CN107419006A - 一种快速检测嗜肺军团菌的cpa引物组及其检测方法 - Google Patents
一种快速检测嗜肺军团菌的cpa引物组及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107419006A CN107419006A CN201710358715.8A CN201710358715A CN107419006A CN 107419006 A CN107419006 A CN 107419006A CN 201710358715 A CN201710358715 A CN 201710358715A CN 107419006 A CN107419006 A CN 107419006A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cpa
- legionella pneumophilia
- primer
- detection
- primer sets
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 title claims abstract description 87
- 241000589248 Legionella Species 0.000 title claims abstract description 85
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 73
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 34
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 10
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 10
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 abstract description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000589276 Legionella jordanis Species 0.000 description 4
- 241000589293 Legionella maceachernii Species 0.000 description 4
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- 238000004378 air conditioning Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N phenanthrene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=CC2=C1 YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000189574 Legionella adelaidensis Species 0.000 description 1
- 241000589259 Legionella feeleii Species 0.000 description 1
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 description 1
- 241000189496 Legionella quateirensis Species 0.000 description 1
- 241000589272 Legionella rubrilucens Species 0.000 description 1
- 241000589268 Legionella sp. Species 0.000 description 1
- 208000004023 Legionellosis Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010054161 Pontiac fever Diseases 0.000 description 1
