可以是-(CH₂)_n二价基团，其中n是1、2、3、4、5或6。亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚异丁基、亚仲丁基、亚戊基和亚己基。

烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是选自以下的各种基团：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)₂R’、-NH-C(NH₂)＝NH、-NR’C(NH₂)＝NH、-NH-C(NH₂)＝NR’、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-CN和-NO₂，其数量范围为0到(2m’+1)，其中m’是这种基团中的碳原子总数。R’、R”和R”’各自独立地是指氢、未取代的(C₁-C₈)烷基和杂烷基、未取代的芳基、1-3个卤素取代的芳基、未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基-(C₁-C₄)烷基。当R’和R”连接至相同的氮原子时，它们可以与氮原子组合形成5元环、6元环或7元环。例如，-NR’R”意在包括1-吡咯烷基和4-吗啉基。术语“烷基”包括例如卤代烷基(例如-CF₃和-CH₂CF₃)和酰基(例如-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)的基团。优选地，取代的烷基和杂烷基具有1-4个取代基，更优选1、2或3个取代基。那些全卤代烷基(例如，五氟乙基等)例外，它们也是本发明所优选和可考虑的。

烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是一种或多种选自但不限于以下的各种基团：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)₂R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-NRSO₂R’、-CN和-NO₂，其数量范围为0到(2m’+1)，其中m’是这种基团中的碳原子总数。R’、R”、R”’和R””各自优选独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基(例如1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或芳烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当存在多于一个这些基团时，各R基团独立地选择为R’、R”、R’”和R””基团。当R’和R”连接到相同的氮原子时，它们可以与氮原子组合形成5元环、6元环或7元环。例如，-NR’R”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上述取代基的讨论中，本领域技术人员会理解术语“烷基”意在包括包含与氢原子以外的基团结合的碳原子的基团，例如卤代烷基(例如-CF₃和-CH₂CF₃)和酰基(例如-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)。

“烷氧基”是指具有氧原子的烷基，该氧原子将烷氧基连接到连接点或与烷氧基的两个碳连接。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基可以进一步被本文所述各种取代基取代。例如，烷氧基可以被卤素取代以形成“卤代烷氧基”。

“羧基烷基”是指被羧基取代的烷基(如本文所定义)。术语“羧基环烷基”是指被羧基取代的环烷基(如本文所定义)。术语烷氧基烷基是指被烷氧基取代的烷基(如本文所定义)。本文使用的术语“羧基”是指羧酸及其酯。

“卤代烷基”是指一些或所有氢原子被卤素原子取代的如上定义的烷基。卤素(卤代)优选表示氯或氟，但也可以是溴或碘。例如，卤代烷基包括三氟甲基、氟甲基、1,2,3,4,5-五氟苯基等。术语“全氟”定义为所有可用的氢被氟取代的化合物或基团。例如，全氟苯基是指1,2,3,4,5-五氟苯基，全氟甲基是指1,1,1-三氟甲基，全氟甲氧基是指1,1,1-三氟甲氧基。

“氟取代的烷基”是指一个、一些或所有氢原子被氟取代的烷基。

本发明上下文中的“细胞因子”是可在免疫和炎症反应中参与细胞间通讯的一组蛋白信号分子的成员。细胞因子通常是质量为约8-35kDa的小的水溶性糖蛋白。

“环烷基”是指含有约3-12个、3-10个或3-7个环内碳原子的环状烃基。环烷基包括稠合结构、桥环结构和螺环结构。

“环内”是指构成部分环状环结构的原子或原子团。

“环外”是指连接但不限定环状环结构的原子或原子团。

“环状烷基醚”是指具有3个或4个环内碳原子和1个环内氧原子或硫原子的4元或5元环状烷基(例如，氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、四氢呋喃、四氢噻吩)；或具有1个或2个环内氧或硫原子的6元至7元环状烷基(例如四氢吡喃、1,3-二噁烷、1,4-二噁烷、四氢噻喃、1,3-二噻烷、1,4-二噻烷、1,4-氧硫杂环己烷)。

“烯基”是指具有至少一个双键的2-6个碳原子的直链或支链烃基。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、1,5-己二烯基、2,4-己二烯基或1,3,5-己三烯基。烯基还可以具有2-3、2-4、2-5、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6个碳。烯基通常是一价的，但可以是二价的，例如当烯基将两个部分连接在一起时。

“亚烯基”是指连接至少两个其它基团的如上定义的烯基，即二价烃基。与亚烯基连接的两个部分可以连接到亚烯基的相同原子或不同原子。亚烯基包括但不限于亚乙烯基、亚丙烯基、亚异丙烯基、亚丁烯基、亚异丁烯基、亚仲丁烯基、亚戊烯基和亚己烯基。

“炔基”是指具有具有至少一个三键的2-6个碳原子的直链或支链烃基。炔基的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1,3-戊二炔基、1,4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1,3-己二炔基、1,4-己二炔基、1,5-己二炔基、2,4-己二炔基或1,3,5-己三炔基。炔基还可以具有2-3、2-4、2-5、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6个碳。炔基通常是一价的，但可以是二价的，例如当炔基将两个部分连接在一起时。

“亚炔基”是指连接至少两个其它基团的如上定义的炔基，即二价烃基。连接到亚炔基的两个部分可以连接到亚炔基的相同原子或不同原子。亚炔基包括但不限于亚乙炔基、亚丙炔基、亚丁炔基、亚仲丁炔基、亚戊炔基和亚己炔基。

“环烷基”是指含有3-12个环原子或指定原子数的饱和或部分不饱和的、单环、稠合双环或桥连多环组合体。单环包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。双环和多环包括例如降冰片烷、十氢萘和金刚烷。例如，C_3-8环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环辛基和降冰片烷。

“亚环烷基”是指连接至少两个其它基团的如上定义的环烷基，即二价烃基。连接到亚环烷基的两个部分可以连接到亚环烷基的相同原子或不同原子。亚环烷基包括但不限于亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基和亚环辛基。

“杂环烷基”是指具有3个环成员至约20个环成员和1个至约5个诸如N、O和S的杂原子的环***。也可以用其他的杂原子，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子也可以被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)₂-。例如，杂环包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吗啉代、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、哌啶基、二氢吲哚基、奎宁环基和1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基。

“亚杂环烷基”是指连接至少两个其它基团的如上所定义的杂环烷基。连接到杂环亚烷基的两个部分可以连接到杂环亚烷基的相同原子或不同原子。

“芳基”是指含有6-16个环碳原子的单环或稠合双环、三环或更大的芳族环组合体。例如，芳基可以是苯基、苄基或萘基，优选苯基。“亚芳基”是指衍生自芳基的二价基团。芳基可以被一个、两个或三个基团单取代、双取代或三取代，所述基团选自烷基、烷氧基、芳基、羟基、卤素、氰基、氨基、氨基烷基、三氟甲基、亚烷基二氧基和氧-C₂-C₃亚烷基，所有这些基团任选地进一步被取代，例如如上文所定义；或1-萘基或2-萘基；或1-菲基或2-菲基。亚烷基二氧基是连接到苯基的两个相邻碳原子的二价取代基，例如亚甲二氧基或亚乙二氧基。氧-C₂-C₃亚烷基也是连接到苯基的两个相邻碳原子的二价取代基，例如氧亚乙基或氧亚丙基。氧-C₂-C₃-亚烷基-苯基的实例为2,3-二氢苯并呋喃-5-基。

优选的芳基为萘基、苯基或被烷氧基、苯基、卤素、烷基或三氟甲基单取代或双取代的苯基，特别是苯基或被烷氧基、卤素或三氟甲基单取代或双取代的苯基，特别是苯基。

作为R的取代苯基的实例为例如4-氯苯-1-基、3,4-二氯苯-1-基、4-甲氧基苯-1-基、4-甲基苯-1-基、4-氨基甲基苯-1-基、4-甲氧基乙基氨基甲基苯-1-基、4-羟乙基氨基甲基苯-1-基、4-羟乙基-(甲基)-氨基甲基苯-1-基、3-氨基甲基苯-1-基、4-N-乙酰基氨基甲基苯-1-基、4-氨基苯-1-基、3-氨基苯-1-基、2-氨基苯-1-基、4-苯基苯-1-基、4-(咪唑-1-基)苯基、4-(咪唑-1-基甲基)苯-1-基、4-(吗啉-1-基)-苯-1-基、4-(吗啉-1-基甲基)苯-1-基、4-(2-甲氧基乙基氨基甲基)苯-1-基和4-(吡咯烷-1-基甲基)苯-1-基、4-噻吩基-苯-1-基、4-(3-噻吩基)-苯-1-基、4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯-1-基和杂环任选地被取代的4-(哌啶基)苯基和4-(吡啶基)苯基。

“亚芳基”是指连接至少两个其它基团的如上定义的芳基。连接到亚芳基的两个部分连接到亚芳基的不同原子。亚芳基包括但不限于亚苯基。

“亚芳基-氧基”是指如上定义的亚芳基基团，其中连接到亚芳基上的部分之一通过氧原子连接。亚芳氧基包括但不限于亚苯基-氧基。

类似地，芳基和杂芳基的取代基是多样的并且选自：-卤素、-OR’、-OC(O)R’、-NR’R”、-SR’、-R’、-CN、-NO₂、-CO₂R’、-CONR’R”、-C(O)R’、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR”C(O)₂R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NH-C(NH₂)＝NH、-NR’C(NH₂)＝NH、-NH-C(NH₂)＝NR’、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-N₃、-CH(苯基)₂、全氟(C₁-C₄)烷氧基和全氟(C₁-C₄)烷基，数量范围从0到芳族环体系上的开放化合价的总数；其中R’、R”和R”’独立地选自氢、(C₁-C₈)烷基和杂烷基、未取代芳基和杂芳基、(未取代芳基)-(C₁-C₄)烷基和(未取代芳基)氧基-(C₁-C₄)烷基。

芳基环或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-T-C(O)-(CH₂)_q-U-的取代基替代，其中T和U独立地为-NH-、-O-、-CH₂-或单键，且q为0-2的整数。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-A-(CH₂)_r-B-的取代基替代，其中A和B是独立地为-CH₂-、-O-、-NH-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S(O)₂NR’-或单键，r为1-3的整数。如此形成的新环的单键之一可以任选地被双键代替。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-(CH₂)_s-X-(CH₂)_t-的取代基替代，其中s和t独立地为0-3的整数，X为-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-或-S(O)₂NR’-。-NR’-和-S(O)₂NR’-中的取代基R’选自氢或未取代的(C₁-C₆)烷基。

“杂芳基”是指含有5-16个环原子的单环或稠合双环或三环芳香环组合体，其中1-4个环原子为各自为N、O或S的杂原子。例如，杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、苯并噻唑基、噁唑基、异噁唑基、***基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基或任何其它被例如烷基、硝基或卤素取代(尤其是单取代或双取代)的基团。吡啶基表示2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基，有利地表示2-吡啶基或3-吡啶基。噻吩基表示2-噻吩基或3-噻吩基。喹啉基优选表示2-喹啉基、3-喹啉基或4-喹啉基。异喹啉基优选表示1-异喹啉基、3-异喹啉基或4-异喹啉基。苯并吡喃基、苯并噻喃基优选分别表示3-苯并吡喃基或3-苯并噻喃基。噻唑基优选表示2-噻唑基或4-噻唑基，最优选4-噻唑基。***基优选为1-(1,2,4***基)、2-(1,2,4***基)或5-(1,2,4***基)。四唑基优选是5-四唑基。

优选地，杂芳基为吡啶基、吲哚基、喹啉基、吡咯基、噻唑基、异噁唑基、***基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、异喹啉基、苯并噻吩基、噁唑基、吲唑基或任何被取代的(特别是单取代或二取代的)基团。

术语“杂烷基”是指具有1-3个诸如N、O和S的杂原子的烷基。也可以使用其他杂原子，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子也可以被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)₂-。例如，杂烷基可以包括醚、硫醚、烷基胺和烷基硫醇。

术语“亚杂烷基”是指连接至少两个其它基团的如上所定义的杂烷基。连接到亚杂烷基的两个部分可以连接到亚杂烷基的相同原子或不同原子。

“亲电体”是指离子或原子或原子集合，其可以是离子的，具有亲电中心，即寻找电子并能够与亲核体反应的中心。亲电体(或亲电试剂)为通过从其反应配体(reactionpartner)接受两个键合电子而与该反应配体(亲核体)形成键的试剂。

“亲核体”是指离子或原子或原子集合，其可以是离子的，具有亲核中心，即寻求亲电中心或能够与亲电体反应的中心。亲核体(或亲核试剂)是通过提供两个键合电子与其反应配体(亲电体)形成键的试剂。“亲核基团”是指与反应性基团反应之后的亲核体。非限制性实例包括氨基、羟基、烷氧基、卤代烷氧基等。

“马来酰亚胺基”是指具有以下结构的吡咯-2,5-二酮-1-基：

其在与巯基(例如硫代烷基)反应时形成具有如下结构的-S-马来酰亚胺基：

其中“·”表示马来酰亚胺基团的连接点，而表示硫原子将巯基连接到原始的含巯基基团的其余部分的连接点。

为了本发明的目的，在蛋白质和多肽中发现的“天然存在的氨基酸”为L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和/或L-缬氨酸。在蛋白质中发现的“非天然存在的氨基酸”为除了那些记载为天然存在的氨基酸以外的任何氨基酸。非天然存在的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的D异构体，以及天然存在的氨基酸的D异构体和L异构体的混合物。对于其它氨基酸，例如N-α-甲基氨基酸(例如肌氨酸)、4-羟脯氨酸、锁链素、异锁链素、5-羟赖氨酸、ε-N-甲基赖氨酸、3-甲基组氨酸，虽然其发现于天然存在的蛋白质中，但为了本发明的目的被认为是蛋白质中发现的非天然存在的氨基酸，因为它们通常通过mRNA的核糖体翻译以外的手段引入。

涉及聚合物的几何形状、架构或整体结构的“线性”是指具有单条聚合物臂的聚合物。

涉及聚合物的几何形状、架构或整体结构的“支化”是指具有2条或更多条从包含在引发剂内的芯结构延伸的聚合物“臂”的聚合物。引发剂可以用于原子转移自由基聚合(ATRP)反应。支化聚合物可具有2条聚合物链(臂)、3条聚合物臂、4条聚合物臂、5条聚合物臂、6条聚合物臂、7条聚合物臂、8条聚合物臂、9条聚合物臂或更多条聚合物臂。每条聚合物臂从聚合物引发位点延伸。每个聚合物引发位点是可通过加入单体增长聚合物链的位点。例如但不限于，使用ATRP，引发剂上的聚合物引发位点通常是经历由过渡金属化合物(如卤化亚铜)催化的可逆氧化还原过程的有机卤化物。优选地，该卤化物为溴。

“药学上可接受的赋形剂”是指可以包含在本发明的组合物中、对患者没有显著不利的毒理学作用并且被FDA批准或可批准用于治疗用途(特别是在人类中)的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、正常蔗糖、正常葡萄糖等。

以有效方案施用双重拮抗剂是指延迟病症发作、降低病症严重性、抑制病症进一步恶化和/或改善病症的至少一种体征或症状的剂量、施用途径和施用频率。如果患者已经患有病症，则该方案可以称为治疗有效的方案。如果患者相对于一般群体处于高患病风险但尚未发现症状，则该方案可以被称为预防有效的方案。在一些情况下，相对于同一患者的历史对照或以往经历，可以在该个体患者中观察到治疗或预防功效。在其它情况下，相对于未治疗患者的对照群体，可在临床前或临床试验中在经治疗的患者群体中证明治疗或预防功效。

物质的“生物半衰期”是药代动力学参数，其说明在物质引入后一半物质从组织或生物体中除去所需的时间。

“HEMA-PC”是2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯。

“TAF”是指PDGFRβ-GS10-VEGF-A抗体重链/VEGF-A抗体轻链，其中重链的氨基酸1-282对应于人PDGFR-β的氨基酸33-314(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)，通过连接到贝伐单抗重链序列的N末端的甘氨酸-丝氨酸接头(GGGGSGGGGS)融合为单个开放阅读框，该贝伐单抗重链序列在可变区中具有以下突变：T28D、N31H、H97Y、S100aT(Ferrara N，DamicoL，Shams N，et al.2006.Development of Ranibizumab，an anti-vascular endothelialgrowth factor antigen binding fragment，as therapy for neovascular age-relatedmacular degeneration.Retina 26(8):859-870)；且在Fc区中具有以下突变：L234A、L235A和G237A(EU编号)(Strohl WR.2009.Optimization of Fc-mediated effector functionsof monoclonal antibodies.Curr Opin in Biotech.20:685-691)。轻链是具有M4L突变的贝伐单抗轻链。TAF通常作为具有两条重链和两条轻链的二聚体存在。TAF在从细胞表达后可以具有或不具有碳水化合物或其他翻译后修饰。TAF有时也称为TAFwt或TAFWT，其表明所讨论的分子在重链(Fc区)中既不具有Q347C突变也不具有L443C突变，如下文定义的TAF347或TAF443。

“TAF347”与TAF相同，除了它具有Q347C突变。

“TAF443”与TAF相同，除了其具有L443C突变。TAF443在本文中有时称为OG1321。

“OG1786”是用于聚合物合成的具有图35所示结构的9-臂引发剂，图35描述了OG1786与三氟乙酸形成的盐形式。根据本发明，OG1786可作为其它盐或作为游离碱使用。

“OG1801”是采用OG1786作为ATRP合成引发剂并采用单体HEMA-PC单体进行制备的约(+/-15％)750kDa的聚合物(Mn或Mp)。

“OG1802”是增加马来酰亚胺官能团的OG1801，如图36所示，其中n₁、n₂、n₃、n₄、n₅、n₆、n₇、n₈和n₉各自是整数(正数)(从0到约3000)，使得聚合物的总分子量为750,000±15％道尔顿(Mw)。

“OG1448”为与OG1802生物聚合物缀合的TAF443。

具体实施方式

I概述

本发明提供了包含与PDGF拮抗剂连接的VEGF拮抗剂的VEGF/PDGF双重拮抗剂。VEGF拮抗剂是VEGF的抗体或VEGFR的抗体，或是VEGFR细胞外陷阱段(extracellular trapsegment)(即一个或多个VEGFR受体的胞外区的区段，其抑制至少一种VEGFR与至少一种VEGF的结合)。PDGF拮抗剂为PDGF的抗体或PDGFR的抗体或为PDGFR细胞外陷阱段(即一个或多个PDGFR的胞外区的区段，其抑制至少一种PDGFR与至少一种PDGF的结合)。所述拮抗剂中的至少一种不是抗体，或换句话说，所述拮抗剂中的至少一种是细胞外陷阱段。优选地，双重拮抗剂包括抗体拮抗剂和一种细胞外陷阱段拮抗剂。在这种双重拮抗剂中，优选将细胞外陷阱段任选地通过接头与抗体重链的N末端融合。抗体轻链以与天然抗体中类似的方式与抗体重链形成复合体。这种双重拮抗剂优选以缀合物的形式提供，该缀合物具有与双重拮抗剂缀合的半衰期延长部分。优选地，已引入拮抗剂中的半胱氨酸残基用于进行缀合。更优选地，半胱氨酸残基位于IgG1重链的位置347或位置443。优选半衰期延长部分是两性离子聚合物。最优选地，两性离子聚合物是含磷酰胆碱的聚合物。

血管生成是新血管产生的过程，在发育(从胚胎到成人)和伤口愈合(损伤或受损的组织恢复血流)中起关键作用。然而，当血管生成失调时，其促成许多病症的病理，包括癌症、牛皮癣、关节炎和失明(Carmeliet P.2003.Angiogenesis in health anddisease.Nature Med 9(6):653-660)。

异常血管生成与湿性年龄相关性黄斑变性(老年人失明的主要原因)和癌症相关。血管生成的特征在于增生的内皮细胞和基质细胞的增加以及形态改变的脉管***的增加(一般参见Folkman J.2007.Angiogenesis:an organizing principle for drugdiscovery？.Nat Rev Drug 6:273-286and Baluk P，Hashizume H，McDonaldDM.2005.Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer.CurrOpin Genet Dev.15:102-111)。

如上所述，新血管形成(NV)是在发育和伤口愈合中发生的正常过程，但是当血管生成失调并且发生在与肿瘤(癌症)相关的组织、无血管角膜或视网膜下空间(湿性AMD)中时，新血管形成变成病理性的。NV血管的增殖、入侵和迁移由生长因子、血管内皮细胞、细胞外基质分子、趋化因子和细胞信号分子之间的复杂相互作用控制。

NV组织由内皮细胞(EC)、周细胞和炎性细胞(例如巨噬细胞)组成。周细胞通过从肥大细胞分化衍生。新血管形成的过程首先涉及由EC组成的血管生成芽从现有毛细血管形成至无血管空间中。VEGF信号传导被理解为该NV过程的主开关。在这方面，VEGF已经定位在引导血管生成芽的尖端细胞丝状伪足中。

在芽形成之后，新形成的血管外面被周细胞覆盖，导致NV的成熟。NV的周细胞覆盖层(coating)通过信号传导在物理上稳定并支持NV，包括VEGF的周细胞产生(Armulik A，Abramsson A，Betsholtz C.2005.Endothelial/Pericyte Interactions.Circ Res.97:512-523)。

批准的湿性AMD疗法都是针对VEGF信号传导的抑制。这些疗法包括2004年批准的哌加他尼(pegaptanib，)、2004年批准的用于癌症的Genentech的贝伐单抗2006年批准的Genentech的兰尼单抗和2011年批准的Regeneron的阿柏西普(aflibercept，)。哌加他尼是一种基于适体的治疗剂，但与基于蛋白质的治疗剂相比，其市场有限，这可能是由于对患者视敏度的增加有限。贝伐单抗是批准用于癌症治疗的抗VEGFA IgG1抗体，但在核准标示外被广泛用于治疗AMD。兰尼单抗是由贝伐单抗亲和力成熟的Fab并被批准用于AMD。然而，使用更便宜的贝伐单抗显著削减了兰尼单抗的市场。最后，阿柏西普是VEGF捕获剂(trap)，使用可溶性受体片段诱饵(decoy)。

抗VEGF单一疗法未导致病理性NV的疾病缓解性退化(Brown DM，Kaiser PK，Michels M，et al.2006.ANCHOR Study Group.Ranibizumab versus verteporfin forneovascular age-related macular degeneration.N Engl J Med 355(14):1432-1444；Rosenfeld PJ，Brown DM，Heier JS，et al.2006.MARINA study group.Ranibizumab forneovascular age-related macular degeneration.N Engl J Med 355(14):1419-1431；Regillo CD，Brown DM，Abraham P，et al.2008.Randomized，double-masked，sham0controlloed trial of ranibizumab for neovacular age-related maculardegeneration:PIER study year 1.Am J Ophthalmol.145:239-248)。相反，抗VEGF疗法的大多数疗效或治疗益处归因于其抗通透性(Zebrowski BK，Yano S，Liu W，etal.1999.Vascular endothelial growth factor levels and induction ofpermeability in malignant pleural effusions.Clin Cancer Res 5:3364-3368)。

