CN107406854B

CN107406854B - Rna指导的人类jc病毒和其他多瘤病毒的根除

Info

Publication number: CN107406854B
Application number: CN201580068318.6A
Authority: CN
Inventors: K·卡利里; W·胡; H·沃勒勃
Original assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Current assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2015-10-30
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2035-10-30
Also published as: CN115044570A; HK1247636A1; RU2017115838A; RU2017115838A3; CA2967990A1; CN107406854A; AU2015338993A1; US20170333572A1; ZA201703163B; MA40880A; MX2017005672A; US20230001016A1; EP3212795A1; AU2015338993B2; CA2967990C; RU2747722C2; WO2016070070A1; EP3212795A4

Abstract

本发明包括从宿主细胞中消除多瘤病毒如约翰·坎宁安病毒(JCV)的方法和组合物，以及多瘤病毒相关疾病如进行性多灶性脑白质病(PML)的治疗。所述组合物包含分离的核酸序列，其包含CRISPR相关核酸内切酶和指导RNA，其中所述指导RNA与多瘤病毒中的靶序列互补。

Description

RNA指导的人类JC病毒和其他多瘤病毒的根除

关于联邦资助研究的声明

本发明是依据国家卫生研究院向Kamel Khalili和Wenhui Hu颁发的授权号：NIHR01 NS087971在美国政府支持下进行的。美国政府可能对发明有一定的权利。

与本申请相关的序列表通过EFS-Web以电子格式提交，并在此通过引用其整体并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称为0392-7Temple JCV PCT SeqLst 10 302015_ST25。文本文件的大小为8KB，且该文本文件是在2015年10月30日创建的。

发明领域

本发明涉及特异性裂解多瘤病毒例如人类神经营养多瘤病毒如约翰·坎宁安病毒中的靶序列的组合物。可以向患有神经营养性多瘤病毒感染的受试者施用可以包含规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)相关核酸内切酶和一个或多个特异性指导RNA序列的这样的组合物。

背景技术

人类神经营养多瘤病毒约翰·坎宁安病毒(JCV)是致死性脱髓鞘病、进行性多灶性脑白质病(P ML)的病原体。中枢神经***(CNS)的神经胶质细胞中的JCV的溶血感染造成负责在脑中产生髓鞘的少突胶质细胞的死亡。这导致广泛的、轻度至重度的神经障碍并最终死亡(Berger，2011)。PML有许多诱发因素，但都涉及免疫***的某些程度的损害。

虽然该疾病首先认为是一种主要在淋巴组织增生和骨髓增生性疾病患者中见到的罕见疾病(

等，1958)，但AIDS大流行的发病大大增加了PML的发病率。HIV-1感染和AIDS仍然是JCV重新激活的最常见的免疫缺陷环境，约占PML病例的80％(Tavazzi等，2012)。免疫抑制疗法已经成为活跃JCV感染的另一个触发因素。用于自身免疫性疾病如多发性硬化和类风湿性关节炎治疗的新的治疗性免疫调节单克隆抗体包括那他珠单抗(Chakley和Berger，2013)、依法利珠单抗(Schwab等，2102)和美罗华(Clifford等，2011)认为是PML的诱因(Nagayama等，2013)。

JCV是病毒的多瘤病毒家族的成员，其基因组由大小为5.1kb的双链环状DNA组成，其在病毒感染的早期即DNA复制前以及感染周期的晚期(DeCaprio等，2013)产生两类蛋白质。位于早期和晚期基因之间的双向编码序列负责病毒基因表达并且包含病毒DNA复制的起源。病毒早期蛋白、大T-抗原(T-Ag)和一个较小尺寸的T-Ag蛋白家族通过选择性剪接产生，并且在病毒复制周期期间对病毒的协调具有调节作用。特别是大T-抗原负责启动病毒DNA复制并刺激病毒晚期基因转录，因此对于病毒生命周期的各个方面至关重要。此外，JCVT-Ag在细胞培养中表现出转化能力，并且在不存在其他病毒蛋白的情况下，其在动物模型中的表达诱导神经源性肿瘤(参见White和Khalili，2004)。在几种动物模型中，T-抗原(Tag)与几种细胞蛋白如p53和pRb结合并调节细胞增殖，从而潜在地导致细胞的转化和肿瘤形成。晚期蛋白是病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3以及称为Agno蛋白的小调节蛋白(Khalili等，2005)。血清流行病学研究表明，JCV感染在全世界人群中非常常见并且初期感染通常发生在儿童期(White和Khalili，2011)。JCV感染的高血清阳性和PML的罕见性表明免疫***能够将病毒维持在持续无症状状态，因为改变的免疫功能似乎成为所有易患PML的条件基础。

已经有许多治疗方案应用于PML，但大部分没有成功(Tavazzi等，2012)。已经有不同的方法靶向病毒生命周期中的各个点如进入和复制。由于JCV与5-羟色胺2A受体(5-HT2AR)之间的相互作用已报道是病毒进入所必需的(Elphick等，2004)，已经研究了与5HT2AR结合的利培酮，但发现其没有作用(Chapagain等，2008)。已经在体外和体内进行了病毒复制的小分子抑制剂如西多福韦的测试，但产生了相互矛盾的结果(Andrei等，1997；Hou和Major，1998)。显然，对于这种致命的脱髓鞘疾病的治疗迫切需要替代的策略选择。

靶向JCV病毒基因组进行根除的新策略特别有吸引力。这样的策略可以有效地靶向活跃复制病毒和持久性病毒，其中病毒或保持在休眠状态或在病毒蛋白不表达或生产水平非常低的状态。工程化核酸酶技术的最新进展提出了该治疗策略可能即将在临床上实施的前景。实例是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)和更近期的规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)-相关9(Cas9)(Gaj等，2013)。

特别是基于CRISPR/Cas9DNA编辑***的工具和技术为基因组编辑提供了前所未有的控制(Mali等，2013；Hsu等，2014)。CRISPR/Cas9***是从细菌和古细菌的适应性免疫***中开发的，并使用短的指导RNA(gRNA)引导Cas9核酸内切酶切割特异性核酸(Bhaya等，2011)。切割，通常是平头端双链切割，通常导致由缺陷DNA修复引起的DNA片段的缺失、***和切除。

CRISPR/Cas9DNA编辑***已经用于灭活***细胞中致癌性人***状瘤基因E6和E7(Kennedy等，2014)，并促进体内肝内乙型肝炎基因组模板的清除(Lin等，2014)。最近有报道称，CRISPR/Cas9可用于从潜在感染的细胞中消除HIV-1病毒，并预防新的HIV-1感染(Hu等，2014)。不幸的是，还没有开发任何***用gRNA指导的核酸内切酶攻击来靶向JCV。非常需要CRISPR/核酸内切酶组合物和方法用于裂解JCV基因中的特异性靶标，破坏JCV基因组的完整性，从而从宿主细胞中消除JCV。

发明内容

本发明提供了一种用于从感染JCV的宿主细胞中消除JCV的组合物。所述组合物包含至少一个编码规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)相关核酸内切酶的分离的核酸序列以及至少一个具有与JCV DNA中的靶序列互补的间隔序列的指导RNA(gRNA)。这些gRNA的优选靶序列在JCV DNA的大T-抗原(T-Ag)基因中，特别是T-Ag的TM1、TM2和TM3区域。

本发明还提供了一种从感染JCV的宿主细胞中消除JCV的方法。所述方法包括以下步骤：用包含CRISPR相关核酸内切酶和至少一个具有与JCV DNA中靶序列互补的间隔序列的gRNA的组合物处理宿主细胞；以及从宿主细胞中消除所述JCV。

本发明进一步提供了一种用于从感染JCV的宿主细胞中消除JCV的载体组合物。所述载体组合物包含至少一个编码CRISPR相关核酸内切酶的分离的核酸序列和至少一个具有与JCV DNA中的靶序列互补的间隔序列的gRNA。所述分离的核酸序列包含在至少一个表达载体中，用于在宿主细胞中诱导所述CRISPR相关核酸内切酶和至少一个gRNA的表达。

本发明还进一步提供了一种预防处于JCV感染风险中的患者的细胞的JCV感染的方法。所述方法包括以下步骤：确定患者处于JCV感染风险中；将患者细胞暴露于有效量的包含编码CRISPR相关核酸内切酶的分离的核酸和编码至少一个包含与JCV中的靶序列互补的间隔序列的gRNA的至少一个分离的核酸的表达载体组合物中；在所述患者的细胞中稳定表达CRISPR相关核酸内切酶和gRNA；以及预防所述患者的细胞的JCV感染。

本发明还提供了一种从哺乳动物受试者的细胞中消除JCV的药物组合物。所述药物组合物包含至少一个编码CRISPR相关核酸内切酶的分离的核酸序列和编码至少一个具有与JCV DNA中的靶序列互补的间隔序列的gRNA的至少一个分离的核酸序列。在优选的实施方案中，所述分离的核酸序列包含在至少一个表达载体中。

本发明进一步提供了一种治疗患有LCV相关病症如进行性多灶性脑白质脑病的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的前述药物组合物的步骤。

本发明还进一步提供了一种用于治疗或预防JCV感染的试剂盒，包含实数测量的一种或多种前述组合物，其包含CRISPR相关核酸内切酶和与JCV DNA中靶序列互补的gRNA。所述试剂盒还包括一个或多个项目，如使用说明书、无菌容器和注射器。

