CN107407678A - 病毒检测用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病毒检测用试剂盒、病毒检测用组合物及病毒检测方法。根据本发明,可以在短时间内以低成本高效率地检测病毒。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测用试剂盒、病毒检测方法及病毒检测用组合物。
背景技术
病毒是比细菌更小的传染性病原体。病毒由作为遗传物质的RNA或DNA、和围绕遗传物质的蛋白质组成。根据宿主的类型,病毒可分为植物病毒、动物病毒和细菌病毒(噬菌体)。然而,在大多数情况下,病毒根据核酸的类型分为DNA病毒亚门和RNA病毒亚门,并且还被细分为纲、目和科。
在这些病毒中,禽流感是由禽流感病毒感染鸡、鸭或野鸟引起的急性病毒感染性疾病,很少发展成人类感染性疾病。禽流感病毒根据致病性分为高致病性、低致病性和非致病性三种,2003年末至2008年2月,已经报道了超过640例的高致病性禽流感A(H5N1)的人类感染病例。禽流感由于死亡率高和禽类产蛋率低而造成巨大的经济损失,尽管不太可能引起感染,但人被感染时死亡率高。由于难以开发根本性禽流感疫苗,且传播速度非常快,因此必须通过早期诊断来使疾病传播和经济损失最小化。
作为诊断这种病毒的方法,已知诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)和免疫荧光测定(IFA)等免疫学检测方法和通过RT-PCR的RNA检测方法,但是这些方法的问题在于,诊断病毒需要花费太多时间并且需要高昂的实验费用,或由于非特异性反应而降低了特异性和灵敏度。
因此,有必要开发一种以低成本在短时间内有效地检测病毒的方法。
发明内容
技术问题
本发明旨在提供一种能够在短时间内有效地检测病毒的病毒检测用试剂盒、病毒检测方法以及病毒检测用组合物。
技术方案
本发明提供病毒检测用试剂盒,其包括与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子;以及与由生物分子活化的病毒反应的探针。
本发明还提供病毒检测用组合物,其包括与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子;以及与由生物分子活化的病毒反应的探针。
本发明还提供一种病毒检测方法,该方法包括使从受试者获得的样品与和病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子接触,并且使与生物分子接触的样品与和由生物分子活化的病毒反应的探针接触。
有益效果
根据本发明,能够在短时间内以低成本高效率地检测病毒。
附图说明
图1是根据本发明的实施方式的流感病毒检测方法的示意图。
图2示出了根据本发明的实施方式的两亲性粒子(FluSome)的TEM图像。
图3示出了根据本发明的实施方式的两亲性粒子的平均直径。
图4示出了验证根据本发明的实施方式的两亲性粒子的荧光共振能量转移(FRET)效应的结果。
图5示出了使用根据本发明的实施方式的两亲性粒子检测流感病毒的结果。
图6示出了使用根据本发明的实施方式的两亲性粒子检测各种类型的流感病毒的结果。
图7示出了使用根据本发明的实施方式的两亲性粒子检测各种类型的流感病毒的结果。
图8示出了使用根据本发明的实施方式的有机/无机粒子检测流感病毒的结果。
图9示出了使用根据本发明的实施方式的有机/无机粒子检测流感病毒的结果。
图10示出了通过测量表面增强拉曼散射信号来检测流感病毒的结果。
图11示出了通过目视观察颜色变化来检测流感病毒的结果。
图12示出了使用根据本发明的实施方式的脂质体来检测流感病毒的结果。
具体实施方式
所有类型的病毒,包括流感病毒和埃博拉病毒都由与宿主细胞结合的表面蛋白血凝素(HA)(用于入侵宿主细胞)、参与成熟病毒粒子从宿主细胞逃逸的神经氨酸酶、用于控制氢离子浓度平衡的M2离子通道以及含有病毒遗传信息的核糖核蛋白(RNP)组成。
基于上述病毒的共同特征,本发明人进行了研究,以开发用于在早期检测病毒的方法。结果发现,通过使用与病毒的表面蛋白特异性反应以活化病毒的生物分子和与由此活化的病毒反应以检测病毒存在的探针的简单方法能够检测病毒,并完成了本发明。
因此,本发明提供病毒检测用试剂盒,其包含与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子和与由生物分子活化的病毒反应的探针。
本文中使用的术语“病毒”是指专性细胞内寄生虫,其具有DNA或RNA作为核酸,从核酸开始增殖,不通过二元裂变增殖,并且不具有产生ATP所需的酶***。本发明的病毒包括裸病毒和包膜病毒,具体地,根据本发明的实施方式,病毒可以是包膜病毒。
具体地,包膜病毒包括DNA病毒,例如疱疹病毒、痘病毒和嗜肝DNA病毒,以及RNA病毒,例如黄病毒、披膜病毒、冠状病毒、丁型肝炎、正粘病毒、副粘病毒、弹状病毒、布尼亚病毒、线状病毒和逆转录病毒。
正粘病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、鲑传贫病毒(isavirus)、托高土病毒和quaranjavirus属。
冠状病毒包括α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和δ冠状病毒属。
副粘病毒包括副粘病毒、风疹病毒、麻疹病毒和肺病毒属。
病毒包括核酸和围绕该核酸的蛋白。这种病毒蛋白参与保护病毒基因组、将病毒粒子附着和/或融合到细胞中、确定病毒抗原性,并且包括维持病毒形状的结构蛋白和与蛋白质和核酸的合成有关的非结构蛋白。
本文中使用的术语“病毒的表面蛋白”是指结构蛋白。具体地,本发明的“表面蛋白”具有病毒的特异性抗原性,并且包括在参与将病毒附着和/或融合到细胞的包膜上存在的所有外周蛋白。在一个实施方式中,本发明的这种表面蛋白可以包括糖蛋白和参与融合到细胞的融合蛋白。
根据本发明的一个实施方式,病毒的表面蛋白可以是血凝素(HA)、纤突蛋白或F蛋白。
根据本发明的一个实施方式,本发明的病毒可以包括附着于宿主细胞的细胞膜的表面蛋白,致使膜融合。具体地,本发明的病毒可以包括具有如下性质的表面蛋白:其中以非活性形式存在的表面蛋白通过生物分子被转换成以活性形式,以引起宿主细胞与细胞膜的附着和/或膜融合。
根据本发明的一个实施方式,“病毒”可以是流感病毒或高致病性流感病毒。流感病毒包括糖蛋白、作为其“表面蛋白”的血凝素(HA)。血凝素被表达为一种多肽(前体HA0),通过蛋白水解将HA0的切割位点分成HA1和HA2,在酸性条件下活化由疏水性氨基酸残基组成的融合肽。由于流感病毒的致病性,HA具有与切割位点的氨基酸不同的氨基酸组成。
根据本发明的另一个实施方式,“病毒”可以是冠状病毒。冠状病毒包括纤突蛋白作为表面蛋白,并且纤突蛋白包括S1部分和S2部分。当纤突蛋白的S1部分与宿主细胞结合时,其被蛋白酶切割成S1和S2,并且S2末端的疏水域暴露并因此被活化。
根据本发明的另一个实施方式,“病毒”可以是副粘病毒。副粘病毒包括HN蛋白作为表面蛋白。HN蛋白是将病毒结合或附着于宿主细胞的结合(或附着)蛋白,并且当其在病毒的非活性状态下作为前体HN0存在时,其通过水解通过从C末端除去氨基酸残基而被活化。此外,副粘病毒包括F蛋白作为表面蛋白。当F蛋白在病毒的非活性状态下作为前体F0存在时,其在被生物分子切割成F1和F2后被活化为新形式的N末端F1。F蛋白在切割位点包括多元碱性残基和一元碱性残基。优选地,F蛋白质可以是具有多元碱性残基的F蛋白质。
