CN107427466B - 从细胞膜衍生的纳米囊泡及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞膜衍生的纳米囊泡，其制备方法，使用纳米囊泡的药物组合物和诊断试剂盒。因为从纳米囊泡中除去了用于递送治疗性或诊断性物质所不必要的细胞内物质(例如，遗传物质和胞质蛋白)，因此根据本发明的细胞膜衍生的纳米囊泡可以防止潜在的副作用的发生。此外，由于纳米囊泡可以靶向特定类型的细胞或组织，治疗性或诊断性物质可主要被递送至靶细胞或组织，同时可以抑制治疗性或诊断性物质被递送至非靶向部位。因此，当细胞膜衍生的纳米囊泡被应用于疾病治疗时，可以减少药物等治疗物质的副作用，从而可以在治疗疾病的过程中缓解患者的痛苦和不便，并且可以改进治疗功效。此外，本发明的装载有用于治疗或诊断疾病的物质的细胞膜衍生的纳米囊泡和制备纳米囊泡的方法可以在体外或体内用于治疗或诊断目的，或用于实验用途。

Description

从细胞膜衍生的纳米囊泡及其用途
技术领域
本发明涉及细胞膜衍生的纳米囊泡、其制备方法、使用纳米囊泡的药物组合物和诊断试剂盒。
背景技术
当向个体施用药物用于疾病治疗时，控制施用的药物递送和释放到细胞、组织和器官中以获得最佳功效的药物递送***(DDS)是重要的。药物递送***用于维持药物的足够血液浓度以达到最大治疗效果。当应用药物递送***时，可以实现诸如使药物的功效和稳定性最大化，延长药物停留时间，增加药物的生物利用度和使药物的副作用最小化等优点。因此，药物递送***是将药物有效地递送到特定身体部位所需的医学技术，被认为与药物本身一样重要。自20世纪60年代初以来，已经开发药物递送***以注射和输注的形式，以栓剂的形式用于鼻腔和口服施用，以及通过皮肤或肺部施用。近年来，根据患者和使用目的不同开发和应用了各种药物递送***(DDS)，例如吸收促进和受控DDS(口服、经皮、粘膜)，持续DDS(注射、口服、经皮)，靶向DDS(口服、注射等)，以及人工智能(智能)DDS(按需型)。
在DDS中，脂质体作为药物递送***被广泛研究，因为脂质体在20世纪60年代被首次使用。脂质体是类似于由各种磷脂制成的细胞膜的人造膜，可以看作具有纳米级粒度的胶体半固体分散剂。脂质体制剂的毒性低，并且因为脂质体制剂的粒度、装载、膜组成和膜渗透性可以根据处方来控制其具有高度适用性。最近，开发了通过将脂质体与聚合物(例如聚乙二醇 (PEG))共轭制备隐形脂质体。隐形脂质体通过防止含药物的脂质体容易从血液中除去而增加药物的循环半衰期。使用这种方法，递送多柔比星 (doxorubicin，一种抗癌剂)的DOXIL已被商业化。然而，由于脂质体和隐形脂质体缺乏识别特定类型的细胞的能力，脂质体和隐形脂质体可能不用于将药物递送到特定类型的细胞或组织的目的。为了使脂质体能够结合特异性靶标，已经开发了与单一靶标特异性抗体缀合的脂质体，但是在通过临床试验后都没有商业化。
因此，正在开发使用天然细胞膜代替由人工合成的脂质制成的脂质体的递送***。由于细胞衍生的递送***利用细胞的天然靶向***，与常规递送***(如脂质体)不同，可能容易诱导靶向。作为代表性的例子，正在进行使用由细胞天然分泌的细胞外囊泡的药物递送的研究。另外，已经报道了将各种药物(例如抗癌药物)装载到由有核哺乳动物细胞人工制备的纳米囊泡 (微囊)中并将纳米囊泡递送到癌组织的研究。
然而，除了靶向所需的物质之外，由细胞人工制备的细胞外囊泡和纳米囊泡包括细胞内成分，例如胞质蛋白和遗传物质(DNA和RNA)，其对于靶向是不必要的。当将靶向非必要成分施用于体内时有可能降低载药量的效率或者诱发副作用，因此没有其管腔内成分的***的发展至关重要。
发明内容
【技术问题】
本发明人进行了解决如上所述的常规问题的研究。结果，发明人已发现，当用pH 9至14的碱性溶液处理细胞时，可以选择性地提取其中细胞内组分 (如遗传物质和胞质蛋白)从细胞移除的细胞的膜，可以使用这些提取的细胞膜制备纳米囊泡。因此，完成了本发明。
因此，本发明涉及提供纳米囊泡，其中纳米囊泡是从细胞膜衍生的，其细胞内成分已经通过用pH 9至14的碱性溶液处理细胞而被除去，并且纳米囊泡的尺寸小于细胞的尺寸，以及使用纳米囊泡递送药物的方法。
本发明的另一个目的是提供一种制备装有用于治疗或诊断疾病的物质的细胞膜衍生的纳米囊泡的方法。
然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，本领域技术人员从下面的描述中可以清楚地理解没有提到其它问题。
【技术方案】
本发明的一个方面提供了纳米囊泡，其中纳米囊泡是从细胞膜衍生出来的，其细胞内成分已经通过用pH 9至14的碱性溶液处理细胞而被去除，并且纳米囊泡的尺寸小于细胞的尺寸。
在本发明的一个实施方案中，碱性溶液可以使用选自碳酸钠 (Na2CO3)、氢氧化钠(NaOH)、氨(NH3)、氢氧化钙(Ca(OH)2)、氢氧化钾(KOH)、碳酸氢钠(NaHCO3)和氢氧化镁(Mg(OH)2)中的一种或多种制备。
在本发明的另一个实施方案中，细胞可以选自单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和作为成核哺乳动物细胞的干细胞。
在本发明的另一个实施方案中，细胞可以是靶向特定类型的细胞或组织的转化细胞。
在本发明的另一个实施方案中，细胞可以是表达选自细胞粘附分子、抗体、靶蛋白、细胞膜融合蛋白及其融合蛋白中的一种或多种的转化细胞。
在本发明的另一个实施方案中，细胞可以是表达选自生长因子、细胞因子、受体、荧光蛋白及其融合蛋白中的一种或多种的转化细胞。
在本发明的另一个实施方案中，纳米囊泡的膜还可以包括非细胞膜的成分。
在本发明的另一个实施方案中，非细胞膜的成分可以是环糊精或聚乙二醇。
在本发明的另一个实施方案中，纳米囊泡可以具有化学改性的膜成分。
在本发明的另一个实施方案中，纳米囊泡可以保留纳米囊泡起源的细胞的膜蛋白的拓扑结构。
本发明的另一方面提供一种用于递送物质的药物组合物，其包括装载有用于治疗或诊断疾病的物质的纳米囊泡。
在本发明的一个实施方案中，可以注射用于治疗或诊断疾病的物质。
在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或诊断疾病的物质可以是选自抗癌剂、抗炎剂、血管发生抑制剂、肽、蛋白质、毒素、核酸、珠粒、微米颗粒和纳米颗粒中的一种或多种。