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000035896 Twin-reversed arterial perfusion sequence Diseases 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000000498 cooling water Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 229940115932 legionella pneumophila Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种快速检测嗜肺军团菌的CPA引物组及其检测方法，所述引物组包含一条交叉引物CP，一对剥离引物DPF/DPR和一对检测引物DF/DR，其序列依次如SEQ ID NO：1～5所示。所述检测方法为以待测样品基因组DNA为模板，利用所述嗜肺军团菌CPA引物组进行CPA扩增；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳即可判断结果或者扩增产物加入SYBR Green I观察颜色变化即可判断结果。本发明所述检测方法简便、快速、高效，特异性强、灵敏度高，扩增与检测时均不需要复杂仪器设备，非常适合基层现场快速检测嗜肺军团菌，具有较大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物分子检测技术领域。更具体地，涉及一种快速检测嗜肺军团菌的CPA引物组及其检测方法。
背景技术
军团菌属细菌（Legionella sp.）是一类革兰氏阴性菌，广泛存在于天然淡水或人工水体中。该菌的许多种类一旦以气溶胶的方式被易感人群吸入肺中，即有可能在肺泡中繁殖，并导致军团病（Legionellosis或Legionnaires’ disease, LD）。军团病可分为庞蒂亚克热（Pontiac fever）和军团菌肺炎（Legionnaires pneumonia）。前者是一种自限性流感样疾病，后者按严重程度从轻微咳嗽到快速致命的肺炎不等。嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是军团病最主要的致病原。1976年，美国费城召开的退伍军人大会上暴发了一场大规模感染，221人出现非典型肺炎症状，34人死亡；次年分离出致病菌株，即嗜肺军团菌。此后，军团菌病在世界各地时有暴发流行，我国也于1982年首次报道了军团菌病的临床病例。研究表明，军团菌肺炎暴发的首要风险来自于中央空调冷却塔和供水***；***也于2012年发布的《公共场所集中空调通风***卫生规范》中明确指出，集中空调***冷却水和冷凝水中不得检出嗜肺军团菌。随着我国城市化水平的提高，空调及供水***普及，嗜肺军团菌的检测对预防军团菌病的爆发和流行无疑具有重要意义。
自军团菌病于1977被报道以来，环境中嗜肺军团菌的检测就获得极大的重视，各种检测方法也不断出现。传统的嗜肺军团菌检测方法有分离培养、血清抗体检测、尿抗原检测等。细菌培养法是检测嗜肺军团菌的“金标准”，但其生长所需营养丰富，耗时长，检测成本高且效率低下；血清学检测则存在滞后性，缺乏早期诊断意义；尿抗原检测对血清型1型（LP1）以外的嗜肺军团菌敏感性较低。而近年来发展起来的分子生物学技术以其快速、简便、特异、敏感等优点，已在嗜肺军团菌检测及军团病快速诊断方面占有一席之地。其中，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）无疑是一种相对成熟、应用广泛的方法。但是，PCR依赖于热循环完成扩增，在实际应用中往往离不开昂贵的仪器热循环仪（即PCR仪）。
交叉引物扩增法（Cross Priming Amplification, CPA）是由杭州优思达生物技术有限公司发明的DNA恒温扩增技术（专利号200810134583.1）。CPA利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）及多条引物，在65℃恒温条件下可实现目标区域高效、快速的扩增。该方法的重点和难点在于引物组的设计，即各引物的位点选择与引物序列确定。目前，尚未有将CPA应用于嗜肺军团菌检测的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中嗜肺军团菌检测技术的缺陷和不足，建立了一种嗜肺军团菌的CPA检测方法，其检测靶标为嗜肺军团菌IVB型分泌***（TypeIVB secretion system, T4BSS）的结构基因dotA。所述方法简便、快速、高效，特异性强，灵敏度高，对仪器要求低，且扩增灵敏度高于普通PCR，具有较大的应用前景。
本发明的目的是提供一种快速检测嗜肺军团菌的CPA引物组。
本发明另一目的是提供一种快速检测嗜肺军团菌的方法。
本发明的再一目的是提供一种快速检测嗜肺军团菌的试剂盒。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种检测嗜肺军团菌的CPA引物组，所述引物组包含一条交叉引物CP，一对剥离引物DPF/DPR和一对检测引物DF/DR，其序列依次如SEQ ID NO：1～5所示。
目前的研究表明，dotA基因对嗜肺军团菌至关重要，缺失dotA的嗜肺军团菌将完全丧失毒力和感染能力。因此本发明通过比对嗜肺军团菌IVB型分泌***（Type IVBsecretion system, T4BSS），以结构基因dotA为靶标设计筛选了CPA检测引物组，所述引物组包含一条交叉引物CP，一对剥离引物DPF/DPR和一对检测引物DF/DR。所述寡聚核苷酸链能依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使DNA的循环扩增能不断的实现。
