CN107419006A - 一种快速检测嗜肺军团菌的cpa引物组及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测嗜肺军团菌的CPA引物组及其检测方法,所述引物组包含一条交叉引物CP,一对剥离引物DPF/DPR和一对检测引物DF/DR,其序列依次如SEQ ID NO:1~5所示。所述检测方法为以待测样品基因组DNA为模板,利用所述嗜肺军团菌CPA引物组进行CPA扩增;扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳即可判断结果或者扩增产物加入SYBR Green I观察颜色变化即可判断结果。本发明所述检测方法简便、快速、高效,特异性强、灵敏度高,扩增与检测时均不需要复杂仪器设备,非常适合基层现场快速检测嗜肺军团菌,具有较大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物分子检测技术领域。更具体地,涉及一种快速检测嗜肺军团菌的CPA引物组及其检测方法。
背景技术
军团菌属细菌(Legionella sp.)是一类革兰氏阴性菌,广泛存在于天然淡水或人工水体中。该菌的许多种类一旦以气溶胶的方式被易感人群吸入肺中,即有可能在肺泡中繁殖,并导致军团病(Legionellosis或Legionnaires’ disease, LD)。军团病可分为庞蒂亚克热(Pontiac fever)和军团菌肺炎(Legionnaires pneumonia)。前者是一种自限性流感样疾病,后者按严重程度从轻微咳嗽到快速致命的肺炎不等。嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)是军团病最主要的致病原。1976年,美国费城召开的退伍军人大会上暴发了一场大规模感染,221人出现非典型肺炎症状,34人死亡;次年分离出致病菌株,即嗜肺军团菌。此后,军团菌病在世界各地时有暴发流行,我国也于1982年首次报道了军团菌病的临床病例。研究表明,军团菌肺炎暴发的首要风险来自于中央空调冷却塔和供水***;***也于2012年发布的《公共场所集中空调通风***卫生规范》中明确指出,集中空调***冷却水和冷凝水中不得检出嗜肺军团菌。随着我国城市化水平的提高,空调及供水***普及,嗜肺军团菌的检测对预防军团菌病的爆发和流行无疑具有重要意义。
自军团菌病于1977被报道以来,环境中嗜肺军团菌的检测就获得极大的重视,各种检测方法也不断出现。传统的嗜肺军团菌检测方法有分离培养、血清抗体检测、尿抗原检测等。细菌培养法是检测嗜肺军团菌的“金标准”,但其生长所需营养丰富,耗时长,检测成本高且效率低下;血清学检测则存在滞后性,缺乏早期诊断意义;尿抗原检测对血清型1型(LP1)以外的嗜肺军团菌敏感性较低。而近年来发展起来的分子生物学技术以其快速、简便、特异、敏感等优点,已在嗜肺军团菌检测及军团病快速诊断方面占有一席之地。其中,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)无疑是一种相对成熟、应用广泛的方法。但是,PCR依赖于热循环完成扩增,在实际应用中往往离不开昂贵的仪器热循环仪(即PCR仪)。
交叉引物扩增法(Cross Priming Amplification, CPA)是由杭州优思达生物技术有限公司发明的DNA恒温扩增技术(专利号200810134583.1)。CPA利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)及多条引物,在65℃恒温条件下可实现目标区域高效、快速的扩增。该方法的重点和难点在于引物组的设计,即各引物的位点选择与引物序列确定。目前,尚未有将CPA应用于嗜肺军团菌检测的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中嗜肺军团菌检测技术的缺陷和不足,建立了一种嗜肺军团菌的CPA检测方法,其检测靶标为嗜肺军团菌IVB型分泌***(TypeIVB secretion system, T4BSS)的结构基因dotA。所述方法简便、快速、高效,特异性强,灵敏度高,对仪器要求低,且扩增灵敏度高于普通PCR,具有较大的应用前景。