在本发明的另一个实施方案中，核酸可以选自DNA、RNA、适体、锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代。
在本发明的另一个实施方案中，纳米颗粒可以选自铁氧化物、金、碳纳米管和磁珠。
在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或诊断疾病的物质可以是荧光发射材料。
在本发明的另一个实施方案中，荧光发射材料可以是荧光蛋白或量子点。
本发明的另一方面提供一种制备装载有用于治疗或诊断疾病的物质的细胞膜衍生的纳米囊泡的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过用pH 9至14的碱性溶液处理细胞来除去细胞内物质的步骤；
(b)将治疗性或诊断性物质添加到含有已除去细胞内物质的细胞的膜的悬浮液中的步骤；
(c)通过将超声处理方法应用于添加了治疗性或诊断性物质的悬浮液来制备纳米囊泡的步骤；和
(d)从悬浮液中分离制备的纳米囊泡的步骤。
本发明的另一方面提供一种制备装载有用于治疗或诊断疾病的物质的细胞膜衍生的纳米囊泡的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过用pH 9至14的碱性溶液处理细胞来除去细胞内物质的步骤；
(b)通过将超声处理方法应用于含有已除去细胞内物质的细胞的膜的悬浮液来制备纳米囊泡的步骤；
(c)向包含纳米囊泡的悬浮液中加入治疗性或诊断性物质并培养该混合物的步骤；和
(d)将培养的纳米囊泡与悬浮液分离的步骤。
在本发明的一个实施方案中，该方法还可以包括挤出通过超声处理方法制备的纳米囊泡的步骤。
在本发明的另一个实施方案中，碱性溶液可以使用选自碳酸钠 (Na2CO3)、氢氧化钠(NaOH)、氨(NH3)、氢氧化钙(Ca(OH)2)、氢氧化钾(KOH)、碳酸氢钠(NaHCO3)和氢氧化镁(Mg(OH)2)中的一种或多种制备。
在本发明的另一个实施方案中，细胞可以选自单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和作为成核哺乳动物细胞的干细胞。
在本发明的另一个实施方案中，细胞可以是靶向特定类型的细胞或组织的转化细胞。
在本发明的另一个实施方案中，细胞可以是表达选自细胞粘附分子、抗体、靶蛋白、细胞膜融合蛋白及其融合蛋白中的一种或多种的转化细胞。
在本发明的另一个实施方案中，细胞可以是表达选自生长因子、细胞因子、受体、荧光蛋白及其融合蛋白中的一种或多种的转化细胞。
在本发明的另一个实施方案中，纳米囊泡的膜还可以包括非细胞膜的成分。
在本发明的另一个实施方案中，非细胞膜的成分可以是环糊精或聚乙二醇。
在本发明的另一个实施方案中，纳米囊泡可以保留纳米囊泡起源的细胞的膜蛋白的拓扑结构。
在本发明的另一个实施方案中，治疗性或诊断性物质可以从细胞外注射。
在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或诊断疾病的物质可以是选自抗癌剂、抗炎剂、血管发生抑制剂、肽、蛋白质、毒素、核酸、珠粒、微米颗粒和纳米颗粒中的一种或多种。
在本发明的另一个实施方案中，核酸可以选自DNA、RNA、适体、锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代。
在本发明的另一个实施方案中，纳米颗粒可以选自铁氧化物、金、碳纳米管和磁珠。
在本发明的另一个实施方案中，用于治疗或诊断疾病的物质可以是荧光发射材料。
在本发明的另一个实施方案中，荧光发射材料可以是荧光蛋白或量子点。
本发明的另一方面提供了用于诊断疾病的组合物，其包括本发明的装载有用于诊断疾病所需的引物、探针、反义核酸或抗体的纳米囊泡。
本发明的另一方面提供了用于诊断疾病的试剂盒，其包括本发明的组合物。
本发明的另一方面提供一种递送物质的方法，所述方法包括使用本发明的纳米囊泡将治疗性或诊断性物质递送到特定类型的细胞或组织中的步骤。
本发明的另一方面提供了治疗或诊断疾病的方法，所述方法包括使用本发明的纳米囊泡将治疗性或诊断性物质递送到特定类型的细胞或组织的步骤。
本发明的另一方面提供本发明的纳米囊泡的治疗或诊断用途。
【有益效果】
根据本发明的细胞膜衍生的纳米囊泡可以防止潜在的副作用的发生，这是因为从细胞外囊泡和人造纳米囊泡中除去了对于递送治疗性或诊断性物质是不必要的细胞内或腔内材料(例如，遗传物质和胞质蛋白)。此外，由于纳米囊泡可以靶向特定类型的细胞或组织，治疗性或诊断性物质可以主要被递送到靶细胞或组织，同时可以抑制向非靶向位点递送治疗性或诊断性物质。因此，当细胞膜衍生的纳米囊泡被应用于疾病治疗时，可以减少诸如药物等治疗物质的副作用，从而可以在治疗疾病过程中缓解患者的痛苦和不便，并且可以改进治疗功效。此外，本发明的其中装载了用于治疗或诊断疾病的物质的细胞膜衍生的纳米囊泡和制备纳米囊泡的方法可以在体外或体内用于治疗或诊断目的，或用于实验用途。
附图说明
图1显示了衍生自有核哺乳动物细胞或转化的有核哺乳动物细胞的纳米囊泡，并示出了装载各种物质(如靶向物质和治疗性和诊断性物质)的纳米囊泡的制备方法的示意图。
图2A显示了使用碱溶液处理、超声处理和密度梯度法从有核哺乳动物细胞制备的纳米囊泡的透射电子显微镜图像。
图2B是显示了使用碱溶液处理、超声处理和密度梯度法从有核哺乳动物细胞制备的纳米囊泡的尺寸的图。
图3是显示了衍生自转化的有核哺乳动物细胞的纳米囊泡的尺寸的图。
图4显示了蛋白质印迹结果，其证实了衍生自有核细胞的纳米囊泡中不存在胞质蛋白和核蛋白，存在大量的膜蛋白。
图5显示实时RT-PCR和RT-PCR的结果，其证实了衍生自有核哺乳动物细胞的纳米囊泡中不存在DNA和RNA。
图6显示了衍生自有核哺乳动物细胞的纳米囊泡的拓扑结构是正常的。这通过在胰蛋白酶处理后，确定衍生自有核哺乳动物细胞的纳米囊泡的 ICAM1蛋白和装载到纳米囊泡中的EGFP蛋白是否被表达来证实这一点。
图7显示了胆固醇-聚乙二醇-生物素与衍生自有核哺乳动物细胞的纳米囊泡的双层膜的结合。