本发明还提供了一种从病毒宿主细胞中消除除了JCV以外的多瘤病毒的方法。所述方法包括以下步骤：用包含CRISPR相关核酸内切酶和至少一个具有与多瘤病毒DNA中的靶序列互补的间隔序列的gRNA的组合物处理所述宿主细胞；以及从所述宿主细胞中消除多瘤病毒。优选地，所述靶序列位于编码特定多瘤病毒的大T抗原的区域中。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一个以颜色执行的附图。含有彩色附图的本专利或专利申请公布副本将由劳工局根据要求提供，并支付必要的费用。

通过结合附图并参考以下详细描述，可以更好地理解本发明的其他优点，其中：

图1A和1B显示用于CRISPR/Cas9靶向JCV的指导RNA的设计。图1A显示了在图示的JCV T-Ag(T)编码区内的不同位置设计的三个gRNA(TM1、TM2和TM3)。该T-Ag编码区开始于5130nt循环Mad-1JCV基因组(NCBI参考序列：NC_001699.1；Frisque等，1984)的核苷酸(nt)5013，并逆时针转向至nt 2603。图1B显示给出了位于三个靶位点(粗体和红色高亮)的每一个上的JCV基因组的序列。注意，顶链的序列对于T-Ag的编码区来说是顺时针和反义的，因为T-Ag是由逆时针转录的并在底部(有义链)显示。前间区序列邻近基序(PAM)序列的位置以蓝色斜体显示；

图2A-2C显示在用T-Ag和Cas9转染的TC620细胞中，gRNA m1和m2的表达导致T-Ag表达和T-Ag刺激的JCV晚期基因表达的降低。图2A：TC620细胞用JCV_L-LUC报道质粒和Cas9表达质粒在有或没有T-Ag和每种gRNA表达质粒的情况下转染，如图1所示，单独或组合的gRNA如文。收获细胞并测定荧光素酶活性，如实施例1所述。将活性归一化为单独用报道质粒转染的细胞(泳道1)。图2B：通过蛋白质印迹(WB)分析图2A中提及的细胞提取物，用于分析T-Ag、Cas9和α-微管蛋白(加载对照)的表达。图2C：使用Bio-Rad Quantity One软件对图2B所示的蛋白质印迹(WB)进行定量，并显示为单独对T-Ag进行归一化的直方图(泳道2)；

图3A-3D显示表达Cas9和gRNA ml的SVGA的克隆衍生物具有降低支持JCV感染的能力。图3A：SVGA细胞用Cas9或Cas9+gRNA m1转染，并选择稳定的克隆细胞系。选择三个克隆并测定JCV感染(moi＝1，7天)：相对于亲本SVGA细胞，一个单独具有Cas9的克隆和两个具有Cas9+gRNA ml(克隆8和10)的克隆。通过蛋白质印迹(WB)检测病毒感染的VP1和Agno蛋白，α-微管蛋白作为加载对照。图3B：使用QPCR定量来自图3A实验中的培养物上清液中的病毒。图3C：通过蛋白质印迹(WB)测定SVGACas9和SVGACas9mlc8的Cas9表达，β-微管蛋白作加载对照。图3D：TC620细胞用FLAG标记的Cas9的表达质粒转染并用抗-FLAG抗体进行免疫细胞化学(ICC)，如材料和方法中所述。用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记核；

图4A-4C显示Cas9和JCV特异性gRNA的瞬时转染后T-Ag基因切割的直接证据。同时含有整合的TAg基因的小鼠BsB8和仓鼠HJC-2细胞用Cas9和所示的各种组合的gRNA表达质粒转染。使用JCV特异性引物扩增基因组DNA。图4A显示T-Ag基因的图，表明PCR引物的位置、预期的切割点和T-Ag基因得到的区域的预期长度。图4B：通过PCR扩增来自转染的BsB8细胞的T-Ag基因，在琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙锭标记。为了清晰的呈现，将图像反转。图4C：通过PCR扩增来自转染的HJC-2细胞的T-Ag基因，在琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙锭标记。为了清晰的呈现，将图像反转；

图5描绘了用于靶向T抗原的三个不同基序的引物；

图6A和6B显示表达多西环素诱导型Cas9的HJC-2细胞的稳定衍生物在用表达JCV特异性gRNA和多西环素诱导的慢病毒转导时表现出T-Ag基因的inDle突变。图6A：表达多西环素诱导型Cas9的HJC-2细胞用表达JCV特异性gRNA的慢病毒转导，并用和不用强力霉素进行处理，如实施例1所述。提取总基因组DNA，并通过PCR扩增T-Ag区域，克隆到pCR4-TOPOTA载体中并测序。图6B：使用Surveyor测定法检测源自HJC-2细胞的PCR产物中突变的存在，所述HJC-2细胞表达Cas9并且每个gRNA(ml、m2和m3)由慢病毒载体转导。PCR产物通过逐渐冷却而变性并杂交，如实施例1所述。用SURVEYOR核酸酶消化杂交的DNA以切割异源双链DNA，并将样品连同等量的对照样品一起在2％琼脂糖凝胶上拆分；对照样品平行处理，但源自表达Cas9的却不由编码gRNA(ml Con、m2 Con、m3 Con)的慢病毒载体转导的HJC-2细胞；

图7A和7B显示表达多西环素诱导型Cas9的HJC-2细胞的稳定衍生物在用表达JCV特异性gRNA和强力霉素诱导的慢病毒转导时表现出T-Ag表达的消融。图7A：蛋白质印迹(WB)显示Cas9和T-Ag的表达。用三种gRNA中的每一种的慢病毒载体转导表达多西环素诱导型Cas9的JC-2稳定细胞克隆，如实施例1所述。24小时后，用和不用2μg/ml多西环素处理转导的细胞，且另外48小时后收获，并且通过蛋白质印迹(WB)分析T-Ag和Cas9的表达，α-微管蛋白作为加载对照。图7B显示蛋白质印迹(WB)的定量；

图8A-8E显示表达强力霉素诱导型Cas9的HJC-2细胞的稳定衍生物在用表达JCV特异性gRNA和多西环素诱导的慢病毒转导时表现出降低的集落形成。用表达如所指示的各种组合的ml、m2和m3 gRNA的慢病毒转导表达多西环素诱导型Cas9的HJC-2细胞，铺板，用或不用强力霉素处理并评估集落形成。结果显示为由重复菌落计数计算出的一个标准偏差呈现的误差棒获得的菌落总数的直方图。图8A显示ml+m2组合的结果，图8B显示ml+m3组合的结果，图8C显示m2+m3组合的结果，且图8D显示ml+m2+m3组合的结果。图8E显示从图8A中总结的实验中显示两个亚甲蓝染色盘的代表性实验的照片。

图9A-9C显示表达Cas9和gRNA的SVG-A细胞的稳定衍生物在脱靶基因中不显示InDel突变。使用SURVEYOR测定法检测源自表达Cas9和gRNA ml(与SEQ ID NO：1互补，图9A)、m2(与SEQ ID NO：5互补，图9B)和m3(与SEQ ID NO：9互补，图9C)的SVG-A细胞的PCR产物中突变的存在。通过在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的BLAST搜索来鉴定与每个基序具有最高同源性的人类细胞基因。对于每个基序，从具有最高同源性的前三个基因扩增PCR产物，并使用SURVEYOR测定检查InDel突变，如实施例1所述。每个图中T-Ag的扩增是阳性对照。图9A：对于基序ml，扩增为M12(NM_017821，人RHBDL2菱形，脉状样2(果蝇)，基因ID:54933,NCBI Ref Seq:NC_000001.1l,>gi|568815597:c38941830-38885806)、M17(NM_001243540，人KIAA1731NL,基因ID:100653515,NCBI Ref Seq：NC_000017.11,>gi|568815581:78887721-78903217)和M19(NM_016252，含有6的人BIRC6杆状病毒IAP重复，基因ID:57448,NCBI Ref Seq:NC_000002.12)；图9B：对于基序m2，扩增为M21(NM_012090，人ACF1微管-肌动蛋白交联因子1，基因ID:23499,NCBI Ref Seq:NC_000001.11,>gi|568815597:39084167-39487138)、M23(NM_005898，人CAPRIN1细胞周期相关蛋白1，基因ID：4076,NCBI Ref Seq:NC_000011.10,>gi|568815587:34051683-34102610)、M24(NM_024562，人TANG06转运和高尔基组织6同系物(果蝇)，基因ID:79613,NCBI Ref Seq:NC_000016.10,>gi|568815582:68843553-69085482)；图9C：对于基序m3，扩增为M31(NM_001048194，人RCC1染色体浓缩调节因子1，基因ID:1104,NCBI Ref Seq:NC_000001.11,>gi|568815597:28505943-28539196)、M32(NM_004673，人ANGPTL1血管生成素样1，基因ID:9068,NCBI Ref Seq:NC_000001.1l,>gi|568815597:c178871353-178849535)、M33(NM_174944，人TSSK4睾丸特异性丝氨酸激酶4，基因ID:283629,NCBI Ref Seq:NC_000014.9,>gi|568815584:24205530-24208248)。

发明详述

本发明代表了CRISPR技术在JCV的活跃、潜伏和潜在感染问题上的首次应用。与现有技术的替代ZFN和TALEN技术不同，CRISPR技术可以轻松针对特定靶标进行定制，并且是可复用的。本发明的CRISPR组合物和方法有效地消除宿主细胞的JCV感染并保护宿主细胞免受未来感染。

用于多瘤病毒感染的消除和预防的组合物和方法。

RNA指导的CRISPR生物技术适应细菌的基因组防御机制，其中CRISPR/Cas基因座编码针对可移动遗传元件(病毒、转座因子和接合质粒)的RNA指导的适应性免疫***。