因为常规抗VEGF治疗不会引起病理性NV的消退，许多患者的视敏度增加非常有限。此外，新血管***也可导致视网膜下纤维化，这是湿性AMD患者失明的原因。

在抗VEGF治疗两年内，在近一半经治疗的眼中发生视网膜下瘢痕形成(Daniel E，Toth CA，Grunwald JE.2014.Risk of scar in the comparison of age-relatedmacular degeneration in clinical settings.Retina 32:1480-1485)。视网膜下纤维化形成可引起黄斑***的永久性功能障碍；这会导致光感受器、视网膜色素上皮和脉络膜血管的破坏(Ishikawa K，Ram K，Hinton DR.2015.Molecular mechanisms of subretinalfibrosis in age-related macular degeneration.Eye Res.Mar 13，2015Epub 1-7)。尽管抗VEGF治疗通常稳定或改善视敏度，但瘢痕形成已被鉴定为治疗后视敏度丧失的原因之一(Cohen SY，Oubraham H，Uzzan J，et al.2012.Causes of unsuccessful ranibizumabtreatment in exudative age-related macular degeneration in clinicalsettings.Retina 32:1480-1485)。

促血管生成因子通常在病理性血管生成中上调，包括血管内皮生长因子(VEGF)家族的两个成员：VEGF-A和胎盘生长因子(PGF)。VEGF-A和PGF激活休眠的内皮细胞，促进细胞增殖和血管通透性。VEGF-A已被鉴定为湿性AMD中血管渗漏的主要因素(Dvorak HF，NagyJA，Feng D，Brown LF，Dvorak AM.1999.Vascular permeability factor/vascularendothelial growth factor and the significance of microvascularhyperpermeability in angiogenesis.Curr Top Microbiol Immunol.237:97-132)。

血小板衍生生长因子“PDGF”信号传导在NV成熟中起重要作用，特别是在周细胞对NV的覆盖中起重要作用。周细胞对NV内皮细胞的覆盖开始于旁分泌的血小板衍生生长因子B的EC表达，其形成同源二聚体PDGF-BB。PDGF-BB通过硫酸肝素蛋白聚糖高度保留在血管生成芽的尖端细胞中。然后这种PDGF-BB被周细胞结合受体PDGFR-β识别，这引发周细胞随着发展的新血管形成进行增殖和迁移。

还已发现PDGF-DD在病理性血管生成中起核心作用(Kumar10.Platelet-derivedGrowth Factor-DD Targeting Arrests Pathological Angiogenesis by ModulatingGlycogen Synthase Kinase-3βPhosphorylation.J Biol Chem 285(20):15500-15510)。PDGF-DD过表达在血管生成期间诱导血管成熟(Kong D,Wang Z,Sarkar FH,etal.2008.Platelet-Derived Growth Factor-D Overexpression Contributes toEpithelial-Mesenchymal Transition of PC3Prostate Cancer Cells.Stem Cells 26:1425-1435)。PDGF-DD在眼中高度表达(Ray S,Gao C,Wyatt K,et al.2005.Platelet-derived Frowth Factor D,Tissue-specific Expression in the Eye,and a Key Rolein Control of Lens Epithelial Cell Proliferation.J Biol Chem.280:8494-8502)。Kumar等人(2010)发现PDGF-DD表达在病理性血管生成期间上调，并且PDGF-DD信号传导的抑制降低脉络膜和视网膜新生血管形成。

本文所用的术语“PDGF”是指生长因子类别中的任何(i)结合PDGF受体如PDGFR-β或PDGFR-α；(ii)激活与PDGF受体相关的酪氨酸激酶活性；和(iii)从而影响血管生成或血管生成过程的成员。术语“PDGF”通常是指生长因子类别中通过结合和激活响应细胞类型上的血小板衍生生长因子细胞表面受体(即PDGFR)来诱导DNA合成和有丝***的那些成员。PDGF影响特定的生物效应，包括例如：定向细胞迁移(趋化性)和细胞活化；磷脂酶活化；增加的磷脂酰肌醇周转和***素代谢；刺激响应细胞的胶原和胶原酶合成；改变细胞代谢活性，包括基质合成、细胞因子产生和脂蛋白摄取；间接诱导缺乏PDGF受体的细胞中的增殖反应；纤维化和强的血管收缩活性。术语“PDGF”意在包括“PDGF”多肽及其相应的“PDGF”编码基因或核酸。

PDGF家族由PDGF-A(Swiss Protein P04085)、PDGF-B(P01127)、PDGF-C(Q9NRA1)和PDGF-D(Q9GZP0)的二硫键键合的同源二聚体和异源二聚体PDGF-AB组成。各种PDGF同种型通过结合α-酪氨酸激酶受体和β-酪氨酸激酶受体(分别为PDGFR-α(P16234)和PDGFR-β(P09619))发挥其作用。通常参见第5,872,218号美国专利，此专利通过引用并入本文用于所有目的。所述α受体和β受体在结构上相似：两者都具有拥有5个免疫球蛋白(Ig)样结构域的细胞外结构域和具有激酶功能的细胞内结构域。PDGF结合主要通过受体的结构域2和3发生，并引起受体的二聚化。Ig样结构域4参与受体二聚化。受体二聚化是PDGF信号传导的关键组成部分：受体二聚化导致受体自身磷酸化。自身磷酸化转而导致受体的构象变化并激活受体激酶。PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D以不同的亲和力和作用结合两种不同的受体。PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-CC诱导αα受体同源二聚体，PDGF-BB和PDGF-DD诱导ββ同源二聚体，PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-DD产生αβ受体异源二聚体。

在功能方面，PDGFR-α和PDGFR-β似乎具有显著不同的作用。PDGFR-α信号传导涉及原胚肠形成和颅神经嵴、心神经嵴、性腺、肺、肠、皮肤、CNS和骨骼的发育。PDGFR-β信号传导涉及血管形成和早期造血(Andrae J,Radiosa G,Betsholtz C.2008.Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine.Genes Develop 22:1276-1312)。就各种PDGF配体与受体的相互作用而言，PDGF-AA和PDGF-CC仅与PDGFR-α结合并相互作用。PDGF-BB和PDGF-AB与α和β受体结合。PDGF-DD仅与PDGFR-β相互作用(Raica M,Cimpean AM.2010.Platelet-Derived Growth Factor(PDGF)/PDGF Receptors(PDGFR)Axis as Target for Antitumor and Antiangiogenic Therapy.Pharmaceut.3:572-599)。

除非上下文另有说明，提及的PDGF意指任何PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D的任何天然同种型或天然变体或与天然形式有至少90％、95％、98％或99％序列同一性的诱导变体。优选地，这样的PDGF是人PDGF。同样，提及的PDGFR是指PDGFR-A(P16234)或PDGFR-B，包括任何天然同种型或天然变体，或与天然序列有至少90％、95％、98％或99％或100％序列同一性的诱导变体。

人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的氨基酸序列示于图1中，图1显示全长人PDGFR-β(包括前导序列)，其为具有1106个氨基酸的蛋白质。氨基酸1-32是在成熟蛋白中被切除的前导肽的一部分。PDGFR-β具有5个胞外Ig样结构域，即D1-D5(Williams AF,Barclay AN.1988.The immunoglobulin superfamily—domains for cell surfacerecognition.Annu Rev Immunol.6:381-405)。全长胞外区约由氨基酸33延伸至氨基酸532，跨膜结构域约由残基533延伸至残基553，细胞质结构域约由残基554延伸至残基1106。胞外区包括5个免疫球蛋白样结构域D1-D5。通常认为D1结构域为约氨基酸33(Leu)至约氨基酸123(Pro)。根据本发明，D1也可以是氨基酸33-122(Val)。通常认为D2为约氨基酸124(Thr)至约氨基酸213(Ser)。根据本发明，D2可以是氨基酸129(Pro)至氨基酸210(Gln)。通常认为D3为约氨基酸214(Ile)至氨基酸314(Gly)。根据本发明，D3可以是氨基酸214(Ile)至氨基酸309(Thr)。通常认为D4为约氨基酸315(Tyr)至氨基酸416(Pro)。通常认为D5为约氨基酸417(Val)至氨基酸531(Lys)。

D1-D5结构域的确切边界可根据如何进行分析而变化。优选地，边界的变化为9个氨基酸或更少。通常其变化为7个氨基酸或较少，更通常5个氨基酸或更少。通常边界方差为3个氨基酸或更少。最通常地，边界的变化仅为一个氨基酸。每个结构域的基本特征是其结合其同源配体的能力。

“PDGF拮抗剂”或“拮抗PDGF”的分子是部分或完全减少或抑制PDGF的至少一种活性的试剂，该活性包括其特异性结合PDGFR的能力以及随后的细胞反应(如增殖)。PDGF拮抗剂包括特异性结合PDGF或PDGFR的抗体和PDGFR的细胞外陷阱段。

PDGFR-β细胞外受体序列的一个或多个部分可用作PDGF-PDGFR-β信号传导的拮抗剂。术语细胞外陷阱段是指来自不同PDGF受体的全长胞外区或其任何部分或部分的组合，所述全长胞外区或其任何部分或部分的组合能够拮抗PDGF-PDGFR-β信号传导。这些部分通常不使用PDGFR的跨膜序列和胞内序列，因此被称为可溶性的。这些部分通过作为同源PDGF的陷阱或诱饵而发挥拮抗作用。PDGF结合可溶性PDGFR-β区段陷阱且不能结合相应的膜结合受体。优选地，这样的陷阱包括PDGFR-βD1-D5结构域中的一个或多个。优选地，陷阱包含D2和D3中的至少一个。更优选地，陷阱包含D1、D2和D3。更优选地，陷阱是对应于图8的氨基酸33-314的连续区段，其含有D1-D3。PDGFR-α同样包括D1至D5结构域，并且并入PDGFR-α的相应结构域的细胞外陷阱段同样可以用于代替PDGFR-β。

抗体还可以用作PDGFR-β的拮抗剂，其包括结合受体的抗体(例如2A1E2[美国第7,060,271号专利]；HuM4Ts.22[美国第5,882,644号专利]；或1B3或2C5[美国第7,740,850号专利])和抗-PDGF抗体(例如抗-PDGFBB、抗-PDGF-DD、抗-PDGF-BB和抗-PDGF-AB)。

“VEGF”或“血管内皮生长因子”是影响血管生成或血管生成过程的人血管内皮生长因子。特别地，术语VEGF是指生长因子类别中(i)结合VEGF受体例如VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)或VEGFR-3(FLT-4)；(ii)激活与VEGF受体相关的酪氨酸激酶活性；和(iii)从而影响血管生成或血管生成过程的任何成员。

VEGF家族的因子由以下五种相关糖蛋白组成：VEGF-A(也称为VPE)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PGF(胎盘生长因子)。其中，VEGF-A是研究最充分的，并且是抗血管生成治疗的靶标(Ferrara et al，(2003)Nat.Med.9:669-676)。VEGF-A作为许多通过选择性剪接和蛋白水解产生的一些同种型存在：VEGF-A₂₀₆、VEGF-A₁₈₉、VEGF-A₁₆₅和VEGF-A₁₂₁。同种型在结合肝素和称为神经纤毛蛋白(neuropilins)的非信号结合蛋白的能力方面有所不同。同种型作为二聚体均具有生物活性。

VEGF的各种作用由VEGF(例如VEGF-A(P15692)、VEGF-B(P49766)、VEGF-C(P49767)和VEGF-D(Q43915))与受体酪氨酸激酶(RTK)的结合介导。VEGF家族受体属于V类RTK，且每种受体在细胞外结构域(ECD)中携带七个Ig样结构域。在人中，VEGF结合三种类型的RTK：VEGFR-1(Flt-1)(P17948)、VEGFR-2(KDR，Flk-1)(P935968)和VEGFR-3(Flt-4)(P35916)。图2中显示了VEGFR-1的序列。除非上下文中另有说明，否则提及的VEGF意指VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PGF中的任一种的任何天然同种型或天然变体或与天然形式具有至少90％、95％、98％或99％或100％序列同一性的诱导变体。优选地，这样的VEGF是人VEGF。同样提及的VEGFR是指VEGFR-1、VEGFR-2或VEGFR-3的任一种，包括任何天然同种型或天然变体，或与天然序列具有至少90％、95％、98％或99％或100％序列同一性的诱导变体。

胞外区约由氨基酸27延伸至氨基酸758，跨膜结构域约由氨基酸759延伸至氨基酸780，胞内区约为氨基酸781-1338。胞外区包括7个免疫球蛋白样结构域，即D1-D7。VEGFR-1的结构域1为氨基酸32(P)-128(I)，结构域2为氨基酸134(P)-125(Q)，结构域3为氨基酸232(V)-331(K)，结构域4为氨基酸333(F)-428(P)，结构域5为氨基酸431(Y)-553(T)，结构域6为氨基酸558(G)-656(R)，结构域7为氨基酸662(Y)-751(T)。一般参见美国第8,273,353号专利，该专利通过引用并入本文用于所有目的。VEGFR-1的D1-D7结构域的确切边界可以根据如何进行分析而变化。优选地，边界变化9个氨基酸或更少。通常其变化7个氨基酸或更少，更通常变化5个氨基酸或更少。通常，边界方差为3个氨基酸或更少。最通常地，边界变化仅为一个氨基酸。

VEGFR-2的蛋白质序列显示于图3中。

胞外区约由残基20延伸至残基764，跨膜结构域约由残基765延伸至残基785，细胞内结构域约由残基786延伸至残基1356。胞外区包括7个免疫球蛋白样结构域，即D1-D7。VEGFR-2的结构域1为氨基酸32(P)-118(V)，结构域2为氨基酸124(P)-220(G)，结构域3为氨基酸226(V)-327(K)，结构域4为氨基酸329(F)-421(P)，结构域5为氨基酸424(G)-548(T)，结构域6为氨基酸553(I)-662(L)，结构域7为氨基酸668(T)-757(A)。一般参见美国第8,273,353号专利，其通过引用并入本文用于所有目的。VEGFR-2的D1-D7结构域的确切边界可以根据如何进行分析而变化。优选地，边界变化9个氨基酸或更少。通常其变化7个氨基酸或更少，更通常变化5个氨基酸或更少。通常，边界方差为3个氨基酸或更少。最通常地，边界仅变化一个氨基酸。

VEGFR-3的蛋白质序列显示在图4中。胞外区约由残基25延伸至残基775，跨膜结构域约由残基776延伸至残基796，细胞内结构域约由残基797延伸至残基1363。细胞外结构域包括七个免疫球蛋白样结构域，即D1-D7。VEGFR-3的结构域1为氨基酸30(P)-132(V)，结构域2为氨基酸138(P)-226(G)，结构域3为氨基酸232(I)-330(N)，结构域4为氨基酸332(F)-422(P)，结构域5为氨基酸425(H)-552(T)，结构域6为氨基酸557(G)-673(Q)，结构域7为氨基酸679(R)-768(S)。一般参见美国第8,273,353号专利，该专利通过引用并入本文用于所有目的。VEGFR-3的D1-D7结构域的确切边界可以根据如何进行分析而变化。优选地，边界变化9个氨基酸或更少。通常其变化7个氨基酸或更少，更通常5个氨基酸或更少。通常，边界方差为3个氨基酸或更少。最通常地，边界仅变化一个氨基酸。

VEGFR-2主要在血管内皮细胞上表达。VEGFR-1也在血管内皮上表达，但另外其还被许多其它细胞类型表达：嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、壁细胞和内皮祖细胞。VEGFR-1对VEGF-A的亲和力高于VEGFR-2。然而，当VEGFR-1在内皮细胞中结合VEGF-A时，VEGFR-1仅表现出非常弱的酪氨酸磷酸化。因此，认为VEGF-A(包括其各种同种型)对血管内皮的作用由VEGF-A与VEGFR-2的结合介导。

PGF和VEGF-B仅结合VEGFR-1。PGF和VEGF-B与致病性血管重塑有关联(CarmelietP,Moons L,Lutten A,et al.2001.)。血管内皮生长因子和胎盘生长因子之间的协同作用促进病理状况中的血管生成和血浆外渗(Nat Med.7(5)；575-583)。VEGF-C和VEGF-D以高亲和力结合VEGFR-3，VEGFR-3主要发现于成人淋巴内皮细胞上。VEGF-C和VEGF-D被认为在***生成中起作用。

“VEGF拮抗剂”或“拮抗VEGF”的分子是部分或完全减少或抑制VEGF活性的试剂，该活性包括其特异性结合其受体(VEGFR)的能力和随后的细胞应答(例如血管发生和细胞增殖)。VEGF拮抗剂包括特异性结合VEGF或VEGFR的抗体或VEGFR细胞外陷阱段。

术语细胞外陷阱段是指可以拮抗至少一种VEGF和VEGFR之间的信号传导的来自不同VEGFR受体的全长胞外区或其任何部分或部分的组合。优选地，细胞外陷阱段包括上文定义的VEGFR-1、VEGFR-2或VEGFR-3之一的至少一个结构域，更优选至少两个连续结构域，例如D2和D3。任选地，细胞外结构域包括来自至少两种不同VEGFR的至少一个如上定义的结构域。优选的细胞外结构域包含或基本上由VEGFR-1的D2和VEGFR-2的D3组成。

VEGF拮抗剂疗法已被批准用于治疗某些癌症和湿性AMD。贝伐单抗(Genentech/Roche)是结合并中和人VEGF(特别是VEGF-A的所有同种型和VEGF-A的生物活性蛋白水解片段的人源化小鼠单克隆抗体(参见例如Ferrara N，Hillan KJ，Gerber HP，Novotny W.2004.Discovery and development of bevacizumab，an anti-VEGF antibodyfor treating cancer.Nat Rev Drug Discov.3(5):391-400)。贝伐单抗已被批准用于治疗某些癌症。贝伐单抗(DrugBank DB00112)的重链和轻链的蛋白质序列显示在图5中，其中CDR有下划线(也参见SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5)。

贝伐单抗可变轻链CDR为CDR_L1:SASQDISNYLN、CDR_L2:FTSSLHS和CDR_L3:QQYSTVPWT。贝伐单抗可变重链CDR为CDR_H1:GYTFTNYGMN、CDR_H2:WINTYTGEPTYAADFKR和CDR_H3:YPHYYGSSHWYFDV。CDR由Kabat定义，除了CDR_H1为Kabat/Chothia混合定义。

衍生自与贝伐单抗相同的小鼠单克隆抗体的另一抗VEGF分子已被批准用于湿性AMD的治疗：兰尼单抗((Genentech/Roche)。兰尼单抗是抗体片段或Fab。兰尼单抗通过贝伐单抗的可变重链和可变轻链的亲和力成熟制备。兰尼单抗的重链和轻链的序列显示于(如Novartis公布的)图6中(也参见SEQ ID NO.12和13)：

兰尼单抗可变轻链CDR为CDR_L1:SASQDISNYLN、CDR_L2:FTSSLHS和CDR_L3:QQYSTVPWT。兰尼单抗可变重链CDR为CDR_H1:GYDFTHYGMN、CDR_H2:WINTYTGEPTYAADFKR和CDR_H3:YPYYYGTSHWYFDV。

也可以使用与贝伐单抗竞争结合VEGF-A或与贝伐单抗结合VEGF-A上的相同表位的抗体。

另一种抗VEGF疗法是VEGF陷阱(VEGF Trap)。例如，阿柏西普(Regeneron)由VEGFR-1的第二Ig样结构域和表达为与人IgG1的恒定区(Fc)直线融合的VEGFR-2的第三Ig样结构域组成(Papadopoulos N,et al.2012.Binding andneutralization of vascular endothelial growth factor(VEGF)and related ligandsby VEGF Trap,ranibizumab and bevacizumab.Angiogenesis 15:171-185)。理论上，阿柏西普不仅结合VEGF-A，而且结合VEGF-B和PGF，从而拮抗它们与VEGFR-1的相互作用。

根据本发明，提供了包含与PDGF拮抗剂连接的VEGF拮抗剂的VEGF/PDGF双重拮抗剂。该连接优选包括蛋白链的融合以形成由两种拮抗剂的组分形成的杂交链。或者，组分可通过化学交联连接。作为融合连接的实例，如果双重拮抗剂由抗体和细胞外陷阱段形成，则抗体的重链或轻链可以与细胞外陷阱段融合。优选地，细胞外陷阱区段经由接头直接或间接融合到抗体重链或轻链的N-末端。不与细胞外陷阱段融合的那条链可以与链以类似于天然抗体中重链轻链缔合的方式连接。例如，示例性形式具有通过接头与抗体重链的N末端融合的细胞外陷阱段和与抗体重链形成复合体的抗体轻链。这种双重拮抗剂中的抗体可以是完整抗体或上述任何结合片段，例如Fab片段。优选地，在这样的双重拮抗剂中，VEGF拮抗剂是VEGF-A的抗体，例如贝伐单抗或兰尼单抗，并且PDGF拮抗剂为来自PDGR-1的细胞外陷阱段。

在替代形式中，VEGF拮抗剂和PDGF拮抗剂都是细胞外陷阱段。两个区段可以相对于彼此在任一取向上直接或通过接头融合。也就是说，VEGFR细胞外陷阱区可连接至PDGFR细胞外陷阱区的N末端或C末端。这种融合蛋白的C末端可以连接到抗体的Fc区，形成Fc融合蛋白。

在优选的实施方案中，PDGFR为PDGFR-β，且细胞外陷阱段包含PDGFR-β的D1-D5结构域中的一个或多个。更优选地，细胞外陷阱段包含PDGFR-β的D1-D3结构域。更加优选地，细胞外陷阱段包含SEQ ID NO.11的氨基酸33-314或由其组成。在优选的实施方案中，VEGF拮抗剂为抗VEGF的抗体，优选抗VEGF-A的抗体。

在具有彼此融合的抗体和细胞外陷阱组分的双重拮抗剂中，各组分(通常是抗体重链和细胞外陷阱段)被接头序列分开。接头优选为GGGGSGGGGS、GG或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG或这些中任何一个的寡聚体。更优选地，接头为GGGGSGGGGS。

根据本发明的一个方面，抗VEGF-A的抗体重链具有至少以下CDR序列：CDR_H1:GYDFTHYGMN、CDR_H2:WINTYTGEPTYAADFKR和CDR_H3:YPYYYGTSHWYFDV。优选地，VEGF-A抗体轻链具有至少以下CDR：CDR_L1:SASQDISNYLN、CDR_L2:FTSSLHS和CDR_L3:QQYSTVPWT。在抗VEGF-A的抗体重链的情况下，优选其同种型是IgG1并且具有CH₁结构域、铰链结构域、CH₂结构域和CH₃结构域。还优选轻链同种型是κ。优选的IgG1序列的恒定区如SEQ ID NO.17所示。轻链恒定区的序列优选如SEQ ID NO.18所示。