图8显示了荧光显微镜图像，其证实了将FITC-siRNA装载到衍生自成核哺乳动物细胞的纳米囊泡中。
图9显示了荧光显微镜图像，其证实了将Qdot 705装载到衍生自有核哺乳动物细胞的纳米囊泡中。
图10显示了确认氧化铁纳米颗粒装载到衍生自有核哺乳动物细胞的纳米囊泡中的图像。在Optiprep溶液中使用密度梯度法将氧化铁纳米颗粒装载到纳米囊泡中。
图11显示，在TNF-α处理条件下，衍生自有核哺乳动物细胞的纳米囊泡可用于将多柔比星递送至靶细胞，并且当使用纳米囊泡时，多柔比星诱导的细胞死亡增加。
图12显示，在TNF-α处理条件下，衍生自有核哺乳动物细胞的纳米囊泡可用于将核糖核酸酶A(RNase A)递送到靶细胞中，并且当使用纳米囊泡时，核糖核酸酶A诱导的细胞死亡增加。
图13显示，衍生自转化的有核细胞的纳米囊泡可以用于将多柔比星或 RNase A递送到特定类型的细胞中，并且当使用纳米囊泡时，多柔比星或 RNase A诱导的细胞死亡增加。
图14显示衍生自转化的有核细胞的纳米囊泡可用于将多柔比星特异性递送至人肺癌细胞，并且当使用纳米囊泡时，多柔比星诱导的细胞死亡增加。
具体实施方式
本发明提供了纳米囊泡，其中纳米囊泡是从细胞膜衍生出来的，其细胞内成分已经通过用pH 9至14的碱性溶液处理细胞而被去除，并且纳米囊泡的尺寸小于细胞的尺寸。
本发明的纳米囊泡的内部和外部的特征在于由起始细胞的细胞膜成分组成的脂质双层膜。这些纳米囊泡包括起始细胞的细胞膜脂质和蛋白质，并具有与起始细胞相同的拓扑结构。然而，从纳米囊泡中除去细胞内物质(如遗传物质(例如核酸)和胞质蛋白)，并且纳米囊泡的尺寸可以小于原始细胞的尺寸，但不限于此。
本发明的碱性溶液可以使用选自碳酸钠(Na2CO3)、氢氧化钠 (NaOH)、氨(NH3)、氢氧化钙(Ca(OH)2)、氢氧化钾(KOH)、碳酸氢钠(NaHCO3)和氢氧化镁(Mg(OH)2)中的一种或多种制备，但不限于此。
本发明的细胞可以选自单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、和作为有核哺乳动物细胞的干细胞，并且还可以选自由干细胞分化的细胞，特别是可以包括靶向特定类型的细胞或组织的转化细胞。具体地，转化的细胞可以包括被转化以表达治疗性或诊断性物质、靶向物质或细胞膜与靶细胞的融合所必需的物质的各种类型的细胞，并且转化的细胞可以包括以上细胞类型中的两种或更多种的组合，但不限于此。
有核哺乳动物细胞可以通过物质处理或基因导入进行转化，转化多于一次，并转化以抑制一种或多种特异性蛋白质的表达。
如本文所用，术语“转化”是指通过刺激细胞增加或降低诸如蛋白质之类物质的表达的方法，以及通过基因导入改变蛋白质的表达的方法，并且可以使用本领域通常使用的方法。作为通过基因导入增加或抑制特异性蛋白质表达的方法，可以例如RNA干扰(RNAi)、病毒介导方法、磷酸钙沉淀、脂质体、电穿孔、显微注射、超声介导方法等，并且全部通常已知的方法都可以使用。
本发明的细胞可以是表达选自细胞粘附分子、抗体、靶蛋白、细胞膜融合蛋白及其融合蛋白中的一种或多种的转化细胞，也可以是表达选自生长因子、细胞因子、受体、荧光蛋白及其融合蛋白一种或多种的转化细胞，但不限于此。
除了原始细胞的细胞膜以外，本发明的纳米囊泡的膜可以包括靶向物质、与靶细胞融合所必需的物质(例如，融合剂)、环糊精、聚乙二醇等，可以通过各种方法(包括细胞膜的化学修饰)来加入非细胞膜的成分。
此外，本发明提供了用于递送物质的药物组合物，其包括装载有用于治疗或诊断疾病的物质的纳米囊泡。
根据本发明，可以根据诊断性或治疗性物质所靶向的组织来制备各种尺寸的纳米囊泡，并且纳米囊泡的尺寸优选为10nm以上且10μm以下。
待装载到本发明的纳米囊泡中的物质没有特别限制，并且可以是治疗性或诊断性物质。此外，可以装载在细胞外制备的物质，并且装载的物质可以是一个或多个。
用于治疗或诊断疾病的物质可以是选自抗癌剂、抗炎剂、血管生成抑制剂、肽、蛋白质、毒素、核酸、珠粒、微米颗粒和纳米颗粒中的一种或多种，而不限于此。
核酸可以选自DNA、RNA、适体、锁定核酸(LNA)、肽核酸 (PNA)和吗啉代，并且纳米颗粒可以选自氧化铁、金、碳纳米管和磁珠，而不限于此。
根据本发明的用于治疗或诊断疾病的物质可以是荧光发射材料，优选荧光蛋白或量子点，但不限于此。
本发明的药物组合物可以含有作为活性成分的抗癌剂、抗炎剂、血管发生抑制剂、肽、蛋白质、毒素、核酸、珠粒、微米颗粒或纳米颗粒中的一种或多种。此外，药物组合物可以与药学上可接受的载体如盐水、无菌水、林格溶液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体和这些载体中的一种或多种混合；以及当需要时，药物组合物还可以含有其它常规添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂等。此外，还可以向药物组合物中另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂，因此药物组合物可以配制成可注射制剂，例如水溶液、悬浮液和乳剂、丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。此外，根据Remington的参考文献(Remington's Pharmaceutical Science，Mack Publishing Company，EastonPA)中公开的方法或本领域的适当方法，可以根据各组分适当地配制药物组合物。本发明的药物组合物在制剂中没有特别限制，但优选配制成注射剂或吸入剂。
施用本发明的药物组合物的方法没有特别限制，但是根据目的，药物组合物可以通过肠胃外施用，例如通过静脉内、皮下、腹膜内、通过吸入或局部施用或口服。剂量可以根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用时间、施用方法、***量和疾病的严重程度而不同地确定。每日剂量是指对需要治疗的个体施用治疗物质时能够缓解疾病状态的治疗物质的量。治疗物质的有效量取决于特定化合物，疾病状态和疾病严重性，需要治疗的个体，其可以由本领域普通技术人员常规确定。作为非限制性实例，本发明组合物对人体的剂量可以根据患者的年龄、体重、性别、剂型、健康状况和疾病严重程度而变化。基于体重70kg的成年患者，剂量通常为0.1至1,000mg/ 天，优选1至500mg/天。组合物也可以每天一次或以定期时间间隔多次分开施用。