本文中使用的术语“反应”是指当任何材料与不同材料接触时物理和/或化学状态(例如条件、颜色、形状或化学键)的变化、或其现象。
在一个实施方式中,当病毒的表面蛋白与生物分子反应时,病毒的表面蛋白被转化,导致活化病毒的状态改变,从而形成融合肽。在另一个实施方式中,活化病毒和探针之间的反应可以是融合或聚集。
根据一个实施方式,融合可以是活性病毒与本发明的探针的一部分结合的现象。可以理解为,融合还包括探针中的物质通过融合释放到外部的现象。在一个示例中,可以通过使用如下原理来通过确认活性病毒是否与探针融合来检测活性病毒:在活性病毒的表面蛋白中存在的融合肽诱导核内体与细胞膜的融合。
聚集是指分子或粒子在溶液中结合在一起的现象。在本发明的一个实施方式中,凝集是指由于作为检测对象的病毒导致凝结和/或沉淀而使得本发明的探针的稳定性降低而引起的探针凝结现象。
本文中使用的术语“生物分子”是指活生物体中的结构、功能或信号转导所需的分子。生物分子可以包括用于功能或信号转导的特定结构和/或区域。这种生物分子的特定结构是通过分子间结合反应产生反应的驱动力。生物分子包括氨基酸和蛋白质、糖和碳水化合物、脂肪酸和脂质以及核苷酸和核酸,并且包括在活生物体和/或人工合成制品中制备的所有产物。根据本发明的一个实施方式,“生物分子”可以是酶,其是由约62至2500个氨基酸残基组成的蛋白质。
在一个实施方式中,酶可以是蛋白酶。在一个示例中,使第一合成形式的酶失活,但是在由于去除(或切割)特定部分而显示活性的蛋白质中,蛋白酶切割特定部分,导致失活的蛋白质的活化。蛋白酶可以是能够切割特定部分的任何酶,而对其类型没有限制。
在一个实施方式中,蛋白酶可以是选自由弗林蛋白酶、胰蛋白酶、丝氨酸、内切蛋白酶和羧肽酶组成的组中的一种或多种。蛋白酶包括其衍生物或修饰物。例如,蛋白酶可以包括重组人类弗林蛋白酶、重组小鼠弗林蛋白酶、胰蛋白酶-EDTA、乙酰化胰蛋白酶、N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮-胰蛋白酶(TPCK-胰蛋白酶)、胰蛋白酶-丙烯酸、弗林蛋白酶样蛋白酶、Kex2蛋白酶、跨膜蛋白酶丝氨酸、TMPRSS2、TMPRSS4、克拉拉类胰蛋白酶、纤溶酶、丝氨酸蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶样内切蛋白酶、羧肽酶及其组合。
在一个实施方式中,当胰蛋白酶与流感病毒的表面蛋白反应时,对于血凝素(HA),胰蛋白酶的酶促降解发生在His57-Asp102-Ser195处,并且弗林蛋白酶的酶促降解发生在His194-Asp153-Ser368处。由于胰蛋白酶降解高致病性和低致病性流感病毒的血凝素,因此可以使用胰蛋白酶检测高/低致病性流感病毒。此外,由于弗林蛋白酶只可降解高致病性流感病毒的血凝素,所以可以使用弗林蛋白酶检测高致病性流感病毒。
在另一个实施方式中,当蛋白酶与冠状病毒的表面蛋白反应时,在S1区域和S2区域之间的交界处发生水解。因此,随着通过水解的切割而暴露S2的疏水域,冠状病毒被活化用于使用本发明的探针进行检测。
在又一个实施方式中,与副粘病毒的表面蛋白反应的生物分子可以是蛋白酶或羧肽酶,其有利于在C末端(羧基侧)的精氨酸残基处切割。蛋白酶可以识别并切割含有R-X-K/R-R排列的F蛋白。作为具体示例,蛋白酶可以是弗林蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶样内切蛋白酶。
本文中使用的术语“活性病毒”或“活化病毒”是指其表面蛋白由与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子活化的病毒。这里,病毒的表面蛋白的活化意味着病毒的表面蛋白被改变为准备好用于宿主细胞和/或探针之间的反应,例如宿主细胞和/或探针之间的特异性反应。这里,术语“病毒的活化”是指将非活性病毒转化为活性病毒的过程。由于病毒的活化是病毒感染所必需的,所以可以通过检测活性病毒的存在来确定病毒感染。
在一个实施方式中,病毒的表面蛋白的活化是指其中存在于病毒的表面蛋白上的融合蛋白或融合肽能够与宿主细胞的膜的表面或本发明的探针的表面融合的状态。
在一个实施方式中,对于流感病毒,活化的病毒意味着通过酶降解而使表面蛋白血凝素(HA)转化以将存在于血凝素中的处于灭活状态的融合肽暴露。也就是说,用于特异性降解HA的切割位点的酶包括弗林蛋白酶和/或胰蛋白酶。由于弗林蛋白酶只可降解高致病性流感病毒的血凝素,所以当流感病毒的HA被弗林蛋白酶降解时,流感病毒表现出高致病性。此外,由于胰蛋白酶可能降解高致病性和低致病性流感病毒的血凝素,所以当血凝素被胰蛋白酶降解时,流感病毒表现出高致病性或低致病性。低致病性流感病毒的限制性位点包括C-末端中的-R-,高致病性流感病毒的限制位点由R/K-R-K-K-R组成。
当HA被特异性降解HA的限制性位点的酶活化时,发生HA的重排,因此HA中的融合肽暴露于外部,从而导致活性病毒。同样,当根据本发明的实施方式在酸性条件下被活化的流感病毒遇到探针时,流感病毒与探针之间的反应由于流感病毒的融合肽而发生。通过测量随探针反应变化的信号,可以检测病毒感染。
在另一个实施方式中,对于冠状病毒,活化的病毒意味着表面蛋白即纤突蛋白(S蛋白)被改变,使得存在于纤突蛋白中的处于灭活形式的疏水域由于生物分子而被暴露。具体地,当纤突蛋白的S1区域与宿主细胞结合时,通过蛋白酶将纤突蛋白切割成S1和S2,暴露S2末端的疏水域,导致病毒的活化。S2的暴露的疏水域附着到宿主细胞的细胞膜中的疏水域,另一方面,由于构象变化(其中S2区的中间部分被折叠同时结合到病毒的外膜)发生膜融合。因此,当本发明的探针与活化的冠状病毒反应时,探针的稳定性改变,产生各种信号,因此可以通过测量这种变化来检测病毒感染。
在另一个实施方式中,在副粘病毒中活化的病毒是指通过生物分子从HN蛋白中除去C-末端的残基的状态。具体地,在HN蛋白保持失活状态(HN0)时,当去除大约90个C末端残基时,HN蛋白被活化,以使副粘病毒附着到靶或宿主细胞的膜上。此外,活性副粘病毒意味着F蛋白被生物分子切割成F1和F2。在非活性的副粘病毒中,F蛋白在前体F0状态下与生物分子结合,F蛋白被切割成F1和F2,从而成为能够与宿主细胞的细胞膜融合的活性病毒。也就是说,通过形成含有SS键合链F1和F2的活性表面蛋白,并且将表现出充分疏水性的F1的N末端残基固定于靶或宿主细胞的细胞膜,开始膜融合。因此,通过使本发明的生物分子与表面蛋白反应来活化副粘病毒,并且被活化的病毒再与本发明的探针反应,导致探针变化。因此,可以通过测量该变化来检测病毒。
本文中使用的术语“探针”是指与由与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子活化的病毒反应的物质,从而检测病毒或活性病毒的存在。该探针包括与病毒或非活性病毒以外的物质相比,具有高得多的与活性病毒反应的能力的任何物质;或与活性病毒特异性反应的物质,从而能够显著地检测活性病毒的存在,对其类型和形状没有特别限制。在本说明书中,探针与“检测因子”结合使用。
根据靶病毒的类型或病毒的表面蛋白,本发明的探针可以具有各种结构或形状。
根据本发明的实施方式,探针可以具有膜结构。