抗VEGF-A的抗体的IgG1结构域优选具有一个或多个突变以减弱或降低效应子功能。用于效应子功能减弱突变的优选氨基酸包括(EU编号)E233P、L234V、L235、G236、G237、delG236、D270A、K322A、A327G、P329A、A330、A330S、P331S、and P331A，其中第二个提到的氨基酸为该突变。优选地，突变包括以下的一个或多个：E233P、L234V、L234A、L235A、G237A、A327G、A330S和P331S(EU编号)。更优选地，VEGF-A抗体重链具有以下突变：L234A、L235A和G237A。相对于天然人IgG1序列的这种突变的数目不超过10，并且优选不超过5、4、3、2或1。

或者，IgG结构域可以是IgG2、IgG3或IgG4，优选人IgG2、IgG3或IgG4，或其中恒定区由多于一种这些同种型形成的复合物(例如IgG2或IgG4的CH1区，IgG1的铰链、CH2和CH3区)。这样的结构域可含有在所提及的IgG1的一个或多个EU位置上的突变以减弱效应子功能。人IgG2和IgG4相对于人IgG1和IgG3具有减弱的效应子功能。

VEGF-A抗体重链还可以含有通过重组DNA技术作为突变添加的半胱氨酸残基，其可以用于缀合半衰期延长部分。优选地，突变为(EU编号)Q347C和/或L443C。更优选地，突变为L443C。优选地，双重拮抗剂与聚合物的化学计量为1:1；换句话说，缀合物基本上由分子组成，每个分子包含与一分子的聚合物缀合的一分子的双重拮抗剂。

包含VEGF-A抗体和PDGFR细胞外陷阱段的优选的双重拮抗剂包括具有SEQ IDNO.9的氨基酸序列的、抗体重链与PDGFR细胞外陷阱段的融合蛋白以及具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列的抗体轻链，或其变体，该变体包括与SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10各自的不同之处不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸的序列。

在本发明的另一方面，提供了VEGF/PDGF双重拮抗剂，其具有由如上所述的PDGFR的一个或多个区段构成的PDGF拮抗剂和由抗VEGF Fab片段组成的VEGF拮抗剂。对于本发明的这个方面，PDGFR细胞外陷阱包含PDGFR-β的D1-D5结构域中的一个或多个。更优选地，PDGFR陷阱由PDGFR-β的D1-D3结构域构成。更优选地，PDGFR陷阱为SEQ ID NO.11的氨基酸33-314。

PDGFR陷阱优选位于Fab重链或轻链的C末端。PDGFR陷阱也优先位于Fab重链或轻链的N-末端。优选地，双重拮抗剂包括通过接头与PDGFR细胞外陷阱段融合的VEGF-A抗体Fab片段重链以及VEGF-A抗体轻链。

在本发明的另一方面，提供了VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中细胞外陷阱段与PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD中的一种或多种结合。优选地，细胞外陷阱结合PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-DD。更优选地，细胞外陷阱抑制PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-DD与PDGFR-αα、PDGFR-αβ和PDGFR-ββ受体中的任一种结合。

接头优选位于PDGFR陷阱和抗VEGF Fab片段重链之间。优选地，接头选自GGGGSGGGGS、GG和GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG，以及这些中任何一个的寡聚体。更优选地，接头为GGGGSGGGGS。

抗VEGF Fab片段重链优选具有至少以下CDR：CDR_H1:GYDFTHYGMN、CDR_H2:WINTYTGEPTYAADFKR和CDR_H3:YPYYYGTSHWYFDV。VEGF-A抗体轻链优选具有至少以下CDR：CDR_L1:SASQDISNYLN、CDR_L2:FTSSLHS和CDR_L3:QQYSTVPWT。

优选的抗VEGF Fab片段重链同种型为IgG1且包含CH₁结构域，并且轻链同种型是κ。

VEGF/PDGF双重拮抗剂可以具有连接的半衰期延长部分。优选地，半衰期延长部分是两性离子聚合物，但是也可以使用下面讨论的PEG或其它半衰期延长剂。更优选地，两性离子聚合物由具有磷酰胆碱基团的单体形成。优选地，单体为2-(丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯。更优选地，单体是2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯(HEMA-PC)。

与双重拮抗剂缀合的聚合物优选具有至少2条、更优选3条或更多条臂。一些聚合物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12条臂。更优选地，聚合物具有3、6或9条臂。最优选地，聚合物具有9条臂。优选地，聚合物的峰值分子量在300,000Da和1,750,000Da之间。更优选地，聚合物的峰值分子量在500,000Da和1,000,000Da之间。更优选地，聚合物的峰值分子量在600,000Da和800,000Da之间。

聚合物可以通过缀合与双重拮抗剂共价键合。优选地，聚合物通过诸如氨基、羟基、巯基或羧基的基团与VEGF/PDGF双重拮抗剂缀合。巯基可以来自天然存在的半胱氨酸残基。巯基也可以来自通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基。

在本发明的优选方面，聚合物与SEQ ID NO.9的第731位上或本文公开的SEQ IDNO:9的任何变体的对齐位置上的半胱氨酸残基缀合。

在本发明的另一方面，VEGF/PDGF双重拮抗剂具有含有一个或多个VEGFR的细胞外区段(例如VEGFR-1、VEGFR-2或VEGFR-3)的、与抗PDGF抗体或Fab片段重链或轻链融合的VEGFR陷阱，以及未包含在融合物中的抗PDGF抗体或Fab片段重链或轻链。

根据本发明的一个方面，VEGFR的细胞外区段优选为D1-D7结构域中的一个或多个。更优选地，细胞外区段包含来自VEGFR-1的D2和来自VEGFR-2的D3。更优选地，D2连接D3的N末端，并且还包含结构域之间的接头。

在本发明的这方面的优选实施方案中，PDGF拮抗剂是抗体。更优选地，抗体选自人源化2A1E2、HuM4Ts.22、人源化1B3、人源化2C5、抗-PDGF-BB、抗-PDGF-DD、抗-PDGF-BB和抗-PDGF-AB。PDGF拮抗剂也优选为Fab片段。

根据本发明的这个方面，抗体重链优选为IgG1，更优选为人IgG1，轻链优选为κ，人κ。重链可以具有通过重组DNA技术添加的半胱氨酸。优选地，半胱氨酸选自Q347C和L443C。优选地，存在与半胱氨酸缀合的半衰期延长部分。

优选地，半衰期延长部分为具有一种或多种单体单元的两性离子聚合物，并且其中至少一种单体单元具有两性离子基团。优选地，两性离子基团是磷酰胆碱。单体优选为2-(丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯。更优选地，单体是2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯(HEMA-PC)。

根据本发明的这个方面，聚合物优选具有至少2条、更优选3条或更多条臂。一些聚合物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12条臂。更优选地，聚合物具有3、6或9条臂。最优选地，聚合物具有9条臂。根据本发明的一个方面，聚合物的峰值分子量在300,000Da和1,750,000Da之间。更优选地，聚合物的峰值分子量在500,000Da和1,000,000Da之间。更优选地，聚合物的峰值分子量在600,000Da和800,000Da之间。

根据本发明的一个方面，聚合物可以通过缀合与聚合物共价键合。优选地，聚合物通过选自氨基、羟基、巯基或羧基的基团与VEGF/PDGF双重拮抗剂缀合。优选地，巯基可以来自天然存在的半胱氨酸残基。在其他优选的实施方案种，巯基也可以来自通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基。

在本发明的优选方面，如针对其它双重拮抗剂所讨论的，将PDGF陷阱-VEGF陷阱缀合至半衰期延长部分。

优选地，半衰期延长部分为具有一种或多种单体单元的两性离子聚合物，并且其中至少一种单体单元具有两性离子基团。优选地，两性离子基团是磷酰胆碱。单体优选为2-(丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯。更优选地，单体是2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯(HEMA-PC)。

根据本发明的这个方面，聚合物优选具有至少2条、更优选3条或更多条臂。一些聚合物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12条臂。更优选地，聚合物具有3、6或9条臂。最优选地，聚合物具有9条臂。根据本发明的一个方面，聚合物的峰值分子量在300,000Da和1,750,000Da之间。更优选地，聚合物的峰值分子量在500,000Da和1,000,000Da之间。更优选地，聚合物的峰值分子量在600,000Da和800,000Da之间。

根据本发明的一个方面，聚合物通过缀合与聚合物共价结合。优选地，聚合物通过诸如氨基、羟基、巯基或羧基的基团与VEGF/PDGF双重拮抗剂缀合。在一些缀合物中，巯基来自天然存在的半胱氨酸残基。在一些缀合物中，巯基来自通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基。

PDGF/VEGF双重拮抗剂可以通过重组表达制备，重组表达包括(i)通过遗传工程制备重组DNA，(ii)通过例如(但不限于)转染、电穿孔或显微注射将重组DNA引入原核或真核细胞中，(iii)培养转化细胞，(iv)表达双重拮抗剂，例如组成性表达或诱导表达，和(v)分离双重拮抗剂，例如，从培养基中分离或通过收获转化细胞分离，以(vi)获得纯化的双重拮抗剂。

双重拮抗剂可以通过在合适的原核或真核宿主***中表达来产生，该原核或真核宿主***以产生药理学上可接受的双重拮抗剂分子为特征。真核细胞的实例为哺乳动物细胞，例如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hip和HepG2。其它合适的表达***为原核生物(例如具有pET/BL21表达***的大肠杆菌(E.coli))、酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和/或毕赤酵母(Pichia pastoris)***)和昆虫细胞。

多种载体可用于制备双重拮抗剂，并且选自真核和原核表达载体。用于原核表达的载体的实例包括质粒，例如但不限于preset、pet和pad，其中用于原核表达载体的启动子包括但不限于lac、trc、trp、recA或araBAD中的一种或多种。用于真核表达的载体的实例包括：(i)用于在酵母中表达的载体，例如但不限于pAO、pPIC、pYES或pMET，使用的启动子，例如但不限于AOX1、GAP、GAL1或AUG1；(ii)用于在昆虫细胞中表达的载体，例如但不限于pMT、pAc5、pIB、pMIB或pBAC，使用的启动子，例如但不限于PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64或polh，以及(iii)用于在哺乳动物细胞中表达的载体，例如但不限于pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3或pBPV，以及在一方面衍生自病毒***的载体，病毒***例如但不限于痘苗病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或逆转录病毒，使用的启动子，例如但不限于CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV和β-肌动蛋白。

双重拮抗剂的半衰期可以通过连接“半衰期延长部分”或“半衰期延长基团”来延长，术语“半衰期延长部分”和”半衰期延长基团”在本文中可互换使用，是指被连接到一个或多个氨基酸位点链官能团(如-SH、-OH、-COOH、-CONH₂、-NH₂)或一个或多个N-和/或O-聚糖结构，并且当与蛋白质/肽缀合时可以增加这些蛋白质/肽的体内循环半衰期的一个或多个化学基团。半寿期延长部分的实例包括本文所述的聚合物，特别是两性离子单体的聚合物，例如HEMA-磷酰胆碱、PEG、生物相容性脂肪酸及其衍生物、羟基烷基淀粉(HAS)(例如羟乙基淀粉(HES))、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)(HAP)、透明质酸(HA)、肝素前体(Heparosan)聚合物(HEP)、Fleximer、葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、Fc结构域、转铁蛋白、25白蛋白、弹性蛋白样(ELP)肽、XTEN聚合物、PAS聚合物、PA聚合物、白蛋白结合肽、CTP肽、FcRn结合肽及其任何组合。

在一个实施方案中，半衰期延长部分可以使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯通过蛋白质的游离氨基与双重拮抗剂缀合。旨在与氨基缀合的试剂可以与赖氨酸的ε-氨基、N-末端氨基酸的α-氨基和组氨酸的δ-氨基随机反应。

然而，本发明的双重拮抗剂具有许多可用于聚合物缀合的氨基。因此，聚合物与游离氨基的缀合可能对双重拮抗剂蛋白与VEGF和/或PDGF结合的能力产生负面影响。

在另一个实施方案中，半衰期延长部分使用任何合适的巯基反应性化学反应偶联到一个或多个游离SH基团，该巯基反应性化学反应包括但不限于马来酰亚胺化学反应，或在之前的氧化后聚合物酰肼或聚合物胺与双重拮抗剂的碳水化合物部分的偶联。马来酰亚胺偶联的使用是本发明的特别优选的实施方案。偶联优选发生在天然存在或通过遗传工程引入的半胱氨酸上。

聚合物优选与通过定点诱变引入至双重拮抗剂中的半胱氨酸残基共价连接。特别优选采用在双重拮抗剂的Fc部分中的半胱氨酸残基。对于将半胱氨酸残基引入Fc区的优选位点，参见WO 2013/093809、US 7,521,541、WO 2008/020827、US 8,008,453、US 8,455,622和US2012/0213705，以上专利通过引用并入本文用于所有目的。特别优选的半胱氨酸突变为Q347C和L443C，参见EU编号的人IgG重链。

本发明提供了双重拮抗剂和用作半衰期延长剂的高MV聚合物的缀合物。优选的缀合物包含与两性离子聚合物偶联的双重拮抗剂，其中聚合物由一种或多种单体单元形成，并且其中至少一种单体单元具有两性离子基团。优选地，两性离子基团是磷酰胆碱。

优选地，单体单元之一为2-(丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯或2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯(HEMA-PC)。在其它优选实施方案中，聚合物由单一单体合成，所述单体优选为2-(丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯或2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯。

一些双重拮抗剂缀合物具有2条或更多条、优选3条或更多条聚合物臂，其中单体是HEMA-PC。优选地，缀合物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12条聚合物臂，其中单体是HEMA-PC。更优选地，缀合物具有3、6或9条臂。最优选地，缀合物具有9条臂。

聚合物-双重拮抗剂缀合物优选具有分子量在100,000Da和1,500,000Da之间的聚合物部分。更优选地，缀合物具有分子量在500,000Da和1,000,000Da之间的聚合物部分。更优选地，缀合物具有分子量在600,000Da和800,000Da之间的聚合物部分。最优选地，缀合物具有分子量在600,000Da和850,000Da之间的聚合物部分，并具有9条臂。当给出与聚合物缀合的VEGF/PDGF双重拮抗剂分子量时，分子量将是蛋白质的分子量(包括与其连接的任何碳水化合物部分)和聚合物的分子量的加和。

根据本发明的一个方面，VEGF/PDGF双重拮抗剂具有HEMA-PC聚合物，该HEMA-PC聚合物以Mw计的分子量在约100kDa和1500kDa之间。更优选地，聚合物以Mw计的分子量在约500kDa和1000kDa之间。更优选地，聚合物以Mw计的分子量在约600kDa和约900kDa之间。最优选地，聚合物以Mw计的分子量为750kDa加或减15％。

在本发明的这个方面，聚合物优选由适合ATRP的具有一个或多个聚合物引发位点的引发剂制成。优选地，聚合物引发位点具有2-溴异丁酸酯位点。优选地，引发剂具有3个或更多个聚合物引发位点。更优选地，引发剂具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个聚合物引发位点。更优选地，引发剂具有3、6或9个聚合物引发位点。更优选地，引发剂具有9个聚合物引发位点。最优选地，引发剂为OG1786。

本发明提供了合成两性离子聚合物-双重拮抗剂缀合物的方法，所述缀合物具有一个或多个官能剂(functional agent)和一条或多条聚合物臂，其中每条聚合物臂具有一种或多种单体单元，其中该单元中的至少一种具有两性离子。该方法可以具有以下步骤：

a.提供具有一个或多个用于单体聚合的位点的引发剂和具有胺基的第一接头，其中所述引发剂为三氟乙酸盐；

b.提供一种或多种适于聚合的单体，其中至少一种单体为两性离子；

c.使所述单体与所述引发剂反应以形成一条或多条聚合物臂，每条臂对应于用于单体聚合的位点，以提供包含该具有胺基的第一接头的引发剂-聚合物缀合物；

d.提供具有至少第二反应性基团和第三反应性基团的第二接头；

e.将第二接头的第二反应性基团和第三反应性基团之一偶联到引发剂-聚合物缀合物的第一接头的胺基，以提供具有一个或多个在该偶联步骤中未使用的反应性基团的接头-引发剂-聚合物缀合物；以及

f.将一种或多种官能剂偶联到接头-引发剂-聚合物部分的一个或多个未反应的反应性基团上，以提供聚合物-官能剂缀合物。

在本发明之前，引发剂分子或实体必须含有允许官能剂偶联的可脱保护的官能团。具有保护的马来酰亚胺的这种引发剂的实例如下所示：

在聚合物合成之后，将保护的马来酰亚胺用热脱保护以产生可用于偶联官能剂的马来酰亚胺。如果想要改变马来酰亚胺和聚合物引发位点之间的化学实体的性质，则必须合成一个完整的新引发剂。

每当引发剂以任何方式变化或改变时，将必须开发新的按比例放大的合成程序。引发剂分子性质的每个变化对聚合物合成都具有宽范围的影响。然而，根据本发明，提出了一种方法，其中在聚合物合成后加入缀合基团(例如马来酰亚胺)。这有时被称为“搭接策略(snap-on strategy)”或“通用聚合物策略”。单一引发剂部分可用于大规模聚合物和生物缀合物的发现和开发。因此，可以开发用于按比例放大的最佳聚合物合成的条件。然后通过“搭接”各种类型的接头和功能缀合化学物质，这种聚合物可适用于各种类型的官能剂。

例如，如果需要将较大的官能剂与本发明的聚合物(例如甚至Fab片段的抗体)缀合，则可将较长的接头序列搭接在聚合物上。相比之下，较小的官能剂可能需要相对较短的接头序列。

在所述方法的优选实施方案中，引发剂具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个用于聚合物引发的位点。优选地，引发剂具有3、6或9个用于聚合物引发的位点。

根据本发明的一个方面，第二连接体具有第二、第三、第四、第五和第六反应性基团。更优选地，第二接头仅具有第二和第三反应性基团。

根据本发明的一个方面，每条聚合物臂具有约20个至约2000个单体单元。优选地，每条臂具有约100个至500个单体单元或约500个至1000个单体单元或约1000个至1500个单体单元或约1500个至2000个单体单元。

根据本发明的一个方面，聚合物-官能剂缀合物的峰值分子量为约100,000Da至1,500,000Da。优选地，聚合物-官能化试剂缀合物的峰值分子量为约200,000Da至约300,000Da、约400,000Da至约600,000Da或约650,000Da至约850,000Da。

根据本发明的另一方面，第一接头优选为烷基、取代的烷基、亚烷基、烷氧基、羧基烷基、卤代烷基、环烷基、环烷基醚、烯基、亚烯基、炔基、亚炔基、亚环烷基、杂环烷基、亚杂环烷基、芳基、亚芳基、亚芳基氧基、杂芳基、氨基、酰氨基或其任何组合。更优选地，第一接头具有下式：

其中m为1至10。更优选地，第一接头具有上式并且m为4。

在本发明的其它方面，引发剂优选包括选自以下的结构：

和

其中X选自NCS、F、Cl、Br和I。更优选地，X为Br。

在本发明的优选实施方案中，单体选自以下结构：

其中R7为H或C_1-6烷基，t为1-6。

更优选地，单体选自2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯(HEMA-PC)和2-(丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯。

最优选地，单体为2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯。

第二接头部分优选包含具有以下结构的活化酯：

其中R8选自以下结构：

且R9为：

其中p为1-12。

在本发明的更优选的实施方案中，聚合物具有9条臂，R2的m为2-4，R9为：

且p为4-15。进一步优选地，m为4，p为12。

当聚合物通过半胱氨酸(或其它指定的残基)缀合时，聚合物可以直接或间接地连接到该残基(例如，用介入引发剂，和/或间隔基等)。

双重拮抗剂可与药学上可接受的赋形剂一起掺入药物组合物中。适合口服给药的药物组合物可以作为离散单位存在，例如胶囊、溶液、糖浆或混悬剂(在水性或非水性液体中；或作为可食用泡沫状物或粘稠物(whips)；或作为乳液)。适用于片剂或硬胶囊的赋形剂包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其盐。与软胶囊一起使用的合适的赋形剂包括例如植物油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇等。对于溶液和糖浆的制备，可使用的赋形剂包括例如水、多元醇和糖。对于悬浮液的制备，油(例如植物油)可用于提供水包油悬浮液或油包水悬浮液。

药物组合物可适合于鼻内给药，其中赋形剂为固体，包括具有例如在20-500微米范围内的粒度的粗粉末，其以摄取鼻烟的方式给药，即通过从靠近鼻子的粉末容器经鼻道快速吸入。赋形剂为液体的、用于作为鼻喷雾剂或作为滴鼻剂给药的适合的组合物包括活性成分的水溶液或油溶液。适合于通过吸入给药的药物组合物包括可以通过各种类型的计量剂量加压气溶胶、喷雾器或吹入器产生的细颗粒粉末或薄雾。

适于肠胃外施用的药物组合物包括含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液基本等渗的溶质的水性和非水性无菌注射溶液；和可以包含悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。可用于注射溶液的赋形剂包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，使用前仅需加入携带的无菌液体(例如注射用水)。临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。药物组合物可以是基本上等渗的，意味着渗透压重量摩尔浓度为约250-400mOsm/kg水。

药物组合物可以含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、气味剂、盐(本发明的物质本身可以以药学上可接受的盐的形式提供)、缓冲剂、包衣剂或抗氧化剂。除了本发明的物质之外，它们还可以含有治疗活性剂。本发明的药物组合物可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合使用。这样的赋形剂可以包括但不限于盐水、缓冲盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)、葡萄糖、脂质体、水、甘油、乙醇及其组合。

双重拮抗剂和含有它们的药物组合物可以以有效方案施用用于治疗或预防患者疾病，包括例如通过口服、玻璃体内、静脉内、皮下、肌内、骨内、鼻内、局部、腹膜内、和病灶内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药或其他途径等。在治疗中或作为预防剂，活性剂可作为可注射组合物施用于个体，例如作为无菌水分散液，优选等渗的或基本上等渗的。

对于施用给哺乳动物(特别是人类)，预期活性剂的剂量为0.01mg/kg体重，通常为约1mg/kg。医师可以确定最适合个体的实际剂量，其取决于将个体的年龄、体重、性别和反应、所治疗的疾病或病症以及所治疗个体的年龄和状况包括在内的因素。上述剂量是平均情况的示例。当然，可存在需要更高或更低剂量的情况。

该剂量可以酌情重复(例如，每周、每两周、每月、每季度)。如果发生副作用，可以根据正常的临床实践减少剂量的量和/或频率。在一个实施方案中，药物组合物可以每1天至30天施用一次。

本发明的双重拮抗剂和药物组合物可单独使用或与其它化合物(例如治疗剂化合物或分子，例如抗炎药、镇痛药或抗生素)联合使用。这种与其它化合物的联合给药可以是同时、分开或顺序给药。组分可以以试剂盒的形式制备，试剂盒可以视情况包括说明书。

本文公开的双重拮抗剂和药物组合物可用于治疗或预防疾病，特别是本文所述的眼部疾病或病症。尽管双重拮抗剂内的两种拮抗剂形式被认为有助于如上所述和实施例40中所示的功效，但是本发明的实施不需要了解机制。优选地，双重拮抗剂比单独施用的等摩尔浓度的每种拮抗剂或作为单独分子施用的拮抗剂的1:1组合更有效。