同时，所述CPA引物组在检测和/或鉴定嗜肺军团菌中的应用，以及在制备嗜肺军团菌检测试剂或试剂盒中的应用。亦在本发明保护范围内。
一种快速检测嗜肺军团菌的方法，包括如下步骤：
S1.以待测样品基因组DNA为模板，利用上述嗜肺军团菌CPA引物组进行CPA扩增；
S2.根据扩增结果判断待测样品中是否含有嗜肺军团菌。
优选地，步骤S1所述CPA扩增的反应体系为：10× Isothermal AmplificationBuffer 2μL，100mM MgSO41.2μL，10mM dNTP mix 0.8μL，Bst DNA聚合酶8U，10μM交叉引物CP 1.2μL，10μM剥离引物DPF、DPR各0.2μL，10μM检测引物DF、DR各1μL，模板DNA 1μL，加入ddH2O补足20μL。
优选地，步骤S1所述CPA扩增的反应条件为：60～65℃，60min，85℃，10min。
更有选地，步骤S1所述CPA扩增的反应条件为：65℃，60min，85℃，10min。
优选地，步骤S2所述根据扩增结果判断待测样品中是否含有嗜肺军团菌的具体方法为：利用电泳法或荧光染料法对CPA扩增产物进行检测，根据检测结果判断待测样品中是否含有嗜肺军团菌。
具体地，电泳法：若扩增产物呈现CPA特有的梯形条带，则为阳性，表示待测样品中含有嗜肺军团菌；若扩增产物未出现条带，则为阴性，表示待测样品中不含有嗜肺军团菌；
荧光染料法：若呈现绿色荧光，则为阳性，表示待测样品中含有嗜肺军团菌；若呈现橙色，则为阴性，表示待测样品中不含有嗜肺军团菌。
本发明建立的嗜肺军团菌CPA检测方法所需检测时间仅需1小时左右，且检测灵敏度为普通PCR的100倍，扩增与检测时均不需要复杂仪器设备，非常适合现场快速检测嗜肺军团菌。
此外，上述快速检测嗜肺军团菌的方法在检测和/或鉴定嗜肺军团菌中的应用，也在本发明的保护范围之内。
同时，本发明还提供一种快速检测嗜肺军团菌的试剂盒，所述试剂盒包含上述检测嗜肺军团菌的CPA引物组。
优选地，所述CPA引物组各引物的反应终浓度为：交叉引物CP0.6μmol/L，剥离引物DPF0.1μmol/L，剥离引物DPR0.1μmol/L，检测引物DF0.5μmol/L，检测引物DR0.5μmol/L。
优选地，所述试剂盒还包含CPA扩增反应所需试剂。
更优选地，所述试剂为恒温扩增缓冲液、MgSO4、dNTP mix、Bst DNA聚合酶和ddH2O。
优选地，所述试剂盒还包含嗜肺军团菌基因组DNA提取所需试剂。
作为一种优选的可实施方式，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
（1）提取待测样品基因组DNA。
（2）以基因组DNA为模板，利用上述嗜肺军团菌CPA检测引物组进行扩增反应；
CPA扩增的反应体系为：10× Isothermal Amplification Buffer 2μL，100mMMgSO41.2μL，10mM dNTP mix 0.8μL，Bst DNA聚合酶8U，10μM交叉引物CP 1.2μL，10μM剥离引物DPF、DPR各0.2μL，10μM检测引物DF、DR各1μL，模板DNA 1μL，加入ddH2O补足20μL；
CPA扩增的反应条件为：65℃，60min，85℃，10min。
（3）通过电泳法或荧光染料发观察CPA扩增产物；
电泳观测时，若扩增产物呈现CPA特有的梯形条带，则为阳性，表示待测样品中含有嗜肺军团菌；若扩增产物未出现条带，则为阴性，表示待测样品中不含有嗜肺军团菌；
荧光染料法观测时，若呈现绿色荧光，则为阳性，表示待测样品中含有嗜肺军团菌；若呈现橙色，则为阴性，表示待测样品中不含有嗜肺军团菌。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明所述CPA引物组特异性高，灵敏度强，扩增结果稳定可靠。
（2）本发明所述检测方法简便、快速、高效，特异性强、灵敏度高，扩增与检测时均不需要复杂仪器设备，只需一个恒温水浴锅即可完成扩增反应，扩增反应后可通过加入SYBR Green I观察颜色变化来判断靶基因的存在与否，非常适合基层与现场快速检测嗜肺军团菌，具有较大的应用前景。
附图说明
图1为嗜肺军团菌CPA产物琼脂糖凝胶电泳图；NTC：阴性对照；+：阳性结果；M：DS2000 marker。
图2为嗜肺军团菌CPA产物颜色判定结果；1、2、3：阳性结果；4、5、6：阴性结果。
图3为嗜肺军团菌CPA检测法特异性试验琼脂糖凝胶电泳图；M：DS 2000 marker；NTC：阴性对照；+：Lp02；1：沙门氏菌；2：约旦军团菌；3：马氏军团菌；4：阿德莱德军团菌；5：菲氏军团菌；6：考特拉军团菌；7：红光军团菌。
图4为嗜肺军团菌CPA检测法特异性试验琼脂糖凝胶电泳图；NTC：阴性对照；+：Lp02；M：DS 2000 marker；1：LP3；2：LP6；3：LP8.