本发明的目的是提供一种快速检测嗜肺军团菌的CPA引物组。
本发明另一目的是提供一种快速检测嗜肺军团菌的方法。
本发明的再一目的是提供一种快速检测嗜肺军团菌的试剂盒。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的:
一种检测嗜肺军团菌的CPA引物组,所述引物组包含一条交叉引物CP,一对剥离引物DPF/DPR和一对检测引物DF/DR,其序列依次如SEQ ID NO:1~5所示。
目前的研究表明,dotA基因对嗜肺军团菌至关重要,缺失dotA的嗜肺军团菌将完全丧失毒力和感染能力。因此本发明通过比对嗜肺军团菌IVB型分泌***(Type IVBsecretion system, T4BSS),以结构基因dotA为靶标设计筛选了CPA检测引物组,所述引物组包含一条交叉引物CP,一对剥离引物DPF/DPR和一对检测引物DF/DR。所述寡聚核苷酸链能依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特性,使DNA的循环扩增能不断的实现。
同时,所述CPA引物组在检测和/或鉴定嗜肺军团菌中的应用,以及在制备嗜肺军团菌检测试剂或试剂盒中的应用。亦在本发明保护范围内。
一种快速检测嗜肺军团菌的方法,包括如下步骤:
S1.以待测样品基因组DNA为模板,利用上述嗜肺军团菌CPA引物组进行CPA扩增;
S2.根据扩增结果判断待测样品中是否含有嗜肺军团菌。
优选地,步骤S1所述CPA扩增的反应体系为:10× Isothermal AmplificationBuffer 2μL,100mM MgSO41.2μL,10mM dNTP mix 0.8μL,Bst DNA聚合酶8U,10μM交叉引物CP 1.2μL,10μM剥离引物DPF、DPR各0.2μL,10μM检测引物DF、DR各1μL,模板DNA 1μL,加入ddH2O补足20μL。
优选地,步骤S1所述CPA扩增的反应条件为:60~65℃,60min,85℃,10min。
更有选地,步骤S1所述CPA扩增的反应条件为:65℃,60min,85℃,10min。
优选地,步骤S2所述根据扩增结果判断待测样品中是否含有嗜肺军团菌的具体方法为:利用电泳法或荧光染料法对CPA扩增产物进行检测,根据检测结果判断待测样品中是否含有嗜肺军团菌。
具体地,电泳法:若扩增产物呈现CPA特有的梯形条带,则为阳性,表示待测样品中含有嗜肺军团菌;若扩增产物未出现条带,则为阴性,表示待测样品中不含有嗜肺军团菌;
荧光染料法:若呈现绿色荧光,则为阳性,表示待测样品中含有嗜肺军团菌;若呈现橙色,则为阴性,表示待测样品中不含有嗜肺军团菌。
本发明建立的嗜肺军团菌CPA检测方法所需检测时间仅需1小时左右,且检测灵敏度为普通PCR的100倍,扩增与检测时均不需要复杂仪器设备,非常适合现场快速检测嗜肺军团菌。
此外,上述快速检测嗜肺军团菌的方法在检测和/或鉴定嗜肺军团菌中的应用,也在本发明的保护范围之内。
同时,本发明还提供一种快速检测嗜肺军团菌的试剂盒,所述试剂盒包含上述检测嗜肺军团菌的CPA引物组。
优选地,所述CPA引物组各引物的反应终浓度为:交叉引物CP0.6μmol/L,剥离引物DPF0.1μmol/L,剥离引物DPR0.1μmol/L,检测引物DF0.5μmol/L,检测引物DR0.5μmol/L。
优选地,所述试剂盒还包含CPA扩增反应所需试剂。
更优选地,所述试剂为恒温扩增缓冲液、MgSO4、dNTP mix、Bst DNA聚合酶和ddH2O。
优选地,所述试剂盒还包含嗜肺军团菌基因组DNA提取所需试剂。
作为一种优选的可实施方式,所述试剂盒的使用方法包括如下步骤:
(1)提取待测样品基因组DNA。
(2)以基因组DNA为模板,利用上述嗜肺军团菌CPA检测引物组进行扩增反应;
CPA扩增的反应体系为:10× Isothermal Amplification Buffer 2μL,100mMMgSO41.2μL,10mM dNTP mix 0.8μL,Bst DNA聚合酶8U,10μM交叉引物CP 1.2μL,10μM剥离引物DPF、DPR各0.2μL,10μM检测引物DF、DR各1μL,模板DNA 1μL,加入ddH2O补足20μL;