此外，本发明提供一种制备装载有用于治疗或诊断疾病的物质的细胞膜衍生的纳米囊泡的方法，该方法包括通过用pH 9至14的碱性溶液处理细胞来除去细胞内物质的步骤；将治疗性或诊断性物质添加到含有已除去细胞内材料的细胞的膜的悬浮液中的步骤；通过将超声处理方法应用于添加了治疗性或诊断性物质的悬浮液来制备纳米囊泡的步骤；以及从悬浮液中分离制备的纳米囊泡的步骤。
此外，本发明提供一种制备装载有用于治疗或诊断疾病的物质的细胞膜衍生的纳米囊泡的方法，该方法包括通过用pH 9至14的碱性溶液处理细胞来除去细胞内物质的步骤；通过将超声处理方法应用于含有除去细胞内材料的细胞的膜的悬浮液制备纳米囊泡的步骤；向包含纳米囊泡的悬浮液中加入治疗性或诊断性物质并培养该混合物的步骤；以及从悬浮液中分离培养的纳米囊泡的步骤。
本发明的方法还可以包括挤出通过超声处理方法制备的纳米囊泡的步骤。
在本发明中，使用制备纳米囊泡的方法，即使用碱溶液处理、超声处理和密度梯度法(参见实施例1)，从单核细胞系U937和转化的HEK293和 HT1080细胞制备纳米囊泡。
在本发明的一个实施方案中，当确定从单核细胞和转化细胞制备的纳米囊泡的形状和尺寸时，纳米囊泡为球形脂质双层的形式，单核细胞衍生的纳米囊泡的尺寸为100nm至200nm，即平均180nm，而转化的细胞衍生的纳米囊泡的平均尺寸为70nm至150nm，即平均100nm。
另外，当对单核细胞衍生的纳米囊泡和单核细胞进行western印迹以确定β-肌动蛋白(细胞质蛋白)、H2B(核蛋白)、GM130、LFA1和 ICAM1(细胞膜蛋白)的表达水平时，纳米囊泡不含胞质蛋白和核蛋白，而细胞膜蛋白在纳米囊泡中表达。此外，作为实时PCR的结果，确认与单核细胞不同，纳米囊泡不含DNA和RNA，即核酸。通过分析纳米囊泡的拓扑结构，发现纳米囊泡的膜蛋白位于纳米囊泡外，这类似于单核细胞的膜蛋白。也就是说，纳米囊泡的膜蛋白保持与单核细胞的膜蛋白相同的拓扑结构(参见实施例2)。
在本发明的另一个实施方案中，通过将胆固醇-聚乙二醇-生物素加入到根据实施例1的方法制备的单核细胞衍生的纳米囊泡中制备含有聚乙二醇的纳米囊泡。此后，将链霉亲和素-HRP加入到纳米囊泡中，然后培养。培养后，加入BM-POD作为底物，测定显色量。结果证实胆固醇-聚乙二醇-生物素与含有聚乙二醇的纳米囊泡结合(参见实施例3)。
在本发明的另一个实施方案中，当根据实施例1的方法使用碱溶液处理、超声处理和密度梯度法制备纳米囊泡时，在进行超声处理的步骤中，将 FITC-siRNA、Qdot 705或氧化铁纳米颗粒各自装载入纳米囊泡中，制备各自含有FITC-siRNA、Qdot 705或氧化铁纳米颗粒的纳米囊泡。在制备之后，检查每种物质是否适当地装载到纳米囊泡中。荧光显微镜观察显示，FITC- siRNA和Qdot 705中的每一种都被适当地装载到纳米囊泡中。另外，使用Optiprep溶液的密度梯度法也证实了氧化铁纳米颗粒也被装载到纳米囊泡中 (参见实施例4至6)。
在本发明的另一个实施方案中，证明当使用单核细胞衍生的纳米囊泡时，在细胞水平的药物递送和细胞特异性药物递送是可行的。制备装载有作为化学药物的多柔比星或作为蛋白质药物的核糖核酸酶A(RNase A)的单核细胞衍生的纳米囊泡。此后，用TNF-α处理人血管细胞系人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)以激活HUVEC，导致细胞膜中细胞粘附分子(如ICAM-1， VCAM-1和E-选择素)的增加的表达。确认单核细胞衍生的纳米囊泡是否识别这些分子，并将药物递送至靶细胞。结果，当处理TNF-α时，多柔比星和 RNase A都被递送至HUVEC并根据纳米囊泡的处理浓度诱导细胞死亡(参见实施例7)。
在本发明的另一个实施方案中，在细胞水平上证实了转化细胞衍生的纳米囊泡的药物递送能力。在从过量表达ICAM1的HT1080转化细胞制备装载有多柔比星或RNase的纳米囊泡后，用不同浓度的制备的纳米囊泡处理 U937单核细胞，培养24小时。培养后，用台盼蓝溶液染色单核细胞，测定细胞死亡程度。结果，药物通过纳米囊泡被递送到单核细胞中，并且在用装载多柔比星的纳米囊泡处理单核细胞的情况下，以5μg/ml或更高的浓度诱导细胞死亡，并且在RNase A的情况下，以10μg/ml或更高的浓度诱导细胞死亡(参见实施例8)。
在本发明的另一个实施方案中，纳米囊泡从表达粘附分子(如EGF和 GE11)的转化细胞制备，粘附分子位于转化细胞的膜中并且能够结合到在人肺癌细胞系A549细胞膜中表达的EGFR。然后确认转化细胞衍生的纳米囊泡的药物递送能力。将装载有多柔比星的纳米囊泡加入到A549细胞接种的板中并培养。培养后，在荧光显微镜下观察细胞。结果，观察到细胞死亡。基于此结果，证实存在于纳米囊泡中的GE11和EGF可以特异性结合到表达在细胞表面上的EGFR的细胞，纳米囊泡衍生自表达在其细胞膜中的EGF和 GE11的转化细胞并装载有抗癌药物，并且装载的抗癌药物可被递送至细胞以诱导细胞死亡(参见实施例9)。
此外，本发明提供了用于诊断疾病的组合物，组合物包括本发明的纳米囊泡，本发明的纳米囊泡装载有诊断疾病所需的引物、探针、反义核酸或抗体。
此外，本发明提供了用于诊断疾病的试剂盒，试剂盒包括组合物。
在下文中，描述了优选的实施例以便于理解本发明。然而，仅为了更容易理解本发明而提供以下实施例，本发明不受以下实施例的限制。
[实施例]
实施例1.通过碱溶液处理和超声处理制备纳米囊泡
为了制备衍生自有核哺乳动物细胞或已经去除细胞内成分的转化的有核哺乳动物细胞的纳米囊泡，对单核细胞或转化细胞进行碱溶液处理、超声处理和密度梯度法，制备纳米囊泡的示意图如图1所示。
