CN107422111A - 一种检测免疫性血小板减少症血小板自身抗体的流式微球方法 - Google Patents

一种检测免疫性血小板减少症血小板自身抗体的流式微球方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于血小板临床试验研究上具有较高敏感性和特异性的一种检测免疫性血小板减少症血小板自身抗体的流式微球方法。它用抗人血小板膜糖蛋白单抗包被微球，将血小板裂解液与包被过的微球孵育，之后加入藻红蛋白标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体，流式细胞仪分析。若血小板表面存在自身抗体，则形成“微球‑血小板膜糖蛋白单抗‑血小板膜糖蛋白自身抗体‑藻红蛋白标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体”复合物结构，表现为检测微球的荧光强度增高。本发明操作方便，技术成熟，检测血小板自身抗体敏感性高，有助于血小板抗体的基础实验研究。

Description

一种检测免疫性血小板减少症血小板自身抗体的流式微球 方法
技术领域：
本发明属于一种血小板临床试验研究上用来检测血小板特异性抗体的具有较高敏感性和特异性的新型试验方法。
背景技术：
血小板减少症是临床上血液科常见疾病。根据发病机制的不同可分为免疫性血小板减少症和非免疫性血小板减少症。如何区分两者需要一种较高特异性和敏感性的血小板自身抗体试验检测方法。
依据试验室血小板抗体检测方法出现的早晚，可分为I期、II期及III期检查方法、。I期检查出现于19世纪50年代至70年代，主要检测患者血清或血浆在体外对正常血小板功能的影响，所用的试验方法均是间接法，其敏感性和特异性均很低。II期试验方法在19世纪70年代发展起来，主要是检测血小板相关抗体。血小板相关抗体虽然有较高的敏感性但特异性较低。III期试验方法是在19世纪80年代中期发展起来的抗原特异性分析法。最近发展起来的糖蛋白俘获检查法-即单克隆抗体固定特异血小板抗原法，不仅可检测血小板特异性抗体(间接法)而且可检测血小板相关的特异性抗体(直接法)；并且血小板裂解发生在特异性抗体与血小板膜糖蛋白结合后，避免了去垢剂处理对自身抗原表位的破坏；试验中在分离的试管内洗涤致敏的正常血小板，阻止了血浆/血清与塑料的粘附，减低了背景干扰。这些方法特异性较高，敏感性太低，限制了其在血小板抗体临床研究方面的应用。目前试验室需要一种敏感性高的检测免疫性血小板减少症血小板自身特异性抗体的试验方法。
发明内容：
本发明属于一种血小板临床试验研究上用来检测免疫性血小板减少症血小板特异性抗体的具有较高敏感性和特异性的新型试验方法。
本发明用抗人血小板膜糖蛋白单抗包被微球，将血小板裂解液与包被过的微球孵育，之后加入藻红蛋白标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体，流式细胞仪分析。若血小板表面存在特异性抗体，则形成“微球-血小板膜糖蛋白单抗-血小板膜糖蛋白特异性抗体-藻红蛋白标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体”复合物结构，表现为检测微球的荧光强度增高。
本发明的技术方案包括如下步骤：
1微球包被：采用物理吸附的方法包被聚苯乙烯微球，利用抗体Fc段的疏水作用与微球吸附，Fab段仍保持活性。包被前重悬微球，将微球加入包被缓冲液稀释好的鼠抗人单抗中，室温涡旋震荡；
2患者血样采集与处理：抽取患者静脉血分离血小板，转移至离心管，离心取沉淀，血小板裂解液裂解后离心，吸取上清液；
3抗原的俘获与上机检测：向裂解后上清液加入单抗包被过的微球，室温震荡孵育，加入藻红蛋白标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体，避光震荡孵育离心，弃上清，流式细胞仪上进行检测；
4数据处理：散点图圈出检测微球门，获取微球，记录直方图中的检测微球的平均荧光强度，对数据进行分析。设正常人作为对照。
本发明操作方便，技术成熟，检测血小板特异性抗体敏感性高，有助于血小板特异性抗体的临床试验研究。
具体实施方式：
本发明的检测步骤如下：
1.微球包被：采用物理吸附的方法包被聚苯乙烯微球，利用抗体Fc段的疏水作用与微球吸附，Fab段仍保持活性。包被前重悬微球，将微球加入包被缓冲液稀释好的鼠抗人血小板膜糖蛋白单抗中(使抗体与微球比例为70ug抗体/ml微球)，室温涡旋震荡2小时(或4℃涡旋震荡过夜)，0.01M PBS/TWEEN洗涤三次，之后5％小牛血清白蛋白震荡封闭微球2h，0.01M PBS/TWEEN洗涤三次，含0.2％叠氮钠的等渗盐溶液重悬微球，使微球最终浓度为0.25％。4℃保存。于第1、2、5、10、30、40天应用异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白G多克隆抗体及羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗体(阴性对照)检测微球，根据荧光强度的高低及其变化判断微球包被效果和稳定性；
2.血样采集与处理：采血前血细胞计数仪计数患者血小板，根据患者血小板计数，于枸橼酸钠抗凝的硅化管采集外周静脉血(应使采集血液中至少含有1×108个血小板)，200×g离心10分钟，吸取上层富血小板血浆(PRP)，转移至离心管，3000转/分钟离心2分钟(将上清取出，置于离心管中，-80℃冻存，留作血浆中糖蛋白特异性特异性抗体的测定)，取沉淀，PH6.2、0.05mol/L的枸橼酸钠洗涤5次，重悬计数，取1×108个血小板置于Ep藻红蛋白ndorf管中，离心弃上清，加入含1％Triton X-100的裂解液110ul(内含0.1mg/ml的leu藻红蛋白ptin)，4℃30分钟。5000转/分钟离心5分钟，吸取上清液，转移至另一Ep藻红蛋白ndorf管；
3.抗原的俘获与上机检测：向裂解后上清液加入15000个单抗包被过的微球，室温震荡孵育2h，离心，弃上清，PBS-TWEEN洗涤三次，之后用98ul 0.01M PBS重悬，加入2ul藻红蛋白标记的羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗体，避光震荡孵育1h，离心，弃上清，PBS-TWEEN洗涤二次，0.01M PBS调整最终体积至200ul，在BD-FACS Calibur流式细胞仪上利用CellQuest Pro软件进行检测；
4.数据处理：FSC/SSC散点图圈出检测微球门，获取2500-3000个微球，纪录FL-2直方图中的检测微球的平均荧光强度，存盘后用软件对数据进行分析。检测标本的同时，将三个正常人的血样作为正常对照。计算正常对照平均荧光强度的均值，将标本平均荧光强度与之比较并计算比率。