本文中所用的术语“膜结构”是指其内侧被膜或壳包围的结构。膜结构包括任何类型的封装粒子,例如囊泡、人造细胞或微胶囊,对其没有限制。在本说明书中,膜结构与壳结构组合使用。膜结构还包括内部含有流体或单独组合物的结构。
膜包括单层或双层结构。单层可以是包括“疏水域-亲水域”的膜结构,并且在一个实施方式中,膜结构包括疏水性芯和亲水性壳(在水溶液中)。双层是包括“亲水域-疏水域-疏水域-亲水域”的膜结构。在一个实施方式中,双层可以包括结合在一起的两个单层。此外,双层可以是包括亲水芯、围绕亲水芯的疏水域和围绕疏水域的亲水壳的结构。
膜结构包括单膜和具有两个以上的单膜的多膜。在一个示例中,当具有单膜的粒子再次被一个单膜包围时,该粒子可以具有多膜。单膜和多膜是与单层和双层不同的概念。具体而言,仅包括具有双层结构的一个膜的粒子具有单膜,而其中具有单层结构的膜被单层膜结构的膜再次包围的粒子被称为具有多膜结构的粒子。
具有上述膜结构的探针可以通过本发明中包括的常规方法,例如,根据实施方式,使用微流化设备的微流化、高压均化、乳化或超声处理制备,但是本发明不是限于此。
具有上述膜结构的所有类型的粒子可以包括在本发明的探针中,而没有限制。在一个实施方式中,粒子可以选自由囊泡、胶束、聚合物囊泡、胶体体(colloidsome)、脂质体、液滴及其组合,但本发明不限于此。
术语“胶束”是指具有疏水性芯和亲水性壳的粒子。在一个实施方式中,胶束可以是表面活性剂的胶束或聚合物自组装胶束。根据形成共聚物的聚合物的类型,通过自组装得到的胶束可以具有各种形状,但本发明不限于此。胶束还包括包含两个以上单层的多膜。胶束的形状可以是但不限于例如球体、椭圆体或圆柱体。具有胶束结构的探针还可以包括疏水核区域中的成分例如标记物和无机粒子。
术语“聚合物囊泡”是指具有“亲水域-疏水域-疏水域-亲水域”的双层膜结构的粒子,并且在疏水区域和亲水区域中包括聚合物或共聚物。聚合物或共聚物可以包括人工合成的聚合物或共聚物和脂质,或仅包括人工合成的聚合物或共聚物。人工合成的聚合物或共聚物是指不是由天然脂质制成的任何聚合物或共聚物。聚合物囊泡包括具有双层结构的单膜或具有两个以上单层结构的多膜。
术语“脂质体”是指具有至少一个脂质双层的粒子。脂质体包括单膜和多膜,只要其具有模仿两亲性生物膜的脂质膜即可。形成脂质体的方法是本领域公知的,通常,可以通过在盐水溶液中悬浮或对于含有磷脂的水溶液进行超声处理来获得磷脂,但本发明不限于上述方法。
“胶体体”是指尺寸为1nm-1000nm的胶体粒子或粒子密集填充的构造体。根据形成膜的亲水域和疏水域中的聚合物类型,胶体体可以包括单层和双层。此外,胶体可以包括单膜和多膜。
“液滴”是指膜结构粒子中的水滴状粒子。液滴包括单层和双层,以及单膜和多膜。
本发明的探针可以根据形状进行分类,但是本发明不限于此。在一个实施例中,探针的形状包括杆状、球形、环状、扁平状、圆柱体形、椭圆体形,被膜包围的形状及其组合,但是本发明不限于此。
杆状包括直线形,例如棒形、条形或柱形。球形包括包含完整球体和不完整球体的圆形。环形通常是指具有中空芯的球形或圆形。扁平状是指薄而均匀的板状。根据实施方式,可以通过经由涂覆在基材或载体上或其外部放置扁平探针而形成扁平状探针。
本发明的探针可以根据用于与构成探针或活性病毒的成分反应的方法被进行分类。
在本发明的一个实施方式中,探针可以选自由包含标记物的两亲性粒子;有机和无机粒子;抗体;适体;及其组合组成的组。
根据本发明的实施方式,“具有标记物的两亲性粒子”可以是具有能够确定探针与活性病毒之间的反应的标记物的两亲性探针。术语“两亲性”也可以是亲水脂性的,这是指具有亲水性和疏水性两者。对两亲性探针的形状没有特别限制,只要探针表现出两亲性即可。
本文中使用的术语“标记物”是指能够检测探针与活性病毒之间的反应的物质。对标记物的类型没有特别限定,根据反应前后的探针的变化而变化,可以使用能够通过试验确认所改变的性质的任何标记物而没有限制。例如,能够检测探针融合的标记物可以选自自猝灭染料、荧光染料、电化学发光物质及其组合。
在本发明中,自猝灭染料是指当与另一种物质相邻时被猝灭的物质,并且当附聚的染料被释放以扩散时,通过去猝灭而发射荧光。
在一个实施方式中,自猝灭染料可以是选自由3,3-双十八烷氧基碳菁高氯酸盐(dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate)(Dio;Dioc)、3,3-双十八烷基-5,5-二(4-磺基苯基)氧碳菁钠盐、4-(4-(双十六烷基氨基)苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓碘化物(DiA;4-二-16-ASP)、4-(4-(二癸基氨基)苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓碘化物(4-二-10-ASP)、1,1-双十八烷基-3,3,3,3-四甲基吲哚碳菁高氯酸盐(Dil)、1,1-双十八烷基-6,6-二(4-磺基苯基)-3,3,3,3-四甲基吲哚碳菁、4,4-二异硫氰酸根合茋-2,2-二磺酸二钠盐(DIDS)、1,1-双十八烷基-3,3,3,3-四甲基吲哚三碳菁碘化物(DiR)、1,1-二油烯基-3,3,3,3-四甲基吲哚碳菁、荧光素、BODYPY、四甲基罗丹明、十八烷基胺(octadecylodamine)B氯化物(R18)、Alexa、菁和别菁(allopicocyanine)。荧光染料可以具有200nm以下或50nm至10000nm的平均直径。
在一个实施方式中,电化学发光材料包括但不限于三(2,2'-联吡啶)钌(II)[Ru(bpy)32+]。
在本发明中,荧光染料是发射荧光的材料,其吸收光中包含的波长、改变颜色并重新发射。荧光染料也称为发光染料,并且可以使用本领域中熟知的任何荧光染料而没有限制。在一个实施方式中,荧光染料可以是选自由德克萨斯红、荧光素、4-氯-7-硝基苯并呋咱(NBD-Cl)、鲁米诺、富勒烯和具有芳族基团的化合物组成的组中的一种或多种。
在一个实施方式中,磷光染料是指通过重新发射具有与光源吸收的光的波长不同的波长的光而显示出光致发光效果的材料。在一个示例中,磷光染料可以是但不限于硫化物矿物(XmZn,X是金属元素,Z是非金属元素)或碱土金属的硫化物。
在本发明中,两亲性粒子是指具有亲水域和疏水域的粒子。对两亲性粒子没有限制,只要粒子具有亲水域和疏水域即可。两亲性粒子包括亲水性聚合物、疏水性聚合物、脂质聚合物及其组合。可以以共聚物的形式包含聚合物。
在一个实施方式中,亲水性聚合物包括选自由聚亚烷基二醇(PAG)、聚丙烯酸(PAA)、聚丙烯腈(PAN)、聚环氧乙烷(PEO)、聚乙酸乙烯酯(PVAc)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺和亲水性聚氨基酸及其衍生物组成的组中的一种或多种。例如,亲水性聚合物可以是选自由(单)甲氧基聚乙二醇、(单)乙酰氧基聚乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯和丙二醇的共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(谷氨酰胺)、聚谷氨酸、聚苏氨酸、聚(天冬酰胺)、聚(精氨酸)和聚(丝氨酸)组成的组中的一种或多种。此外,亲水性聚合物包括其衍生物。例如,聚乙二醇的衍生物可以是甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