8×107个U937细胞(ATCC No.CRL-1593.2)用作单核细胞，4×107个 HEK293细胞(ATCC No.CRL-1573)或4×107个HT1080细胞(ATCC No.CCL-121)用作转化细胞。每个细胞类型用8ml碱性溶液(200mM Na2CO3，1×磷酸酶抑制剂，pH 11.5)处理，在循环条件：0.5和振幅：50下，用超声仪超声处理30次，以100,000×g进行超速离心15分钟，得到颗粒。将沉淀物重悬浮在8ml碱性溶液中，储存在设定在4℃的转子组中30分钟，并以100,000×g进行超速离心15分钟，得到颗粒。将得到的颗粒用10ml HEPES缓冲盐水(HBS)溶液重悬浮，再次以100,000×g进行超速离心15分钟，得到颗粒。将颗粒用0.4ml HBS溶液悬浮，用超声仪进行超声处理30次，在水浴超声仪中再次超声处理30分钟，并将溶液用6.6ml HBS溶液悬浮。接着，将1ml 50％Optiprep，2ml 10％Optiprep和7ml悬浮液依次加入到11ml 超速离心管中，以100,000×g进行超速离心2小时，得到在50％Optiprep和 10％Optiprep之间的层中存在的纳米囊泡。
实施例2.纳米囊泡的表征
2-1.鉴定纳米囊泡的形状和尺寸
分析通过实施例1的方法制备的单核细胞和转化细胞衍生的纳米囊泡的形状和尺寸。首先，使用透射电子显微镜观察衍生自单核细胞的纳米囊泡。将衍生自单核细胞的纳米囊泡吸附在辉光放电的碳涂覆的铜网格中持续3分钟。网格用蒸馏水洗涤，用2％乙酸双氧铀染色1分钟，并用电子显微镜 JEM101(日本Jeol)观察。
结果，如图2A 所示，发现使用碱性溶液处理由单核细胞制备的纳米囊泡由脂质双层组成，尺寸为100至200nm，呈大致球形。另外，将从单核细胞制备的纳米囊泡在1ml HBS中稀释至0.5μg/ml的浓度，将1ml含有纳米囊泡的HBS溶液置于室中，并用纳米颗粒跟踪分析仪进行分析。如图2B 所示，纳米囊泡的尺寸为100至200nm，平均粒径为180nm。
此外，将从表达表皮生长因子(EGF)和GE11肽 (YHWYGYTPQNVI)的转化细胞制备的纳米囊泡在1ml HBS中稀释至浓度为5μg/ml，将1ml含有纳米囊泡的HBS加入到比色杯并用动态光散射仪进行分析。
结果，如图3所示，从转化细胞制备的纳米囊泡的尺寸为70至 150nm，平均粒径为100nm。
2-2.验证在单核细胞衍生的纳米囊泡中存在或不存在胞质蛋白和核蛋白
为了确定根据实施例1的方法使用碱性溶液处理从单核细胞制备的纳米囊泡是否含有胞质蛋白和核蛋白，对纳米囊泡和单核细胞进行蛋白质印迹分析。
分别制备5μg的纳米囊泡和单核细胞，加入5×装载染料(250mM Tris-HCl，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油)，最终为1×，然后将混合物在100℃下处理5分钟。制备12％聚丙烯酰胺凝胶，将样品装载到凝胶上，并在80V下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳2小时。转移过程在400mA下进行2小时，使得凝胶上的蛋白质通过电流转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。转移过程完成后，通过将膜浸泡在含有3％非脂肪乳的0.05％TBS-T(Tween-20) 中并将膜培养2小时进行封闭处理。封闭后，用特异性结合至β-肌动蛋白、 H2B、GM130、LFA1和ICAM1的一抗处理膜，然后在室温下反应2小时。用0.05％TBS-T(Tween-20)洗涤膜三次后，用与过氧化物酶缀合的二抗处理膜，随后在室温下反应90分钟。然后用0.05％TBS-T(Tween-20)将膜洗涤3次，然后用增强的化学发光法(ECL，Amersham Co.No.RPN2106)， WEST-ZOL(iNtRON.No.16024)或Femto(Thermo Scientific，No.37074) 确定每种蛋白的表达。
如图4所示，单核细胞表达β-肌动蛋白(ACTB)，β-肌动蛋白是细胞骨架的主要成分并存在于细胞质中，H2B是构成细胞核中组蛋白的蛋白质，而使用碱性溶液处理制备的纳米囊泡(MNV)没有表达β-肌动蛋白(ACTB) 和H2B。此外，与单核细胞相比，使用碱性溶液处理制备的纳米囊泡高度表达细胞膜蛋白，如LFA-1、ICAM1和GM130。基于此结果，使用碱处理制备的纳米囊泡不表达胞质蛋白和核蛋白(如β-肌动蛋白和H2B)，而与细胞相比，纳米囊泡含有更多的细胞膜蛋白(如LFA-1、ICAM1和GM130)。
2-3.验证单核细胞衍生的纳米囊泡中存在或不存在核酸
为了确定根据实施例1的方法使用碱性溶液处理从单核细胞制备的纳米囊泡是否含有核酸，在纳米囊泡和单核细胞上进行实时RT-PCR和实时 PCR。
将100ng从单核细胞制备的纳米囊泡和1×105个单核细胞在95℃下培养10分钟。因此，纳米囊泡和细胞爆裂，所有内部核酸被释放。然后，进行实时RT-PCR和实时PCR，以在DNA降解酶(例如DNase)处理或未处理的条件下测定GAPDH的表达水平。
如图5所示，为了确定从单核细胞制备的纳米囊泡是否含有核酸，进行实时RT-PCR，以测定在不进行DNase处理时的GADPH的表达。结果，核酸不存在于从单核细胞制备的纳米囊泡中，而核酸存在于单核细胞中。为了确定纳米囊泡是否含有RNA，用DNase处理含有爆发的纳米囊泡或单核细胞的溶液以除去DNA，然后加入DNase抑制剂以抑制DNase活性。使用 RNA作为模板进行实时RT-PCR，以测量GADPH的表达。结果，在单核细胞制备的纳米囊泡中不存在RNA，而在单核细胞中存在RNA。为了确定纳米囊泡是否含有DNA，将含有爆发(burst)纳米囊泡或单核细胞的溶液在不进行DNase处理的情况下针对GADPH进行实时PCR。结果，从单核细胞制备的纳米囊泡中不存在DNA，而单核细胞中存在DNA。此外，当在DNase处理后，对含有爆发纳米囊泡或单核细胞的溶液进行GADPH的实时PCR时， DNA也不存在于单核细胞中。该结果表明，DNase具有酶活性。这些结果表明DNA和RNA都存在于单核细胞中，而DNA和RNA不存在于衍生自单核细胞的纳米囊泡中。
2-4.纳米囊泡的拓扑分析
为了分析根据实施例1的方法用碱性溶液处理、超声处理和密度梯度法从单核细胞制备的纳米囊泡的拓扑结构，在超声处理的步骤中，纳米囊泡装载增强的绿色荧光蛋白(EGFP)。