CRISPR簇编码间隔区，该序列与病毒核酸中的靶序列(“前间区序列”)或另一个待靶向的核酸互补。将CRISPR簇转录并加工至成熟的CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复)RNA(crRNA)中。CRISPR簇还编码包括DNA核酸内切酶的CRISPR相关(Cas)蛋白。该crRNA与靶DNA序列结合，于是Cas核酸内切酶在靶序列处或与靶序列相邻的位置处裂解靶DNA。

一个有用的CRISPR***包含CRISPR相关核酸内切酶Cas9。Cas9由包含间隔区的约20-30个碱基对(bp)的成熟的crRNA和充当用于前crRNA的核糖核酸酶III辅助加工的指导的反式活化的小RNA(tracrRNA)指导。该crRNA:tracrRNA双链体通过crRNA上的间隔区和靶DNA上的靶序列间的碱基互补配对指导Cas9靶向DNA。Cas9识别三核苷酸(NGG)前间区序列邻近基序(PAM)以决定切割位点(PAM的第三个核苷酸)。crRNA和tracrRNA可以单独地表达或通过合成的茎环(AGAAAU)被工程改造成人工嵌合小指导RNA(sgRNA)以模拟天然的crRNA/tracrRNA双链体。可以合成或体外转录这样的sgRNA用于指导RNA转染，或者它们可以在例如来自U6或H1促进的RNA表达载体中原位表达。术语“指导RNA”(gRNA)将用于表示crRNA:tracrRNA双链体或sgRNA。将明白的是，术语“与靶序列互补的gRNA”表示其间隔序列与靶序列互补的gRNA。

本发明的组合物包含编码CRISPR相关核酸内切酶例如Cas9的核酸和至少一个与多瘤病毒如JCV中的靶序列互补的gRNA。

在本发明的优选实施方案中，所述CRISPR相关核酸内切酶是Cas9核酸酶。Cas9核酸酶可具有与野生型酿脓链球菌(S.pyrogenes)序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述CRISPR相关核酸内切酶可以是来自其他物种的序列，例如其他链球菌属物种如嗜热链球菌(thermophilus)；绿脓杆菌(P.aeruginosa)、大肠杆菌(E.coli)、或其他测序的细菌基因组和古细菌、或其他原核微粒体。或者，野生型酿脓链球菌(S.pyrogenes)Cas9序列可被修饰。优选地，所述核酸序列可以是为在哺乳动物细胞中的有效表达(即“人源化”)而优化的密码子。人源化Cas9核酸酶序列可以是例如由在以下列出的任一表达载体编码的Cas9核酸酶序列：Genbank登记号KM099231.1GI:669193757、KM099232.1GI:669193761或KM099233.1GI:669193765。或者，Cas9核酸酶序列可以是例如在可商购获得的载体例如来自Addgene(Cambridge,MA)的PX330或PX260内所含的序列。在一些实施方案中，所述Cas9核酸内切酶可以具有作为Genbank登记号KM099231.1GI:669193757、KM099232.1GI:669193761或KM099233.1G1:669193765的Cas9核酸内切酶序列或者PX330或PX260(Addgene,Cambridge,MA)的Cas9氨基酸序列中的任一个的变体或片段的氨基酸序列。

Cas9核苷酸序列可被修饰以编码Cas9的生物活性变体，并且这些变体可以具有或可以包含例如凭借含有一个或多个突变(例如添加、缺失或取代突变或这些突变的组合)而与野生型Cas9不同的氨基酸序列。取代突变中的一个或多个可以是取代(例如保守氨基酸取代)。例如，Cas9多肽的生物活性变体可具有与野生型Cas9多肽至少或约50％序列同一性(例如至少或约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性)的氨基酸序列。保守氨基酸取代通常包括在以下组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。

Cas9氨基酸序列中的氨基酸残基可以是非天然存在的氨基酸残基。天然存在的氨基酸残基包括由遗传密码天然编码的那些以及非标准氨基酸(例如具有D-构型而不是L-构型的氨基酸)。本发明的肽还可以包括标准残基的修饰形式的氨基酸残基(例如可以使用吡咯赖氨代替赖氨酸以及硒代半胱氨酸可以代替半胱氨酸)。非天然存在的氨基酸残基是在自然界中尚未发现但符合氨基酸的基本配方并且可以并入肽中的那些。这些包括D-别异亮氨酸(2R,3S)–2–氨基–3–甲基戊酸和L–环戊基甘氨酸(S)–2–氨基–2–环戊基乙酸。对于其他示例，可以查阅教科书或万维网(网站目前由California Institute of Technology维护并且展示已经成功并入功能蛋白中的非天然氨基酸的结构)。

Cas9核酸酶序列可以是突变序列。例如，Cas9核酸酶可以在参与链特异性切割的保守的HNH和RuvC结构域中突变。例如，在RuvC催化结构域中的天冬氨酸盐向丙氨酸(D10A)的突变允许Cas9切口酶突变体(Cas9n)切割而非裂解DNA以产生单链断裂，并且经由HDR22的后续优先修复可潜在地降低来自靶标外双链断裂的不需要的InDel突变的频率。

在一些实施方案中，本发明的组合物可包含由如上所述的任何核酸序列编码的CRISPR相关核酸内切酶多肽。多肽可以通过多种方法产生，包括例如重组技术或化学合成。一旦产生，多肽可以通过本领域熟知的手段分离和纯化至任何所需的程度。例如，可以在例如在多糖凝胶介质如Sephadex G-25上的反相(优选地)或正相HPLC或尺寸排阻或分配色谱法之后使用冻干。最终多肽的组成可以通过在经由标准手段的肽降解后的氨基酸分析、通过氨基酸测序、或通过FAB-MS技术证实。

在示例性实施方案中，本发明包括包含Cas9和与JCV T-抗原序列互补的一个或多个gRNA的工程化的CRISPR***。示例性的JCV基因组序列是Mad-1菌株，NCBI参考序列，GenBank编号:NC_001699.1，public GI(Frisque等，1984)。在Mad 1菌株中，T-Ag编码区开始于5130nt循环Mad-1JCV基因组的核苷酸(nt)5013。示例性的gRNA间隔序列与JCV T-抗原序列的TM1、TM2或TM3区域互补。Mad-l JCV的结构组织如图1A所示。对应于TM1、TM2和TM3的核苷酸序列如图1B所示，并且gRNA的靶序列以粗体大写字母显示。靶序列的长度可以从约20延长至40或更多nt。应当理解的是，在JCV的不同菌株中或在突变变体中，通过公知的测序和基因组技术可以容易地鉴定与TM1、TM2和TM3同源的序列。

TM1中的示例性靶序列包含SEQ ID NO:1或其反向平行链上的互补序列SEQ IDNO:2。每条链中的PAM序列(以小写粗体显示)可以包含在靶序列中，使得靶序列可以包含SEQ ID NO:3或其反向平行链上的互补序列SEQ ID NO:4。因此，与TM1互补的命名为gRNAml的gRNA可包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4互补的间隔序列。

核苷酸序列如下：

AAATGCAAAGAACTCCACCCTGATGAAGGTG(SEQ ID NO:1)

AAATGCAAAGAACTCCACCCTGATGAAGGTGGGG(SEQ ID NO:2)

CACCTTTATCAGGGTGGAGTTCTTTGCATTT(SEQ ID NO:3)

CCCCACCTTTATCAGGGTGGAGTTCTTTGCATTT(SEQ ID NO:4)

TM2中的示例性靶序列包含SEQ ID NO:5或其反向平行链上的互补序列SEQ IDNO:6。每条链中的PAM序列也可以包含在靶序列中，使得靶序列可以包含SEQ ID NO:7或其反向平行链上的互补序列SEQ ID NO:8。因此，与TM2互补的命名为gRNA m2的gRNA可以包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8互补的间隔序列。

核苷酸序列如下：

GATGAATGGGAATCCTGGTGGAATACATTTAATGAGAAGT(SEQ ID NO:5)

GATGAATGGGAATCCTGGTGGAATACATTTAATGAGAAGTGGG(SEQ ID NO:6)

ACTTCTCATTAAATGTATTCCACCAGGATTCCCATTCATC(SEQ ID NO:7)

CCCACTTCTCATTAAATGTATTCCACCAGGATTCCCATTCATC(SEQ ID NO:8)

TM3中的示例性靶序列包含SEQ ID NO:9或其反向平行链上的互补序列SEQ IDNO:10。每条链中的PAM序列也可以包含在靶序列中，使得靶序列可以包含SEQ ID NO:11或其互补序列SEQ ID NO:12。因此，与TM3互补的命名为m3的gRNA可以包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12互补的间隔序列。

核苷酸序列如下：

A AGGTACTGGCTATTCAAGGGGCCAATAGACAG(SEQ ID NO:9)

AAGGTACTGGCTATTCAAGGGGCCAATAGACAGTGG(SEQ ID NO:10)

CTGTCTATTGGCCCCTTGAATAGCCAGTACCTT(SEQ ID NO:11)

CCACTGTCTATTGGCCCCTTGAATAGCCAGTACCTT(SEQ ID NO:12)

含有TM1、TM2和TM3的靶位点的DNA的延伸如图1A所示，且它们的核苷酸序列于图1B中如SEQ ID NO:13-18所示。应当理解的是，本发明的gRNA还可以包含可或不可与靶序列互补的额外的5'和/或3'序列。每个gRNA的间隔区可以具有与其靶序列小于100％的互补性，例如95％的互补性。