Claims (2)

1.一种检测免疫性血小板减少症血小板自身抗体的流式微球方法，其特征在于它采用如下步骤：
(1)微球包被：采用物理吸附的方法包被聚苯乙烯微球，利用抗体Fc段的疏水作用与微球吸附，Fab段仍保持活性，包被前重悬微球，将微球加入包被缓冲液稀释好的鼠抗人单抗中，室温涡旋震荡；
(2)患者血样采集与处理：抽取患者静脉血分离血小板，转移至离心管，离心取沉淀，血小板裂解液裂解后离心，吸取上清液；
(3)抗原的俘获与上机检测：向裂解后上清液加入单抗包被过的微球，室温震荡孵育，加入藻红蛋白标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体，避光震荡孵育离心，弃上清，流式细胞仪上进行检测；
(4)数据处理：散点图圈出检测微球门，获取微球，记录直方图中的检测微球的平均荧光强度，对数据进行分析，设正常对照。
2.根据权利要求1所述的一种检测免疫性血小板减少症血小板自身抗体的流式微球方法，其特征在于：用抗人血小板膜糖蛋白单抗包被微球，将血小板裂解液与包被过的微球孵育，之后加入藻红蛋白标记的羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗体，流式细胞仪分析，患者血小板表面存在自身抗体，形成“微球-血小板膜糖蛋白单抗-血小板膜糖蛋白自身抗体-藻红蛋白标记的羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗体”复合物结构，表现为检测微球的荧光强度增高。
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