在一个实施方式中,疏水性聚合物可以是能够与亲水性聚合物形成两亲性粒子的任何材料而没有限制。例如,疏水性聚合物可以是选自由聚酯、聚(酸酐)、疏水性聚(氨基酸)、聚原酸酯和聚磷腈组成的组中的一种或多种。聚(氨基酸)包括选自由聚亮氨酸、聚异亮氨酸、聚缬氨酸、聚苯丙氨酸、聚脯氨酸、聚甘氨酸、聚色氨酸、聚丙氨酸、聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯和聚蛋氨酸组成的组中的一种或多种。此外,疏水性聚合物包括其衍生物。
本文中使用的术语“脂质”或“脂质聚合物”包括磷脂、脂质蛋白、糖脂和阳离子脂质,只要它们能够形成双层膜结构即可,但本发明不限于此。此外,脂质包括天然诱导的脂质和合成的脂质衍生物。磷脂包括甘油磷脂和磷酸鞘脂。甘油磷脂可以包括二丙烯酸甘油酯结构,具体包括磷脂酸(PA)、卵磷脂(磷脂酰胆碱,PC)、脑磷酯和磷酸肌醇。脑磷脂包括磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)。此外,磷酸肌醇样磷脂包括磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂酰肌醇二磷酸酯(PIP2)和磷脂酰肌醇三磷酸酯(PIP3)。鞘磷脂包括神经酰胺磷酰胆碱(鞘磷脂,SPH)、神经酰胺磷酰乙醇胺(鞘磷脂,Cer-PE)和神经酰胺磷酰脂。
对合成磷脂衍生物的类型没有限制,但在一个实施方式中,合成磷脂衍生物可以选自由1,2-双十二烷酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(EPC)、11,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-L-丝氨酸(POPS)及其组合组成的组。
根据本发明的实施方式,两亲性粒子可以通过已知方法制备而没有限制。例如,两亲性粒子可以通过如下方法来制备:将含有亲水域和疏水域的两亲性嵌段共聚物分散在水溶液中并进行超声处理的方法、在有机溶剂中分散或溶解包含亲水域和疏水域的两亲性嵌段共聚物并用过量的水萃取或蒸发有机溶剂的方法、在将包括亲水域和疏水域的两亲性嵌段共聚物分散或溶解在有机溶剂中之后用过量的水透析有机溶剂的方法、将包含亲水域和疏水域的两亲性嵌段共聚物分散或溶解在有机溶剂中并使用均化器或高压乳化器强力蒸发溶剂的方法或薄膜水合。
可以根据两亲性粒子中使用的聚合物的类型和制备方法来形成具有各种结构和形状的探针。
在本发明的一个实施方式中,两亲性粒子可以是具有膜结构的粒子,其具体选自胶束、聚合物囊泡、胶体体、囊泡、脂质体、液滴及其组合。
在本发明的一个实施方式中,当根据下式计算的质量分数为0.25-0.40时,两亲性粒子可以形成为聚合物囊泡结构,并且当质量分数为大于0.40且0.70以下时,两亲性粒子具有胶束结构。
[式1]
质量分数=亲水性聚合物的质量/(亲水性聚合物的质量+疏水性聚合物的质量)
此外,当质量分数表示为质量%(百分比)且质量%满足25%-40%时,两亲性粒子形成为聚合物囊泡结构,当质量%为大于40%且70%以下时,两亲性粒子形成为胶束结构。在一个实施方式中,两亲性粒子的尺寸不受限制。两亲性粒子可以是纳米粒子或微米粒子,例如,两亲性粒子的平均直径可以为50nm-10000nm。
根据本发明的另一个实施方式,探针可以是“有机/无机粒子”。
在有机/无机粒子探针的情况下,通过探针与活性病毒或活化表面蛋白之间的反应,探针在溶液中的稳定性降低,致使混合物凝聚。因此,根据反应的存在或不存在,本发明的有机/无机粒子探针可以用于检测病毒。
本文中所用的术语“有机/无机粒子”是指包括有机物和无机物的粒子。具体地说,这样的粒子可以是由无机物形成的芯的表面(或壳)被有机物涂覆或结合的粒子。在一个实施方式中,有机/无机粒子的形状可以是但不限于棒状、球形、圆柱形、扁平状、椭圆形或环形。
无机物可以由金属组成,并且金属可以是例如金、银、包括它们的混合物、以及其组合。金属优选为金、银及其组合。
有机物可以是无机物的稳定剂。本文中所用的术语“稳定剂”是指用于防止粒子凝聚的物质,并与分散剂组合使用。稳定剂优选为金属的稳定剂。稳定剂无论其类型如何,只要其将无机物良好地保持分散在溶剂中,都可被包括,并且可以是例如表面活性剂。
表面活性剂不限于具体示例并且包括阳离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂。具体地,表面活性剂可以是选自由十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,十六烷基三甲基溴化铵)、十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)、十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯(吐温20)、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单棕榈酸酯(吐温40)、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯(吐温80)和Triton X-100组成的组中的一种或多种。
根据本发明的实施方式,有机/无机粒子还可以包括两亲性聚合物。两亲性聚合物可以结合至有机/无机粒子的表面,或者有机/无机粒子可以被用两亲性聚合物层或两亲性聚合物壳结构涂覆。
根据本发明的实施方式,进一步包含两亲性聚合物的有机/无机粒子还可以包括在两亲性聚合物和有机/无机粒子表面之间的官能团层。作为具体示例,官能团层可以使具有官能团的化合物容易地与待结合的无机粒子的表面结合,并且可以形成聚合物层与化合物结合的结构。
具有官能团的任何化合物,只要其能够在无机粒子的表面上形成-SH键,都可以使用,并且可以是例如半胱胺,但本发明不限于此。
在本发明的一个实施方式中,当无机粒子为金时,可以通过将能够形成SH键的化合物与金粒子的表面结合而形成官能团层,然后将该官能团与两亲性聚合物键合。
根据本发明的实施方式,包含两亲性聚合物的有机/无机粒子还可以包括用于在官能团层和两亲性聚合物之间的键上引发氨基酸聚合的官能团。该官能团可以是NH2。
两亲性聚合物可以形成为包含亲水性A嵌段和疏水性B嵌段的A-B型两亲性嵌段共聚物或B-A-B型三嵌段共聚物。另外,两亲性聚合物也可以是脂质。
在一个实施方式中,亲水性A嵌段可以是亲水性聚合物,其是选自由聚亚烷基二醇(PAG)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸(PAA)、聚丙烯腈(PAN)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(乙酸乙烯酯)(PVAc)、亲水性聚(氨基酸)及其衍生物组成的组中的一种或多种。亲水性A嵌段优选为选自由单甲氧基聚乙二醇、单乙酰氧基聚乙二醇、聚乙二醇、聚乙二醇和丙二醇的共聚物、聚谷氨酰胺、聚谷氨酸、聚苏氨酸、聚(天冬酰胺)、聚(精氨酸)、聚(丝氨酸)和聚乙烯基吡咯烷酮组成的组中的一种或多种。亲水性A嵌段的数均分子量为200至50,000道尔顿或1,000至20,000道尔顿。