在实施例2、4和5中，发现包含Cas9和gRNAs m1、m2和/或m3的CRISPR***抑制宿主细胞中的JCV复制和T-Ag表达，并损害JCV基因组的完整性。这些影响导致游离性附加型病毒和整合到宿主基因组中的病毒的消除。没有产生对健康基因有害的脱靶效应。因此，本发明包括一种用于从感染JCV的宿主细胞中消除JCV的组合物。所述组合物包含至少一个编码CRISPR相关核酸内切酶的分离的核酸序列，以及至少一个具有与JCV DNA中的靶序列互补的间隔序列的gRNA。本发明还包括一种从感染JCV的宿主细胞中消除JCV的方法。所述方法包括以下步骤：用包含CRISPR相关核酸内切酶和至少一个具有与JCV DNA中的靶序列互补的间隔序列的gRNA的组合物处理宿主细胞；和从所述宿主细胞中消除所述JCV。

在实施例3的实验中，确定了本发明的CRISPR***的稳定表达可以使得宿主细胞免除JCV的新感染。因此，本发明还包括一种预防JCV感染处于JCV感染风险中的患者的细胞的方法。所述方法包括以下步骤：确定患者处于JCV感染风险中；将处于JCV感染风险中的患者的细胞暴露于有效量的表达载体组合物中，所述表达载体组合物包含编码CRISPR相关核酸内切酶的分离的核酸和编码至少一个包含与JCV DNA中的靶序列互补的间隔序列的指导RNA的至少一个分离的核酸；预防所述患者的细胞的JCV感染。

本发明的gRNA可以被构造成单序列或一个或多个不同序列的组合，例如多重构型。多重构型可以包括两个、三个或更多个不同gRNA的组合。当组合物施用于表达载体中时，指导RNA可以由单个载体编码。或者，多个载体可被工程改造以便每个包含两个或更多个不同的指导RNA。gRNA的特别有用的组合造成在裂解位点之间的病毒序列的切除，使得JCV基因组或JCV蛋白表达的去除。切除区域在大小上可以从单个核苷酸变化至数百个核苷酸。

RNA分子(如crRNA、tracrRNA、gRNA)可被工程改造以包含一个或多个修饰的核碱基。例如，RNA分子的已知修饰可见于例如Genes VI，第9章(“Interpreting the GeneticCode”),Lewis编著(1997,Oxford University Press,New York),and Modification andEditing of RNA,Grosjean和Benne编著(1998,ASM Press,Washington DC)中。修饰的RNA组分包括以下：2'-O-甲基胞苷、N⁴-甲基胞苷、N⁴-2'-O-二甲基胞苷、N⁴-乙酰基胞苷、5-甲基胞苷、5,2'-O-二甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、2'-O-甲基-5-甲酰基胞苷、3-甲基胞苷、2-硫代胞苷、赖西丁、2'-O-甲基尿苷、2硫代尿苷、2-硫代-2'-O-甲基尿苷、3,2'-O-二甲基尿苷、3-(3-氨基-羧丙基)尿苷、4-硫代尿苷、胸腺嘧啶核糖核苷、5,2'-O-二甲基尿苷、5-甲基-2硫代尿苷、5-羟基尿苷、5-甲氧基尿苷、尿苷5-氧基乙酸、尿苷5-氧基乙酸甲酯、5-羧基甲基尿苷、5-甲氧羰基甲基尿苷、5-甲氧羰基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-甲氧羰基甲基-2'-硫代尿苷、5-氨甲酰基甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基、2'-O-甲基尿苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、5-(羧基羟甲基)尿苷甲酯、5-氨基甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硒代尿苷、5-5-羧基甲基氨基甲基尿苷、5-羧基甲基氨基甲基-2'-O-甲基-尿苷、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、二氢尿苷、二氢胸腺嘧啶核糖核苷、2'-甲基腺苷、2-甲基腺苷、N⁶-甲基腺苷、N⁶,N⁶-二甲基腺苷、N6,2'-O-三甲基腺苷、2-甲硫基-N⁶N-异戊烯基腺苷、N⁶-(顺式-羟基异戊烯基)-腺苷、2-甲硫基-N⁶-(顺式-羟基异戊烯基)-腺苷、N⁶-甘氨酰基氨基甲酰基)腺苷、N⁶-苏氨酰氨基甲酰腺苷、N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N⁶-甲基-N⁶-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、N⁶-羟基正缬氨酰氨基甲酰腺苷；2-甲硫基-N⁶-羟基正缬氨酰氨基甲酰腺苷、2-O-核糖基腺苷(磷酸酯)、肌苷、2'O-甲基肌苷、1-甲基肌苷、l；2'-O-二甲基肌苷、2'-O-甲基鸟苷、1-甲基鸟苷、N²-甲基鸟苷、N²,N²-二甲基鸟苷、N²,2'-O-二甲基鸟苷、N²,N²,2'-O-三甲基鸟苷、2'-O-核糖基鸟苷(磷酸盐)、7-甲基鸟苷、N²；7-二甲基鸟苷、N²；N²；7-三甲基鸟苷、丫苷、甲基丫苷、修饰不足的羟基怀丁苷、30羟基怀丁苷、过氧基怀丁苷、辫苷、环氧基辫苷、半乳糖-辫苷、甘露糖基-辫苷、7-氰基-7-脱氮鸟苷、花生四烯酸[也称为7-甲酰氨基-7-脱氮鸟苷]以及7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷。本发明的方法或本领域的其他方法可以用于鉴定另外的修饰的RNA分子。

本发明的gRNA不限于与JCV T-抗原的TM1、TM2或TM3区域内发现的序列互补的那些。JCV的其他区域和其他多瘤病毒可以被具有合适设计的gRNA的CRISPR***靶向。对于使用酿脓链球菌Cas9的CRISPR***，PAM序列可以是AGG、TGG、CGG或GGG。可通过接近5'PAM如AGG、TGG、CGG或GGG来鉴定候选靶序列。其他Cas9直系同源可具有不同的PAM特异性。例如，嗜热链球菌Cas9需要5'-NNAGAA用于CRISPR1和5'-NGGNG用于CRISPR3)以及脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)需要5'-NNNNGATT)。gRNA的特异性序列可变化，但有用的gRNA序列将是使脱靶效应最小化同时实现JCV的高效和完全消除那些。可以通过实施例1-5中公开的测定法来确定候选gRNA的效率和脱靶效应。

本发明不限于Cas9核酸内切酶。它还包括需要使用任何CRISPR相关核酸内切酶的组合物和方法，所述CRISPR相关核酸内切酶能够通过gRNA指导到PAM位点后裂解病毒基因组。实例包括家族Cpfl(来自Prevotelia和Francisella 1的CRISPR)的核酸内切酶(Zetsche等，2015)。迄今为止，已证实两个Cpfl内切核酸酶在培养的人肾细胞***中对基因编辑是有效的：Acidominococcus sp.BV3L6 Cpfl和Lachnospiraceae细菌D2006 Cpfl。

Cpfl核酸内切酶扩大JCV和其他多瘤病毒中可能靶点的范围，因为它们识别PAM与由Cas9识别富含胞嘧啶的PAM是不同的。Cpfl识别富含胸腺嘧啶的PAM，其具有共有序列TTN，并且PAM位于靶序列的5'末端。Cpfl由比Cas9***更小、更简单的gRNA指导。Cpfl由单导RNA(称为sgRNA)指导，而不是由包含crRNA和tracrRNA的双单元gRNA或crRNA和tracrRNA的工程化嵌合杂交体指导。Cpfl分子也小于Cas9分子。这种更大的简单性和更小的尺寸同时有助于CRISPR/Cpfl***的设计和使用，以及将核酸内切酶组分递送至宿主细胞的细胞核。

gRNA的序列将取决于选择用于编辑的特定靶位点的序列。优选的靶位点位于JCV或另一种多瘤病毒的T-Ag区域。通常，gRNA预测是与靶DNA序列互补，直接是其3'与富含胸腺嘧啶的PAM的序列5'TTN互补。gRNA序列可以与有义或反义序列互补。gRNA序列可或不可包含PAM序列的补体。gRNA序列可以包含可能不与靶序列互补的额外的5'和/或3'序列。gRNA序列可以与靶序列具有小于100％的互补性，例如95％的互补性。gRNA具有与编码或非编码靶序列互补的序列。gRNA序列可以以多重构型使用，包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个不同gRNA的组合。

本发明的组合物和方法已经证明通过gRNA指导的对T-Ag基因的进攻在消除JCV方面是有效的。因此，本发明很可能容易适用于其他多瘤病毒如SV40的有效治疗。适应主要是Cas9或另一合适的核酸内切酶识别特定多瘤病毒的T-A基因或其他关键基因中的PAM序列的问题。然后通过实施例1-5中公开的方法产生和检测与PAM序列相邻的序列互补的gRNA。

因此，本发明包括从感染多瘤病毒的宿主细胞中消除多瘤病毒的方法。所述方法包括以下步骤：用CRISPR相关核酸内切酶和至少一个具有与多瘤病毒DNA中的靶序列互补的间隔序列的指导gRNA处理宿主细胞；和从宿主细胞中消除多瘤病毒。在优选的实施方案中，gRNA间隔序列与多瘤病毒DNA的大T-抗原(T-Ag)编码区中的靶序列互补。

载体。本发明包括一种载体，其包含一个或多个用于表达CRISPR组分如一个或多个gRNA和Cas核酸内切酶如Cas9的盒。载体可以是本领域已知的并且适于表达所需表达盒的任何载体。已知许多载体能够介导基因产物转移至本领域已知的并在此描述的哺乳动物细胞中。“载体”(有时称为基因递送或基因转移“载体”)是指体外或体内包含要递送至宿主细胞的多核苷酸的大分子或分子复合物。待递送的多核苷酸可包含基因治疗中感兴趣的编码序列。