如此使用，通常将缀合物配制为适合以下给药方式并通过以下方式给药：眼部、眼内和/或玻璃体内注射和/或近巩膜注射和/或视网膜下注射和/或眼球筋膜下注射和/或超冠状动脉注射和/或以眼药水和/或软膏的形式局部给药。这样的双重拮抗剂和组合物可以通过多种方法递送，例如作为允许化合物缓慢释放到玻璃体中的装置和/或贮库(depot)进行玻璃体内递送，包括诸如Intraocular Drug Delivery(眼内药物递送)，Jaffe，Ashton，and Pearson，editors，Taylor&Francis(March 2006)的参考文献中描述的那些。在一个实例中，装置可以是在长时间内释放化合物的微泵和/或基质和/或被动扩散***和/或包封细胞(encapsulated cell)的形式(Intraocular Drug Delivery，Jaffe，Ashton，andPearson，editors，Taylor&Francis(March 2006))。

用于眼、眼内或玻璃体内给药的制剂可以通过本领域已知的方法使用本领域已知的成分制备。高效治疗的主要要求是适当渗透眼睛。不同于药物可以局部递送的眼睛前部的疾病，视网膜疾病需要更加位点特异性的方法。滴眼剂和软膏很少渗透到眼后部，并且血眼屏障阻碍全身给药的药物渗透到眼组织中。因此，通常选择的用于治疗视网膜疾病(例如AMD和CNV)的药物递送方法为直接玻璃体内注射。玻璃体内注射通常以取决于患者的状况以及所递送的药物的性质和半衰期的间隔进行重复。

本发明的治疗性双重激动剂和相关缀合物通常置于具有无菌入口的容器中，例如具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。这种组合物也可以以预填充注射器的形式提供。

“稳定的”制剂为其中的蛋白质或与其它半衰期延长部分的聚合物缀合的蛋白质在储存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。“稳定的”还指表现出很少不稳定性迹象(包括聚集和/或脱酰胺)或无不稳定性迹象的制剂。例如，根据本发明的一个方面，当在5-8℃的温度下储存时，本发明提供的制剂可以至少两年保持稳定。

在本领域中可获得用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术，并且在例如以下文献中对其进行了综述：Peptide and Protein Drug Delivery(肽和蛋白质药物递送)，247-301(Vincent Lee ed.，New York，N.Y.，1991)and Jones，1993Adv.Drug DeliveryRev.10:29-90。稳定性可以在选定的温度下测量选定的时间段。稳定制剂的储存优选至少6个月，更优选12个月，更优选12-18个月，更优选2年或更多年。

如果在肉眼检查颜色和/或透明度或通过紫外光散射或尺寸排阻色谱法测量时，没有显示出聚集、沉淀、脱酰胺和/或变性的迹象，则蛋白质(例如抗体或其片段)在药物制剂中“保持其物理稳定性”。

如果给定时间处的化学稳定性使得蛋白质被认为仍然保持其生物活性，则蛋白质在药物制剂中“保持其化学稳定性”。化学稳定性可以通过检测和定量蛋白质的化学改变形式来评价。化学变化可涉及尺寸变化(例如剪切)，其可以使用例如尺寸排阻色谱法、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)进行评价。其它类型的化学改变包括电荷改变(例如，作为脱酰胺的结果而发生)，其可以通过例如离子交换色谱法评价。如果，例如在抗原结合测定中测定的，抗体在给定时间处的生物活性在药物制剂制备时显示的生物活性的约10％以内(在测定的误差内)，则抗体在药物制剂中“保留其生物活性”。

蛋白质-聚合物缀合物“保持其化学稳定性”，蛋白质和聚合物之间的化学键保持完整，例如其不被水解或不以其它方式被破坏。缀合物的蛋白质部分保持其如上所述的化学稳定性。

“等渗”是指关注的制剂具有与人血液或用于玻璃体内注射的玻璃体基本上相同的渗透压。等渗制剂通常具有约250-400mOsm的渗透压。等渗性可以使用例如蒸汽压或冰冻型渗压计测量。

如本文所用，“缓冲液”是指通过其酸-碱共轭组分的作用抵抗pH变化的缓冲溶液。本发明的缓冲液的pH优选在约3.0至约8.0的范围内；例如约4.5至8，或约pH6至约7.5，或约6.0至约7.0，或约6.5-7.0，或约pH7.0至约7.5，或约7.1至约7.4。还涵盖上述范围之间的任何点的pH。

“PBS”磷酸盐缓冲盐水、基于Tris的缓冲液和基于组氨酸的缓冲液是本发明的双重拮抗剂的特别优选的缓冲液。在OG1448的情况下，PBS是特别优选的。更优选地，在OG1448的情况下，PBS缓冲液的pH为7-8，OG1448的浓度为约10mg/ml至约100mg/ml。更优选地，OG1448浓度为约25mg/ml至约65mg/ml，pH为约7.4。在本发明的最优选的实施方案中，OG1448的浓度为50mg/ml至60mg/ml。

在本发明的优选实施方案中，PBS缓冲液至少由Na₂HPO₄、KH₂PO₄和NaCl组成，进行调节以提供合适的pH。在本发明的特别优选的实施方案中，缓冲液可以含有其它药物赋形剂例如KCl和其它盐、洗涤剂和/或防腐剂以提供稳定的储存溶液。

“防腐剂”是可以包括在制剂中以基本上减少其中的细菌作用从而便于例如多用途制剂的生产的化合物。潜在的防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基为长链化合物)和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳香醇如苯酚、丁醇基和苄基醇、对羟基苯甲酸烷基酯(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚。

根据本发明的一个方面，人类使用安全或动物试验安全的本发明的PDGF/VEGF双重拮抗剂必须具有足够低水平的内毒素。“内毒素”是来自革兰氏阴性细菌的细胞膜的脂多糖(LPS)。内毒素由共价连接到疏水脂质部分(脂质A)的亲水多糖部分组成(Raetz CR，Ulevitch RJ，Wright SD，Sibley CH，Ding A，Nathan CF.1991.Gram-negativeendotoxin:an extraordinary lipid with profound effects on eukaryotic signaltransduction.FASEB J.5(12):2652-2660)。脂质A负责内毒素的大多数生物活性，即其毒性。在细菌细胞死亡时以及在生长和***期间内毒素大量流出。它们是高度热稳定的，并且在常规灭菌条件下不被破坏。必须使用热或pH极限处理，例如180-250℃和超过0.1M的酸或碱(Petsch D，Anspach F.2000.Endotoxin removal from protein solutions.JBiotechnol.76:97-119)。这种条件当然会对生物药物非常不利。

在生物技术和制药工业中，可以在生产过程和最终产品中找到内毒素。由于细菌可以在营养不良的培养基(包括水、盐水和缓冲液)中生长，内毒素是普遍的，除非采取预防措施。内毒素注射到动物或人体引起各种各样的病理生理效应，包括内毒素休克、组织损伤甚至死亡(Ogikubo Y,Ogikubo Y,Norimatsu M,Noda K,Takahashi J,Inotsume M,Tsuchiya M,Tamura Y.2004.Evaluation of the bacterial endotoxin test forquantifications of endotoxin contamination of porcine vaccines.Biologics 32:88-93)。

在以低浓度(1ng/mL)静脉内注射内毒素后，在哺乳动物中诱发热原反应和休克(Fiske JM,Ross A,VanDerMeid RK,McMichael JC,Arumugham.2001.Method forreducing endotoxin in Moraxella catarrhalis UspA2protein preparations.J ChromB.753:269-278)。所有药典将药物和生物制品的静脉内应用的内毒素的最大水平设定为每小时每kg体重5个内毒素单位(EU)(Daneshiam M,Guenther A,Wendel A,Hartung T,VonAulock S.2006.In vitro pyrogen test for toxic or immunomodulatory drugs.JImmunol Method 313:169-175)。EU是内毒素的生物活性的量度。例如，100pg的标准内毒素EC-5和120pg来自大肠杆菌O111:B4的内毒素具有1EU的活性(Hirayama C,SakataM.2002.Chromatographic removal of endotoxin from protein solutions by polymerparticles.J Chrom B 781:419-432)。达到该阈值水平在生物研究和制药工业中一直是一个挑战(Berthold W,Walter J.1994.Protein Purification:Aspects of Processes forPharmaceutical Products.Biologicals 22:135-150；Petsch D,AnspachFB.2000.Endotoxin removal from protein solutions.J Biotech 76:97-119)。

在将要通过玻璃体内注射递送的药物中内毒素的存在受到特别的关注。在1945年，药物(青霉素)的玻璃体内注射首次由Rycroft进行(Rycroft.RycroftBW.1945.Penicillin and the control of deep intra-ocular infection.British JOphthalmol 29(2):57-87)。玻璃体是一个的室，高水平的药物可引入其中并维持相对长的时间段。通过玻璃体内注射可获得的药物浓度远远超过可以通过局部给药或通过全身给药(例如静脉内给药)产生的浓度。

可能由玻璃体内注射引起的最危险的并发症之一是眼内炎。眼内炎分为两类：感染性眼内炎和无菌性眼内炎。传染性眼内炎通常由细菌、真菌或寄生虫引起。感染性眼内炎的症状包括严重的疼痛、视力丧失以及结膜和下面的巩膜外层发红。传染性眼内炎需要紧急诊断和治疗。在一些情况下可能的治疗包括玻璃体内注射抗生素和平坦部玻璃体切除术。可能需要眼球摘除术以除去失明和疼痛的眼睛(参见，例如Christy NE，SommerA.1979.Antibiotic prophylaxis of postoperative endophthalmitis.Ann Ophthalmol11(8):1261–1265)。

相反，无菌性眼内炎不涉及传染原，并且可以定义为玻璃体腔的急性眼内炎症，其不需要玻璃体内抗生素和/或玻璃体视网膜手术即可消退。如果已经进行了玻璃体微生物学研究，则需要证明为阴性培养物以维持无菌性眼内炎的诊断(Marticorena J，Romano V，Gomez-Ulla F.2012“Sterile Endophthalmitis after Intravitreal Injections”MedInflam.928123)。

已经观察到玻璃体内注射被内毒素污染的生物药物可导致无菌性眼内炎(Marticorena等)。贝伐单抗(阿瓦斯汀)被美国食品和药物管理局批准用于治疗成胶质细胞瘤、转移性结肠直肠癌、晚期非鳞状非小细胞肺癌和转移性肾癌。贝伐单抗也在核准标示外广泛用于湿性AMD的治疗。制造商提供的贝伐单抗为100mg/4ml。该溶液不能直接用于玻璃体内注射，必须由药剂师配制。已经观察到一些无菌性眼内炎并且理论上认为是由配制药剂师无意造成内毒素对贝伐单抗的污染引起的。

鉴于玻璃体内注射内毒素的可怕的临床结果，可以通过玻璃体内给药给予患者的内毒素的总量是非常有限的。根据本发明的一个方面，提供了具有根据本发明的VEGF/PDGF双重拮抗剂的溶液，其具有不超过5.0EU/ml的内毒素水平。更优选地，内毒素水平不超过1.0EU/ml。更优选地，内毒素水平不超过0.5EU/ml。更加优选地，内毒素水平不超过0.2EU/ml。在更优选的实施方案中，内毒素水平不超过0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02或0.01EU/ml。

两种常用的FDA批准的用于内毒素存在的测试为兔热原测试和鲎变形细胞溶解物(LAL)测定(Hoffman S,et al.2005.International validation of novel pyrogentests based on human monocytoid cells J.Immunol.Methods 298:161-173；Ding JL,Ho BA.2001.New era in pyrogen testing.Biotech.19:277-281)。兔热原测试在20世纪20年代开发，包括监测注射有测试溶液的兔子的体温升高。然而，由于花费和长的周转时间，几年来兔热原测试的使用已经大大减少。更常见的是LAL测试。LAL来自暴露于内毒素时鲎的血液和血块。

最简单的LAL测定法之一是LAL凝胶-凝血测定法。本质上，将LAL凝血测定与所述样品的连续稀释组合。凝胶的形成与样品中内毒素的量成比例。由样品制备连续稀释液，并测定每种稀释液形成LAL凝胶的能力。在某点含有负反应。原始样品中内毒素的量可以根据稀释测定估算。

还开发了其他LAL测试，包括比浊LAL测定(Ong KG,Lelan JM,Zeng KF,BarrettG,Aourob M,Grimes CA.2006.A rapid highly-sensitive endotoxin detectionsystem.Biosensors and Bioelectronics 21:2270-2274)和显色LAL测定(Haishima Y,Hasegawa C,Yagami T,Tsuchiya T,Matsuda R,Hayashi Y.2003.Estimation ofuncertainty in kinetic-colorimetric assay of bacterial endotoxins.J PharmBiomed Analysis.32:495-503)。比浊和显色测定比简单的凝胶-凝血稀释测定更加灵敏并且是定量的。

本发明提供了减少具有VEGF/PDGF双重拮抗剂的组合物中内毒素的量的方法，所述方法具有以下步骤：使所述组合物与结合所述VEGF/PDGF双重拮抗剂的亲和层析树脂接触；从亲和层析树脂洗脱VEGF/PDGF双重拮抗剂以形成具有所述拮抗剂的亲和层析洗脱液；使亲和层析洗脱液与结合VEGF/PDGF双重拮抗剂的离子交换树脂接触；以及从离子交换树脂洗脱VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中从离子交换树脂洗脱的VEGF/PDGF双重拮抗剂基本上不含内毒素。

用于减少内毒素的量的上述方法或本文所述的其它方法或过程可以以上述步骤中描述的顺序进行，或者其可任选地通过改变步骤的顺序或甚至重复一个或多个步骤进行。在一个实施方案中，减少组合物中内毒素的量的方法以所描述的步骤的顺序进行。在一些实施方案中，在亲和层析洗脱液与离子交换树脂接触之前，以相同的次序将亲和层析树脂接触、洗涤和洗脱步骤重复一次以上。该方法还可以包括使用例如0.1微米、0.22微米或0.44微米过滤器的过滤步骤，可以对在每个树脂结合步骤后移走的一个或多个洗脱液进行该步骤。

在某些情况下，在使第一洗脱液与离子交换树脂接触之前，可将组合物与亲和层析树脂接触的步骤、洗涤步骤和从亲和层析树脂洗脱抗体的步骤重复多于一次。在一个实施方案中，亲和层析树脂包含重组蛋白A(“rProteinA”)树脂。合适的重组蛋白A树脂的一个实例为rProteinA Sepharose树脂(Amersham，新泽西州皮斯卡塔韦)。在另一个实施方案中，合适的亲和层析树脂将包含蛋白G层析树脂。在其它实施方案中，合适的亲和层析树脂包含混合的蛋白A/蛋白G树脂。在其它实施方案中，合适的亲和层析树脂包含含有4-巯基乙基吡啶配体的疏水电荷诱导树脂，例如MEP树脂(BioSepra，法国圣克里斯多夫塞日)。

在一些实施方案中，离子交换树脂优选包含阴离子交换树脂。如本领域技术人员所知的，对基质以及所连接的带电基团而言，离子交换剂可以是基于各种材料的。例如，可以使用以下基质，其中所提及的材料可以或多或少地交联：MacroCap Q(GE HealthcareBiosciences，新泽西州皮斯卡塔韦)、基于琼脂糖的基质(例如SepharoseSepharose Fast 和Sepharose High)、基于纤维素的基质(例如DEAE )、基于葡聚糖的基质(例如)、基于二氧化硅的基质和基于合成聚合物的基质。对于阴离子交换树脂，共价连接到基质上的带电基团可以是例如二乙基氨基乙基、季氨基乙基和/或季铵。阴离子交换树脂优选包含季胺基。具有用于结合抗M-CSF抗体的季胺基团的示例性阴离子交换树脂为Q树脂(Amersham，新泽西州皮斯卡塔韦)。

在其它方面，如果在组合物经历上述阴离子交换色谱步骤之后，内毒素水平高于所需的，则组合物可以备选地经历阳离子交换树脂。根据本发明的这一方面，组合物中的任何内毒素与离子交换树脂的结合应当不同于所述的蛋白质的结合以纯化蛋白质去除内毒素。在这点上，内毒素是带负电荷的，并且通常结合阴离子交换树脂。如果蛋白质和内毒素都与阴离子交换树脂结合，则可以通过使用盐梯度将两者洗脱至不同的级分来实现其中一种的纯化。蛋白质与特定树脂的相对结合也可以通过相对于蛋白质的pI改变缓冲液的pH来实现。在本发明的优选方面，阳离子交换色谱是采用的唯一的离子交换色谱。

根据本发明的另一方面，如果在阴离子交换树脂之后内毒素水平太高，则组合物可以进一步经历第二离子交换步骤，例如通过使组合物与阳离子交换树脂接触，随后进行洗涤步骤，然后从离子交换树脂中洗脱。在优选的实施方案中，阳离子交换树脂包含用于结合的磺酸基。示例性的阳离子交换树脂为SP树脂FF(Amersham，新泽西州皮斯卡塔韦)、Poros XS(CEX)(Life Technology，纽约州格兰德岛)。

根据本发明的一个方面，在产生具有指定水平的内毒素的PDGF/VEGF双重拮抗剂蛋白溶液之后，在蛋白质的最终制剂之前有多个步骤。在本发明的一些实施方案中，半衰期延长部分与蛋白质缀合。然后将缀合物配制成注射到患者体内的最终药物制剂。在一些实施方案中，缀合物再次用离子交换树脂纯化，该离子交换树脂可优选为阳离子交换树脂。在其他实施方案中，对蛋白质进行配制。在所有情况下，必须使用正常的实验室程序以防止内毒素污染物引入至蛋白质样品或蛋白质-聚合物缀合物中。

实施例

实施例1.PDGFRβ-GS10-VEGF-A抗体轻链/VEGF-A抗体重链(野生型Fc)的蛋白质序列。

构建PDGFR-β陷阱-VEGF-A抗体轻链/VEGF-A抗体重链，其具有下图7A、7B所示序列。PDGFR-GS10-VEGF-A抗体轻链的氨基酸1-282对应于人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的33-314，随后是接头序列GGGGSGGGGS和贝伐单抗轻链序列。任选地，在PDGFR-β区段和VEGF抗体区段之间不需要使用接头。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2(如上所述)、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。根据本发明也可以使用本领域技术人员已知的其它连接基序，包括G、GG、GGGS和GGGES x1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。SEQ ID NO.19显示了图7A的序列。图7B显示贝伐单抗重链序列(SEQ ID NO.2)。贝伐单抗轻链任选地具有M4L突变(Kabat编号)。贝伐单抗重链任选地具有一个或多个以下突变：T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat编号)、L234A、L235A、G237A、Q347C和L443C EU编号)。

实施例2.PDGFRβ-GG-VEGF-A抗体轻链/VEGF-A抗体重链(野生型Fc)的蛋白质序列。

构建另一种PDGFR-β陷阱-VEGF-A抗体轻链/VEGF-A抗体重链，其具有下图8A、8B所示的序列。图8A的氨基酸1-282对应于人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的33-314，随后是接头序列GG和贝伐单抗轻链序列。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。根据本发明也可以使用其它连接基序，包括G、GG(如上所述)、GGGS和GGGES x1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。SEQ ID NO.3显示了图8A的序列。图8B显示贝伐单抗重链序列(SEQ ID NO.2)。图8A的贝伐单抗轻链任选地具有M4L突变。贝伐单抗重链任选地具有一个或多个以下突变：T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat编号)、L234A、L235A、G237A、Q347C和L443C(EU编号)。

实施例3.PDGFRβ-GS10-VEGF-A抗体重链(野生型Fc)/VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列。

构建另一种PDGFR-β陷阱-VEGF-A抗体重链(野生型Fc)/VEGF-A抗体轻链，其具有图9A、9B所示的序列。图9A的氨基酸1-282对应于人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的33-314，随后是接头序列GGGGSGGGGS和任选地具有Q347C或L443C(EU编号)的贝伐单抗重链序列。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2(如上所述)、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。根据本发明也可以使用其它连接基序，包括G、GG、GGGS和GGGES x1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。SEQ ID NO.4显示了图9A的蛋白质序列。图9B的蛋白质为贝伐单抗轻链序列(SEQ ID NO.5)。贝伐单抗轻链任选地具有M4L突变。贝伐单抗重链任选地具有一个或多个以下突变：T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat编号)、L234A、L235A、G237A、Q347C和L443C(EU编号)。

实施例4.PDGFRβ-GG-VEGF-A抗体重链(野生型Fc)/VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列。

构建另一种PDGFR-β陷阱-VEGF-A抗体重链(野生型Fc)/VEGF-A抗体轻链，其具有下图10A、10B所示的序列。图10A的氨基酸1-282对应于人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的33-314，随后是接头序列GG和任选地具有Q347C或L443C的贝伐单抗重链序列。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。根据本发明也可以使用其它连接基序，包括G、GG(如上所述)、GGGS和GGGES x1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。SEQ ID NO.6显示了图10的蛋白质序列。图10B的蛋白是贝伐单抗轻链序列(SEQ ID NO.5)。贝伐单抗轻链任选地具有M4L突变。贝伐单抗重链任选地具有一个或多个以下突变：T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat编号)、L234A、L235A、G237A、Q347C和L443C(EU编号)。

实施例5.VEGF-A抗体重链(野生型Fc)-GS21-PDGFRβ/VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列。

构建PDGFR-β陷阱-VEGF-A抗体构建体，其中VEGF-A抗体重链在PDGFR-β陷阱的上游或N末端，其具有下图11A、11B所示的序列。图11A的氨基酸1-451对应于任选地具有Q347C或L443C的贝伐单抗重链序列，随后是接头序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2(如上所述)、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。根据本发明也可使用其它连接基序，包括G、GG、GGGS和GGGES x1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。接头之后是人PDGFR-β的氨基酸33-314序列(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)。SEQ ID NO.7显示了图11A的蛋白质序列。图11B显示贝伐单抗轻链序列(SEQ ID NO.5)。贝伐单抗轻链任选地具有M4L突变。贝伐单抗重链任选地具有一个或多个以下突变：T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat编号)、L234A、L235A、G237A、Q347C和L443C(EU编号)。

实施例6.PDGFRβ-GS10-VEGF-A抗体重链(Q347C)/VEGF-A抗体轻链(TAF347)的蛋白质序列。

构建另一种PDGFR-β陷阱-VEGF-A抗体重链(Q347C)/VEGF-A抗体轻链，其具有下图12A、12B所示的序列。图12A的氨基酸1-282对应于人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)氨基酸33-314。PDGFR序列之后紧接着是10个氨基酸的接头GGGGSGGGGS。任选地，在PDGFR-β区段和VEGF抗体区段之间不需要使用接头。接头可以是上述的组合。连接至接头的丝氨酸残基的羧基末端的是具有以下氨基酸的贝伐单抗重链：T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat编号)、L234A、L235A、G237A和Q347C(EU编号)。SEQ ID NO.8显示了图12A的蛋白质序列。图12B的蛋白为兰尼单抗轻链(贝伐单抗w/M4L)(SEQ ID NO.12)。