CPA扩增的反应条件为:65℃,60min,85℃,10min。
(3)通过电泳法或荧光染料发观察CPA扩增产物;
电泳观测时,若扩增产物呈现CPA特有的梯形条带,则为阳性,表示待测样品中含有嗜肺军团菌;若扩增产物未出现条带,则为阴性,表示待测样品中不含有嗜肺军团菌;
荧光染料法观测时,若呈现绿色荧光,则为阳性,表示待测样品中含有嗜肺军团菌;若呈现橙色,则为阴性,表示待测样品中不含有嗜肺军团菌。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明所述CPA引物组特异性高,灵敏度强,扩增结果稳定可靠。
(2)本发明所述检测方法简便、快速、高效,特异性强、灵敏度高,扩增与检测时均不需要复杂仪器设备,只需一个恒温水浴锅即可完成扩增反应,扩增反应后可通过加入SYBR Green I观察颜色变化来判断靶基因的存在与否,非常适合基层与现场快速检测嗜肺军团菌,具有较大的应用前景。
附图说明
图1为嗜肺军团菌CPA产物琼脂糖凝胶电泳图;NTC:阴性对照;+:阳性结果;M:DS2000 marker。
图2为嗜肺军团菌CPA产物颜色判定结果;1、2、3:阳性结果;4、5、6:阴性结果。
图3为嗜肺军团菌CPA检测法特异性试验琼脂糖凝胶电泳图;M:DS 2000 marker;NTC:阴性对照;+:Lp02;1:沙门氏菌;2:约旦军团菌;3:马氏军团菌;4:阿德莱德军团菌;5:菲氏军团菌;6:考特拉军团菌;7:红光军团菌。
图4为嗜肺军团菌CPA检测法特异性试验琼脂糖凝胶电泳图;NTC:阴性对照;+:Lp02;M:DS 2000 marker;1:LP3;2:LP6;3:LP8.
图5为梯度稀释模板的普通PCR产物电泳图;M:DS 2000 marker;1~6:梯度稀释模板(0.192ng/μL、1.92×10-2ng/μL、1.92×10-3ng/μL、1.92×10-4ng/μL、1.92×10-5ng/μL、1.92×10-6ng/μL);NTC:阴性对照。
图6为梯度稀释模板的CPA产物电泳图;NTC:阴性对照;1~6:梯度稀释模板(0.192ng/μL、1.92×10-2ng/μL、1.92×10-3ng/μL、1.92×10-4ng/μL、1.92×10-5ng/μL、1.92×10-6ng/μL);M:DS 2000 marker。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1嗜肺军团菌CPA引物设计及检测
1、引物设计
参考比对嗜肺军团菌(参考序列NC_002942.5)IVB型分泌***序列,通过大量研究,设计和筛选出以嗜肺军团菌dotA基因为靶标的CPA引物组,包括一条交叉引物CP,一对剥离引物DPF/DPR,一对检测引物DF/DR,其序列分别如下所示:
交叉引物CP(SEQ ID NO.1):
5’-AAGAGTAGTTTTGATCCCACACACTGACCTAAAGCAGGTACGC-3’
剥离引物DPF(SEQ ID NO.2):5’-CACTAAGATCAGGTTGCT-3’
剥离引物DPR(SEQ ID NO.3):5’-AATTTGATACGGGAACA-3’
检测引物DF(SEQ ID NO.4):5’-TGACTGGATTTGAATCAGCT-3’
检测引物DR(SEQ ID NO.5):5’-CAGGATCCCTATTCATTATTGT-3’
2、CPA反应
以嗜肺军团菌Lp02(L. pneumophila Philadelphia-1)的基因组DNA为阳性模板,ddH2O为阴性对照进行CPA扩增反应。
扩增反应体系(20μL)为:10× Isothermal Amplification Buffer 2μL,100mMMgSO41.2μL,10mMdNTP mix 0.8μL,Bst DNA聚合酶8U,10μM交叉引物CP1.2μL,10μM剥离引物DPF、DPR各0.2μL,10μM检测引物DF、DR各1μL,模板DNA 1μL,加入ddH2O补足20μL。
扩增反应条件为:65℃ 60min扩增;85℃ 10min失活。
3、结果
(1)取扩增产物10μL进行2%琼脂糖凝胶电泳,结果如图1所示:阴性对照无明显条带,阳性模板的产物呈现CPA特有的梯形条带。