在一个实施方式中,疏水性B嵌段可以是疏水性聚合物。具体地,疏水性B嵌段可以是选自由聚酯、聚(酸酐)、疏水性聚(氨基酸)、聚原酸酯和聚磷腈组成的组中的一种或多种。疏水性B嵌段优选为选自由聚亮氨酸、聚异亮氨酸、聚缬氨酸、聚苯丙氨酸、聚脯氨酸、聚甘氨酸和聚蛋氨酸、聚色氨酸、聚丙氨酸、聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯、聚二噁烷-2-酮、聚丙交酯和乙交酯的共聚物、聚丙交酯和二噁烷-2-酮的共聚物、聚丙交酯和己内酯的共聚物、以及聚乙交酯和己内酯的共聚物组成的组中的一种或多种。疏水性B嵌段的数均分子量为50至50,000道尔顿或200至20,000道尔顿。
有机/无机粒子可以通过在作为稳定剂的两亲性聚合物的存在下使离子性无机物与能够还原无机物的还原剂进行反应来制备。作为用于制备有机/无机粒子的稳定剂,包括十六烷基三甲基溴化铵,但本发明不限于此。此外,当有机/无机粒子还包含两亲性聚合物层时,两亲性聚合物层优选具有能够用作有机/无机粒子的稳定剂的双层结构。
在一个实施方式中,有机/无机粒子可以为,但不限于,纳米级或微米级。例如,有机/无机粒子的平均直径可以为50nm-1000nm。
本发明的有机/无机粒子可以使用乳化、薄膜水合或透析来制备,并且具体制备条件可以根据有机物、无机物和聚合物的类型在常规使用的范围内变化。
本发明的有机/无机粒子还可以包括用于更准确地确定与病毒有无反应的标记物。
根据本发明的又一实施方式,探针可以是“适体”。本文中使用的术语“适体”是指以单链或双链DNA或RNA的形式能够结合至靶分子的物质。
根据本发明的又一个实施方式,探针可以是“抗体”。本文中使用的术语“抗体”是指能够结合至靶分子的物质,并且可以是用糖链结合于氨基酸的蛋白质。
本发明的靶分子可以是活性病毒、活化表面蛋白、表现出活性病毒抗原性的蛋白质及其组合。适体或抗体可以特异性结合至靶分子,并优选具有能够与靶分子互补结合的结构。
适体或抗体可以根据适体或抗体与活性病毒、活化表面蛋白和/或活性病毒的抗原蛋白之间是否存在特异性结合而检测病毒。
在本发明的一个实施方式中,靶分子可以是存在于病毒的表面蛋白上的膜融合蛋白。此外,在一个实施方式中,在流感病毒的情况下,靶分子可以是血凝素(HA)的融合肽。用于检测HA的融合肽的适体或抗体包括能够与融合肽特异性结合的互补结构或序列。此外,在冠状病毒的情况下,靶分子可以是纤突蛋白,而在副粘病毒的情况下,可以是F蛋白。
适体或抗体还可以包括金属粒子或标记物,从而更容易或清楚地确认与靶分子的结合反应。
根据本发明的实施方式的制备适体或抗体的方法是本领域中公知的,并且可以用于通过已知方法制备和选择适体或抗体。此外,用于确认适体或抗体的结合的方法是本领域中公知的。例如,当适体或抗体与金粒子结合时,通过与金属粒子结合的适体或抗体与病毒的融合肽的结合,根据粒子尺寸的变化来改变颜色。可以通过观察这种颜色变化来检测活性病毒。
本发明的试剂盒或组合物可以包括单一类型的探针或两种以上类型的探针。
在本发明的一个实施方式中,试剂盒或组合物还可以包括pH 6以下的酸性物质。例如,pH 6以下的酸性物质可以是酸溶液,并且具有上述pH范围的酸溶液可以包含在试剂盒中,并且可以直接制备使用。pH 6以下的酸溶液可以是满足pH条件的任何溶液而没有限制。作为酸溶液,储备溶液可以商购或直接制备使用。例如,可以将浓酸溶液(储备溶液)在水中稀释以具有pH 6以下。例如,酸溶液可以具有pH 4-6或pH 5-5.7。由于上述范围类似于宿主细胞中的pH范围,所以可以提高检测效率。
在一个实施方式中,本发明的试剂盒和组合物还可包含佐剂。
佐剂可用于生物分子以有助于与病毒的反应或者可以有助于靶分子与探针的反应。作为具体示例,佐剂可用于有助于蛋白酶与表面蛋白的反应或有助于包括活性病毒的活化表面蛋白和活性病毒的抗原蛋白的靶分子与探针的反应。
本文中使用的术语“佐剂”可以是能够通过上述反应提高对病毒的检测灵敏度和/或特异性的任何物质。病毒的检测灵敏度和/或特异性可以通过增加反应速率、降低反应发生的最小值或抑制除表面蛋白与生物分子之间的反应以外的其它反应来增加,但是本发明不限于上述机制。佐剂包括能够根据生物分子和与其反应的表面蛋白的类型来增加检测灵敏度和/或特异性的所有物质而没有限制。
佐剂的具体示例可以是酮。
酮化合物可以包括例如苯基乙基氯甲基酮、甲苯磺酰基苯丙氨酰基氯甲基酮(TPCK)及其组合,但本发明不限于此。
在本发明的一个实施方式中,为了检测流感病毒,还可以包括酮作为佐剂。在这种情况下,通过降低其他酶的活性并增加血凝素(HA)蛋白酶、特别是胰蛋白酶的活性,可以进一步增加试剂盒的灵敏度。
本发明涉及病毒检测方法。
本发明的检测方法包括使样品与生物分子接触,并使与生物分子接触的样品与探针接触。具体地说,本发明的检测方法包括将从受试者获得的样品和与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子接触;并将与生物分子接触的样品和与被生物分子活化的病毒反应的探针接触。
本发明的检测方法可以通过确认存在或不存在由于这种接触而发生的反应来检测病毒。作为示例,利用内体的细胞膜被在活性病毒的表面蛋白中存在的融合肽融合的机制,通过检查探针是否与活性病毒融合来检测活性病毒。在另一个示例中,可以利用在活性病毒的表面蛋白中存在的融合肽降低探针的稳定性的机制来检查探针是否被聚集,以检测活性病毒。
通过本发明中的检测反应的方法,可以测定由反应产生的探针的信号或变化。作为示例,当活性病毒与探针反应时产生的变化或信号可以是选自探针的荧光强度、发光强度、磷光强度、吸光度、电信号、表面增强拉曼光谱(SERS)信号、场效应晶体管(FET)、颜色和分散性组成的组中的一种或多种,但本发明不限于此。
例如,当使用自猝灭染料作为能够确定探针的反应的标记物时,活性病毒与探针融合,通过释放标记物例如探针中携带的自猝灭染料而发生去猝灭,从而发出荧光。因此,可以通过测量荧光强度的变化来检测病毒感染。
此外,当使用荧光染料作为测定探针的反应的标记物时,由于活性病毒与探针的融合,探针中携带的荧光染料可以被释放,因此可以测量荧光强度以检测病毒感染。除荧光强度外,由于发光强度、磷光强度和吸光度强度根据波长而变化(类似于荧光强度),因此可以通过测量强度来检测病毒感染。特别地,在这些荧光染料中,鲁米诺或富勒烯可用于视觉地检测颜色变化,而无需通过特定装置来测量荧光强度。
除了荧光染料之外,可以包括诸如三(2,2'-联吡啶)钌(II)[Ru(bpy)32+])的电化学发光物质,在这种情况下,颜色的变化可以在视觉上观察到。
此外,可以通过使用纳米间隙传感器测量电信号来检测病毒。可以作为电流变化来测量电信号或使用FET来测量电信号。纳米间隙传感器是指包括具有大约100nm以下的间隙间隔的电极的传感器。例如,当使用荧光染料作为能够确定探针的反应的标记物时,探针中的荧光染料由于活性病毒与探针的融合而被释放并置于纳米间隙传感器的纳米间隙中。这里,可以通过测量预先放置在纳米间隙传感器中的诸如金、银、铬、钛、铂、铜、钯、氧化铟锡(ITO)或铝等金属粒子的电流变化来检测病毒感染。金属粒子可以具有几纳米的平均直径,例如2nm至4nm。
此外,可以通过测量SERS信号来检测病毒。为了测量SERS信号,可以使用能够与样品结合的基材。基材可以是纳米粒子、胶体或液体,但本发明不限于此。例如,当使用荧光染料作为能够确定探针融合的标记物时,由于活性病毒与探针的融合,探针中的荧光染料被释放。