实施例7.PDGFRβ-GS10-VEGF-A抗体重链(L443C)/VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列。

构建另一种PDGFR-β陷阱-VEGF-A抗体重链(L443C)/VEGF-A抗体轻链，其具有下图13A、13B所示的序列。图13A的氨基酸1-282对应于人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的33-314。PDGFR序列之后紧接着是10个氨基酸的接头GGGGSGGGGS。连接至接头的丝氨酸残基的羧基末端的是具有以下氨基酸的贝伐单抗重链：T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat编号)、L234A、L235A、G237A和L443C(EU编号)。除M4L变化(Kabat编号)外，TAF443轻链与贝伐单抗相同。SEQ ID NO.9显示了图13A的蛋白质序列。图13B显示兰尼单抗轻链(贝伐单抗w/M4L)(SEQ ID NO.12)。

实施例8.PDGFRβ-GS10-VEGF-A抗体轻链/VEGF-A抗体Fab的蛋白质序列。

构建PDGFR-β陷阱-VEGF-A抗体轻链/VEGF-A抗体Fab，其具有下图14A、14B所示序列。图14A的氨基酸1-282对应于人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的33-314，随后是接头序列GGGGSGGGGS和贝伐单抗轻链序列。任选地，在PDGFR-β区段和VEGF抗体区段之间不需要使用接头。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2(如上所述)、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。根据本发明也可以使用其它接头基序，包括G、GG、GGGS和GGGES x1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。SEQ ID NO.1显示了图14A的蛋白质序列。图14B的蛋白是贝伐单抗Fab(SEQ ID NO.21)。图14A的贝伐单抗轻链任选地具有M4L突变。第二蛋白质的贝伐单抗Fab任选地具有一个或多个以下突变：T28D、N31H、H97Y和S100aT。第二条链的贝伐单抗Fab任选地具有添加到C-末端的、用于缀合半衰期延长部分的半胱氨酸部分。优选地，半胱氨酸部分通过SGGGC或CAA添加。或者，可以将SGGGC或CAA添加到轻链的C末端。

实施例9.PDGFRβ-GG-VEGF-A抗体轻链/VEGF-A抗体Fab的蛋白质序列。

构建PDGFR-β陷阱-VEGF-A抗体轻链/VEGF-A抗体Fab，其具有下图15A、15B所示的序列。图15A的氨基酸1-282对应于人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的33-314，随后是接头序列GG和贝伐单抗轻链序列。任选地，在PDGFR-β区段和VEGF抗体区段之间不需要使用接头。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。根据本发明也可以使用其它接头基序，包括G、GG(如上所述)、GGGS和GGGES x1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。SEQ ID NO.3显示了图15A的蛋白质序列。图15B显示贝伐单抗Fab的重链(SEQ ID NO.21)。图15A的贝伐单抗轻链任选地具有M4L突变(Kabat编号)。图15B的贝伐单抗Fab任选地具有一个或多个以下突变：T28D、N31H、H97Y和S100aT(Kabat编号)。图15B的贝伐单抗Fab任选地具有添加到C-末端的、用于缀合半衰期延长部分的半胱氨酸部分。优选地，半胱氨酸部分通过SGGGC或CAA添加。或者，可以将SGGGC或CAA添加到轻链的C末端。

实施例10.PDGFRβ-GS10-VEGF-A抗体Fab/VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列。

构建另一种PDGFR-β陷阱-VEGF-A抗体Fab/VEGF-A抗体轻链，其具有下图16A、16B所示的序列。图16A的氨基酸1-282对应于人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的33-314，随后是接头序列GGGGSGGGGS和贝伐单抗Fab序列。任选地，在PDGFR-β区段和VEGF抗体区段之间不需要使用接头。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2(如上所述)、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。根据本发明也可以使用其它接头基序，包括G、GG、GGGS和GGGESx1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。SEQ ID NO.22显示了图16A的蛋白质序列。图16B显示贝伐单抗轻链序列(SEQ ID NO.5)。贝伐单抗轻链任选地具有M4L突变。贝伐单抗重链任选地具有一个或多个以下突变：T28D、N31H、H97Y和S100aT(Kabat编号)。重链任选地具有添加到C-末端的、用于缀合半衰期延长部分的半胱氨酸部分。优选地，半胱氨酸部分通过SGGGC或CAA添加。或者，可以将SGGGC或CAA添加到轻链的C末端。

实施例11.PDGFRβ-GG-VEGF-A抗体Fab/VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列。

构建另一种PDGFR-β陷阱-VEGF-A抗体Fab/VEGF-A抗体轻链，其具有下图17A、17B所示的序列。图17A的氨基酸1-282对应于人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的33-314，随后是接头序列GGGGSGGGGS和贝伐单抗Fab序列。任选地，在PDGFR-β区段和VEGF抗体区段之间不需要使用接头。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2(如上所述)、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。根据本发明也可以使用其它接头基序，包括G、GG、GGGS和GGGESx1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。SEQ ID NO.23显示了图17A的蛋白质序列。图17B显示贝伐单抗轻链序列(SEQ ID NO.5)。贝伐单抗轻链任选地具有M4L突变。贝伐单抗重链任选地具有一个或多个以下突变：T28D、N31H、H97Y和S100aT(Kabat编号)。贝伐单抗Fab重链任选地具有添加至C-末端的用于缀合半衰期延长部分的半胱氨酸部分。优选地，半胱氨酸部分通过SGGGC或CAA添加。或者，可以将SGGGC或CAA添加到轻链的C末端。

实施例12.VEGF-A抗体Fab-GS21-PDGFRβ/VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列。

构建PDGFR-β陷阱-抗VEGF-A抗体构建体，其中抗VEGF-A重链位于PDGFR-β陷阱的上游或N末端，该构建体具有下图18A、18B所示的序列。图18A的氨基酸1-231对应于贝伐单抗Fab，随后是接头序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG。任选地，在PDGFR-β区段和VEGF抗体区段之间不需要使用接头。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。根据本发明也可以使用其它接头基序，包括G、GG、GGGS和GGGES x1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。接头后面是人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的氨基酸33-314序列。SEQ ID NO.24显示了图18A的蛋白质序列。图18B显示贝伐单抗轻链序列(SEQID NO.5)。贝伐单抗轻链任选地具有M4L突变。贝伐单抗重链任选地具有一个或多个以下突变：T28D、N31H、H97Y和S100aT。图18A的蛋白质任选地具有添加到C-末端的用于缀合半衰期延长部分的半胱氨酸部分。优选地，半胱氨酸部分通过SGGGC或CAA添加。或者，可以将SGGGC或CAA添加到图18B的轻链的C末端。

实施例13.PDGFRβ-GS10-VEGF-A抗体Fab/VEGF-A抗体轻链的蛋白质序列。

构建另一种PDGFR-β陷阱-VEGF-A抗体Fab/VEGF-A抗体轻链，其具有下图19A、19B所示的序列。图19A的氨基酸1-282对应于人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的33-314。PDGFR序列之后紧接着是10个氨基酸的接头GGGGSGGGGS。任选地，在PDGFR-β区段和VEGF抗体区段之间不需要使用接头。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2(如上所述)、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。根据本发明也可以使用其它接头基序，包括G、GG、GGGS和GGGES x1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。连接至接头的丝氨酸残基的羧基末端的是具有突变T28D、N31H、H97Y和S100aT(Kabat编号)的贝伐单抗Fab。SEQ ID NO.25显示了图19A的蛋白质序列。图19B的蛋白质为兰尼单抗轻链(贝伐单抗w/M4L)(SEQ ID NO.12)。图19A的蛋白质任选地具有添加至C-末端的用于缀合半衰期延长部分的半胱氨酸部分。优选地，半胱氨酸部分通过SGGGC或CAA添加。或者，可以将SGGGC或CAA添加到图19B的轻链的C末端。

实施例14.PDGFRβ-VEGF-A抗体Fab/VEGF-A抗体轻链(1a)的蛋白质序列。

构建另一种PDGFR-β陷阱-VEGF-A抗体Fab/VEGF-A抗体轻链，其具有图20A、20B所示的序列。图20A的氨基酸1-283对应于人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的32-314，随后是贝伐单抗重链。SEQ ID NO.26显示了图20A的蛋白质序列。图20B的蛋白质为贝伐单抗轻链序列(SEQ ID NO.5)。如本实施例所述，在PDGFR-β区段和VEGF抗体区段之间不需要使用接头。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。根据本发明也可以使用其它接头基序，包括G、GG、GGGS和GGGES x1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。贝伐单抗轻链任选地具有M4L突变。贝伐单抗重链任选地具有一个或多个以下突变：T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat编号)、Q347C和L443C(EU编号)。

实施例15.PDGFR-β(D2-D3)-VEGF-A抗体重链/VEGF-A抗体轻链(1b)的蛋白质序列。

构建另一种PDGFR-β陷阱(D2-D3)-VEGF-A抗体重链/VEGF-A抗体轻链，其具有下图21A、21B所示的序列。图21A的氨基酸1-190对应于人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的125-314，随后是贝伐单抗重链。SEQ ID NO.27显示了图21A的蛋白质序列。如本实施例所述，在PDGFR-β区段和VEGF抗体区段之间不需要使用接头。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。根据本发明也可以使用其它接头基序，包括G、GG、GGGS和GGGES x1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。图21B显示贝伐单抗轻链序列(SEQ ID NO.5)。贝伐单抗轻链任选地具有M4L突变。贝伐单抗重链任选地具有一个或多个以下突变：T28D、N31H、H97Y、S100aT(Kabat编号)、Q347C和L443C(Eu编号)。

实施例16.PDGFR-β(D2-D3)-VEGF-A抗体Fab/VEGF-A抗体轻链(2b)的蛋白质序列。

构建另一种PDGFR-β陷阱(D2-D3)-VEGF-A抗体Fab/VEGF-A抗体轻链，其具有图22A、22B所示的序列。图22A的氨基酸1-190对应于人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的125-314，随后是贝伐单抗Fab。如本实施例所述，在PDGFR-β区段和VEGF抗体区段之间不需要使用接头。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。GGGGSGGGGS接头是特别优选的。根据本发明也可以使用其它接头基序，包括G、GG、GGGS和GGGES x1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。SEQ ID NO.28显示了图22A的序列。图22B显示了贝伐单抗轻链序列(SEQ ID NO：5)。贝伐单抗轻链任选地具有M4L突变。贝伐单抗重链任选地具有一个或多个以下突变：T28D、N31H、H97Y和S100aT(Kabat编号)。图22A的贝伐单抗Fab任选地具有添加到C-末端的用于缀合半衰期延长部分的半胱氨酸部分。优选地，半胱氨酸部分通过SGGGC或CAA添加。或者，可以将SGGGC或CAA添加到图22B的轻链的C末端。

实施例17.PDGFR-β(D2-D3)-VEGF-A抗体Fab/VEGF-A抗体轻链(2b’)的蛋白质序列。

构建另一种PDGFR-β陷阱(D2-D3)-6xGS-VEGF-A抗体Fab/VEGF-A抗体轻链，其具有下图23A、23B所示的序列。图23A的氨基酸1-190对应于人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的125-314，随后是接头GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS，然后是贝伐单抗Fab。任选地，在PDGFR-β区段和VEGF抗体区段之间不需要使用接头。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。根据本发明也可以使用本领域技术人员已知的其它连接基序，包括G、GG、GGGS和GGGES x1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。SEQID NO.29显示了图23A的蛋白质序列。图23B显示贝伐单抗轻链序列(SEQ ID NO.5)。贝伐单抗轻链任选地具有M4L突变。贝伐单抗重链任选地具有一个或多个以下突变：T28D、N31H、H97Y和S100aT(Kabat编号)。贝伐单抗Fab重链任选地具有添加至C-末端的用于缀合半衰期延长部分的半胱氨酸部分。优选地，半胱氨酸部分通过SGGGC或CAA添加。或者，可以将SGGGC或CAA添加到轻链的C末端。

实施例18.PDGFR-β(D2-D3)-VEGF-A抗体Fab/VEGF-A抗体轻链(2b’)的蛋白质序列。

构建另一种VEGF-A抗体Fab-6xGS-PDGFR-β陷阱(D2-D3)/VEGF-A抗体轻链，其具有下图24A、24B所示的序列。图24A的氨基酸1-190对应于人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的125-314，随后是接头GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS，然后是贝伐单抗Fab。任选地，在PDGFR-β区段和VEGF抗体区段之间不需要使用接头。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。根据本发明也可以使用其它接头基序，包括G、GG、GGGS和GGGES x1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。SEQ ID NO.29显示了图24A的序列。图24B显示贝伐单抗轻链序列(SEQ ID NO.5)。图24B的贝伐单抗轻链任选地具有M4L突变。第一蛋白的贝伐单抗重链任选地具有一个或多个以下突变：T28D、N31H、H97Y和S100aT(Kabat编号)。图24A的贝伐单抗Fab任选地具有添加到C-末端的用于缀合半衰期延长部分的半胱氨酸部分。优选地，半胱氨酸部分通过SGGGC或CAA添加。或者，可以将SGGGC或CAA添加到轻链的C末端。

实施例19.VEGF-A抗体Fab-6xGS-PDGFR-β(D2-D3)/VEGF-A抗体轻链(3)的蛋白质序列。

构建另一种VEGF-A抗体Fab-6xGS-PDGFR-β(D2-D3)/VEGF-A抗体轻链，其具有下图25A、25B所示的序列。图25A的氨基酸1-231对应于贝伐单抗Fab，随后是接头GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS，然后是人PDGFR-β(UniProtKB/Swiss-Prot:P09619.1)的125-314。任选地，在PDGFR-β区段和VEGF抗体区段之间不需要使用接头。或者，接头可以是GGGGS基序x1、x2、x3、x4等，使得两种蛋白质的活性被优化。根据本发明也可以使用其它接头基序，包括G、GG、GGGS和GGGES x1、x2、x3、x4等。接头可以是上述的组合。SEQ ID NO.30显示了图25A的序列。图25B显示贝伐单抗轻链序列(SEQ ID NO：5)。贝伐单抗轻链任选地具有M4L突变。贝伐单抗重链任选地具有一个或多个以下突变：T28D、N31H、H97Y和S100aT(Kabat编号)。图25A的PDGFR-β任选地具有添加到C-末端的用于缀合半衰期延长部分的半胱氨酸部分。优选地，半胱氨酸部分通过SGGGC或CAA添加。或者，可以将SGGGC或CAA添加到轻链的C末端。

实施例20.PDGFR/VEGF双重拮抗剂蛋白的生产。

将TAF443重链和轻链克隆至表达质粒中并转染至CHO细胞中。细胞在合适的培养基中生长并收获。对TAF443进行如下纯化。用5％(v/v)1.1M HEPES、0.22M EDTA(pH 6.7)或10％0.55M Hepes、0.11M EDTA、5.5％Triton X-100(pH 6.7)调节10L表达SEQ ID NO.31和32的CHO细胞的培养基，并上样至167/400ml的蛋白A柱(2次运行)，该蛋白A柱由在50mMTris、150mM NaCl(pH7.5)(5-CV)中平衡的Mab Select Sure树脂填充。用50mM Tris、150mMNaCl(pH7.5)(2-CV)、50mM Tris、0.5M CaCl₂(pH7.5)(5-CV)以及10mM Tris、10mM NaCl(pH7.5)(3-CV)依次对柱进行洗涤，然后使用150mM甘氨酸、40mM NaCl(pH 3.5)(4-CV)洗脱蛋白质。合并级分，使用2M甘氨酸(pH 2.7)调节至pH 3.5，然后使用2M HEPES(pH 8.0)中和至pH 7。将蛋白A合并液(pool)上样到在50mM Hepes、65mM NaCl(pH 7.0)(5-CV)中平衡的274ml TMAE柱上。用50mM Hepes、65mM NaCl(pH7.0)(3-CV)对柱进行洗涤，然后用50mMTris、200mM NaCl(pH7.5)(5-CV)洗脱。合并洗脱级分，并在用PBS-CMF(pH7.2)平衡的1150mL Sephadex G-25Coarse柱中进行缓冲液交换。将合并液过滤，通过30kMWCOVivaFlow200浓缩至>5mg/ml。浓缩的蛋白质通过0.22μm过滤器过滤，然后通过SDS-PAGE、分析型SEC、O.D.280/320、末端毒素LAL测定(end toxin LAL assay)、蛋白A ELISA、IEF和冷冻/解冻分析来表征。

下表概述了一个示例批次的纯化的TAF443的性质。

实施例21.代表性制剂中高浓度TAF双功能分子的稳定性。

在赋形剂(例如蔗糖)存在下，将TAF双功能物在一系列pH为4.5-7.5的标准制剂缓冲液中浓缩至50-85mg/ml。将这些样品的等分试样在室温(RT)和4℃下储存6周的时间，并在时间零点和随后的每个星期之后取样，以通过分析型SEC测量聚集物质的百分比。

实施例22.构建体转染入CHO细胞。

将TAFwt、TAF443和TAF347的DNA构建体转染到CHO-K1 SV SSI：3个库(pools)/构建体中。在大多数细胞系中观察到正常的3周恢复。然而，TAFwt和TAF347细胞系比其他细胞系滞后约1周。一旦建立库，第4天(对于大部分)和第3天(对于TAFwt和TAF347)的时候，将条件培养基样品在Octet上运行。TAFwt和TAF347的3天条件培养基通过Octet显示约7mg/ml。TAF443的4天条件培养基显示约21mg/ml。在库之间观察到小的差异，并且该库用于制备促进蛋白质产生的库的库。

实施例23.蛋白质的SEC-MALS。

TAF的PDGFR区段具有7个推定的糖基化位点。SEC-MALS测量结果显示蛋白质似乎是高度糖基化的：

构建体	蛋白质(kDa)	糖(kDa)	总数(kDa)
				TAFwt	184	63	247
TAF334	182	62	244
				TAF443	187	63	250

在SEC-MALS上运行(run)的样品都具有大于98％的纯度。测量到的分子量是合理的。观察到一些高分子量物质，可能是三聚体至五聚体(数据未显示)。

实施例24.TAF蛋白的热稳定性。

测量在pH7.2的PBS中TAFwt、TAF443和TAF347的热稳定性曲线。每种蛋白质具有三个峰(数据未显示)。峰的相对位置在下表中列出：

样品	Tm1(℃)	Tm2(℃)	Tm3(℃)
				TAFwt	58.1±0.1	71.9±0.1	83.2±0.1
TAF347	58.2±0.1	71.9±0.1	81.7±0.1
				TAF443	58.2±0.1	71.9±0.1	84.4±0.1

蛋白质在所述温度范围内的稳定性非常相似。然而，应注意T_m3存在一些小的变化。T_m3可能对应于三种TAF蛋白的抗体结构域的CH3结构域，并且所述变化反映Cys突变。TAF蛋白的总体稳定性低可能是由于蛋白质的PDGFR区段的解折叠。

实施例25.TAF强迫聚集。

检测作为热的函数的三种TAF蛋白溶液中聚集体的百分比(数据未显示)。每种蛋白质(TAFwt、TAF347和TAF443)的溶液在约54℃开始显示聚集体。随着温度升高，每种蛋白质的聚集体百分比急剧增加。在64℃，大约40％的每种TAF蛋白形成聚集体。我们注意到在最低Tm时聚集开始发生，看起来对应于蛋白质的PDGFR部分的解折叠。

实施例26.作为pH的函数的TAF443热稳定性。

在各种pH下检测TAF443的热稳定性，如下表所示。在非PBS缓冲液中，看到4个热变性峰：

可以看出，存在弱的pH依赖性。值得注意的是，T_m2和T_m3结构域(可能是C_H2、Fab)在PBS中重叠，但在其他缓冲液中不重叠。

实施例27.PDGF/VEGF双重拮抗剂蛋白和缀合物对靶的亲和力。

表面等离子体共振(SPR)用于表征重组人PDGF-BB(PeproTech，100-14B)对PDGF/VEGF双重拮抗剂变体TAF-WT、TAF-347、TAF-443、TAF443-6A250K和TAF443-3A250K的结合动力学。最初，按照制造商的方案，将抗人IgG抗体(GE Healthcare，BR-1008-39)共价地胺偶联到涂覆有CM5羧甲基化葡聚糖的传感器芯片的所有四个流动池上，达到约10,000个共振单位(RU)的密度。每种PDGF/VEGF变体被捕获至约150RU的水平。用于PDGF分析的运行(running)和样品缓冲液为HBS-EP+300mM NaCl(10mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)pH7.4、300mM NaCl、3mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.05％(v/v)吐温20)。将浓度范围为1nM至0.125nM的PDGF-BB的2倍连续稀释系列以100μL/分钟的流速注射，以进行110秒的缔合，解离时间在300-2700秒之间变化。然后用3M MgCl₂的30秒脉冲、离子再生缓冲液(0.46MKSCN、1.83M MgCl₂、0.92M尿素和1.83M胍-HCl(pH7.4)；Andersson et al.，AnalyticalChemistry,1999)的30秒脉冲进行表面再生，之后用HBS-EP+300mM NaCl运行缓冲液的30秒脉冲平衡。

类似地，SPR用于测定重组人VEGF121(PeproTech，100-20A)对双重PDGF/VEGF拮抗剂变体TAF-WT、TAF-347和TAF-443的结合亲和力。用于VEGF分析的运行和样品缓冲液为HBS-EP+，最终浓度为150mM NaCl。将浓度范围在100nM至12.5nM的VEGF121的2倍稀释系列以50μL/分钟的流速注射，以进行50秒的缔合，解离时间在300-3600秒之间变化。然后用3MMgCl₂的30秒脉冲、离子再生缓冲液(0.46M KSCN、1.83M MgCl₂、0.92M尿素和1.83M胍-HCl(pH7.4)，Andersson et al.，Analytical Chemistry,1999)的30秒脉冲进行表面再生，然后用HBS-EP+150mM NaCl运行缓冲液的30秒脉冲平衡。

所有SPR测定在25℃下使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)以1Hz的数据收集速率进行。所得PDGF和VEGF传感图使用对照表面和缓冲注射液为双重参照。通过使用Biacore T200评估软件v2.0和方程KD＝kd/ka将数据拟合到1:1Langmuir模型来确定速率常数。