(2)除了根据电泳条带判断外,也可以采用简便的目视检测来判断反应结果。具体为在扩增产物中加入1μL SYBR Green I(1000×),其结果如图2所示:阴性管呈橙色,阳性管呈绿色。
实施例2CPA引物组特异性测试
1、挑取沙门氏菌、约旦军团菌(L. jordanis)、马氏军团菌(L.maceachernii)、阿德莱德军团菌(L. adelaidensis)、菲氏军团菌(L. feeleii)、考特拉军团菌(L.quateirensis)、红光军团菌(L. rubrilucens)及嗜肺军团菌血清型3型、6型、8型的菌落,移至50μL无菌水中,煮沸10min后,冰浴1min,13000×g离心5min,上清液即为扩增样本。然后以Lp02的基因组DNA为阳性对照,ddH2O为阴性对照,利用实施例1所述扩增体系和方法进行扩增反应。
2、结果
CPA扩增结果如图3、图4所示:沙门氏菌、约旦军团菌、马氏军团菌、阿德莱德军团菌、菲氏军团菌、考特拉军团菌及红光军团菌均未发生扩增;嗜肺军团菌血清型3型、6型、8型LP3、LP6、LP8均有CPA特有的梯形条带,说明本发明所述引物和方法特异性好。
实施例3CPA引物组灵敏度测试
1、测得Lp02基因组提取液的DNA浓度为192ng/μL。逐级稀释10倍,至稀释浓度为1.92×10-6ng/μL,分别作为CPA及普通PCR的模板。
2、所述CPA反应体系如实施例1所示,普通PCR反应条件如下所示:
反应体系:2× Taq PCR StarMix(GeneStar)10μL,引物DPF、DPR各1μL,模板1μL,ddH2O补至20μL。
反应程序:94℃预变性3min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸6s,34个循环;72℃延伸5min;12℃停止。
3、结果
取10μL普通PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果如图5所示,产物条带为204bp,普通PCR在模板浓度为1.92×10-2ng/μL时,电泳条带已十分微弱。CPA琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示,CPA在模板浓度为1.92×10-4ng/μL时仍可见扩增条件,可见本发明构建的嗜肺军团菌CPA检测法的敏感性显著高于普通PCR。
实施例4 嗜肺军团菌CPA检测试剂盒的建立
1、一种嗜肺军团菌的CPA检测试剂盒,所述试剂盒中含有以下各试剂:
10× Isothermal Amplification Buffer;MgSO4;dNTP mix;交叉引物CP;剥离引物DPF/DPR;检测引物DF/DR;Bst DNA聚合酶;
引物序列如下:
交叉引物CP(SEQ ID NO.1):
5’-AAGAGTAGTTTTGATCCCACACACTGACCTAAAGCAGGTACGC-3’
剥离引物DPF(SEQ ID NO.2):5’-CACTAAGATCAGGTTGCT-3’
剥离引物DPR(SEQ ID NO.3):5’-AATTTGATACGGGAACA-3’
检测引物DF(SEQ ID NO.4):5’-TGACTGGATTTGAATCAGCT-3’
检测引物DR(SEQ ID NO.5):5’-CAGGATCCCTATTCATTATTGT-3’。
2、所述试剂盒的使用方法如下:
以待测样品的DNA为模板,利用引物组(交叉引物CP、剥离引物DPF/DPR和检测引物DF/DR)进行CPA扩增反应。
扩增反应体系(20μL)为:10× Isothermal Amplification Buffer 2μL,100mMMgSO41.2μL,10mM dNTP mix 0.8μL,Bst DNA聚合酶8U,10μM交叉引物CP 1.2μL,10μM剥离引物DPF、DPR各0.2μL,10μM检测引物DF、DR各1μL,模板DNA 1μL,加入ddH2O补足20μL。
扩增反应条件为:65℃ 60min扩增;85℃ 10min失活。