在释放的荧光染料与基材结合后,再次将金属粒子引入与基材结合的荧光染料。通过引入诸如金或银的金属粒子可以增强拉曼光谱。之后,可以使用拉曼光谱仪测量荧光染料的拉曼光谱来检测病毒感染。
作为另一个示例,可以通过确认聚集,即,由于活性病毒引起探针聚集而导致的探针的分散性的变化,来检测病毒。例如,当使用有机/无机粒子作为探针时,通过由活性病毒降低有机/无机粒子的稳定性来使粒子聚集。
根据本发明的实施方式,有机物的稳定性通过用在活性病毒中存在的融合肽吸引稳定剂或两亲性聚合物(例如在有机/无机粒子周围存在的表面活性剂)而降低,致使有机/无机粒子聚集。由于易于视觉观察这种聚集,因此可以容易地检测病毒感染。
在一个实施方式中,可以在pH为6以下的条件下进行步骤中的至少一个。例如,可以在酸性条件例如pH 4至pH 6或pH 5至pH 5.5下进行步骤中的至少一个。在本发明的一个实施方式中,在酸性条件下检测流感病毒可以提供与宿主细胞中的环境非常相似的条件,因此可以提高检测精度。
图3示出根据本发明实施方式的用于检测流感病毒的方法的示意图。简单地,在pH6以下、pH 4至pH 6或pH 5至pH5.5的条件下,将从受试者获得的样品加入到其中存在用于活化在样品中存在的流感病毒的弗林蛋白酶和/或胰蛋白酶的孔中,然后用根据本发明的实施方式的探针进行处理。当存在流感病毒时,由于融合肽,活性流感病毒和探针之间发生反应,所以可以通过测量根据反应而变化的信号来检测流感病毒的存在。如上所述,活性流感病毒和探针之间的反应可以是融合或聚集。活性流感病毒与探针之间的反应以及由此而变化的信号如上所述。
本文中使用的术语“样品”是指所获得的表示病毒检测用亲本的材料。在一个实施方式中,样品可以是唾液、口腔粘液或***物样品。
本发明还涉及病毒检测用组合物,其包括与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子;以及与由生物分子活化的病毒反应的探针。这里,关于病毒检测用试剂盒和病毒检测方法的所有细节可以适用于病毒检测用组合物。
在下文中,参照实施例对本发明进行说明。仅提供以下实施例来举例说明本发明,并且本发明的范围不限于此。
[实施例]
[制备例1]携带自猝灭染料的以宿主细胞样两亲性粒子形式的探针(FluSome)的制备
为了制备与宿主细胞的表面相同的两亲双层粒子,使用mPEG-b-PLA共聚物以含有标记物的胶束或聚合物囊泡型两亲性粒子形式制备探针。
具体地,通过如下制备携带自猝灭染料的两亲性粒子:将2mL mPEG-b-PLA(聚乳酸)分散,将作为自猝灭染料的DiO(Ex:484nm)和Dil(Em:565nm)溶解,并用过量的水对所得溶液进行透析。分别地,通过将mPEG聚合物和聚丙交酯(PLA聚合物)的分子量之间的质量分数调整为0.3来制备聚合物囊泡,以及通过将所述质量分数调整为0.7来制备胶束。
使用透射电子显微镜(TEM)使所制备的两亲性粒子的形式可视化。
结果,如图2中所示,可以确认制得了具有疏水性芯和亲水性壳的胶束型球状粒子和具有被疏水性膜和亲水性壳包围的亲水性核的聚合物囊泡型球状粒子。
此外,通过动态光散射(DLS)测量所制备的两亲性粒子的尺寸。
结果,如图3中所示,对于胶束,测得两亲性粒子的尺寸为36.79±1.52nm,对于聚合物囊泡,尺寸为122.12±2.50nm。
此外,聚合物囊泡的分子量为6700g/mol,所制备的胶束的分子量为4500g/mol。
此外,通过与上述相同的方法制备两亲性粒子型探针,不同之处在于将共聚物用mPEG-b-聚亮氨酸嵌段共聚物代替。
[制备例2]有机/无机粒子探针的制备
通过将作为稳定剂的表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(Sigma Aldrich)和还原剂硼氢化钠(Sigma Aldrich)加入到具有金离子的氯化金三水合物(Sigma Aldrich)中来制备种子溶液,然后通过依次加入十六烷基三甲基溴化铵稳定剂、氯化金三水合物(SigmaAldrich)、还原剂硝酸银(Sigma Aldrich)、L-抗坏血酸(Sigma Aldrich)和种子溶液来制备棒状有机/无机粒子(其中金粒子的表面涂覆有作为稳定剂的十六烷基三甲基溴化铵)。
通过观察,该有机/无机粒子形成为金纳米棒形式,并且该粒子的平均尺寸为10nm。
[制备例3]包含两亲性聚合物的有机/无机粒子探针的制备
通过使有机/无机粒子与两亲性聚合物反应来制备包含两亲性聚合物的探针。
具体地,在作为稳定剂的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的存在下,通过使金离子与还原剂反应,通过与制备例2中所述相同的方法来制备有机/无机粒子。随后,通过制备4-氨基苯硫酚和聚苯丙氨酸摩尔比为1:35的共聚物来制备包含两亲性聚合物的有机/无机粒子,将制备的有机/无机粒子与mPEG-pPhe(聚苯丙氨酸)共聚物混合并搅拌,以使聚合物粘附于金纳米棒的表面。通过如下来制备其中自组装有金纳米棒状聚合物的胶束型有机/无机粒子探针:将所得粒子溶解在四氢呋喃(THF)中,在搅拌下蒸发THF,沿烧瓶壁形成薄膜,同时使膜水合。
[制备例4]以脂质体结构的两亲性粒子探针的制备
除了以下条件外,通过与制备例1中所述相同的方法制备脂质体型探针。
具体地,通过如下制备携带自猝灭染料的脂质体粒子:将磷脂酰胆碱、胆固醇和单磷酰脂质A(MPL)以5:2:0.02的重量比混合,以制得具有总共10mg的有机物,并将所得混合物分散在1mL氯仿(CF)中,将CF蒸发,将DiO(Ex:484nm)和Dil(Em:565nm)各40μl加入到所形成的具有自猝灭染料(购自Avanti)的膜中,将所得产物在60℃下水合12小时,并搅拌产物12小时,然后进行透析。
[实验例1]FluSome的荧光共振能量转移(FRET)效应的确认
为了确认通过制备例1中描述的方法所制备的两亲性粒子型探针(FluSome)的FRET效应,在不存在流感病毒下检验猝灭效应和去猝灭效应。
在不存在流感病毒下,使用破坏粒子的Triton X-100通过用阴离子表面活性剂降解双层结构来考察去猝灭效应。使用荧光测量装置、混合多模式酶标仪(Synergy H4,BioTek,USA)测量荧光强度。
结果,如图4中所示,在用弗林蛋白酶、胰蛋白酶或Triton X-100处理后即刻以及在处理后2小时,在无酶对照组、弗林蛋白酶处理组和胰蛋白酶处理组中,荧光强度无变化,而在Triton X-100处理组中,荧光强度发生了变化。在弗林蛋白酶和胰蛋白酶处理组中,在不存在流感病毒下,即使用弗林蛋白酶和胰蛋白酶进行处理也不会发生病毒活化和融合肽的融合,因此没有变化。然而,当用Triton X-100破坏两亲性粒子时,由于自猝灭染料的去猝灭,荧光强度发生变化。
[实验例2]使用FluSome检测流感病毒
进行实验以确认通过制备例1的方法制备的两亲性粒子型探针(FluSome)检测高致病性流感病毒的能力。
具体地,使用能够特异性降解高致病性流感病毒中的血凝素的弗林蛋白酶和能够特异性降解低致病性流感病毒和高致病性流感病毒中的血凝素的胰蛋白酶,考察是否能够根据用上述酶的处理来检测高/低致病性流感病毒。
低致病性流感病毒提供自Green Cross Veterinary Product Co.,Ltd.,高致病性病毒提供自Hanoi University of agriculture。