更具体地，如实施例1所示，在从U937细胞、单核细胞制备纳米囊泡时，用10mlHEPES缓冲盐水(HBS)溶液悬浮颗粒，以100,000×g进行超速离心15分钟，得到颗粒。然后，用HBS悬浮得到的颗粒，将EGFP以 50μg/ml的浓度加入到HBS溶液中，以制备最终体积为0.4ml的溶液。以与实施例1相同的方式进行以下步骤，得到装载有EGFP的单核细胞衍生的纳米囊泡。制备10μg装载有EGFP的纳米囊泡和30ng EGFP蛋白，并在37℃下用1μg胰蛋白酶处理4小时或不进行处理，以制备胰蛋白酶处理的样品和未用胰蛋白酶处理的样品。以与实施例2-2中所述相同的方式进行Western印迹。使用ICAM1-特异性或EGFP-特异性抗体作为一抗，符号“+”表示用胰蛋白酶处理，符号“-”表示无胰蛋白酶处理。
结果，如图6所示，当未用胰蛋白酶处理时，在纳米囊泡 (MNVEGFP)的情况下检测到ICAM1和EGFP蛋白，在EGFP的情况下也检测到EGFP蛋白。然而，当用胰蛋白酶处理时，在EGFP的情况下，EGFP 蛋白质被胰蛋白酶降解，因此没有检测到EGFP蛋白质。另一方面，在纳米囊泡的情况下，ICAM1的细胞外结构域被降解并未被检测到，装载到纳米囊泡中的EGFP蛋白质没有降解。当细胞膜的内部和外部部分逆转时，ICAM1 的细胞外结构域指向纳米囊泡内部，ICAM1的胞外结构域不被胰蛋白酶降解，因此可能诱导抗体反应。在用胰蛋白酶处理的纳米囊泡中，没有观察到相对于ICAM1的抗体反应。该结果表明，ICAM1的细胞外结构域指向纳米囊泡的外部。此外，在蛋白质装载在纳米囊泡中的情况下，可以看出蛋白质被纳米囊泡的双层膜保护。
基于这些结果，在使用碱性溶液处理制备的纳米囊泡的情况下，推测除了ICAM1以外的细胞膜蛋白的细胞外结构域如在起始细胞中那样指向纳米囊泡的外部。这表明纳米囊泡的膜保持与细胞膜相同的拓扑结构。
实施例3.含有聚乙二醇的纳米囊泡的制备
通过将聚乙二醇装载到根据实施例1的方法制备的单核细胞衍生的纳米囊泡中制备含有聚乙二醇的纳米囊泡。
超声处理后，加入HBS进行悬浮，溶液通过1μm过滤器(双层)挤出。将0.5ml 50％Optiprep、1ml 10％Optiprep和3ml悬浮液依次加入超速离心管中，然后以100,000×g进行超速离心2小时，得到存在于50％Optiprep 和10％Optiprep之间的层中的纳米囊泡。超速离心后，加入5μg/ml胆固醇- 聚乙二醇-生物素，并在室温下培养1小时。再次，将0.5ml50％Optiprep、 1ml 10％Optiprep和3ml悬浮液依次加入5ml超离心管中，然后以100,000×g 进行超速离心2小时，得到存在于50％Optiprep和10％Optiprep之间的层中的含有聚乙二醇的纳米囊泡。
接着，制备10μg/ml的含有聚乙二醇的纳米囊泡，将100μl制备的纳米囊泡加入到96孔板的各个孔中，并在室温下培养至少12小时以涂覆该板的孔。用PBS洗涤3次后，加入100μl的1％BSA/PBS进行1小时的封闭。封闭后，将板用PBS洗涤三次，然后加入链霉亲和素-HRP，并培养20分钟。然后，添加BM-POD基板，测定显色量。
结果，如图7所示，当显色后测量相对发光单位(RLU)时，由于将胆固醇-聚乙二醇-生物素掺入到纳米囊泡中，含有聚乙二醇的聚乙二醇化纳米囊泡(MNV聚乙二醇化)表现出高的RLU值。另一方面，未经胆固醇-聚乙二醇-生物素处理的纳米囊泡(MNV对照组)显示出低RLU值。
实施例4.含有FITC-siRNA的纳米囊泡的制备
为了在根据实施例1的方法的碱溶液处理、超声处理和密度梯度法中制备含有FITC-siRNA的单核细胞衍生的纳米囊泡，在超声处理步骤中，用 FITC-siRNA装载纳米囊泡。
更具体地说，如实施例1所示，从U937细胞、单核细胞制备纳米囊泡时，用10mlHEPES缓冲盐水(HBS)溶液悬浮颗粒，以100,000×g进行超速离心15分钟，得到颗粒。然后，用HBS悬浮得到的颗粒，以10μM的浓度将FITC-siRNA加入到HBS溶液中，制备最终体积为0.4ml的溶液。然后，用超声仪进行30次超声波处理，在水浴超声仪中再次超声处理30分钟，并用0.6ml HBS溶液悬浮该溶液。将溶液通过1μm过滤器(双层)挤出，并用 2.0ml HBS悬浮。将0.5ml 50％Optiprep、1ml 10％Optiprep和3ml悬浮液依次加入5ml超速离心管中，然后以100,000×g进行超速离心2小时，得到在 50％Optiprep和10％Optiprep之间的层中的装载有FITC-siRNA的纳米囊泡。
为了验证使用所述方法制备的纳米囊泡是否含有FITC-siRNA，制备了50μl装载FITC-siRNA的纳米囊泡，并加入浓度为10μM的DiI溶液，并悬浮纳米囊泡。将溶液放置在玻璃罩上，将盖玻片置于潮湿室中，并在4℃下保存至少12小时。将5μl封固溶液(mountingsolution)装载在载玻片上，将盖玻片放置在载玻片上，并使用荧光显微镜进行观察。通过Dil(1,1'-十八烷基-3,3,3'3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐)的红色荧光观察纳米囊泡，并通过 FITC的绿色荧光观察siRNA。结果示于图8。
结果，如图8所示，用DiI标记未装载FITC-siRNA的纳米颗粒，呈现出红色荧光，但没有显示FITC-siRNA的绿色荧光。另一方面，装载有 FITC-siRNA的纳米囊泡显示了DiI的红色荧光以及FITC-siRNA的绿色荧光。在相同位置存在绿色荧光和红色荧光证实了FITC-siRNA被装载到纳米囊泡中。
实施例5.装载有Qdot的纳米囊泡的制备
为了制备装载有Qdot 705的纳米囊泡，使用与实施例4的装载有 FITC-siRNA的纳米囊泡相同的方法，在超声处理的步骤中，加入20nM Qdot 705代替FITC-siRNA。
为了验证使用所述方法制备的纳米囊泡是否包含Qdot 705，制备了 50μl装载有20μg/ml Qdot 705的纳米囊泡。以与实施例4相同的方法制备样品，并使用荧光显微镜进行观察。通过DiI的红色荧光观察纳米囊泡，并通过蓝色伪色观察Qdot 705。