图5为梯度稀释模板的普通PCR产物电泳图；M：DS 2000 marker；1～6：梯度稀释模板（0.192ng/μL、1.92×10-2ng/μL、1.92×10-3ng/μL、1.92×10-4ng/μL、1.92×10-5ng/μL、1.92×10-6ng/μL）；NTC：阴性对照。
图6为梯度稀释模板的CPA产物电泳图；NTC：阴性对照；1～6：梯度稀释模板（0.192ng/μL、1.92×10-2ng/μL、1.92×10-3ng/μL、1.92×10-4ng/μL、1.92×10-5ng/μL、1.92×10-6ng/μL）；M：DS 2000 marker。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1嗜肺军团菌CPA引物设计及检测
1、引物设计
参考比对嗜肺军团菌（参考序列NC_002942.5）IVB型分泌***序列，通过大量研究，设计和筛选出以嗜肺军团菌dotA基因为靶标的CPA引物组，包括一条交叉引物CP，一对剥离引物DPF/DPR，一对检测引物DF/DR，其序列分别如下所示：
交叉引物CP（SEQ ID NO.1）：
5’-AAGAGTAGTTTTGATCCCACACACTGACCTAAAGCAGGTACGC-3’
剥离引物DPF（SEQ ID NO.2）：5’-CACTAAGATCAGGTTGCT-3’
剥离引物DPR（SEQ ID NO.3）：5’-AATTTGATACGGGAACA-3’
检测引物DF（SEQ ID NO.4）：5’-TGACTGGATTTGAATCAGCT-3’
检测引物DR（SEQ ID NO.5）：5’-CAGGATCCCTATTCATTATTGT-3’
2、CPA反应
以嗜肺军团菌Lp02（L. pneumophila Philadelphia-1）的基因组DNA为阳性模板，ddH2O为阴性对照进行CPA扩增反应。
扩增反应体系（20μL）为：10× Isothermal Amplification Buffer 2μL，100mMMgSO41.2μL，10mMdNTP mix 0.8μL，Bst DNA聚合酶8U，10μM交叉引物CP1.2μL，10μM剥离引物DPF、DPR各0.2μL，10μM检测引物DF、DR各1μL，模板DNA 1μL，加入ddH2O补足20μL。
扩增反应条件为：65℃ 60min扩增；85℃ 10min失活。
3、结果
（1）取扩增产物10μL进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示：阴性对照无明显条带，阳性模板的产物呈现CPA特有的梯形条带。
（2）除了根据电泳条带判断外，也可以采用简便的目视检测来判断反应结果。具体为在扩增产物中加入1μL SYBR Green I（1000×），其结果如图2所示：阴性管呈橙色，阳性管呈绿色。
实施例2CPA引物组特异性测试
1、挑取沙门氏菌、约旦军团菌（L. jordanis）、马氏军团菌（L.maceachernii）、阿德莱德军团菌（L. adelaidensis）、菲氏军团菌（L. feeleii）、考特拉军团菌（L.quateirensis）、红光军团菌（L. rubrilucens）及嗜肺军团菌血清型3型、6型、8型的菌落，移至50μL无菌水中，煮沸10min后，冰浴1min，13000×g离心5min，上清液即为扩增样本。然后以Lp02的基因组DNA为阳性对照，ddH2O为阴性对照，利用实施例1所述扩增体系和方法进行扩增反应。
2、结果
CPA扩增结果如图3、图4所示：沙门氏菌、约旦军团菌、马氏军团菌、阿德莱德军团菌、菲氏军团菌、考特拉军团菌及红光军团菌均未发生扩增；嗜肺军团菌血清型3型、6型、8型LP3、LP6、LP8均有CPA特有的梯形条带，说明本发明所述引物和方法特异性好。
实施例3CPA引物组灵敏度测试
1、测得Lp02基因组提取液的DNA浓度为192ng/μL。逐级稀释10倍，至稀释浓度为1.92×10-6ng/μL，分别作为CPA及普通PCR的模板。
2、所述CPA反应体系如实施例1所示，普通PCR反应条件如下所示：
反应体系：2× Taq PCR StarMix（GeneStar）10μL，引物DPF、DPR各1μL，模板1μL，ddH2O补至20μL。
反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸6s，34个循环；72℃延伸5min；12℃停止。
3、结果
取10μL普通PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示，产物条带为204bp，普通PCR在模板浓度为1.92×10-2ng/μL时，电泳条带已十分微弱。CPA琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示，CPA在模板浓度为1.92×10-4ng/μL时仍可见扩增条件，可见本发明构建的嗜肺军团菌CPA检测法的敏感性显著高于普通PCR。
实施例4 嗜肺军团菌CPA检测试剂盒的建立
1、一种嗜肺军团菌的CPA检测试剂盒，所述试剂盒中含有以下各试剂：
10× Isothermal Amplification Buffer；MgSO4；dNTP mix；交叉引物CP；剥离引物DPF/DPR；检测引物DF/DR；Bst DNA聚合酶；
引物序列如下：
交叉引物CP（SEQ ID NO.1）：
5’-AAGAGTAGTTTTGATCCCACACACTGACCTAAAGCAGGTACGC-3’
剥离引物DPF（SEQ ID NO.2）：5’-CACTAAGATCAGGTTGCT-3’
剥离引物DPR（SEQ ID NO.3）：5’-AATTTGATACGGGAACA-3’