实施例28.马来酰亚胺缀合前的TAF443的脱帽(decapping)。

TAF443半胱氨酸残基通常被细胞培养基中的化学物质“加帽”或氧化，并且不可用于进行缀合。鉴于这种情况，对纯化的TAF443(OG1321)进行脱帽(即还原)程序以将帽除去并使游离的半胱氨酸残基(即不参与Cys-Cys二硫键的那些半胱氨酸残基)与聚合物的马来酰亚胺官能团缀合。通过在25℃下将TAF蛋白与30x摩尔过量的还原剂TCEP(三(2-羧乙基)膦，3,3′,3″-Phosphanetriyltripropanoic acid)混合1小时来进行脱帽。通过SDS-PAGE对使用TCEP的还原反应进行监测。未变性的TAF作为约250kDa的单个条带运行(该重量的约40kDa为碳水化合物)。当完全变性时，单个250kDa带被转化成对应于轻链和重链的带。变性后，使用Pellion XL盒式超滤膜包通过UFdF用20mM Tris缓冲液(pH7.5)、150mM NaCl、0.5mM TCEP缓冲液洗涤TAF蛋白以将帽除去。然后在相同的UfdF设置下用20mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl除去TCEP试剂。使用空气(环境氧)使还原的TAF重折叠，然后再次进行SDS-PAGE测定。

脱帽的详细过程如下：

在4℃下将500mg OG1321从-80℃解冻过夜，并在25℃水浴中加热，然后与30x摩尔过量的TCEP混合。将反应在25℃水浴中孵育1小时。在15分钟、30分钟和60分钟取样，在SDS-PAGE上运行以评价还原完成度。使用截留分子量为10kD的UFdF盒式膜包进行缓冲液交换。用20mM Tris(pH7.5)、100mM NaCl、0.5mM TCEP以约100×进行第一缓冲液交换步骤，以将帽彻底除去。在空气重折叠之前，用20mM Tris(pH7.5)、100mM NaCl以约1000×进行第二缓冲液交换步骤，以除去TCEP。样品中的最终TCEP浓度为约0.5μM。从两个缓冲液交换步骤中取出样品用于SDS-PAGE和SEC分析以评估蛋白质的再氧化状态和蛋白质聚集。在第二缓冲液交换步骤后，将OG1321浓缩至约2mg/ml，进行0.22μm过滤，并在4℃下使用空气使其再氧化。在不同时间点取出样品用于SDS-PAGE和SEC分析以评价再氧化状态。对再氧化的OG1321进行0.22μm过滤并进一步浓缩。继续将样品用截留分子量为30k的VIVACELL 100旋转浓缩器浓缩至4-6mg/ml，并对样品进行无菌过滤，通过OD280定量。

实施例29.TAF443与生物聚合物的缀合。

使用15×过量的聚合物在pH7.5的Tris缓冲液中脱帽后，将TAF443(也称为OG1321)与聚合物OG1802(参见下文)缀合以产生OG1448，如图26所示。图26显示了OG1448的化学结构，其为与生物聚合物OG1802缀合的TAF443。TAF443在该图所示的分子的极右侧，通过半胱氨酸443残基缀合到5元环上。通过SDS-PAGE对缀合进行监测，并使缀合接近完成。通过阴离子交换色谱对缀合物进行纯化，并由UF/DF通过缓冲液交换将缀合物交换到制剂缓冲液中。

一般来说，由组分OG1802和OG1321合成OG1448涉及三个步骤。步骤A：OG1321必须被还原或脱帽以释放443位置处的半胱氨酸的巯基。虽然认为TAF重链第443位的半胱氨酸不参与半胱氨酸-半胱氨酸二硫键配对，但该半胱氨酸通常被培养基的组分加帽并且在不进行还原的情况下不能与马来酰亚胺反应。步骤B：然后将还原的TAF与OG1802缀合。步骤C：然后通过层析法将缀合的TAF(OG1448)与未缀合的TAF和聚合物分离开。在下表中，将这三个一般步骤分为七个更小的步骤：

实施例30.通过阴离子交换(Macrocap Q)纯化OG1448。

在如上所述将TAF443缀合至OG1802之后，对OG1448进行如下纯化：按照树脂:缀合物比例为约3:1装填2×400ml的Macrocap Q柱。用5M NaCl冲洗柱子并采用20mM Tris缓冲液(pH7.5)、20mM NaCl(平衡缓冲液)通过虹吸作用进行平衡。将缀合反应混合物用20mMTris缓冲液(pH7.5)稀释并上样到柱上。然后用平衡缓冲液处理(chased)柱子，用20mMTris缓冲液(pH7.5)、50mM NaCl洗涤(第一次洗涤)，然后用20mM Tris缓冲液(pH7.5)、100mM NaCl洗涤(第二次洗涤)。用20mM Tris缓冲液(pH7.5)以及150mM、200mM、220mM、250mM、300mM和500mM不连续梯度的NaCl进行洗脱。将所有柱流过液、洗涤液和洗脱液收集在干净的瓶中用于SDS-PAGE和AEX分析。合并含有缀合物的洗脱级分，并使用截留分子量为30kD、具有PES膜的Pellicon XL TFF盒式膜进行浓缩。然后使用相同的TFF盒式膜将浓缩的合并液用1×PBS(pH7.4)缓冲液以约100×进行缓冲液交换，并转移至VIVACELL 100旋转浓缩器中以进一步浓缩，直到达到目标浓度(约30mg/ml)。将最终的缀合物通过0.2μm PES针筒式滤器过滤用于批次放行检测。

实施例31.细菌内毒素的减少。

为了降低最终蛋白质(OG1321)或缀合物(OG1448)中内毒素的水平，可以使用纯化程序对蛋白质或缀合物进行纯化，该纯化程序利用阳离子交换代替阴离子交换。例如，在上述纯化OG1321的过程中，使用阴离子交换树脂TMAE。可使用阳离子交换树脂CEX代替TMAE树脂。然而，为了使用CEX树脂，含有所述蛋白质的溶液的pH必须降低至低于蛋白质的pI。对于OG1321，将蛋白A柱处理后的蛋白质溶液的pH降低至pH 3.5。OG1321在pH5下与Poros XS柱结合。然后，Porox XS(CEX)可用于结合和洗脱OG1321。

实施例32.OG1802的合成途径1。

用于合成OG1802的第一种途径如下。首先，合成具有图27所示结构的TFA/胺盐引发剂(化合物L)，合成过程如下。

首先，合成具有图28所示结构的化合物K，合成过程如下。在氮气下向200mL圆底烧瓶中加入化合物J(OG1563)(1.9g，2.67mmol，3.3当量)和化合物E(0.525g，0.81mmol，1.0当量)(参见图38)，随后加入二甲基甲酰胺(10mL)，然后加入二异丙基乙胺(2.5mL，14.6mmol，18当量)。

使用冰浴将烧瓶冷却至0℃。在约6分钟内向其中加入丙基膦酸酐溶液(50重量％的乙酸乙酯溶液，2.5mL，4.04mmol，5当量)。

将反应升温至室温并搅拌15分钟。通过加入水(20mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和乙酸乙酯(100mL)淬灭反应。分离有机层，水层用乙酸乙酯(75mL)萃取。合并的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)、0.5M柠檬酸水溶液(40mL)、水(25mL)和饱和氯化钠水溶液(40mL)洗涤，然后干燥(硫酸钠)、过滤并真空浓缩。残余物无需进一步纯化即可使用，得到2.0g(0.80mmol，99％)化合物K。

1H NMR(400MHz DMSO-d6):＝1.36(s,9H,OCCH3),1.90(s,54H,CC(CH3)2Br),2.31(t,J＝7.2Hz,6H,CCH2CH2NH),2.98(d,J＝5.6Hz,6H,CCH2NH),3.04(q,J＝6.0Hz,2H,OCH2CH2NH),3.18(s,2H,OCH2C),3.3-3.37(m,8H,CH2),3.47-3.55(m,12H,CH2),3.58(s,6H,OCH2C),3.87(s,6H,O＝CCH2O),4.27(s,18H,CCH2OC＝O),6.74(br t,1H,CH2NHC＝O),7.69(t,J＝6.8Hz,3H,CH2NHC＝O),7.84(t,J＝6.0Hz,3H,CH2NHC＝O)。

LC-MS(ES,m/z):[(M+2H-boc)/2]+(C84H136Br9N7O33+2H-Boc)/2的计算值＝1196.6；实验值为1196.6。

接下来，合成化合物L(图27)，合成过程如下：在氮气下，向100mL圆底烧瓶中加入化合物K(2.0g，0.8mmol)、二氯甲烷(10mL)，然后加入三氟乙酸(5mL)。将反应在室温下搅拌30分钟。将反应物在真空下浓缩。使用二氯甲烷(10mL)稀释反应物并在真空下浓缩。使用乙腈(10mL)溶解残余物，通过针筒式滤器(Acrodisc CR25，PN 4225T)过滤，并上样到制备型HPLC柱上，用60％的乙腈水溶液(含0.1％三氟乙酸)至98％的乙腈(含0.1％三氟乙酸)洗脱。合并含有产物的试管，在真空下浓缩，冷冻并置于冷冻干燥器上。得到990mg(0.4mmol，2个步骤的产率50％)白色粉末状化合物L。

1H NMR(400MHz DMSO-d6):＝1.90(s,54H,CC(CH3)2Br),2.31(t,J＝7.2Hz,6H,CCH2CH2NH),2.97-3.0(m,8H,CCH2NH和OCH2CH2NH),3.17(s,2H,OCH2C),3.3(q,6H,CH2CH2NHC＝O),3.4-3.59(m,20H,CH2),3.87(s,6H,O＝CCH2O),4.27(s,18H,CCH2OC＝O),7.69-7.84(m,9H,CH2NHC＝O和NH3+)。

LC-MS(ES,m/z):[(M+2H)/2]+(C84H136Br9N7O33+2H)/2的计算值＝1196.6；实验值为1197.4。

接下来，将化合物L用作引发剂以合成MPC聚合物。通常将引发剂制备成约100mg/mL的DMF储备溶液。将引发剂和配体(2,2’-联吡啶)引入Schlenk管中。使用干冰/丙酮混合物将所得溶液冷却至-78℃，并在真空下脱气10分钟。在氩气下将管再次填充，把保持在氩气下的催化剂(CuBr，除非另有说明)引入Schlenck管中(引发剂中的溴原子/催化剂(CuBr)/配体的摩尔比保持在1/1/2)。溶液立即变为深棕色。将Schlenk管密封，并立即通过施加短循环真空/氩气吹扫。通过在保持于氮气下的手套箱中制备的限定量的单体与200标准酒精度(proof)的脱气乙醇混合来制备HEMA-PC的溶液。将单体溶液逐滴加入Schlenk管(通过套管)(并轻轻搅拌使其均匀)。温度保持在-78℃。对反应混合物施加完全真空至少10-15分钟直到溶液鼓泡停止。然后用氩气再填充该管并升温至室温。搅拌溶液，随着聚合的进行，溶液变粘稠。在3-8小时或使其过夜之后，通过直接暴露于空气中以将Cu(I)氧化为Cu(II)使反应猝灭，混合物变成蓝绿色，并通过硅胶柱以除去铜催化剂。通过旋转蒸发浓缩收集的溶液，所得混合物用四氢呋喃沉淀或用水透析，然后冷冻干燥，得到自由流动的白色粉末。下表列出了使用化合物L作为引发剂的聚合物的聚合物数据。

接下来，将马来酰亚胺Mal-PEG4-PFP酯搭接(如图29所示)到上文提及的750kDa聚合物以提供OG1802。向20mL小瓶中加入聚合物R3707(使用L作为引发剂制备的750kDa聚合物，515mg)，搅拌40分钟后用乙醇(4.0mL)溶解。向其中加入1％4-甲基吗啉的乙腈(22μL)溶液。在单独的小瓶中将Mal-PEG4-PFP(1.97mg)溶于乙腈(1.0mL)中，并将该溶液在室温下在约2分钟内加入到聚合物溶液中，将所得溶液搅拌过夜。将反应用0.1％三氟乙酸水溶液(2mL)(pH约5)稀释，然后用水(约12mL)稀释，通过针筒式滤器(Acrodisc Supor，PN 4612)过滤，并均匀地置于3个Amicon离心膜透析管(截留分子量为30,000)中。将管稀释并与水混合(每管约5mL)，置于离心机(rpm 3200)中处理25分钟。移出滤液用于分析，同时稀释保留物并与水混合(约10mL/管)。离心过程再重复5次，之后移出保留物并置于小瓶中。用水冲洗Amicon膜管(每管2×约2mL)，并将其与保留物合并。将保留物溶液通过针筒式滤器(Acrodisc Supor，PN 4612)过滤、冷冻并置于冷冻干燥器上。得到485mg白色粉末。

实施例33.TAF(OG1448和OG1321)的Biacore结合研究。

通过Biacore测定评价OG1448(和OG1321)对其预期靶标的结合亲和力。使用配备有GLM(Proteon)和CM4(Biacore)传感器芯片并用运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、0.005％Tween-20、0.2mg/ml BSA)平衡的BioRad Proteon XPR36和Biacore 2000光学生物传感器在25℃和37℃进行结合研究。OG1448、OG1321、贝伐单抗、阿柏西普和抗PDGF抗体(anti-PDGF)通过胺偶联固定到传感器表面。

通过标准方法测定偶联蛋白与配体的结合。例如，在始于52nM的三倍稀释系列中测试rhVEGFA-165的结合。将rhVEGFA-165在整个表面注射5分钟，然后当用缓冲液洗涤表面时，监测解离阶段>1000秒。如在洗涤阶段(>300秒)中明显稳定(apparently flat)的反应所指示的(数据未显示)，rhVEGFA-165/OG1448复合物似乎相当稳定。监测52nM rhVEGFA-165的解离阶段超过2小时。没有观察到结合反应随时间降低。

类似地，在始于11.4nM的三倍系列中测试rhPDGF-BB的结合。对于rhPDGF-BB/OG1448相互作用，由于传质效应，速率常数太快以至于不能可靠地报道。观察到以下KD常数：

实施例34.TAF—rhVEGFA-165与rhVEGFR结合的竞争性抑制剂。

在竞争性结合测定中评价了TAF(OG1448和OG1321)对VEGFA-165的结合活性，该结合活性作为TAF(OG1448和OG1321)潜在的抗VEGF活性效力的量度，其中不同浓度的TAF与固定化的rhVEGFR竞争结合rhVEGF。通过ELISA测定由固定的VEGFR结合的rhVEGFA-165(数据未显示)。

将人VEGFR1/Fc以1.0μg/mL涂覆在96孔ELISA板的底部。将范围在0.39-200nM的各种浓度的TAF(OG1448和OG1321)与0.1nM生物素化的VEGFA-165培养30分钟，然后加入ELISA板。通过链霉亲和素-HRP检测结合VEGFR1的生物素化的rhVEGFA-165，然后用HRP底物显色。类似地测试兰尼单抗(Lucentis)和贝伐单抗(阿瓦斯汀)对VEGFA-165与VEGFR1结合的竞争性结合抑制。

OG1321、OG1448、兰尼单抗和贝伐单抗在抑制VEGF-165与rhVEGFR的结合方面显示相似的IC₅₀，这表明其在抗VEGF活性方面具有相似的潜在效力。这些结果表明，TAF(OG1448和OG1321两者)可以与批准的药物兰尼单抗和贝伐单抗一样有效，因此适合于治疗新生血管性(即湿性)AMD。

实施例35.OG1448—在rhPDGF-BB存在下rhVEGFA-165与rhVEGFR结合的竞争性抑制剂。

为了评价在rhPDGF-BB存在下OG1448是否可以结合rhVEGFA-165，即结合TAF受体诱饵的rhPDGF-BB是否抑制TAF结合rhVEGFA-165的能力，进行与实施例27类似的结合研究，但该研究是在各种浓度的rhPDGF-BB存在下进行的。

将人VEGFR1/Fc以1.0μg/mL涂覆在96孔ELISA板的底部。将各种浓度的OG1448与0.1nM的rhVEGFA-165加上浓度分别为0.4nM、1.2nM和2.0nM的rhPDGF-BB孵育30分钟，然后加入ELISA板。通过0.4μg/mL的生物素化的抗VEGFA抗体和之后的链霉亲和素HRP和HRP底物检测rhVEGFA-165与rhVEGFR1的结合。发现OG1448具有10.1的IC 50(nM)。这与在实施例28中无rhPDGF-BB时观察到的IC50相当。在该测定中没有测定OG1321的值，但预期其与OG1448相似。

实施例36.TAF—rhPDGF-BB与rhPDGFR结合的竞争性抑制剂。

在竞争性结合测定中评价TAF(OG1448和OG1321)与rhPDGF-BB的结合活性，该活性作为TAF(OG1448和OG1321)潜在的抗PDGF活性效力的量度，其中不同浓度的TAF与固定的PDGFR竞争结合rhPDGFBB。通过ELISA测定法测定结合至固定化PDGFR的rhPDGF-BB。

将人PDGFR/Fc以0.4μg/mL涂覆在96孔ELISA板的底部上。将范围在1pM-20nM的各种浓度的OG1448和OG1321与0.2nM的rhPDGF-BB孵育30分钟，然后加入到ELISA板中。通过0.4μg/mL的生物素化的抗-PDGFBB抗体和之后的链霉亲和素-HRP和HRP底物检测结合rhPDGFR的rhPDGF-BB。

如下表所示，OG1448、OG1321和参照抗PDGF抗体在抑制rhPDGFBB与PDGFR结合方面显示相似的IC50，表明高度有效的抗PDGF活性。

实施例37.OG1448—在rhVEGFA-165存在下rhPDGF-BB与rhPDGFR结合的竞争性抑制剂。

为了评价在rhVEGFA-165存在下OG1448是否可以结合rhPDGF-BB，在rhVEGFA-165存在和不存在的情况下进行类似的对PDGF的竞争性结合抑制研究(如实施例29)。

将人PDGFRb/Fc以0.4μg/mL涂覆在96孔ELISA板的底部。将各种浓度的OG1448与0.2nM的PDGFBB，与0.2nM的PDGFRb，加上浓度分别为0.2nM、0.6nM和1.0nM的rhVEGFA-165孵育30分钟，然后加入到ELISA板中。通过0.4μg/mL生物素化的抗-PEGFBB抗体和随后的链霉亲和素HRP和HRP底物检测与PDGFRb结合的PDGF-BB。在rhVEGFA-165(25)存在下的IC50(pM)与实施例29中得到的数值相当。未测定在rhVEGFA-165存在下OG1321的数值，但预期与OG1448相似。

实施例38.对VEGF-诱导的原发性人视网膜微血管内皮细胞(HRMVEC)增殖的抑制。

内皮细胞增殖是血管生成中的关键步骤，因此也是新生血管性AMD发病机理中的关键步骤。OG1448的拮抗VEGF对原发性人视网膜微血管内皮细胞的增殖作用的能力可以作为其治疗新生血管性AMD的生物活性的量度。

在各种浓度的TAF(OG1448和OG1321)和参照药物的存在下，用1.3nM的rhVEGF165-A刺激HRMVEC 3天。通过WST-1细胞增殖检测试剂测量细胞增殖。结果如下表所示：

OG1448和OG1321在该测定中表现出与其它批准的抗VEGF治疗剂相当的IC50。这些数据显示TAF(OG1448和OG1321两者)具有与兰尼单抗、贝伐单抗和阿柏西普至少相当的抑制VEGF-介导的视网膜微血管内皮细胞增殖活性的效力。

实施例39.对PDGF诱导的原发性人脑血管周细胞(HBVP)增殖的抑制。

周细胞迁移和增殖是血管生成中的关键事件，因此在新生血管性AMD的发病机理中起重要作用。TAF(OG1448和OG1321)的拮抗PDGF对人脑周细胞的增殖作用的能力可以作为其治疗新生血管性AMD的有效性的量度。

在各种浓度的TAF(OG1449和OG1321)和参照抗-PDGF-BB抗体(R&D Systems，目录号AB-220-NA)的存在下，用2.0nM PDGFBB刺激HBVP 3天。通过WST-1细胞增殖检测试剂测量细胞增殖。

从上述比较OG1321(TAF443)与OG1448(TAF443聚合物缀合物)的各种实验中，可以看出与HEMA-PC生物聚合物的缀合不会对蛋白质活性造成负面影响。

OG1448和OG1321显示与抗-PDGF抗体相当的IC50。

实施例40.对人视网膜微血管内皮细胞(HRMVEC)和人间充质周细胞(HMP)的共培养物中出芽的抑制。

为了模拟内皮细胞和周细胞共存于血管中并在血管生成期间一起增殖和迁移(即新生血管性AMD中的关键事件)的体内条件，建立了HRMVEC和HMP的三维共培养物，其目的是评价OG1448在这种复杂模型中抑制血管生成的能力。

在第7天将载体、阿瓦斯汀、抗PDGF-BB抗体(与上文相同)、阿瓦斯汀与抗PDGF-BB抗体组合和OG1448加入共培养物中。在第14天，使用CD31(内皮细胞)和aSMA(周细胞)的免疫组化染色以量化与实验组相比从建立的内皮细胞球体长出的芽的长度。

在两种不同的浓度下，与单独的阿瓦斯汀或单独的抗PDGF抗体相比，OG1448在抑制HRMVEC-HMP共培养物中内皮细胞/周细胞的出芽方面更加有效。此外，与阿瓦斯汀和抗PDGF-BB抗体的组合相比，OG1448也在抑制出芽方面更加有效。这证明OG1448相对于阿瓦斯汀和抗PDGF-BB抗体具有协同作用。结果示于下表和图40中。

实施例41.OG1448对食蟹猴(Cynomolgus monkeys)中激光诱导的脉络膜新血管形成的抑制功效。

使用食蟹猴中激光诱导的脉络膜新生血管形成(CNV)模型(公认的灵长类动物CNV模型)中评价OG1448的体内功效。参见例如Nork TM,Dubielzig RR,Christian BJ,etal.2011.Prevention of experimental choroidal neovascularization andresolution of active lesions by VEGF trap in nonhuman primates.ArchOphthalmol.129:1042-1052；Lloyd RL,Harris J,Wadhwa S,Chambers W.2008.Food andDrug Administration approval process for ophthalmic drugs in the U.S.CurrOpin Ophthalmol.19:190-194，以上两篇文献通过引用并入本文。在该模型中，激光损伤位于猴眼黄斑中的脉络膜视网膜复合体中，证据是布鲁赫氏膜(Bruch’s membrane)破裂。脉络膜新生血管形成在两至三周内发生。在不同的时间点，使用荧光素血管造影术评价临床相关的损伤(IV级)，其显示原发损伤以外的荧光素泄漏。这种CNV模型已广泛用于CNV损伤的研究，并用作所有目前批准的用于新生血管性AMD的治疗的基准。在该模型中，所有批准的用于新生血管性AMD的抗VEGF剂可有效抑制临床相关IV级损伤引起的渗漏。该研究在威斯康辛州麦迪逊的科文斯公司(Covance)进行。

总之，在动物中观察到对以0.5mg/眼或2.4mg/眼(基于蛋白质含量计算)的量进行的OG1448的单次玻璃体内注射的剂量相关反应，其中在治疗前允许CNV损伤发展14天并在随后的时间点使用荧光素血管造影术进行评价，荧光素血管造影术集中在视网膜/脉络膜上的临床相关的IV级损伤上。在0.5mg/眼的情况下，对IV级损伤的有益效果是显著的(p＝0.019；广义估计方程(GEE)模型；0.5mg治疗组(即第7组)对注射PBS的空白对照组(即第5组))。在2.4mg/眼的OG1448的情况下，在贝伐单抗或阿柏西普治疗剂量以内的剂量(以摩尔当量计)在改善IV级-CNV损伤的渗漏(leakage)方面是高效的(在从第15天开始到第43天IV级-CNV样损伤减少75％，而PBS治疗组中减少27％)(p＝0.0007；GEE模型；2.4mg治疗组9对注射PBS的空白对照组5)。