将受试者分为仅含FluSome的处理组(无酶组)和酶处理组,测定在酸性条件(pH5.5)存在下各实验组的荧光强度变化。为了达到pH5.5,将酸储备溶液与含有FluSome的溶液混合。将荧光强度的测定结果示于表1和图5。在表1中,第一行示出高致病性流感病毒的荧光强度,第二行示出低致病性流感病毒(H3N2)的荧光强度,第三行示出低致病性流感病毒(H9N2)的荧光强度。
【表1】
如图5和表1中所示,在无酶组和非酸性组中,未观察到探针的荧光变化。然而,高致病性流感病毒组显示,在酸性条件下,当用FluSome和弗林蛋白酶两者、用FluSome和胰蛋白酶两者处理以及用FluSome和弗林蛋白酶以及胰蛋白酶在酸性条件下处理时,通过将FluSome中的自猝灭染料去猝灭而检测到荧光,这表明能够使用酸性条件、血凝素蛋白酶和FluSome来特异性检测高致病性流感病毒。
[实验例3]使用FluSome检测各种高致病性流感病毒
为了确认FluSome用于检测各种高致病性流感病毒的效果,用各种高致病性流感病毒通过与实验例2中所述相同的方法来确认FluSome用于检测高致病性流感病毒的能力。所有实验都在相同的酸性条件(pH5.5)下进行,共有5种类型的H5N1-型病毒被用作高致病性流感病毒。
将荧光强度的测定结果示于表2以及图6和图7。
【表2】
弗林蛋白酶 | 胰蛋白酶 | |
H5N1_01 | 3346 | 3417 |
H5N1_02 | 3304 | 3358 |
H5N1_03 | 3207 | 3185 |
H5N1_04 | 2948 | 3141 |
H5N1_05 | 3691 | 3504 |
H9N2 | 398 | 3376 |
对照 | 318 | 374 |
BLANK | 21 | 17 |
如表2和图6中所示,当用弗林蛋白酶处理时,确认了通过将在FluSome中的自猝灭染料的去猝灭而检测到荧光。
另外,图7显示,当用弗林蛋白酶或胰蛋白酶处理各种高致病性流感病毒时,在所有情况下都在大约570nm处检测到荧光,并且在低致病性流感病毒的情况下,仅用胰蛋白酶处理时,在约570nm处检测到荧光。
[实验例4]确认高致病性流感病毒的可检测浓度
为了确认使用本发明的探针对流感病毒的可检测浓度,使用根据制备例1的FluSome和高致病性流感病毒,测量根据病毒浓度的荧光强度的变化。作为实验组,制备高致病性流感病毒处理组和高致病性流感病毒+***物处理组,作为对照,制备***物溶液处理组(Excreta Sln)、DPBS处理组和***物处理组(根据***物类型用总共10个组进行试验)。将所有实验组和对照组在相同pH条件(pH 5.5)下用弗林蛋白酶处理,然后测量荧光强度的变化。
将结果示于表3。
【表3】
如表3中所示,确认当仅在1/2至1/(27)浓度(稀释因子)的范围内处理流感病毒时,荧光强度发生变化。此外,确认在流感病毒+***物处理组中,荧光强度在1/10以上发生变化。这表明当流感病毒以1/2至1/(27)浓度存在或流感病毒和***物的混合物以1/10以上存在时,可以检测病毒。
另一方面,当只处理***物时,荧光强度没有变化。这表明荧光强度的变化是由流感病毒引起的,不受***物的影响。
[实验例5]用包含两亲性聚合物的有机/无机粒子检测流感病毒
为了检测有机/无机粒子检测流感病毒的效果,使用包含通过制备例3中所述方法制备的两亲性聚合物的有机/无机粒子探针确认检测低致病性流感病毒的效果,且确认了用于特异性降解流感病毒的血凝素的酶例如弗林蛋白酶、胰蛋白酶和N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)-胰蛋白酶。
作为对照,制备无酶组(含有两亲性聚合物的未处理的有机/无机粒子溶液),并制备弗林蛋白酶处理组、胰蛋白酶处理组和TPCK-胰蛋白酶处理组作为实验组。所有实验条件均在pH 5.5下进行,对照组和每个实验组均用低致病性病毒处理,然后目视观察以考察病毒处理前后的变化。将结果示于图8。
如图8中所示,在无酶对照组中,没有观察到明显的变化,但是在TPCK-胰蛋白酶处理组中,通过目视观察明显地确认通过病毒降低包含两亲性聚合物的有机/无机粒子的稳定性而产生的沉淀和团簇。
[实验例6]用有机/无机粒子检测流感病毒
由于有机粒子和无机粒子聚集是由于被血凝素蛋白酶活化的病毒的肽与有机/无机粒子探针(GNR)存在其上的稳定剂的反应而发生的,所以在病毒存在下,可以根据聚集快速检测病毒。因此,进行实验以确认这种用于检测流感病毒的有机/无机粒子的效率。
使用快速试剂盒确认,用通过制备例2的方法制备的有机/无机粒子探针(GNR)和作为用于特异性降解流感病毒的血凝素的酶的弗林蛋白酶、酶胰蛋白酶和TPCK-胰蛋白酶检测高致病性流感病毒(H5N1,H5N6)的效率。G1和G2表示高致病性流感病毒的检测,G3表示低致病性流感病毒的检测。
此外,在无酶条件下将GNR加入到阴性对照中,同时将酶和pH溶液加入到从小猎犬鼻子取得的鼻粘液中,以检查是否发生反应。将结果示于图9。
如图9中所示,虽然在无探针阴性对照和无酶阴性对照中,未观察到颜色变化,但在G1组和G2组中均目视观察到颜色变化,并且在低致病性G3组中,目视检测到可检测水平的变化,但是当仅含有弗林蛋白酶时,以低水平检测到颜色变化。因此,确认了当使用本发明的有机/无机粒子探针时,迅速检测到是否存在流感病毒。
[实验例7]确认根据酶佐剂的处理检测流感病毒的能力
当还包括特异性降解病毒的血凝素的酶佐剂时,进行实验以确认检测效率的变化。
作为酶佐剂,使用酮,并使用根据制备例1的方法制备的探针(FluSome)。除了还包括酮之外,通过与实验例2中所述相同的方法进行实验。对于用酶佐剂处理的组,酮被表示为Try-TPCK。
【表4】
【表5】
【表6】
如表4-6中所示,确认了与仅用弗林蛋白酶或胰蛋白酶处理的组相比,用Try-TPCK处理的所有实验组都显示出优异的检测效率。确定这是因为酶佐剂降低除了血凝素蛋白酶以外的其它酶的活性,从而增加了血凝素蛋白酶的活性,因此使用这种酶佐剂能够进一步提高病毒检测效率,从而能够检测少量病毒并增加检测试剂盒的灵敏度。
[实验例8]通过测量表面增强拉曼散射信号检测流感病毒
为了确认根据表面增强拉曼散射信号的测量来检测流感病毒,替代在制备例1中制备的自猝灭染料,制备用于携带拉曼报告物(与病毒样品反应的2-萘硫酚,并且所释放出的2-萘硫酚与纳米级金共轭)的FluSome,随后在下列测量条件下观察拉曼散射信号的变化:激光:785nm,功率:0.7mW,光栅:300gr/mm,孔:500um,光谱范围:300cm-1至1700cm-1,曝光时间:120秒。
结果,如图10中所示,与无病毒对照相比,在胰蛋白酶和胰蛋白酶-TPCK处理的低致病性病毒组和高致病性病毒组中,根据2-萘硫酚-金共轭物的存在,确认了拉曼信号的变化。对于弗林蛋白酶,仅在高致病性病毒组中,确认了拉曼信号的变化。
这样的结果表明,通过测量表面增强拉曼散射信号,能够用弗林蛋白酶检测高致病性流感病毒的存在,并且能够用胰蛋白酶检测低/高致病性流感病毒的存在。
[实验例9]根据目视观察颜色变化来检测流感病毒
为了确认是否能够通过目视观察颜色变化来检测流感病毒,使病毒样品与制备用于携带富勒烯(TCI)(替代制备例1中制备的自猝灭染料)的FluSome反应,并且在将释放的富勒烯加入到甲苯溶液中后观察颜色变化。富勒烯是指其中碳元素排列成球形、椭圆形或圆柱形的分子。