优选的载体是慢病毒载体。慢病毒载体具有提供增殖和静息细胞的有效转导、通过整合至宿主染色质中的递送基因的稳定表达以及不存在预先存在的病毒免疫的干扰的优点。在实施例5中公开的实验中，Cas9/gRNA组分的药物诱导性慢病毒表达载体显示在去除感染细胞中的JCV T-Ag表达方面是有效的。在示例性构型中，宿主细胞用多西环素诱导型慢病毒载体中的Cas9或另外合适的CRISPR核酸内切酶稳定地转导。当需要消除JCV时，该宿主细胞用一个或多个gRIMA转导并用多西环素处理，以激活Cas9的表达，以引起JCV基因组的指导性裂解和病毒的灭活。或者，一个或多个gRNA可以以药物可诱导的方式稳定地转导，或者CRISPR相关核酸内切酶和gRNA两者可以如此转导。在临床情况下，该治疗可用于处于JCV感染风险中的患者，随着CRISPR组分在感染后被激活。

因此，本发明包括用于从宿主细胞中消除JCV的载体组合物。所述载体组合物包含至少一个编码CRISPR相关核酸内切酶的分离的核酸序列和至少一个具有与JCV DNA中的靶序列互补的间隔序列的gRNA。所述分离的核酸序列包含在至少一个表达载体中，该表达载体在宿主细胞中诱导CRISPR相关核酸内切酶和至少一个gRNA表达。

本发明不限于实施例1-5描述的质粒和慢病毒载体。其他优选的载体包括腺病毒载体和腺相关病毒载体。这些具有不整合到宿主细胞DNA的优点。许多其他重组病毒载体也是合适的，包括但不限于水泡性口炎病毒(VSV)载体、痘病毒载体和逆转录病毒载体。

“重组病毒载体”是指包含一个或多个异源基因产物或序列的病毒载体。由于许多病毒载体表现出与包装相关的尺寸限制，所以通常通过替换病毒基因组的一个或多个部分来引入异源基因产物或序列。这样的病毒可变成复制缺陷型，需要有待在病毒复制和衣壳化期间反式提供的缺失功能(通过使用例如辅助病毒或携带用于复制和/或衣壳化所必需的基因产物的包装细胞系)。还描述了其中有待递送的多核苷酸在病毒颗粒外携带的修饰的病毒载体。

逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一种优选的基于HIV的病毒载体包含至少两个载体，其中gag和pol基因来自HIV基因组而env基因来自另一种病毒。优选的是DNA病毒载体。这些载体包括痘载体如天花或禽痘载体、疱疹病毒载体如单纯疱疹病毒(HSV)载体。

痘病毒载体将基因导入细胞胞质中。禽痘病毒载体仅产生核酸的短期表达。腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体可以是某些发明实施方案的适应症。腺病毒载体比腺相关病毒产生更短期的表达(例如少于约一个月)，在一些实施方案中，可表现出更长期的表达。所选的具体载体将取决于靶细胞和待治疗的病症。可以容易地完成合适的启动子的选择。在一些实施方案中，可以使用高表达启动子。合适的启动子的例子是763-碱基对巨细胞病毒(CMV)启动子。还可以使用劳氏肉瘤病毒(RSV)和MMT启动子。某些蛋白质可以使用其天然启动子表达。还可以包括可增强表达的其他元件，例如增强子或产生高水平表达的***如tat基因和tar元件。此盒能因此***载体中，例如质粒载体，如pUC19、pUC118、pBR322或其他已知的质粒载体，其包括例如大肠杆菌复制起点。质粒载体还可以包括可选择的标记，例如针对氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，前提条件是该标记多肽不会对所治疗的生物体的代谢产生不利影响。所述盒还可以结合至合成递送***如WO 95/22618中所公开的***中的核酸结合部分。

另一种递送方法是使用单链DNA产生载体，其可在细胞内产生表达产物。参见例如Chen等，BioTechniques，34:167-171(2003)，其整体通过引用并入本文。

表达可以由本领域已知的在选择用于表达的宿主中起作用的任何启动子/增强子元件来控制。除了实施例部分中描述的启动子之外，可用于基因表达的其他启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子；SV40早期启动子区域；包含在劳氏肉瘤病毒3'长末端重复中的启动子；疱疹胸苷激酶启动子；金属硫蛋白基因的调控序列；原核表达载体如β-内酰胺酶或tac启动子；来自酵母或其他真菌的启动子元件如Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子；以及显示组织特异性并已用于转基因动物中的动物转录控制区域；在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区域；在胰腺β-细胞中有活性的胰岛素基因控制区域；在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区域；在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区域；在肝脏中有活性的白蛋白基因控制区域；在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因控制区域；在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区域；在骨髓细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区域；在脑中的少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区域；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区域和在下丘脑中有活性的***释放激素基因控制区域。

可采用多种宿主/表达载体组合表达本发明的核酸序列。有用的表达载体例如可由染色体、非染色体和合成DNA序列的片段组成。合适的载体包括SV40和已知的细菌质粒的衍生物，例如大肠杆菌质粒col E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX、pMB9及其衍生物；质粒如RP4；噬菌体DNA，例如噬菌体1的众多衍生物，例如NM989及其他噬菌体DNA，例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒如2μ质粒或其衍生物；适用于真核细胞中的载体，例如适用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体；衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，例如经修饰以采用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒；等等。

还可以使用酵母表达***。例如，可根据本发明采用非融合pYES2载体(XbaI、SphI、Shol、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamH1、SacI、Kpn1及HindIII克隆位点；Invitrogen)或融合pYESHisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamH1、SacI、KpnI及HindIII克隆位点，N端肽用ProBond树脂纯化并用肠激酶裂解；Invitrogen)，仅提到其中两例。也可根据本发明制备酵母双杂合表达***。

另外合适的载体包括v融合蛋白和化学偶联物。如果需要，本发明的多核苷酸还可以与微递送载体如阳离子脂质体和其他含脂质复合体以及其他能够介导多核苷酸递送至宿主细胞的大分子复合体一起使用。

载体还可包含进一步调节基因递送和/或基因表达或另外向靶细胞提供有利性质的其他组分或功能物。这种其他组分包括例如影响结合或靶向细胞的组分(包括介导细胞型或组织特异性结合的组分)；影响细胞摄取载体核酸的组分；影响摄取之后多核苷酸在细胞内的定位的组分(如介导核定位的因子)；以及影响多核苷酸表达的组分。这种组分还可以包括标记，如可检测和/或可选择的标记，其可被用于检测或选择已经摄入并开始表达被载体递送的核酸的细胞。这种组分可作为载体的天然特征来提供(如具有介导结合和摄取的组分或功能物的某种病毒载体的使用)，或可通过修饰载体来提供此功能物。其他载体包括由Chen等，BioTechniques,534:167-171(2003)所述的那些载体。很多种此类载体在本领域中是已知的并且通常是可获得的。

药物组合物

已证实对从培养的细胞中消除JCV有效的组合物和方法(实施例1-5)，如果通过一种或多种合适的表达载体递送，是非常有可能在体内有效。因此，本发明包括用于从哺乳动物受试者的细胞中消除JCV的药物组合物，包含编码C ISPR相关核酸内切酶的分离的核酸序列和至少一个分离的核酸序列，其编码至少一个与JCV基因组中的靶序列互补的gRNA。优选的gRNA包含与TM1、T 2、TM 3或JCV T-Ag的其它区域互补的间隔序列。例如，可以单独地或以任何组合形式包含gRNA ml、m2和m3。还优选的是，所述药物组合物还包含至少一个表达载体，其中分离的核酸序列被编码。

根据本发明，药物组合物可以以本领域普通技术人员已知的各种方式制备。例如，如上所述的核酸和载体可在组合物内配制以便用于组织培养中的细胞或施用于患者或受试者。这些组合物可以以药物领域众所周知的方式制备，并且可以通过各种途径施用，这取决于是否需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。施用可以是局部的(包括眼睛且至粘膜，包括鼻内、***和直肠递送)、肺部(例如通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和透皮)、眼部、口服或胃肠外。用于眼部递送的方法可以包括局部施用(滴眼液)、结膜下、眼周或玻璃体内注射或通过球囊导管或外科手术置于结膜囊中的眼科***物引入。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内，例如鞘内或心室内施用。胃肠外施用可以是单次推注剂量的形式，或者可以是例如连续灌注泵。用于局部施用的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、粉剂等等。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂诸如此类可能是必需或合乎需要的。

本发明还包括药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的核酸和载体作为活性成分，与一种或多种药学上可接受的载体组合。术语“药学上可接受的”(或“药理学上可接受的”)是指在适当地向动物或人施用时不产生不利的、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等等，其可用作药学上可接受的物质的介质。在制造本发明组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，用赋形剂稀释或者包装入例如胶囊、片剂、小药囊、纸或其他容器形式的这种载体内。当赋形剂充当稀释剂时，它可以是固体、半固体、或液体材料(例如生理盐水)，其用作活性成分的媒介物、载体或介质。因此，所述组合物可呈以下形式：片剂、丸剂、粉剂、糖锭、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬液、乳液、溶液、糖浆剂、气溶胶(作为固体或在液体介质中)、洗剂、霜剂、膏剂、凝胶、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌可注射溶液、以及无菌包装粉剂。如本领域中已知，稀释剂的类型可根据施用的预定途径而变化。所得的组合物可包含另外的试剂，如防腐剂。在一些实施方案中，载体可以是或可包括基于脂质或基于聚合物的胶体。在一些实施方案中，载体材料可以是胶体，其被配制成脂质体、水凝胶、微粒、纳米颗粒、或嵌段共聚物胶束。如所述，载体材料可形成胶囊，并且所述材料可以是基于聚合物的胶体。示例性药学上可接受的载体和稀释剂以及药物制剂的进一步描述可以见于Remington'sPharmaceutical Sciences，本领域的标准文本，和USP/NF。可以向组合物中加入其他物质以稳定和/或保存组合物。