结果，如图9所示，未装载Qdot 705的纳米颗粒用DiI标记并显示出红色荧光，但没有显示出Qdot 705的蓝色荧光。另一方面，装载有Qdot 705 的纳米囊泡显示出DiI的红色荧光以及蓝色荧光。在相同位置存在蓝色荧光和红色荧光证实了Qdot 705装载入纳米囊泡。
实施例6.装载有氧化铁纳米颗粒的纳米囊泡的制备
为了制备装载有氧化铁纳米颗粒的纳米囊泡，使用与制备实施例4的装载FITC-siRNA的纳米囊泡相同的方法，在超声处理步骤中，加入20μg/ml 的氧化铁纳米颗粒代替FITC-siRNA。然后，通过使用Optiprep溶液的密度梯度法将装载有氧化铁纳米颗粒的纳米囊泡(MNV氧化铁)与未装载氧化铁纳米颗粒的纳米囊泡(MNV对照组)进行比较。
结果，如图10所示，未装载氧化铁纳米颗粒的纳米囊泡显示白色带，而装载有氧化铁纳米颗粒的纳米囊泡表现出深棕色带。这些结果证实了氧化铁纳米颗粒被装载到纳米囊泡中。
实施例7.使用单核细胞衍生的纳米囊泡验证药物递送和细胞特异性递送
7-1.使用单核细胞衍生的纳米囊泡确认体外化学药物递送和细胞特异性递送
为了验证本发明的纳米囊泡是否在体外以细胞特异性方式递送化学药物，制备装载有多柔比星(抗癌剂)的单核细胞衍生的纳米囊泡，并使用荧光显微镜来验证药物是否以细胞特异性方式递送。
24孔板的孔用0.1％明胶包被，板中的每个孔用3×104的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种，将细胞培养12小时。除去现有培养基，向其中加入含有10ng/ml TNF-α的培养基，培养16小时。当用TNF-α处理人血管细胞系HUVEC以激活HUVEC时，在细胞膜中细胞粘附分子(如ICAM-1、 VCAM-1和E-选择素)的表达增加。增加的ICAM-1、VCAM-1和E-选择素与单核细胞和巨噬细胞中存在的细胞粘附分子(如LFA-1和Mac-1)结合。这种蛋白质相互作用允许单核细胞和巨噬细胞结合到血液内皮细胞。
因此，根据实施例1的方法制备装载有多柔比星的单核细胞衍生的纳米囊泡。在超声处理的步骤中，加入800μg/ml的多柔比星，并进行超声处理以制备装载有多柔比星的纳米囊泡。
接下来，用装载有多柔比星的0μg/ml、1μg/ml、2μg/ml或5μg/ml的纳米囊泡对HUVEC处理20分钟，用新鲜培养基替换，培养36小时。培养后，用2μM CellTracker(CellTracker，Invitrogen，No.C2925)处理HUVEC，培养1小时，然后用4％多聚甲醛处理用以细胞固定。然后，除去4％多聚甲醛，加入PBS，并使用荧光显微镜观察细胞并测量细胞数量。
结果，如图11所示，在没有TNF-α处理的HUVEC中，细胞数量有一定程度的减少，这表明非特异性药物递送部分发生。然而，当以不同浓度处理TNF-α时，细胞数量根据纳米囊泡的浓度而显著减少。这表明由于存在纳米囊泡，更多的多柔比星被递送到HUVEC。基于这些结果，证实可以使用纳米囊泡以细胞特异性方式递送化学药物。
7-2.使用单核细胞衍生的纳米囊泡确认体外蛋白质药物递送和细胞特异性递送
为了验证本发明的纳米囊泡是否在体外以细胞特异性方式递送蛋白质药物，制备了装载有核糖核酸酶A(RNase A)的单核细胞衍生的纳米囊泡，并使用荧光显微镜来验证RNase A是否以细胞特异性的方式递送。
根据实施例1的方法制备装载有RNase A的单核细胞衍生的纳米囊泡。在超声处理步骤中，加入800μg/ml的RNase A，进行超声处理以制备装载有RNase A的纳米囊泡。样品通过与实施例7-1相同的原理和方法制备，在荧光显微镜下观察细胞，然后测量细胞数量。
结果，如图12所示，当以不同浓度处理装载有RNase A的纳米囊泡时，在没有TNF-α处理的HUVEC中部分观察到非特异性药物递送。然而，当用TNF-α处理时，细胞数量明显减少。这表明由于存在纳米囊泡，更多的 RNase A被递送到HUVEC。基于这些结果，确认纳米囊泡可以用于以细胞特异性方式递送蛋白质药物。
实施例8.使用转化细胞衍生的纳米囊泡验证体外药物递送
为了验证从转化细胞制备的纳米囊泡是否以如实施例7的单核细胞衍生的纳米囊泡类似的细胞特异性方式递送药物，制备装载有多柔比星、抗癌剂或RNase A的单核细胞衍生的纳米囊泡。用制备的纳米囊泡处理单核细胞，然后测量活细胞数量。
根据实施例1的方法制备衍生自表达ICAM-1的HT1080转化细胞并装载有多柔比星或RNase A的纳米级囊泡。在超声处理步骤中，加入 800μg/ml的多柔比星或RNase A，进行超声处理以制备装载多柔比星或 RNase A的纳米囊泡。
然后，将500μl含有1×105个U937细胞(单核细胞)的培养基加入到24孔板的每个孔中，向其中加入0μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml或 10μg/ml的HT1080细胞衍生的纳米囊泡，然后培养24小时。培养后，将 50μl含有细胞的溶液加入到96孔板的每个孔中，并且每个孔用50μl台盼蓝溶液处理。在活细胞中，台盼蓝再次从细胞中分泌出来，所以细胞不被台盼蓝染色。将10μl的混合溶液加入血细胞计数器中，用光学显微镜测量未被台盼蓝染色的细胞数量。
结果，如图13所示，从表达ICAM-1的转化的HT1080细胞制备的纳米囊泡未装载药物或装载有药物，并比较两种类型的纳米囊泡。在未装载药物的纳米囊泡的情况下，用高浓度的纳米囊泡的处理没有诱导细胞死亡。另一方面，当用装载多柔比星的纳米囊泡处理时，从5μg/ml开始诱导细胞死亡。在装载RNase A的纳米囊泡的情况下，从10μg/ml开始诱导细胞死亡。
实施例9.使用衍生自表达在细胞膜中的GE11和EGF的转化细胞的纳米囊泡进行体外药物递送和细胞特异性递送的验证
将12孔板的每个孔接种5×104个A549细胞，A549细胞是表达 EGFR的人肺癌细胞系，并将细胞培养16小时。存在于A549中的EGFR能够结合到粘附分子(如EGF和GE11)。
用PBS洗涤用A549细胞接种的板，并向板的每个孔中加入1ml培养基。然后，将0.1×109颗粒/ml、1×109颗粒/ml或10×109颗粒/ml纳米囊泡加入到然后培养20分钟，所述纳米囊泡根据实施例1从表达在膜中的EGF和 GE11的转化细胞制备并装载有多柔比星。培养后，用PBS洗涤每个孔，向其中加入1ml培养基，培养36小时。然后，在PBS洗涤后，向每个孔中加入500μl无血清培养基，向其中加入5μM CellTracker(Invitrogen， No.C2925)，培养30分钟。此后，向每个孔中加入500μl的4％多聚甲醛，培养10分钟用于细胞固定，并在荧光显微镜下观察固定的细胞。