观察表明,如图11中所示。与无病毒对照相比,在胰蛋白酶和胰蛋白酶-TPCK处理的低致病性病毒组和高致病性病毒组中,由于富勒烯的存在,可见地确认了颜色变化。对于弗林蛋白酶,仅在高致病性病毒组中确认了颜色变化。
这样的结果表明,通过对使用富勒烯的颜色变化的目视观察,弗林蛋白能够检测高致病性流感病毒的存在,胰蛋白酶能够检测低/高致病性流感病毒的存在。
[实验例10]根据对荧光变化的测量检测流感病毒
为了确认是否能够通过使用荧光染料测量荧光变化来检测流感病毒,使病毒样品与制备用于携带荧光染料鲁米诺(Sigma)(替代制备例1中制备的自猝灭染料)的FluSome反应,并且使所释放的鲁米诺在碱水溶液中过氧化后,使用混合多模式酶标仪(Synergy H4,BioTek,USA)测量荧光变化(Ex:303nm,Em:425nm)。由于鲁米诺由于在碱水溶液中的过氧化而发出蓝紫色荧光,所以可以通过测量荧光变化来检测病毒的存在。
结果,如表7中所示,与无病毒对照相比,在胰蛋白酶和胰蛋白酶-TPCK处理的低致病性病毒组和高致病性病毒组中,确认了根据鲁米诺的过氧化的荧光强度变化。对于弗林蛋白酶,仅在高致病性病毒组中确认了荧光强度的变化。
【表7】
对照 | 低致病性 | 高致病性 | |
胰蛋白酶 | 3083 | 88115 | 78195 |
胰蛋白酶-TPCK | 2204 | 97654 | 94257 |
弗林蛋白酶 | 1916 | 2438 | 81248 |
这样的结果表明,通过测量使用鲁米诺的荧光强度,弗林蛋白能检测到高致病性流感病毒的存在,胰蛋白酶能够检测中/高致病性流感病毒的存在。
[实验例11]使用脂质体检测流感病毒
为了确认是否能够使用作为两亲性粒子的脂质体来检测流感病毒,使病毒样品与制备例4中制备的脂质体反应,并通过与实验例3中所述相同的方法测量荧光强度的变化。
测量表明,如图12中所示,与无病毒对照相比,在低致病性病毒组和高致病性病毒组中,荧光强度随着胰蛋白酶的处理而改变。对于弗林蛋白酶,仅在高致病性病毒组中确认了荧光强度的变化。
这样的结果表明,使用作为两亲性粒子的脂质体,弗林蛋白酶能够检测高致病性流感病毒的存在,并且胰蛋白酶能够检测低/高致病性流感病毒的存在。
Claims (28)
1.一种病毒检测用试剂盒,包括:
与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子;和
与由所述生物分子活化的病毒反应的探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其中所述病毒是流感病毒、冠状病毒或副粘病毒。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其中所述病毒的表面蛋白是血凝素(HA)、纤突蛋白或F蛋白。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其中与所述病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子是酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其中所述酶包括选自由弗林蛋白酶、胰蛋白酶、丝氨酸、内切蛋白酶和羧肽酶组成的组中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其中所述酶包括选自由重组人弗林蛋白酶、重组小鼠弗林蛋白酶、胰蛋白酶-EDTA、乙酰化胰蛋白酶、TPCK-胰蛋白酶、胰蛋白酶-丙烯酸弗林蛋白酶样蛋白酶、Kex2蛋白酶、跨膜蛋白酶丝氨酸、TMPRSS2、TMPRSS4、克拉拉类胰蛋白酶、纤溶酶、丝氨酸蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶样内切蛋白酶和羧肽酶组成的组中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的试剂盒,其中所述探针是胶束、聚合物囊泡、胶体体、囊泡、脂质体或液滴。
8.根据权利要求1所述的试剂盒,其中所述探针选自由包含标记物的两亲性粒子;有机和无机粒子;抗体;适体;及其组合组成的组。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其中所述标记物选自由自猝灭染料、荧光染料、电化学发光材料或其组合组成的组。
10.根据权利要求8所述的试剂盒,其中所述两亲性粒子包括亲水性聚合物和疏水性聚合物。
11.根据权利要求10所述的试剂盒,其中所述亲水性聚合物包括选自由聚亚烷基二醇(PAG)、聚丙烯酸(PAA)、聚丙烯腈(PAN)、聚环氧乙烷(PEO)、聚乙酸乙烯酯(PVAc)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮和聚丙烯酰胺组成的组中的一种或多种。
12.根据权利要求10所述的试剂盒,其中所述疏水性聚合物包括选自由聚酯、聚(酸酐)、聚原酸酯、聚磷腈、聚亮氨酸、聚异亮氨酸、聚缬氨酸、聚苯丙氨酸、聚脯氨酸、聚甘氨酸和聚蛋氨酸组成的组的一种或多种。
13.根据权利要求8所述的试剂盒,其中,对于所述有机和无机粒子,所述无机材料是选自金和银组成的组的一种或多种。
14.根据权利要求8所述的试剂盒,其中,对于所述有机和无机粒子,所述有机材料是所述无机材料的稳定剂。
15.根据权利要求14所述的试剂盒,其中所述无机材料的所述稳定剂是表面活性剂。
16.根据权利要求8所述的试剂盒,其中所述有机和无机粒子还包括两亲性聚合物。
17.根据权利要求16所述的试剂盒,其中所述两亲性聚合物是包含亲水性A嵌段和疏水性B嵌段的A-B型两亲性嵌段共聚物、B-A-B型三嵌段共聚物或脂质。
18.根据权利要求1所述的试剂盒,还包括:
pH 6以下的酸性材料。
19.根据权利要求1所述的试剂盒,还包括:
用于所述生物分子的佐剂。
20.根据权利要求19所述的试剂盒,其中用于所述生物分子的所述佐剂是酮。
21.一种病毒检测用组合物,包括:
与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子;和
与由所述生物分子活化的病毒反应的探针。
22.一种病毒检测方法,包括:
使将从受试者获得的样品与和病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子接触;和
使与所述生物分子接触的所述样品与和由所述生物分子活化的所述病毒反应的探针接触。
23.根据权利要求22所述的方法,其中,所述接触在pH 6以下的条件下进行。
24.根据权利要求22所述的方法,还包括:
测量与所述样品接触的所述探针的荧光强度的变化。
25.根据权利要求22所述的方法,还包括:
测量与所述样品接触的所述探针的表面增强拉曼光谱的变化。
26.根据权利要求22所述的方法,还包括:
测量与所述样品接触的所述探针的变化。
27.根据权利要求22所述的方法,还包括:
观察与所述样品接触的所述探针的颜色变化。
28.根据权利要求22所述的方法,还包括:
确认与所述样品接触的所述探针是否聚集。
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