本发明的核酸序列可递送给受试者的适当细胞。这可通过例如使用聚合、生物可降解的微粒或微胶囊递送媒介物实现，它们被调整尺寸以便使吞噬细胞如巨噬细胞的吞噬作用最优化。例如，可使用直径为大约1-10μm的PLGA(聚-乳-共-乙交酯)微粒。将多核苷酸在这些微粒中胶囊化，其被巨噬细胞摄入并且在细胞内逐渐生物降解，从而释放多核苷酸。一旦释放，DNA便在细胞内表达。第二种类型的微粒不想要被细胞直接摄入，而是主要充当核酸的缓释储蓄库，其一旦经由生物降解从微粒释放，便仅被细胞摄入。这些聚合颗粒因此大到足以排除吞噬作用(即，大于5μm且优选地大于20μm)。实现核酸摄取的另一种方式是使用通过标准方法制备的脂质体。核酸可单独并入到这些递送媒介物中或与组织特异性抗体合并，例如，靶向作为HIV感染的通常潜伏感染的储蓄库的细胞类型的抗体，例如脑巨噬细胞、小神经胶质细胞、星形胶质细胞及肠相关淋巴样细胞。或者，可制备由质粒或通过静电或共价力连接至聚-L-赖氨酸上的其他载体组成的分子复合物。聚-L-赖氨酸结合至可结合至靶细胞上的受体的配体。向肌内、皮内或皮下部位递送“裸DNA”(即没有递送媒介物)是实现体内表达的另一种手段。在相关多核苷酸(例如表达载体)中，编码分离的核酸序列的核酸序列与启动子或增强子-启动子组合可操作地连接，所述分离的核酸序列包含编码CRISPR相关核酸内切酶的序列和指导RNA。启动子和增强子如上所述。

在一些实施方案中，本发明组合物可被配制成纳米颗粒，例如包含高分子量线性聚乙烯亚胺(LPEI)的核心的纳米颗粒，该核心与DNA复合并且由聚乙二醇修饰的(聚乙二醇化)低分子量LPEI的外壳包围。

所述核酸和载体也可施用于装置(例如导管)的表面或包含在泵、贴剂或其他药物递送装置内。本发明的核酸和载体可单独或在混合物中在药学上可接受的赋形剂或载体(例如生理盐水)存在下施用。基于施用模式和途径选择赋形剂或载体。合适的药物载体以及在药物制剂中使用的药物必需品描述于Remington's Pharmaceutical Sciences(E.W.Martin)，即在此领域中众所周知的参考文本和USP/NF(United StatesPharmacopeia and the National Formulary)中。

在一些实施方案中，所述组合物可配制成纳米颗粒，该纳米颗粒胶囊化编码Cas9的核酸或变体Cas9和至少一个与靶HIV互补的指导RNA序列或者它可包含编码这些组成部分的载体。或者，所述组合物可配制成纳米颗粒，该纳米颗粒胶囊化由本发明的一种或多种核酸组合物编码的CRISPR相关核酸内切酶多肽。

治疗方法

实施例1-4中公开的结果表明，本发明的CRISPR***有效地从宿主细胞中消除JCV并且使宿主细胞难以接受新感染。这些研究结果表明，CRISPR***的组成部分可以递送至感染JCV的患者以及处于JCV风险中的患者，作为治疗和预防性治疗。优选的递送方法包括前述的药物组合物。

因此，本发明包括治疗患有JCV相关病症例如进行性多灶性脑白质脑病的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的前述药物组合物的步骤。本发明还包括预防处于JCV感染风险中的患者的细胞的JCV感染的方法，包括以下步骤：确定患者处于JCV感染的风险中；将患者的细胞暴露于有效量的表达载体组合物中，所述表达载体组合物包含编码CRISP相关核酸内切酶的分离的核酸和至少一个分离的核酸，其编码至少包含与JCV的DNA中的靶序列互补的间隔序列的gRNA；在患者的细胞中稳定地表达CRISPR相关核酸内切酶和至少一个gRNA；并预防患者细胞的JCV感染。

本发明的组合物和方法普遍地和多方面地对治疗具有多瘤病毒介导的感染例如JCV感染的受试者有用。每当临床有益的结果发生时，受试者被有效地治疗。这可能意味着例如疾病症状的完全解决、疾病症状的严重程度的降低或疾病进展的减缓。因此，本发明的方法可用于治疗与JCV感染相关的疾病和病症，例如肾上腺神经母细胞瘤；神经外胚瘤；源于小脑的肿瘤；垂体瘤；外周神经鞘瘤和癌症，包括脑癌如少突星形细胞瘤、黄色星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、少突胶质细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤，胶质起源的脑肿瘤、中枢神经***淋巴瘤；以及结肠癌和食道癌；或继发感染。所述方法还可以包括以下步骤：a)鉴定具有JCV感染的受试者(例如患者，更具体地，人类患者)，以及b)向受试者提供包含编码CRISPR相关核酸内切酶的核酸和与JCV靶序列(例如T-抗原序列)互补的指导RNA的组合物。提供给受试者的这种组合物的量若造成感染症状的完全消除、感染症状的严重性的降低或感染进展的减慢，则认为是治疗有效量。本方法还可包括监测步骤，以帮助优化给药和调度以及预测结果。

在本发明的某些方法中，可首先确定患者是否患有JCV感染，然后确定是否用本文所述的一种或多种组合物治疗患者。监测也可用于检测耐药性的发作以及快速区分响应性患者与非响应性患者。在一些实施方案中，所述方法还可进一步包括以下步骤：确定由患者携带的特定JCV的核酸序列，然后设计指导RNA以与那些特定序列互补。例如，可以确定受试者的TM1、TM2和/或TM3区域的核酸序列，然后设计一个或多个gRNA以与患者的序列精确互补。

在一些实施方案中，所述组合物可以离体施用以治疗从一个个体移出的用于移植到另一个体中的细胞或器官。用于移植的细胞或器官可以用包含本发明的Cas9组合物的载体转导。可以确认靶JCV序列的去除或减弱，并将处理的细胞注入患者体内。

通过本文体现的方法鉴定的组合物或药剂可以以任何合适的制剂施用于包括动物和人的受试者。例如，所述组合物可以配制在药学上可接受的载体或稀释剂如生理盐水或缓冲盐溶液中。可以基于施用方式和途径以及标准药物实践来选择合适的载体和稀释剂。

本发明的组合物可以通过任何常规技术施用于受试者。所述组合物可以通过例如外科手术递送至内部或外部靶位点或通过导管至血管可接近的位点来直接施用于靶位点。其他递送方法，例如脂质体递送或从浸渍有组合物的装置扩散是本领域已知的。所述组合物可以以单次推注、多次注射或通过连续输注(例如静脉内)施用。对于肠胃外施用，有用的组合物配制成无菌无热原的形式。

所述组合物可以与另外的治疗剂，例如用于治疗脱髓鞘疾病的试剂如纳他珠单抗

芬戈莫德(Gilenya)；B细胞功能障碍(美罗华(

和

)；免疫介导的病症和移植(Adalimumab/Humira；Brentuximab vedotin/Adcetris；Efalizumab/Raptiva；Etanercept/Enbrel；Infliximab(Remicade)；霉酚酸酯((MMF)/CellCept))；或逆转录病毒感染如HAART(高效抗逆转录病毒治疗)一起施用。两种或多种治疗剂的并行施用不需要同时或以相同的途径给药，只要在试剂发挥其治疗作用期间的时间段上有重叠。可以预期同时或连续施用，也可以预期在不同的天或周的施用，因此同时或顺序施用是预期的。治疗剂可以在节奏性方案例如治疗剂的连续低剂量下施用。

此类组合物的剂量、毒性和治疗功效可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序来确定，例如用于测定LD₅₀(对于50％的群体致死的剂量)和ED₅₀(有效治疗50％群体的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数并且可以表示为比率LD50/ED50。显示高治疗指数的Cas9/gRNA组合物是优选的。尽管可以使用显示毒性副作用的Cas9/gRNA组合物，但应注意设计将此类组合物靶向至受影响组织的位点的递送***，以使对未感染细胞的潜在损伤最小化，从而减少副作用。

从细胞培养测定和动物研究处获得的数据可用于配制供人使用的剂量范围。此类组合物的剂量通常落在包括ED50的循环浓度范围内，几乎没有或没有毒性。剂量可在此范围内变化，这取决于采用的剂型和所用的施用途径。对于本发明方法中使用的任何组合物，治疗有效剂量可以最初由细胞培养测定来估算。可在动物模型中配制剂量以实现循环血浆浓度范围，包括如细胞培养中所测定的IC₅₀(即实现症状的一半最大抑制的测试化合物的浓度)。此类信息可用于更加准确地测定人中的有用剂量。血浆中的水平可例如通过高效液相色谱法测量。

如所描述，组合物的治疗有效量(即有效剂量)意指足以产生治疗上(例如临床上)合乎需要的结果的量。组合物可每天施用一次或多次至每周施用一次或多次；包括每隔一天一次。熟练的技术人员将理解，某些因素可影响有效地治疗受试者所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或病症的严重性、先前治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄、及其他现存疾病。此5外，用治疗有效量的本发明组合物治疗受试者可包括单一治疗或一系列治疗。