在该基准CNV模型中，OG1448有效抑制临床相关的IV级损伤引起的渗漏。

下表显示了分组和研究设计。该研究包括耐受性组(第1-4组)，然而为了本专利申请的目的，仅显示了具有药理活性的组和用磷酸盐缓冲盐水(PBS)注射处理的对照组。

评价两种治疗方案。在预防方案中，在第1天、第15天和第29天以0.24mg/眼/剂量(剂量含量基于蛋白质含量；第6组)双侧玻璃体内施用OG1448三次，在给药阶段的第8天用激光治疗；或在第1天、第15天和第29天施用PBS(第5组)，在给药阶段的第8天用激光治疗。使用在激光治疗第15、21、30、37和43天(给药阶段的第22、28、37、44和50天)的荧光素血管造影照片来评价临床相关的IV级损伤。

在治疗方案(第7组[0.5mg]，第8组[0.5mg]，第9组[2.4mg])中，激光诱导后15天(CNV损伤建立时)将OG1448以0.5mg(第7组和第9组)或2.4mg(第9组)的剂量玻璃体内施用于6只动物的两只眼睛。使用在激光治疗的第15、21、30、37和43天获得的荧光素血管造影照片评估临床相关的IV级损伤。

使用广义估计方程(Gee)模型(Halekoh,U&Yan J(2006)The R Package geepackfor Generalized Estimating Equations Journal of Statistical Software 15,2,pp1-11)，在干预方案中观察到对OG1448的剂量相关的反应。在0.5mg/眼的情况下，效果是显著的，如与载体对照相比IV级损伤百分比变化的差异所示(0.5mg治疗组(第7组)对注射PBS的空白对照组(第5组)；p＝0.019，GEE)。在使用2.4mg/眼的OG1448时(在贝伐单抗或阿柏西普的治疗剂量以内剂量，以摩尔当量计)，第43天在IV级损伤的百分比变化方面观察到75％的减少(2.4mg治疗组(第9组)对注射PBS的空白对照组(第5组)；p＝0.0007，GEE)，而PBS对照组中CNV减少27％。猴CNV模型中的各种实验数据显示在图41中。

在该CNV模型中，OG1448在抑制临床相关的IV级损伤引起的渗漏方面显示剂量依赖的有效性。这些结果与上述显示OG1448在对抗VEGF介导的血管生成活性方面的活性的研究一致。

实施例42组织分布和药代动力学

使用雄性新西兰红白F1交叉色素兔进行采用¹²⁵I-OG1448的组织分布和药代动力学研究。总之，这项研究显示OG1448在兔子中的玻璃体半衰期为16.1天，大约为报道的阿柏西普的半衰期(4.5天)的3倍和兰尼单抗半衰期(2.9天)的5倍(Bakri SJ,Snyder MR,ReidJM et al.2007.Pharmacokinetics of Intravitreal Ranibizumab[Lucentis].Ophthalmology 114:2179-2182)，其中较少暴露于血浆(约为暴露于玻璃体的0.2％)，血浆半衰期为6.5天(报道的阿柏西普的半衰期为6.5天)(Struble C,Koehler-Stec E,Zimmer E,and Tu W.2008.Pharmacokinetics and ocular tissue penetration of VEGFTrap after intravitreal injections in rabbits.EVER；Portorz,Slovenia)。

本研究的目的是评价在对雄性新西兰红白F1兔进行玻璃体内或静脉内给药后非放射性标记的测试制品和放射性标记的测试制品的眼部分布和药代动力学。治疗组和研究设计显示在下表中：

基于放射性分析获得PK参数。来自玻璃体、视网膜和脉络膜的清除曲线彼此相似。该模式与其他已建立的CNV治疗(例如兰尼单抗或阿柏西普)一致。下表列出了双侧单次玻璃体内注射0.25mg ¹²⁵I-OG1448后不同眼组织中的药代动力学参数。

在下表和图42中将各种VEGF抑制剂的眼组织半衰期与OG1448进行比较，表明OG1448可以在0.1μg/ml的药学活性最小抑制浓度之上保持大于90天，而Lucentis可保持30天，Eylea可保持50天：

研究显示兔中的OG1448的玻璃体半衰期为16.1天，大约为报道的阿柏西普的玻璃体半衰期(4.5天)的3倍和兰尼单抗的玻璃体半衰期(2.9天)的5倍(Bakri 2007，上文)，其中较少暴露于血浆(约为暴露于玻璃体的0.2％)，其血浆暴露与阿柏西普的血浆暴露一致(Sinapis CI,Routsias JG,Sinapis AI,et al.2011.Pharmacokinetics ofintravitreal bevacizumabin rabbits.Clinical Ophthalmology 5:697-704)。与兰尼单抗和阿柏西普的报道数据类似，玻璃体、视网膜和脉络膜清除曲线彼此相似。

实施例43.毒理学。

在科文斯公司进行OG1448的两次试验性非GLP单剂量的眼部耐受性和全身耐受性的研究：(i)在色素兔中的单剂量57天玻璃体内或静脉内耐受性研究；和(ii)在食蟹猴中玻璃体内给药(58-天研究)或静脉内给药(28-天研究)后单剂量耐受性研究。

简而言之，兔最初对0.25mg OG1448/剂量/眼的单剂量玻璃体内注射具有良好的耐受性，但与给药后约两周(或更晚)发生的持续的前段炎症(轻度至中度结膜充血、轻度至中度房水闪辉和房水细胞)和后段炎症(轻度到严重白色玻璃体细胞、轻度至中度玻璃体浑浊和存在玻璃体漂浮物，以及多病灶灰白色视网膜下炎症病灶)有关。这种炎症反应可通过免疫抑制和抗炎治疗改善。给药后的发作时间和对治疗的反应与动物对眼内施用人源化生物药物的典型免疫介导反应一致。

相比之下，食蟹猴对0.24mg OG1448/剂量/眼或1.4mg OG1448/剂量/眼的单一眼璃体内给药具有良好的耐受性，在眼科、临床和组织病理学上没有不利发现或免疫反应的证据。

在(上面讨论的)功效研究中，以0.24mg/眼/剂量玻璃体内注射三次，每次相隔14天，或者以0.5mg/眼/剂量单次注射，做至少40天的随访，如眼科检查所示，耐受性良好。在经治疗的动物的眼中未注意到免疫相关反应。

这些研究证明当以评价的剂量玻璃体内或静脉内施用OG1448时，耐受性良好。

实施例44.食蟹猴中的单剂量耐受性。

本部分研究的目的是评价在玻璃体内或静脉内施用OG1448后食蟹候对OG1448耐受性。

眼和全身耐受性组以及研究设计显示在下表中：

由委员会认证的兽医眼科医生在给药前对全部4组进行眼睛检查，并(i)对玻璃体内组在第3、8、15、29、43和57天进行眼睛检查，(ii)对静脉内组在第3、8、15和29天进行眼睛检查。当适用时，在第3、8、15、29、43和57天，通过临床观察和临床病理学对动物进行跟踪。还进行解剖病理学研究—在所有动物的尸体剖检期间进行宏观观察，并对第1组和第2组(第57天)的眼组织以及第3组和第4组(第29天)标准清单的全身器官进行微观评价。

在任何组中均无不利的或毒理学上有意义的发现。在任何组中均无临床观察和体重方面的发现。对于任何组(玻璃体内注射组的眼组织和静脉内注射组标准列表的器官/组织)均无来自解剖病理学的OG1448相关的宏观或微观发现。

玻璃体内给药组的眼科发现限于注射相关事件，例如轻度至中度且短暂存在的房水细胞和/或玻璃体细胞，和房水取样位点处的瘢痕。

实施例45聚合物OG1786的合成

OG1786是用于聚合物合成的九臂引发剂，其在OG1802的合成中用作前体。每条臂都用2-溴异丁酸酯封端，该基团能够在ATRP下引发聚合。OG1786是如图30所示的三氟乙酸(TFA)的盐。OG1786的制备如下。首先，如图31所示，使OG1550与TFA(三氟乙酸)反应以产生OG1546。

在装备有磁力搅拌棒和加料漏斗的1L圆底烧瓶中，加入OG1550(14.8g)、甲基叔丁基醚(MTBE)(350ml)和水(30ml)。搅拌混合物以溶解OG1550，然后在冰浴中冷却。在90分钟内向该混合物中滴加三氟乙酸(4.9ml)的水(90ml)溶液。加入完成后，将混合物再搅拌15分钟，然后从冰浴中取出，使其升温至室温。将混合物再搅拌(从冰浴中取出后)4-5小时，直到tlc显示剩余约5％的起始材料，并且水溶液的pH在3和4之间(pH试纸)。

使混合物分层(partitioned)。用水(30ml)洗涤MTBE层。合并水层，然后用MTBE(150ml)萃取水层。将该第二个MTBE相用水(30ml)洗涤。合并的水层用第三部分的MTBE(100ml)洗涤。第三个MBTE相用水(25ml)洗涤。再次合并水层(约250ml，pH约4，通过pH试纸测得)。

通过冷冻干燥收集产物。得到11.5g白色固体。这种物质是极度吸湿的，因此最好在氮气下处理。通过LCMS对产物进行证实。

然后，使制备的OG1546与OG1563反应得到OG1784(如图32所示)。

在氮气下，向装备有搅拌棒的250ml烧瓶中加入OG1546(吸湿剂，9.0g)，然后加入N,N-二甲基甲酰胺(110ml)。将混合物在室温下搅拌，直到所有OG1546溶解(约15分钟)，然后加入OG1563(29.9g)，混合物再搅拌3分钟，直到OG1563也溶解。将所得溶液在冰浴中冷却，在3分钟内加入N,N-二异丙基乙胺(37.6ml)，然后在5分钟内滴加50％的丙基膦酸酐(T3P)的乙酸乙酯(34.5ml)溶液(T3P的加入是放热的)。在T3P加入完成后，将烧瓶从冷却浴中取出并使其达到室温。然后以5分钟间隔取样用于LCMS分析。反应显示非常浅的黄色/棕褐色。

20分钟后，将反应物在冰浴中再次冷却，加入5ml水。然后从冷却浴中取出混合物，再分批加入50ml水，随后加入50ml 0.5M柠檬酸，然后加入乙酸异丙酯(300ml)。使混合物分层。用另外的乙酸异丙酯(150ml)萃取水相(约300ml)。水相为用于HPLC测试的AQ1。将合并的有机物层用柠檬酸水溶液(115ml，65mM，其是15ml的0.5M柠檬酸加上100ml水的混合物)洗涤，水相为AQ2(pH约3)。有机相用水/饱和氯化钠(100ml/25ml)洗涤，水相为AQ3(pH约3)。有机相最后用饱和氯化钠(100ml)洗涤，水相为AQ4。AQ级分均不含有任何重要产物(未提供数据)。通过LCMS证实有机相含有产物。产物用硫酸钠(80g)干燥，过滤，用乙酸异丙酯(75ml)冲洗，并在旋转蒸发器上浓缩，得到棕褐色油状物(33.2g)。将粗产物在氮气下储存过夜。

第二天使粗产物达到室温，然后溶解于乙腈/水(46ml/12ml)中，并使用HPLC盘式过滤器(Cole-Parmer PTFE0.2μm，产品编号02915-20)过滤。将滤液分成三等份并在三次运行中纯化。

上样至用50％乙腈/水平衡的RediSep Rf Gold C18柱(275g，SN 69-2203-339，批号24126-611Y)上。使用以下梯度(溶剂A：水，溶剂B：乙腈)以100ml/min的流速洗脱物质。通过HPLC检测所有相关级分。合并确定为足够纯的(来自所有三次运行的)级分并在旋转蒸发仪上浓缩(浴温保持在约20℃)，然后在二氯甲烷(100ml)和水(5ml)/饱和氯化钠(25ml)之间分配。将水层用二氯甲烷(2×30ml)再萃取两次。将合并的有机物层用硫酸钠(35g)干燥，过滤，用DCM(30ml)冲洗，并浓缩。通过LCMS方法证实产物和纯度。

OG1784批次	R5172	R5228
			使用的OG1546	5.3g	9.0g
使用的OG1563	17.6g	29.9g
			分离后产率	53％	58％
纯度(a/a 210nm)	99.3％	100.0％

接下来，由OG1784制备OG1405，如图33所示。在装备有磁力搅拌棒的500ml圆底烧瓶中，加入OG1784(20.9g)，然后加入二氯甲烷(50ml)，然后加入三氟乙酸(20ml)。将混合物在室温下搅拌，HPLC分析显示在23分钟内完全脱保护。将混合物在旋转蒸发器上浓缩，再溶解在二氯甲烷(25ml)中并再次浓缩，然后再溶解于乙腈(25ml)中并再次浓缩。通过LCMS证实产物。将由此得到的物质(OG1405，34.5g，假定定量收率为21.0g)用作下一步中的油状粗产物。不需要纯化。

接下来，使OG1405与OG1402反应以制备OG1785，如图34所示。在氮气下，在装备有搅拌棒的500ml烧瓶中加入OG1402(5.5g)，随后加入乙腈(70ml)，然后加入N,N-二异丙基乙胺(26.3ml)和T3P溶液(见上文)(7.9ml)。将溶液在室温下搅拌30分钟，然后在冰水浴中冷却，加入OG1405(以上所得油状粗产物，34.5g)的乙腈(70ml)溶液。将混合物升温至室温。20分钟后，将反应物在冰水浴中冷却，并用水(5ml)淬灭。然后使用旋转蒸发器将混合物在真空下浓缩至一半体积。取样用于LCMS。

加入更多的水(50ml)，随后加入0.5M柠檬酸(75ml)和乙酸异丙酯(175ml)。混合物在5分钟内分层。水层再用乙酸异丙酯(50mL)萃取。合并的有机物层用柠檬酸水溶液(0.13M，30ml，由10ml 0.5M柠檬酸和20ml水组成)洗涤。然后用饱和氯化钠(25ml)和水(25ml)的混合物洗涤有机物层，最后用饱和氯化钠(25ml)洗涤。然后用硫酸钠(124g)干燥，过滤，用乙酸异丙酯(30ml)冲洗，并在旋转蒸发器浓缩，得到棕褐色油状物(27.3g)。取样用于LCMS分析。

将油状物溶解在乙腈/水(3:1，15ml/5ml)中，通过HPLC盘式过滤器(Cole-ParmerPTFE膜0.2μm，产品编号02915-20)过滤，并分成三等份，其中对每份进行如下的单独纯化。

将每份上样至用50％溶剂B(乙腈)/50％溶剂A(水)平衡的Redi-Sep Gold C18柱(275g，SN-69-2203-339，批号241234-611W)。然后通过反相HPLC采用溶剂A：水/溶剂B：乙腈梯度纯化该物质。合并适当的级分并在二氯甲烷(150ml)与水(5ml)/饱和氯化钠(25ml)之间进行分配。水层用二氯甲烷(2×50ml)萃取两次。合并的有机物层用硫酸钠(60g)干燥，过滤，用二氯甲烷(40ml)冲洗并浓缩。通过包括LCMS在内的各种分析证实结构和纯度：分离泡沫状固体OG1785(R5329，19.0g，83％产率，95.1％纯度(a/a 210nm))，于4℃在氮气下储存。

接下来，使用三氟乙酸(TFA)除去OG1785上的叔丁氧基羰基保护基团，得到OG1786，如图35所示。

实施例46.聚合物1801的合成。

将化合物OG1802与TAF443的巯基缀合以产生OG1448。首先由引发剂OG1786制备聚合物OG1801。OG1801具有胺官能团，其在聚合物合成期间(比马来酰亚胺)更稳定。为了合成聚合物OG1801，使用改进版本的ATRP，其中通过向Cu(II)中加入金属铜原位产生铜物质(Cu(I))。基于分批加入的单体(HEMA-PC)OG47的以及目标分子量(MW)计算反应中所需的起始原料和试剂。

在手套箱中称量50g单体OG47，并在室温下加入200mL脱气的EtOH以溶解单体；取样进行单体浓度试验。将称量的Cu(II)、Bpy、Cu(0)加入500mL烧瓶中，用氩气吹扫，同时向烧瓶中加入单体溶液；用塞子密封烧瓶并抽真空25分钟直至无气泡。反应物颜色逐渐从浅绿色变为深绿色，然后变为浅棕色；在手套箱中称量约200mg引发剂OG1786，并在室温下溶解在约2000μL DMF中以制备100mg/mL的储备溶液；取样用于引发剂浓度和纯度试验；在氩气下向烧瓶中加入引发剂溶液。反应溶液变成深棕色，并开始随时间变稠；密封***，让反应进行2天。

然后制备OG1801用于加入马来酰亚胺，并按如下过程除去催化剂(铜)：使用预先装柱的Rf正相硅胶柱来除去催化剂。基于反应混合物中铜的量来选择柱的尺寸。例如，将330g柱(目录号69-2203-330，柱尺寸330g，CV＝443mL)用于50g批次的OG1801。当EtOH为洗脱溶剂时，特氟隆管(Teflon)用于所有连接。

除去铜后，将所有级分分批转移到圆底烧瓶中，并通过旋转蒸发器在45-50℃下减压蒸发EtOH至干燥。在该步骤中，监测从冷凝中收集的EtOH的体积以确保EtOH去除率>90％。将聚合物溶解在250mL WFI中，并使用0.2μm过滤器过滤。得到约150mg/mL的澄清至浅黄色聚合物溶液。使用前，溶液可在2-8℃储存长达3个月。

实施例47.聚合物OG1802的合成。

基于分批加入的OG1801计算反应所需的起始原料和试剂。接头为3-马来酰亚胺基丙酸、NHS酯。向50g聚合物溶液(约150mg/mL)中加入30ml 0.5M磷酸钠(WFI溶液，pH8)。搅拌1分钟；pH试纸测量pH值为8.0。称量204.8mg接头并溶解于4.1mL DMF中以制备50mg/mL的储备液；在强烈搅拌下将接头溶液滴加到聚合物溶液中，每分钟加入815μL。加入4095μL接头溶液花费5分钟。在室温下反应30分钟。用20mL 5％乙酸淬灭反应以使最终pH为5。使用1L真空过滤器(0.2μm)过滤溶液。

然后对OG1802进行如下纯化：将Milipore交叉流盒式膜用于水性***中的聚合物纯化。从将聚合物溶液浓缩至250mL(约200mg/mL)开始进行。从储液器中加入新鲜WFI，并将新鲜WFI进料的流速调节至与渗透物相同(～2mL/min)。UF/DF在2-8℃下过夜。通常使用2.5L的WFI(相对于聚合物溶液为10倍的体积比)。收集保留物样品用于纯度测试。目标纯度>98％。通过0.2μM 1L过滤瓶过滤聚合物溶液。在缀合前，聚合物溶液可以在2-8℃下储存长达3个月。

实施例48.OG1448的制剂；可注射性。

使用1.7mM KH₂PO₄的无菌注射用水溶液、5mM Na₂HPO₄的无菌注射用水溶液、150mMNaCl的无菌注射用水溶液制备27.2mg/ml和44.5mg/ml的OG1448溶液。根据体积使用截留分子量为30kD的Millipore Pellicon XL TFF滤筒(目录号PXB030A50，EMD Millipore)或截留分子量为30kD的VIVACELL 100旋转浓缩器(目录号VC1022，赛多利斯公司(Sartorius))浓缩OG1448缀合物。将27.2mg/ml的TAF溶液经由30gauge(G)1/2英寸的针头玻璃体内注射到猴子中用于上述功效实验。不需要过大的压力来推动OG1448穿过针头。在实验室中测试44.5mg/ml溶液的可注射性，该溶液也能够被女性操作者推过针头而不需要过大的压力。

实施例49.储存稳定性。

使用pH7.4的、44.5mg/ml的、在PBS中的R5606批次的OG1448参照液(如上所述)进行正在进行的稳定性研究。选择三个温度用于研究：室温(RT)、4℃和-20℃。采样频率为0、14、28、91、181和362天。通过SDS-PAGE和分析型AE-HPLC对未反应和游离(sequestered)蛋白质以及潜在的聚集体进行分析以评价样品。我们观察到(数据未显示)AE-HPLC显示在全部三个温度下储存长达6个月后OG1448的蛋白质杂质小于5％，这与时间零点的水平相似。该研究正在进行中。

实施例50.备选的磷酰胆碱聚合物。

按照如下所述合成HEA-PC聚合物。与上述甲基丙烯酸酯HEMA-PC相对，HEA-PC(2-(丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基铵)乙基磷酸酯)为丙烯酸酯，且具有以下结构：

HEA-PC聚合至实施例23中所示的引发剂(即化合物L)上。

通过将2.2mg引发剂溶解在11μl无水DMF中来制备200mg/mL的引发剂储备溶液，通过将4.6mg Me6TREN溶解在23μL无水DMF中来制备200mg/ml的配体溶液中。将8.25μl的引发剂储备溶液和13.6μl的配体分配到试管中。在-78℃下脱气5分钟，然后用氩气再填充，并加入1.2mg CuBr。脱气，再填充氩气。在-78℃下向反应器内的溶液中加入HEA-PC在甲醇中的储备溶液(称出0.461g HEA-PC并溶解在0.5mL甲醇中)。用200μl甲醇冲洗小瓶，并将其在-78℃下加入反应器中，然后加入0.5mL蒸馏水，再加入200μl水。彻底除气，直到看不到鼓泡且所有不均匀性消失(固体颗粒溶解或消失)。用4psi氩气重新填充，并使反应在室温下进行1小时。反应物已经是粘稠的。使反应进行约1小时。加入双吡啶的甲醇溶液(5mg双吡啶，0.5uL甲醇)。再加入2-3ml甲醇，使催化剂在4℃氧化过夜。通过¹H NMR估算转化率为94％。

第二天，将聚合物透析，并在pH 7.4的1×PBS中使用Shodex SB806M_HQ柱(7.8×300mm)以1ml/min进行SEC/MALS分析，得到以下结果：PDI为1.157，Mn为723.5kDa，Mp为820.4kDa，Mw为837.2kDa(透析前PDI为1.12，Mn＝695kDa，Mp＝778kDa)。接下来，将马来酰亚胺官能团加入到聚合物中，使得聚合物可以与蛋白质(包括TAF443)缀合。

接下来，将马来酰亚胺Mal-PEG4-PFP(参见上述实施例23)酯搭接到HEA-PC聚合物上，如实施例23所示。如本文针对HEMA-PC聚合物所讨论的，然后可将得到的马来酰亚胺官能化的HEA-PC聚合物与巯基缀合。