检测引物DF（SEQ ID NO.4）：5’-TGACTGGATTTGAATCAGCT-3’
检测引物DR（SEQ ID NO.5）：5’-CAGGATCCCTATTCATTATTGT-3’。
2、所述试剂盒的使用方法如下：
以待测样品的DNA为模板，利用引物组（交叉引物CP、剥离引物DPF/DPR和检测引物DF/DR）进行CPA扩增反应。
扩增反应体系（20μL）为：10× Isothermal Amplification Buffer 2μL，100mMMgSO41.2μL，10mM dNTP mix 0.8μL，Bst DNA聚合酶8U，10μM交叉引物CP 1.2μL，10μM剥离引物DPF、DPR各0.2μL，10μM检测引物DF、DR各1μL，模板DNA 1μL，加入ddH2O补足20μL。
扩增反应条件为：65℃ 60min扩增；85℃ 10min失活。
扩增结束后，扩增产物可加入SYBR Green I，呈现绿色表明结果为阳性。或者扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，呈现CPA特有的梯形条带，即为阳性。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学，广州市金润环保科技有限公司
<120> 一种快速检测嗜肺军团菌的CPA引物组及其检测方法
<130> 2017
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 交叉引物CP
<400> 1
aagagtagtt ttgatcccac acactgacct aaagcaggta cgc 43
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 剥离引物DPF
<400> 2
cactaagatc aggttgct 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 剥离引物DPR
<400> 3
aatttgatac gggaaca 17
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 检测引物DF
<400> 4
tgactggatt tgaatcagct 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 检测引物DR
<400> 5
caggatccct attcattatt gt 22
Claims (10)
1.一种检测嗜肺军团菌的CPA引物组，其特征在于，所述引物组包含一条交叉引物CP，一对剥离引物DPF/DPR和一对检测引物DF/DR，其序列依次如SEQ ID NO：1～5所示。
2.权利要求1所述CPA引物组在检测和/或鉴定嗜肺军团菌中的应用。
3.权利要求1所述CPA引物组在制备嗜肺军团菌检测试剂或试剂盒中的应用。
4.一种快速检测嗜肺军团菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.以待测样品基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组进行CPA扩增；
S2.根据扩增结果判断待测样品中是否含有嗜肺军团菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1所述CPA扩增的反应体系为：10×Isothermal Amplification Buffer 2μL，100mMMgSO41.2μL，10mMdNTP mix 0.8μL，BstDNA聚合酶8U，10μM交叉引物CP 1.2μL，10μM剥离引物DPF、DPR各0.2μL，10μM检测引物DF、DR各1μL，模板DNA 1μL，加入ddH2O补足20μL；步骤S1所述CPA扩增的反应条件为：60～65℃，60min；85℃，10min。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2所述根据扩增结果判断待测样品中是否含有嗜肺军团菌的具体方法为：利用电泳法或荧光染料法对CPA扩增产物进行检测，根据检测结果判断待测样品中是否含有嗜肺军团菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，结果的判断标准为：
电泳法：若扩增产物呈现CPA特有的梯形条带，则为阳性，表示待测样品中含有嗜肺军团菌；若扩增产物未出现条带，则为阴性，表示待测样品中不含有嗜肺军团菌；
荧光染料法：若呈现绿色荧光，则为阳性，表示待测样品中含有嗜肺军团菌；若呈现橙色，则为阴性，表示待测样品中不含有嗜肺军团菌。
8.权利要求4～7任一所述的方法在检测和/或鉴定嗜肺军团菌中的应用。
9.一种快速检测嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述CPA引物组。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含CPA扩增反应所需试剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710358715.8A CN107419006A (zh) | 2017-05-19 | 2017-05-19 | 一种快速检测嗜肺军团菌的cpa引物组及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710358715.8A CN107419006A (zh) | 2017-05-19 | 2017-05-19 | 一种快速检测嗜肺军团菌的cpa引物组及其检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107419006A true CN107419006A (zh) | 2017-12-01 |