结果，如图14所示，证实了活细胞的数量随着浓度增加而减少。总之，已经衍生自表达在细胞膜中的EGF和GE11的转化细胞的并装载有抗癌药物的纳米囊泡能够与表达在细胞表面上的EGFR的细胞结合，将装载的抗癌药物选择性地递送到EGFR表达细胞，导致细胞死亡。
通过举例的方式提供对本发明的上述描述，并且本领域技术人员将理解，本发明可以容易地改变或修改为其它指定形式，而不改变或修改本发明的技术精神或本质特征。因此，应当理解，上述实施例仅以举例的方式提供，而不是被提供以限制本发明。

Claims (28)

1.一种纳米囊泡，其中，所述纳米囊泡衍生自细胞的膜，所述纳米囊泡中没有细胞内成分，所述细胞内成分已通过用pH9-14的碱性溶液处理细胞而被去除，其中所述细胞内成分包括遗传物质和胞质蛋白，并且所述纳米囊泡的尺寸小于所述细胞的尺寸。
2.根据权利要求1所述的纳米囊泡，其中，所述细胞是靶向特定类型的细胞或组织的转化细胞。
3.根据权利要求1所述的纳米囊泡，其中，所述细胞是表达选自细胞粘附分子、抗体、靶蛋白及其融合蛋白中的一种或多种的转化细胞。
4.根据权利要求3所述的纳米囊泡，其中，所述细胞是表达细胞膜融合蛋白的转化细胞。
5.根据权利要求1所述的纳米囊泡，其中，所述细胞是表达选自细胞因子、受体、荧光蛋白及其融合蛋白中的一种或多种的转化细胞。
6.根据权利要求1所述的纳米囊泡，其中，所述细胞是表达生长因子的转化细胞。
7.根据权利要求1所述的纳米囊泡，其中，所述纳米囊泡的膜还包含非细胞膜成分。
8.根据权利要求7所述的纳米囊泡，其中，所述非细胞膜成分选自环糊精或聚乙二醇及其化学改性的膜成分。
9.一种用于递送物质的药物组合物，其包括权利要求1所述的纳米囊泡，所述纳米囊泡装载用于治疗或诊断疾病的物质。
10.根据权利要求9所述的用于递送物质的药物组合物，其中，所述用于治疗或诊断疾病的物质是选自抗癌剂、抗炎剂、血管发生抑制剂、肽、蛋白质、毒素、核酸、珠粒、微米颗粒、纳米颗粒和荧光发射材料中的一种或多种。
11.根据权利要求10所述的用于递送物质的药物组合物，其中，所述核酸选自DNA、RNA、适配体、锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代。
12.根据权利要求10所述的用于递送物质的药物组合物，其中，所述纳米颗粒选自氧化铁、金、碳纳米管和磁珠。
13.一种制备装载有用于治疗或诊断疾病的物质的细胞膜衍生的纳米囊泡的方法，所述方法包括：(a)通过用pH 9至14的碱性溶液处理细胞来除去细胞内物质的步骤；(b)将治疗性或诊断性物质添加到含有已除去细胞内物质的细胞的膜的悬浮液中的步骤；(c)通过将超声处理方法应用于添加了所述治疗性或诊断性物质的所述悬浮液来制备纳米囊泡的步骤；和(d)从所述悬浮液中分离所制备的所述纳米囊泡的步骤。
14.一种制备装载有用于治疗或诊断疾病的物质的细胞膜衍生的纳米囊泡的方法，所述方法包括：(a)通过用pH 9至14的碱性溶液处理细胞来除去细胞内物质的步骤；(b)通过将超声处理方法应用于含有已除去细胞内物质的细胞的膜的悬浮液来制备纳米囊泡的步骤；(c)向包含纳米囊泡的所述悬浮液中加入治疗性或诊断性物质并培养混合物的步骤；和(d)从所述悬浮液中分离所培养的所述纳米囊泡的步骤。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其还包括挤出通过所述超声处理方法制备的所述纳米囊泡的步骤。
16.根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述细胞是靶向特定类型的细胞或组织的转化细胞。
17.根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述细胞是表达选自细胞粘附分子、抗体、靶蛋白及其融合蛋白中的一种或多种的转化细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述细胞是表达细胞膜融合蛋白的转化细胞。
19.根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述细胞是表达选自细胞因子、受体、荧光蛋白及其融合蛋白中的一种或多种的转化细胞。
20.根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述细胞是表达生长因子的转化细胞。
21.根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述纳米囊泡的膜还包含非细胞膜成分。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述非细胞膜成分选自环糊精、聚乙二醇及其化学改性的膜成分。
23.根据权利要求13或14所述的方法，其中，用于治疗或诊断疾病的所述物质是选自抗癌剂、抗炎剂、血管发生抑制剂、肽、蛋白质、毒素、核酸、珠粒、微米颗粒、纳米颗粒和荧光发射材料中的一种或多种。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述核酸选自DNA、RNA、适配体、锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代。
25.根据权利要求23所述的方法，其中，所述纳米颗粒选自氧化铁、金、碳纳米管和磁珠。
26.用于治疗疾病的组合物，其包含权利要求1所述的纳米囊泡，所述纳米囊泡装载有抗癌剂、抗炎剂、血管发生抑制剂、肽、蛋白质、毒素、核酸、珠粒、微米颗粒和纳米颗粒。
27.用于诊断疾病的组合物，其包含权利要求1所述的纳米囊泡，所述纳米囊泡装载有疾病诊断所需的引物、探针、反义核酸或抗体。
28.用于诊断疾病的制剂盒，其包含权利要求1所述的纳米囊泡。
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