本文所述的组合物适用于在如上所述的多种药物递送***中使用。另外，为了延长所施用的化合物的体内血清半衰期，组合物可被胶囊化、引入脂质体的腔中、制备成胶体，或者可采用提供组合物的延长血清半衰期的其他传统技术。可获得用于制备脂质体的多种方法，如例如Szoka等,美国专利号：4,235,871、4,501,728和4,837,028中所述，其各自以引用的方式并入本文。此外，可在靶向药物递送***中，例如在涂覆有组织特异性抗体的脂质体中施用药物。脂质体将会靶向于器官并被其选择性地吸收。

用于施用组合物的制剂包括适合于直肠、鼻、口服、局部(包括口腔和舌下)、***或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)施用的那些。该制剂可以方便地以单位剂量形式例如片剂和缓释胶囊存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。

所述组合物可以包含已用一个或多个Cas/gRNA载体转化或转染的细胞。细胞可以是受试者的细胞或者其可以是单倍型匹配或细胞系。细胞可被照射以防止复制。在一些实施方案中，细胞是人白细胞抗原(HLA)匹配、自体、细胞系或其组合。在其他实施方案中，细胞可以是干细胞，例如胚胎干细胞或人造多能干细胞(诱导多能干细胞(iPS细胞))。胚胎干细胞或人造多能干细胞(诱导多能干细胞(iPS细胞))已从许多动物物种包括人建立。这些类型的多能干细胞将是用于再生医学的最有用的细胞来源，因为这些细胞能够通过对其分化的适当诱导分化成几乎所有的器官，其中保留其活性***的能力，同时维持其多能性。具体说来，iPS细胞可从自我衍生的体细胞建立，且因此与通过破坏胚胎产生的ES细胞相比不可能带来伦理和社会问题。此外，作为自我衍生细胞的iPS细胞使得可能避免排斥反应，这是再生医学或移植疗法的最大障碍。

gRNA表达盒可通过本领域中已知的方法递送给受试者。在某些方面，，Cas可以是其中包含Cas分子的活性结构域的片段，从而缩小分子的尺寸。因此，Cas9/gRNA分子可在临床上使用，类似于当前基因疗法所获得的手段。具体来说，用于细胞移植疗法以及多瘤病毒疫苗接种的Cas9/多重gRNA稳定表达干细胞或iPS细胞将发展以供受试者之用。

根据已建立的方法制备用于再输注的经转导细胞。在约2-4周的一段培养期之后，细胞数量可在1×10⁶与1×10¹⁰之间。就此而言，细胞的生长特点在患者与患者之间并且在细胞类型与细胞类型之间有差异。在转导细胞再输注之前约72小时，采集等分试样用于表达治疗剂的细胞的表型和百分比的分析。当应用于患者总的和整体的健康状况时，为了施用，本发明的细胞可以以一定的速率来施用，该速率由细胞类型的LD₅₀和在各种浓度下细胞类型的副作用所决定。施用可经由单次或分次剂量完成。还可以使用刺激组织或间隙内生成并排出成人干细胞的外源施用因子来动员成人干细胞，所述组织或间隙可包括但不限于骨髓或脂肪组织。

制造物品

本文所述的组合物在合适的容器中包装，所述容器经标记以例如用作治疗患有逆转录病毒感染例如JCV感染的受试者或处于JCV感染风险中的受试者的疗法。该容器可包含组合物，所述组合物包含编码CRISPR相关核酸内切酶例如Cas9核酸内切酶和与JCV中的靶序列互补的指导RNA；或编码那个核酸的载体；以及合适的稳定剂、载体分子、调味剂和/或类似物的一种或多种，根据预期用途适当使用。因此，包含至少一种本发明的组合物，例如编码CRISPR相关核酸内切酶例如Cas9核酸内切酶的核酸序列和与JCV中的靶序列互补的指导RNA、或编码那个核酸的载体以及使用说明书的包装产品(例如含有一种或多种本文所述并经包装供在浓缩或即用浓度下储存、运输或销售之用的组合物的无菌容器)和试剂盒也在本发明的范围内。产品可包括容器(例如小瓶、罐、瓶、袋等等)，所述容器含有一种或多种本发明组合物。另外，制造物品可进一步包括例如包装材料、使用说明书、注射器、递送装置、缓冲剂或用于治疗或监测需要预防或治疗的病状的其他对照试剂。

在一些实施方案中，所述试剂盒可包括一种或多种另外的如上所述的治疗剂。另外的试剂可一起包装在与编码CRISPR相关核酸内切酶例如Cas9核酸内切酶的核酸序列和与JC病毒中的靶序列互补的指导RNA或编码那个核酸的载体同一个容器中，或者这些试剂可单独包装。编码CRISPR相关核酸内切酶例如Cas9核酸内切酶的核酸序列和与JC病毒中的靶序列互补的指导RNA或编码那个核酸的载体与所述另外的试剂可在临使用之前合并或单独施用。

产品还可以包括说明(例如印刷的标签或***物或描述产品使用的其他媒介(例如音频或录像带))。所述说明可以与容器相连(例如粘贴在容器上)并且可以描述其中组合物应当施用的方式(例如施用的频率和途径)、其适应症和其他用途。组合物可以即时施用(例如以剂量适当单位存在)，并且可包含一种或多种另外的药学上可接受的佐剂、载体或其它稀释剂和/或另外的治疗剂。或者，组合物可以以浓缩形式提供，及用于稀释的稀释剂和说明。

实施例

实施例1：材料和方法

使用CRISPR/Cas9技术检测Cas9和gRNA对靶向T-抗原的影响及其功能。用于CRISPR/Cas9靶向JCV的指导RNA的设计如图1A和1B所示。

细胞培养。人类少突胶质细胞瘤细胞系TC620(Wollebo等，2011)和SVG-A，所述SVG-A是源自由表达SV40 T-Ag的原始缺陷型SV40转化的原代人胎儿神经胶质细胞的细胞系(Major等，1985)，将TC620和SVG-A保持在补充有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco'sModified Eagle's Medium(DMEM)中，如前所述(Wollebo等，2011)。HJC-2是表达JCV T-Ag的JCV诱导的仓鼠胶质母细胞瘤细胞系(Raj等，1995)。BsB8是源自在表达JCV早期蛋白T-Ag的转基因小鼠中产生的小脑神经外胚层源的肿瘤的小鼠细胞系(Krynska等，2000)。通过用pX260衍生的质粒(如下所述)转染SVG-A细胞、在含嘌呤霉素的培养基中进行筛选并通过稀释克隆分离单个克隆来开发表达Cas9和JCV T抗原gRNA的SVG-A细胞的衍生物。

质粒制剂。含有人Cas9和gRNA表达盒、pX260和pX330(Addgene)的载体被用于产生各种构建体。两个载体都含有由CAG启动子驱动的人源化Cas9编码序列和由人U6启动子驱动的gRNA表达盒(Cong等，2013)。将载体用Bbsl消化并用南极磷酸酶(AntarcticPhosphatase)处理。将每个靶位点的一对寡核苷酸退火、磷酸化并连接到线性化载体上。该寡核苷酸如图5(SEQ ID NO：19-30)所示。将gRNA表达盒在GENEWIZ中用U6测序引物测序。对于pX330载体，设计了一对具有悬垂消化位点的通用PCR引物，其可以挑出gRNA表达盒(U6-gRNA-crRNA-stem-tracrRNA)用于直接转染或亚克隆至其他载体。

报道构建体JCV_L-LUC(Wollebo等，2011)和pcDNA 3.1-大T-Ag表达质粒已于先前描述(Chang等，1996)。对于慢病毒生产，以下质粒获自Addgene：pCW-Cas9(#50661)、psPAX2(#12260)、pCMV-VSV-G(#8454)、pKLV-U6gRNA(Bbs1)-PGKpuro2ABFP(#50946)、pMDLg/pRRE(#12251)、pRSV-Rev(#12253)。为了构建三个靶中的每一个的gRNA慢病毒表达质粒，通过用侧翼引物(5'-tatgggcccacgcgtgagggcctatttcccatgattcc-3'(SEQ ID NO：42)和5'-tgtggatcctcgaggcgggccatttaccgtaagttatg-3'(SEQ ID NO：43))PCR扩增来自如上所述的三个pX330gRNA质粒的每一个的U6表达盒，并且PCR产物用Mlul和BamHI处理并克隆到已用Mlul和BamHI切割的pKLV-U6gRNA(Bbsl)-PGKpuro2ABFP中。pCR 4-TOPO TA载体来自LifeTechnologies,Inc.,Carlsbad,CA。

瞬时转染和报道分析。JCV_L-LUC报道质粒和T-Ag表达质粒的共转染如先前所述(Wollebo等，2011；Wollebo等，2012)进行。简单地，TC620细胞或单独用报道构建体(200ng)或用多种表达载体的组合转染48小时，然后收获。用空载体DNA标准化转染的DNA的总量。荧光素酶测定如先前所述(Wollebo等，2011；Wollebo等，2012)进行。

表达Cas9和gRNA的SVG-A的克隆衍生物的生产。SVG-A细胞用表达前述三种gRNA的每一种的pX260或pX260衍生质粒转染。用3μg/ml嘌呤霉素进行筛选并通过稀释克隆进行克隆分离。

JCV感染的测定。如上所述，用SVG-A细胞或表达Cas9和gRNA的SVG-A的SVG-A克隆衍生物进行感染实验。以1MOI的Mad-1JCV感染细胞，如先前所述(Radhakrishnan等，2003；Radhakrishnan等，2004)，并且7天后连同未感染的对照培养物一起收获并分析。通过蛋白质印迹(WB)测定全细胞蛋白提取物中病毒蛋白VP1和Agno蛋白的表达。同时，还收集细胞的生长培养基以通过Q-PCR测量病毒载量。