扩增结束后,扩增产物可加入SYBR Green I,呈现绿色表明结果为阳性。或者扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,呈现CPA特有的梯形条带,即为阳性。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学,广州市金润环保科技有限公司
<120> 一种快速检测嗜肺军团菌的CPA引物组及其检测方法
<130> 2017
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 交叉引物CP
<400> 1
aagagtagtt ttgatcccac acactgacct aaagcaggta cgc 43
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 剥离引物DPF
<400> 2
cactaagatc aggttgct 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 剥离引物DPR
<400> 3
aatttgatac gggaaca 17
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 检测引物DF
<400> 4
tgactggatt tgaatcagct 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 检测引物DR
<400> 5
caggatccct attcattatt gt 22
Claims (10)
1.一种检测嗜肺军团菌的CPA引物组,其特征在于,所述引物组包含一条交叉引物CP,一对剥离引物DPF/DPR和一对检测引物DF/DR,其序列依次如SEQ ID NO:1~5所示。
2.权利要求1所述CPA引物组在检测和/或鉴定嗜肺军团菌中的应用。
3.权利要求1所述CPA引物组在制备嗜肺军团菌检测试剂或试剂盒中的应用。
4.一种快速检测嗜肺军团菌的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1.以待测样品基因组DNA为模板,利用权利要求1所述引物组进行CPA扩增;
S2.根据扩增结果判断待测样品中是否含有嗜肺军团菌。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤S1所述CPA扩增的反应体系为:10×Isothermal Amplification Buffer 2μL,100mMMgSO41.2μL,10mMdNTP mix 0.8μL,BstDNA聚合酶8U,10μM交叉引物CP 1.2μL,10μM剥离引物DPF、DPR各0.2μL,10μM检测引物DF、DR各1μL,模板DNA 1μL,加入ddH2O补足20μL;步骤S1所述CPA扩增的反应条件为:60~65℃,60min;85℃,10min。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤S2所述根据扩增结果判断待测样品中是否含有嗜肺军团菌的具体方法为:利用电泳法或荧光染料法对CPA扩增产物进行检测,根据检测结果判断待测样品中是否含有嗜肺军团菌。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,结果的判断标准为:
电泳法:若扩增产物呈现CPA特有的梯形条带,则为阳性,表示待测样品中含有嗜肺军团菌;若扩增产物未出现条带,则为阴性,表示待测样品中不含有嗜肺军团菌;
荧光染料法:若呈现绿色荧光,则为阳性,表示待测样品中含有嗜肺军团菌;若呈现橙色,则为阴性,表示待测样品中不含有嗜肺军团菌。
8.权利要求4~7任一所述的方法在检测和/或鉴定嗜肺军团菌中的应用。
9.一种快速检测嗜肺军团菌的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含权利要求1所述CPA引物组。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包含CPA扩增反应所需试剂。
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