Family
ID=60425982
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710358715.8A Pending CN107419006A (zh) | 2017-05-19 | 2017-05-19 | 一种快速检测嗜肺军团菌的cpa引物组及其检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107419006A (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1664105A (zh) * | 2004-03-01 | 2005-09-07 | 天津瑞爱金生物科技有限公司 | 嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）MIP基因克隆、重组、表达和蛋白纯化方法 |
| CN101638685A (zh) * | 2008-07-29 | 2010-02-03 | 杭州优思达生物技术有限公司 | 交叉引物扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用 |
| ES2336744A1 (es) * | 2008-02-21 | 2010-04-15 | Labaqua, S.A. | Metodo y kit para la deteccion y la cuantificacion de legionella pneumophila. |
| CN103667501A (zh) * | 2013-12-27 | 2014-03-26 | 天津国际旅行卫生保健中心 | 一种新型等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测试剂 |
| CN105256052A (zh) * | 2015-11-13 | 2016-01-20 | 广州金域检测科技股份有限公司 | 一种用于军团菌快速检测与分型的试剂盒及其检测方法 |
| CN105624286A (zh) * | 2015-12-07 | 2016-06-01 | 江苏和创生物科技有限公司 | 嗜肺军团菌荧光pcr检测试剂盒 |
| CN106148332A (zh) * | 2015-04-23 | 2016-11-23 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种鲤疱疹病毒2型cpa检测引物及应用 |
| CN106148566A (zh) * | 2015-04-23 | 2016-11-23 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种大鲵虹彩病毒cpa检测引物及应用 |
| CN106148565A (zh) * | 2015-04-16 | 2016-11-23 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种锦鲤疱疹病毒cpa检测引物及应用 |
-
2017
- 2017-05-19 CN CN201710358715.8A patent/CN107419006A/zh active Pending
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1664105A (zh) * | 2004-03-01 | 2005-09-07 | 天津瑞爱金生物科技有限公司 | 嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）MIP基因克隆、重组、表达和蛋白纯化方法 |
| ES2336744A1 (es) * | 2008-02-21 | 2010-04-15 | Labaqua, S.A. | Metodo y kit para la deteccion y la cuantificacion de legionella pneumophila. |
| CN101638685A (zh) * | 2008-07-29 | 2010-02-03 | 杭州优思达生物技术有限公司 | 交叉引物扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用 |
| CN103667501A (zh) * | 2013-12-27 | 2014-03-26 | 天津国际旅行卫生保健中心 | 一种新型等温环介导嗜肺军团菌核酸标记检测试剂 |
| CN106148565A (zh) * | 2015-04-16 | 2016-11-23 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种锦鲤疱疹病毒cpa检测引物及应用 |
| CN106148332A (zh) * | 2015-04-23 | 2016-11-23 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种鲤疱疹病毒2型cpa检测引物及应用 |
| CN106148566A (zh) * | 2015-04-23 | 2016-11-23 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种大鲵虹彩病毒cpa检测引物及应用 |
| CN105256052A (zh) * | 2015-11-13 | 2016-01-20 | 广州金域检测科技股份有限公司 | 一种用于军团菌快速检测与分型的试剂盒及其检测方法 |