还使用具有以下结构的2-(丙烯酰胺基)乙基-2-(三甲基铵)乙基磷酸酯(Am-PC)单体制备丙烯酰胺PC聚合物：

使用具有以下结构的3臂引发剂(TFA盐)进行Am-PC的聚合：

进行Am-PC聚合物的合成，合成过程如下：

通过将9mg Me6TREN溶解在45μL无水DMF中制备200mg/mL的配体储备溶液。将19.7μL的储备溶液加入到反应容器中。通过将6.5mg物质溶解在32.5μL DMF中制备200mg/mL的引发剂储备溶液。向以上所得的配体中加入11uL引发剂储备溶液。脱气5分钟。加入1mgCuBr。通过将4mg CuBr₂溶解在20μLDMF中制备200mg/mL的CuBr₂储备溶液。将0.5g单体(AmPC)加入到1mL甲醇(缓慢溶解/粘稠溶液)中，然后加入1μL CuBr₂的储备溶液。将单体溶液滴加到上述反应混合物中。用1mL水冲洗。将反应混合物彻底脱气(冻-融)。让反应进行24小时。

然后可以透析Am-PC聚合物。通过SEC/MALS测定上述聚合物的分子量：Mn为215kDa，Mp为250kDa，PDI为1.17。通过¹H NMR估算转化率为94％。按照上文针对HEMA-PC和HEA-PC所讨论的，将马来酰亚胺官能团(functionality)加入到Am-PC聚合物中。马来酰亚胺官能化的Am-PC聚合物可以如上所述与蛋白质如TAF443缀合。

实施例51.用于计算化合物中游离马来酰亚胺的反向Ellman测定法。

在向聚合物OG1801加入马来酰亚胺官能团以形成OG1802(参见上文)之后，使用Ellman测定法测定样品中马来酰亚胺官能团(即可缀合的马来酰亚胺)的量。在中性和碱性pH下，在水中硫醇将Ellman试剂(DTNB)转化为TNB-然后转化为TNB2-，其为黄色(在412nm下测量)。使用半胱氨酸建立标准曲线。由于马来酰亚胺与硫醇反应，该测定实际上测量剩余的硫醇(半胱氨酸)。按照(原始硫醇-加入马来酰亚胺聚合物后留下的硫醇)/(原始硫醇)来计算抑制作用，并将其表示为百分比。

在测定中使用的试剂：使用62.5μM至2μM的半胱氨酸制备标准曲线。通过将粉末溶解在pH7.4的1×PBS(反应缓冲液)中并充分混合来制备聚合物储备溶液。将等摩尔的聚合物和半胱氨酸溶液混合，并使其在27℃下反应30分钟。将150μM的DTNB溶液加入到半胱氨酸标准品和聚合物/半胱氨酸反应中，并在27℃下显色5分钟。在Spectramax读板机上读取412nm处的OD，并用Softmax Pro软件和半胱氨酸标准曲线计算抑制百分比。

上文或下文所引用的所有专利申请、网站、其它出版物、登录号等等通过引用整体并入本文用于所有目的，其程度如同具体地单独指出每个单独文献通过引用并入本文。如果序列的不同版本与在不同时间进行保藏的保藏号相关联，则该序列指在本申请有效申请日时与保藏号相关联的版本。有效申请日指的是实际申请日中较早的一个或涉及保藏号的优先权申请的申请日(如适用)。同样地，如果在不同时间公开了出版物、网站等的不同版本，则本文中的版本指的是在本申请的有效申请日时最近公布的版本，除非另有说明。本发明的任何特征、步骤、元素、实施方式或方面均可以与任何其它特征、步骤、元素、实施方式或方面组合使用，除非另有明确说明。尽管为了清楚和理解的目的通过说明和实施例的方式对本发明进行了详细的描述，但显而易见的是，可以在所附权利要求的范围内进行某些改变和修改。

序列

SEQ ID NO.1

SEQ ID NO.2

SEQ ID NO.3

SEQ ID NO.4

SEQ ID NO.5

SEQ ID NO.6

SEQ ID NO.7

SEQ ID NO.8

SEQ ID NO.9

SEQ ID NO.10

SEQ ID NO.11

SEQ ID NO.12

SEQ ID NO.13

SEQ ID NO.14

SEQ ID NO.15

SEQ ID NO.16

SEQ ID NO.17

SEQ ID NO.18

SEQ ID NO.19

SEQ ID NO.21

SEQ ID NO.22

SEQ ID NO.23

SEQ ID NO.24

SEQ ID NO.25

SEQ ID NO.26

SEQ ID NO.27

SEQ ID NO.28

SEQ ID NO.29

SEQ ID NO.30

SEQ ID NO:31：编码VEGF抗体重链-PDGFR融合物的核酸

GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCCatgaaagctgtggtgctggccgtggctctggtcttcctgacagggagccaggctctggtcgtcacacccccggggccagagcttgtcctcaatgtctccagcaccttcgttctgacctgctcgggttcagctccggtggtgtgggaacggatgtcccaggagcccccacaggaaatggccaaggcccaggatggcaccttctccagcgtgctcacactgaccaacctcactgggctagacacgggagaatacttttgcacccacaatgactcccgtggactggagaccgatgagcggaaacggctctacatctttgtgccagatcccaccgtgggcttcctccctaatgatgccgaggaactattcatctttctcacggaaataactgagatcaccattccatgccgagtaacagacccacagctggtggtgacactgcacgagaagaaaggggacgttgcactgcctgtcccctatgatcaccaacgtggcttttctggtatctttgaggacagaagctacatctgcaaaaccaccattggggacagggaggtggattctgatgcctactatgtctacagactccaggtgtcatccatcaacgtctctgtgaacgcagtgcagactgtggtccgccagggtgagaacatcaccctcatgtgcattgtgatcgggaatgaggtggtcaacttcgagtggacatacccccgcaaagaaagtgggcggctggtggagccggtgactgacttcctcttggatatgccttaccacatccgctccatcctgcacatccccagtgccgagttagaagactcggggacctacacctgcaatgtgacggagagtgtgaatgaccatcaggatgaaaaggccatcaacatcaccgtggttgagagcggcggtggtggcggctccggtggaggcggaagcgaggtgcagctggtggaatccggcggaggcctggtccagcctggcggatccctgagactgtcctgtgccgcctccggctacgacttcacccattacggcatgaactgggtccgacaggcccctggcaagggcctggaatgggtcggatggatcaacacctacaccggcgagcccacctacgccgccgacttcaagcggcggttcaccttctccctggacacctccaagtccaccgcctacctgcagatgaactccctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaagtacccctactactacggcacctcccactggtacttcgacgtgtggggccagggcaccctggtcaccgtgtcctccgcctctaccaagggcccctccgtgttccctctggccccctccagcaagtccacctctggcggcaccgccgctctgggctgcctggtcaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgtcctggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacacctttccagccgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtcgtgaccgtgccctccagctctctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagtcctgcgacaagacccacacctgtcccccctgccctgcccctgaagcagccggtgcacccagcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaatgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtctccaacaaggccctgcctgcccccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgcgagcctcaggtgtacacactgccacccagccgggaagagatgaccaagaaccaggtctccctgacctgtctggtcaagggcttctacccctccgatatcgccgtcgaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgaccgtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtcctgcagccccggcaagtgataaTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC

SEQ ID NO:32：编码VEGF抗体轻链的核酸

GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCCatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtggcaacagctacaggcgtgcactccgacatccagctgacccagtccccctccagcctgtccgcctctgtgggcgacagagtgaccatcacctgttccgccagccaggacatctccaactacctgaactggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaaggtgctgatctacttcacctcctccctgcactccggcgtgccctccagattctccggctctggctccggcaccgactttaccctgaccatctccagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcagtactccaccgtgccctggaccttcggccagggcaccaaggtggaaatcaagcggaccgtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggaaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtccagcaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctcagctccccagtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgctagtaaTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC

Claims (145)

1.VEGF/PDGF双重拮抗剂，其包含与PDGF拮抗剂连接的VEGF拮抗剂，其中所述VEGF拮抗剂(a)为VEGF的抗体或VEGFR的抗体，或所述VEGF拮抗剂(b)为VEGFR细胞外陷阱段，并且所述PDGF拮抗剂(a)为PDGF的抗体或PDGFR的抗体，或所述PDGF拮抗剂(b)为PDGFR细胞外陷阱段，条件是所述VEGF拮抗剂和所述PDGF拮抗剂不都是抗体。

2.根据权利要求1所述的双重拮抗剂，其中所述VEGF拮抗剂是包含重链和轻链的抗体，所述PDGF拮抗剂是PDGFR细胞外陷阱段，所述抗体的重链通过接头与所述PDGFR细胞外陷阱段的C末端融合，且所述轻链与所述重链形成复合体。

3.根据权利要求1或2所述的双重拮抗剂，其中所述抗体为Fab片段。

4.根据权利要求1所述的双重拮抗剂，其中所述抗体为完整抗体。

5.根据前述权利要求1中任一项所述的双重拮抗剂，其中所述PDGF拮抗剂为PDGFR-α受体或PDGFR-β受体的细胞外陷阱段，所述VEGF拮抗剂为VEGF的抗体。

6.前述权利要求中任一项所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述PDGFR细胞外陷阱段包含PDGFR-β的D1-D5结构域中的一个或多个。

7.根据权利要求6所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述PDGFR细胞外陷阱段包含PDGFR-β的D1-D3结构域。

8.根据权利要求7所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述PDGFR细胞外陷阱段包含SEQID NO.11的氨基酸33-314。

9.根据权利要求5-8所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述VEGF拮抗剂包含抗VEGF的抗体。

10.根据权利要求9所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述抗VEGF的抗体为抗VEGF-A的抗体。

11.根据权利要求6-10中任一项所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述PDGFR细胞外陷阱段位于所述重链或所述轻链的C末端。

12.根据权利要求6-10中任一项所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述PDGFR细胞外陷阱段位于所述重链或所述轻链的N末端。

13.根据权利要求12所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其还包含位于PDGFR陷阱和抗VEGF的抗体重链之间的接头。

14.根据权利要求13所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述接头为GGGGSGGGGS、GG或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG。

15.根据权利要求14所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述接头为GGGGSGGGGS。

16.根据权利要求15所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述抗VEGF的抗体重链包含CDR_H1:GYDFTHYGMN、CDR_H2:WINTYTGEPTYAADFKR和CDR_H3:YPYYYGTSHWYFDV。

17.根据权利要求16所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中VEGF抗体轻链包含CDR_L1:SASQDISNYLN、CDR_L2:FTSSLHS和CDR_L3:QQYSTVPWT。

18.根据权利要求17所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中VEGF抗体重链同种型为包含CH₁结构域、铰链结构域、CH₂结构域和CH₃结构域的IgG1，轻链同种型为κ。

19.根据权利要求18所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中IgG1恒定结构域具有SEQ IDNO.17所示的序列，轻链恒定区具有SEQ ID NO.18所示的序列。

20.根据权利要求19所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述IgG1恒定结构域具有一个或多个突变以降低效应子功能。

21.根据权利要求20所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述突变针对一个或多个以下氨基酸位置(EU编号)：E233、L234、L235、G236、G237、A327、A330和P331。

22.根据权利要求20所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述突变选自下组：E233P、L234V、L234A、L235A、G237A、A327G、A330S和P331S(EU编号)。

23.根据权利要求22所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其具有以下突变：L234A、L235A和G237A。

24.根据权利要求23所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述重链还包含通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基。

25.根据权利要求24所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述半胱氨酸残基选自(EU编号)Q347C和L443C。

26.根据权利要求25所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述半胱氨酸残基为L443C。

27.根据权利要求26所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中与细胞外陷阱段形成的重链陷阱融合物具有SEQ ID NO.9的氨基酸序列，轻链具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列。

28.根据权利要求3所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述PDGFR陷阱包含PDGFR-β的D1-D5结构域中的一个或多个。

29.根据权利要求28所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述PDGFR陷阱包含PDGFR-β的D1-D3结构域。

30.根据权利要求29所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述PDGFR陷阱包含SEQ IDNO.11的氨基酸33-314。

31.根据权利要求30所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述VEGF拮抗剂包含抗VEGF的抗体。

32.根据权利要求31所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中VEGF抗体Fab片段包括VEGF-A抗体Fab片段。

33.根据权利要求32所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述PDGFR陷阱位于Fab重链或轻链的C末端。

34.根据权利要求33所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述PDGFR陷阱位于Fab重链或轻链的N末端。

35.根据权利要求34所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中与细胞外陷阱段形成的重链融合物包含VEGF-A抗体Fab片段重链，所述轻链包含VEGF-A抗体轻链。

36.根据权利要求35所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其还包含位于所述PDGFR陷阱和所述VEGF抗体Fab片段重链之间的接头。

37.根据权利要求36所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述接头选自GGGGSGGGGS、GG和GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG。

38.根据权利要求37所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述接头为GGGGSGGGGS。

39.根据权利要求38所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述VEGF抗体Fab片段重链包含CDR_H1:GYDFTHYGMN、CDR_H2:WINTYTGEPTYAADFKR和CDR_H3:YPYYYGTSHWYFDV。

40.根据权利要求39所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中VEGF抗体轻链包含CDR_L1:SASQDISNYLN、CDR_L2:FTSSLHS和CDR_L3:QQYSTVPWT。

41.根据权利要求40所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中VEGF抗体重链同种型为包含CH₁结构域的IgG1，轻链同种型为κ。

42.根据权利要求1-41中任一项所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其还包含半衰期延长部分。

43.根据权利要求42所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述半衰期延长部分为聚合物。

44.根据权利要求43所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物选自PEG和两性离子聚合物。

45.根据权利要求44所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物包含两性离子聚合物。

46.根据权利要求45所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述两性离子聚合物包含含有磷酰胆碱的单体。

47.根据权利要求46所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述单体包含2-(丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯。

48.根据权利要求46所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述单体包含2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯(HEMA-PC)。

49.根据权利要求48所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有3条或更多条臂。

50.根据权利要求49所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12条臂。

51.根据权利要求50所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有3、6或9条臂。

52.根据权利要求51所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有9条臂。

53.根据权利要求49所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中缀合物的聚合物部分的峰值分子量在300,000Da和1,750,000Da之间。

54.根据权利要求53所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述缀合物的聚合物部分的峰值分子量在500,000Da和1,000,000Da之间。

55.根据权利要求54所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述缀合物的聚合物部分的峰值分子量在600,000Da和800,000Da之间。

56.根据权利要求55所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有9条臂。

57.根据权利要求43-56中任一项所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述VEGF/PDGF双重拮抗剂共价键合至所述聚合物。

58.根据权利要求57所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物与选自氨基、羟基、巯基和羧基的部分共价键合。

59.根据权利要求58所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物与巯基共价键合。

60.根据权利要求59所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述巯基来自天然存在的半胱氨酸残基。

61.根据权利要求59所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述巯基来自通过重组DNA技术添加的半胱氨酸残基。

62.根据权利要求61所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物与SEQ ID NO.9第731位上的半胱氨酸残基共价键合。

63.根据权利要求1所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述VEGF拮抗剂包含含有VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的一个或多个细胞外区段的VEGFR细胞外陷阱段，所述PDGF拮抗剂为抗PDGF抗体。

64.根据权利要求63所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中VEGFR的细胞外区段包含D1-D7结构域中的一个或多个。

65.根据权利要求63所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述细胞外区段包含来自VEGFR-1的D2和来自VEGFR-2的D3。

66.根据权利要求65所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述D2连接D3的N-末端并且还包含所述结构域之间的接头。

67.根据权利要求63所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述PDGF拮抗剂是完整抗体。

68.根据权利要求63所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述PDGF拮抗剂是Fab片段。

69.根据权利要求67所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中抗PDGFR抗体为人源化2A1E2、HuM4Ts.22、人源化1B3、人源化2C5、PDGF-BB抗体、PDGF-DD抗体、PDGF-BB抗体或PDGF-AB抗体。

70.根据权利要求69所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂蛋白，其中重链为IgG1，轻链为κ。

71.根据权利要求70所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述重链具有选自Q347C或L443C的半胱氨酸。

72.根据权利要求71所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其还包含与所述半胱氨酸缀合的半衰期延长部分。

73.根据权利要求72所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂蛋白，其中所述半衰期延长部分包含两性离子聚合物，所述聚合物包含一种或多种单体单元，并且其中至少一种单体单元包含两性离子基团。

74.根据权利要求73所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述两性离子基团包含磷酰胆碱。

75.根据权利要求74所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述单体包含2-(丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯。

76.根据权利要求74所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述单体包含2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯(HEMA-PC)。

77.根据权利要求76所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有3条或更多条臂。

78.根据权利要求77所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12条臂。

79.根据权利要求78所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有3、6或9条臂。

80.根据权利要求79所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有9条臂。

81.根据权利要求80所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中缀合物的聚合物部分的峰值分子量在300,000Da和1,750,000Da之间。

82.根据权利要求81所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述缀合物的聚合物部分的峰值分子量在500,000Da和1,000,000Da之间。

83.根据权利要求82所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述缀合物的聚合物部分的峰值分子量在600,000Da和800,000Da之间。

84.根据权利要求1所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述PDGF拮抗剂为包含选自PDGFR-α和PDGFR-β的PDGFR的一个或多个细胞外区段的PDGF细胞外陷阱段，所述VEGF拮抗剂为包含选自VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的VEGFR的一个或多个细胞外区段的VEGF细胞外陷阱段。

85.根据权利要求84所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中VEGFR的细胞外陷阱段包含D1-D7结构域中的一个或多个。

86.根据权利要求85所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述细胞外陷阱段包含来自VEGFR-1的D2和来自VEGFR-2的D3。

87.根据权利要求86所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述D2连接D3的N-末端且还包含所述结构域之间的接头。

88.根据权利要求84所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述PDGFR陷阱包含PDGFR-β的D1-D5结构域中的一个或多个。

89.根据权利要求88所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述PDGFR陷阱包含PDGFR-β的D1-D3结构域。

90.根据权利要求89所述所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述PDGFR陷阱包含SEQID NO.11的氨基酸33-314。

91.根据权利要求90所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其还包含所述VEGF拮抗剂与所述PDGF拮抗剂之间的接头序列。

92.根据权利要求84-91中任一项所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其还包含半衰期延长部分。

93.根据权利要求92所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述半衰期延长部分包含选自PEG和两性离子聚合物的聚合物。

94.根据权利要求93所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述半衰期延长部分包含两性离子聚合物。

95.根据权利要求94所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述两性离子聚合物包含含有磷酰胆碱的单体。

96.根据权利要求95所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述单体包含2-(丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯。

97.根据权利要求95所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述单体包含2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2’-(三甲基铵乙基)磷酸酯(HEMA-PC)。

98.根据权利要求97所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有3条或更多条臂。

99.根据权利要求98所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12条臂。

100.根据权利要求99所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有3、6或9条臂。

101.根据权利要求100所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有9条臂。

102.根据权利要求99所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中缀合物的聚合物部分的峰值分子量在300,000Da和1,750,000Da之间。

103.根据权利要求102所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述缀合物的聚合物部分的峰值分子量在500,000Da和1,000,000Da之间。

104.根据权利要求103所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述缀合物的聚合物部分的峰值分子量在600,000Da和800,000Da之间。

105.根据权利要求104所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有9条臂。

106.根据权利要求5所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述细胞外陷阱段与PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD中的一种或多种结合。

107.根据权利要求107所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中细胞外陷阱结合PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-DD。

108.根据权利要求108所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述细胞外陷阱抑制PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-DD与PDGFR-αα，PDGFR-αβ和PDGFR-ββ受体中的任一种结合。

109.纯化VEGF/PDGF双重拮抗剂的方法，其包括：

使所述VEGF/PDGF双重拮抗剂与结合所述VEGF/PDGF双重拮抗剂的亲和层析残留物接触；

从所述亲和层析树脂洗脱所述VEGF/PDGF双重拮抗剂以形成包含所述VEGF/PDGF双重拮抗剂的亲和层析洗脱液；

使所述亲和层析洗脱液与结合所述VEGF/PDGF双重拮抗剂的离子交换树脂接触；以及

从所述离子交换树脂洗脱所述VEGF/PDGF双重拮抗剂。

110.根据权利要求110所述的方法，其中所述离子交换树脂为阴离子交换树脂

111.根据权利要求110所述的方法，其中所述离子交换树脂为阳离子交换树脂。

112.根据权利要求110、111和112中任一项所述的方法，其中所述亲和层析树脂是蛋白A柱。

113.液体药物组合物，其包含：

药学上可接受的赋形剂；和至少一种VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述组合物的内毒素小于0.2EU/ml。

114.根据权利要求114所述的液体药物组合物，其中所述组合物的内毒素小于0.1EU/ml。

115.根据权利要求115所述的液体药物组合物，其中所述组合物的内毒素小于0.05EU/ml。

116.根据权利要求48所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有以Mw计的在约100kDa和1500kDa之间的分子量。

117.根据权利要求116所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物由适合ATRP的具有一个或多个聚合物引发位点的引发剂制成。

118.根据权利要求117所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂具有3个或更多个聚合物引发位点。

119.根据权利要求118所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个聚合物引发位点。

120.根据权利要求119所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂具有3、6或9个聚合物引发位点。

121.根据权利要求120所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂具有9个聚合物引发位点。

122.根据权利要求121所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂为OG1786。

123.根据权利要求116所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有以Mw计的在约500kDa和1000kDa之间的分子量。

124.根据权利要求123所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物由适合ATRP的具有一个或多个聚合物引发位点的引发剂制成。

125.根据权利要求124所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂具有3个或更多个聚合物引发位点。

126.根据权利要求125所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个聚合物引发位点。

127.根据权利要求126所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂具有3、6或9个聚合物引发位点。

128.根据权利要求127所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂具有9个聚合物引发位点。

129.根据权利要求128所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂为OG1786。

130.根据权利要求125所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有以Mw计的在约600kDa和约900kDa之间的分子量。

131.根据权利要求130所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物由适合ATRP的具有一个或多个聚合物引发位点的引发剂制成。

132.根据权利要求131所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂具有3个或更多个聚合物引发位点。

133.根据权利要求132所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个聚合物引发位点。

134.根据权利要求133所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂具有3、6或9个聚合物引发位点。

135.根据权利要求134所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂具有9个聚合物引发位点。

136.根据权利要求135所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂为OG1786。

137.根据权利要求116所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物具有以Mw计的750kDa加或减15％的分子量。

138.根据权利要求137所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述聚合物由适合ATRP的具有一个或多个聚合物引发位点的引发剂制成。

139.根据权利要求140所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂具有3个或更多个聚合物引发位点。

140.根据权利要求139所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂具有3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个聚合物引发位点。

141.根据权利要求140所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂具有3、6或9个聚合物引发位点。

142.根据权利要求141所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂具有9个聚合物引发位点。

143.根据权利要求142所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂，其中所述引发剂为OG1786。

144.前述权利要求中任一项所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂用于治疗或预防疾病。

145.前述权利要求中任一项所述的VEGF/PDGF双重拮抗剂用于治疗或预防新生血管性病症，任选眼部新生血管性病症，例如湿性年龄相关性黄斑变性。