| CN105624286A (zh) * | 2015-12-07 | 2016-06-01 | 江苏和创生物科技有限公司 | 嗜肺军团菌荧光pcr检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| COSTA J: "Legionella pneumophila partial dotA gene for defective organelle trafficking protein, strain Faco5 ,GenBank: FN652561.1", 《NCBI》 * |
| M. A. YA´N˜EZ等: "Quantitative Detection of Legionella pneumophila in Water Samples by Immunomagnetic Purification and Real-Time PCR Amplification of the dotA Gene", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| 朱水荣等: "嗜肺军团菌环介导等温扩增快速检测方法的建立与应用", 《中华流行病学杂志》 * |
| 杜昕颖等: "嗜肺军团菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立", 《生物技术通讯》 * |
| 赵婷婷等: "CPA恒温扩增技术检测炭疽芽胞杆菌方法的建立", 《中国国境卫生检疫杂志》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105018489B (zh) | 鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株a19和s2的试剂盒 | |
| Orynbayev et al. | Biological characterization of Pasteurella multocida present in the Saiga population | |
| Suchodolski et al. | Application of molecular fingerprinting for qualitative assessment of small-intestinal bacterial diversity in dogs | |
| CN104862406B (zh) | 一种用于现场快速检测结核分枝杆菌复合群的引物与探针及其试剂盒 | |
| CN101736085B (zh) | 牛支原体环介导等温扩增检测方法 | |
| CN103710433B (zh) | 用于检测巴贝斯虫的引物和实时荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN105002173A (zh) | 鉴别布鲁氏菌s2疫苗株与野毒株的试剂盒 | |
| CN105018628B (zh) | 鉴别布鲁氏菌a19疫苗株与野毒株的试剂盒 | |
| CN103074451A (zh) | 一种同步检测二十二种呼吸道病原体的试剂盒及其检测方法 | |
| CN106868166A (zh) | 用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒 | |
| CN106987626A (zh) | 用于快速检测多种真菌并鉴定菌种的引物和探针及其应用 | |
| CN108588277A (zh) | 一种犬瘟热病毒可视化核酸检测方法 | |
| CN108531627A (zh) | 一种用于检测b族链球菌的rpa荧光定量引物对、探针、试剂盒及检测方法 | |
| WO2012117431A1 (en) | Method and reagent kit for the identification of biological fluids in a sample | |
| CN101481742B (zh) | 一种猪肺炎支原体检测试剂盒及其应用 | |
| WO2010062897A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
| CN110499394A (zh) | 检测非洲猪瘟病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN110408727A (zh) | 一种检测j亚群禽白血病病毒的cpa引物组、cpa核酸试纸条试剂盒及其应用 | |
| CN104911269B (zh) | 鉴别气溶胶中布鲁氏菌a19疫苗株的引物、探针及试剂盒 | |
| CN109852715A (zh) | 一种TaqMan探针法检测问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的试剂盒 | |
| CN110093432A (zh) | 一种用于区分结核杆菌和BCG疫苗的sRNA标志物及其用途 | |
| CN103276099A (zh) | 用于荧光定量pcr检测幽门螺杆菌的引物和试剂盒 | |
| CN104946753A (zh) | 用于牛支原体检测的特异性引物对、检测试剂盒及其使用方法和应用 | |
| CN107312849A (zh) | 一种检测牛支原体的cpa检测方法及其试剂盒与应用 | |
| CN110218803B (zh) | 针对人鼠共患病病原微生物的pcr引物对、试剂盒及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20171201 |