免疫细胞化学。TC620细胞用FLAG标记的Cas9的表达质粒转染，并用小鼠抗-FlagM2单抗(1:500，Sigma)进行免疫细胞化学，如先前所述(Hu等，2014)。

通过PCR分析T-Ag基因切割。如上所述，用表达gRNA的质粒pX260或pX260衍生的质粒转染BsB8或HJC-2细胞。48小时后提取总基因组DNA。使用侧翼于JCV T-Ag编码区(5'-gcttatgccatgccctgaaggt-3'(SEQ ID NO:44)和5'-atggacaaagtgctgaataggga-3'(SEQ IDNO:45))的引物通过PCR扩增T-Ag基因，并且对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

用于Cas9的慢病毒载体的生产和表达诱导型Cas9的HJC-2细胞的创建。为了产生用于转导多西环素诱导型Cas9表达的慢病毒载体，293T细胞用质粒pCW-Cas9、psPAX2和pCMV-VSV-Gusing通过磷酸钙沉淀法(Graham和van der Eb，1973)进行转染。48小时后从上清液中收获慢病毒，通过离心清除并过0.45μm滤器，如先前所述(Wollebo等，2013)。为了获得稳定转导的可诱导表达Cas9的HJC-2克隆细胞衍生物，在6μg/ml聚凝胺存在下将慢病毒加入到HJC-2细胞中，随后用3μg/ml嘌呤霉素进行选择并通过稀释克隆进行克隆分离。向培养基中加入2μg/ml多西环素用于在所得的克隆中诱导Cas9表达。

用于gRNA的慢病毒载体的生产和表达诱导型Cas9的HJC-2细胞的转导。为了产生用于转导三种gRNA的慢病毒载体，将如上所述由pKLV-U6gRNA(Bbsl)-PGKpuro2ABFP构建的三种gRNA慢病毒表达质粒衍生物中的每一种通过氯化钙沉淀连同包装质粒pCMV-VSV-G、pDLg/pRRE和pRSV-Rev一起转染至293T细胞中。48小时后从上清液中收获慢病毒，通过离心清除，过0.45μm滤器，并在6μg/ml聚凝胺存在下将慢病毒加入HJC-2细胞中，然后进行选择。24小时后，用2μg/ml多西环素处理转导的细胞以诱导Cas9表达，再过48小时后收获并通过PCR/测序分析T-Ag突变，通过蛋白质印迹(WB)分析T-Ag表达，并通过集落形成测定细胞克隆形成。

InDel突变分析。由于Cas9的DNA切割留下了特征性的短***/缺失(InDel)突变，因此对于InDel突变，分析了来自gRNA转导的HJC-2细胞的T-Ag基因的序列。根据制造商的说明书(5prime Inc.，Gaithersburg MD)，使用基因组DNA纯化试剂盒从细胞中分离总基因组D A，并且使用侧翼引物通过PCR扩增已经被靶向的T-Ag基因的区域。对于TM1和TM 2，使用了如下的引物：

5'-ctctggtcatgtggatgctgt-3'(SEQ ID NO:46)和

5'-atggacaaagtgctgaataggga-3'(SEQ ID NO:47)。对于TM3，使用了引物5'-gcttatgccatgccctgaaggt-3'(SEQ ID NO:48)和

5'-acagcatccacatgaccagag-3'(SEQ ID NO:49)。将PCR产物克隆到TA克隆载体pCR4-TOPO中并进行克隆测序。

SURVEYOR测定。根据制造商的方案，使用SURVEYOR突变检测试剂盒(Transgenomic)检查源自表达Cas9的HJC-2细胞并由用于gRNA的慢病毒载体转导的PCR产物中的突变的存在。使用与用于InDel突变分析所述的相同引物。将异质PCR产物在95℃下变性10min，然后使用热循环仪通过逐步冷却进行杂交。在42℃下，将300ng杂交DNA(9μl)在0.25μl SURVEYOR增强子S和15mM MgCl₂存在下用0.25μl SURVEYOR核酸酶消化4h，该酶是用于扫描异源双链DNA中的突变的错配特异性DNA核酸内切酶。加入终止溶液，并将样品在2％琼脂糖凝胶上连同等量的对照样品一起分解。对照样本平行处理，但是源自表达Cas9的HJC-2细胞却不被用于gRNA的慢病毒载体转导。SURVEYOR测定也用于检测使用表达Cas9和gRNA的SVG-A细胞系的稳定衍生物的细胞基因上的脱靶突变的存在。

集落形成测定。表达诱导型Cas9的HJC-2细胞用三个靶中的每一个用于gRNA的慢病毒表达载体的单个或组合转导。在存在或不存在多西环素的情况下，将细胞铺板用于集落形成测定。细胞生长10-14天，用PBS洗涤，固定并用40％甲醇和0.4％亚甲基蓝染色。超过50个细胞的克隆则被计数。

实施例2：靶向T-Ag的gRNA的表达降低了T-Ag和Cas9转染的TC620细胞中T-Ag的表达和T-Ag刺激的JCV晚期基因的表达

在第一组实验中，确定了Cas9与靶向TM1、TM2和TM3的多种gRNA的结合是否可以抑制人类少突胶质细胞系TC620中T-抗原的表达。在这些实验中，gRNA m1与TM1靶序列SEQ IDNO:1互补；gRNA m2与TM2靶序列SEQ ID NO:5互补；以及gRNA m3与TM3靶序列SEQ ID NO:9互补。

来自单独用表达T-抗原的质粒或用与Cas9的组合，和/或与靶向gRNA的T-Ag表达质粒的组合转染TC620细胞的蛋白印迹分析结果示于图2A中。如图所示，Cas9连同ml或m2gRNA的存在显著地降低了转染的细胞中T-Ag生产水平。然而，gRNA m3的表达对T-Ag表达水平没有显著影响。图2B显示了基于对应于T-抗原的条带的强度的T-抗原生产量化的结果，其被归一化为持家基因β-微管蛋白。

接着，进行功能研究，以评估T-Ag刺激JCV晚期启动子活性的能力(Lashgari等，1989)。TC620细胞在这项研究中尤为合适，因为它们的少突胶质细胞源允许JCV启动子在基础水平上的细胞类型特异性转录，该启动子一经T-Ag表达便被诱导。来自使用JCV晚期启动子JCV_L驱动报道荧光素酶基因的转录研究结果表明，由T-Ag激活的JCV_L启动子的水平在表达Cas9/gRNAml或Cas9/gRNA m2而不是Cas9/gRNA m3(图2C)的细胞中显著地降低了。综合起来，这些观察结果表明，单独或组合的gRNA m1和m2，当连同Cas9一起表达时，降低了T-Ag表达并且随后抑制了T-Ag刺激的与病毒裂解性感染相关的事件。这些作用的结果是宿主细胞中JCV的消除。

实施例3：表达Cas9和靶向T-Ag的gRNA的SVGA的克隆衍生物降低了支持JCV感染的能力

为了研究gRNA指导的Cas9对JCV感染的影响，用SVG-A细胞系进行实验。该系支持病毒基因表达，并且还允许完整的生产性病毒溶解感染。首先，从表达Cas9或Cas9+gRNA ml的SVG-A细胞建立稳定的克隆细胞系。在这些实验中，gRNA ml与TM 1靶序列SEQ ID NO:1互补。选择三个独立的克隆，并在MOI＝1.0的情况下用于JCV感染7天。通过蛋白质印迹分析评估病毒感染是否存在病毒衣壳蛋白、VP1和辅助蛋白、Agno蛋白，以α-微管蛋白作为加载对照。同时进行定量PCR(Q-PCR)，以确定培养基中病毒DNA的水平，作为DNA复制的标志物并因此作为病毒生产的标志物。如图3A所示，仅表达Cas9(泳道3)的克隆细胞系支持了JCV感染，如由这些细胞中病毒衣壳蛋白、VP1和辅助Agno蛋白(泳道2)的存在如证明。相反，同时表达Cas9+gRNA ml的SVG-A克隆未能支持病毒复制。该发现是由Q-PCR实验以衡量培养上清液中的病毒所支持(图3B)。最初同时用Cas9和gRNA ml转染的一些克隆细胞能够支持JCV复制，表明这些细胞或丢失Cas9表达和/或gRNA ml生产(数据未显示)。为了确定JCV感染是否影响Cas9表达，通过蛋白质印迹(WB)证实了SVG-A Cas9和SVG-A Cas9mlc8细胞中的Cas9表达(图3C)，并且通过免疫细胞化学显示了FLAG标记的Cas9定位于细胞核(图3D)。

结果表明Cas9和至少一个靶向JCV T-Ag基因的gRNA的稳定表达使得细胞难以被JCV感染。

实施例4：Cas9和JCV T-Ag靶向gRNA的瞬时转染后T-Ag基因裂解的直接证明

接下来测定Cas9和gRNA编辑对应于T-Ag基因的JCV DNA序列的能力。对于这些实验，使用BsB8细胞。BsB8是一种鼠细胞系，其含有JCV早期区域作为并入的转基因，并且该早期区域表达T-Ag(Krynska等，2000)。还采用另一种细胞系HJC-2，一种来自通过脑内注射JCV诱导的胶质母细胞瘤的有限稀释所分离的仓鼠细胞系(Raj等，1995)。这些细胞也携带整合到宿主基因组中的JCV早期基因，并表达T-Ag。选择这些细胞系用于实验，因为它们的JCV基因组的整合拷贝允许靶向JCV序列的Cas9/gRNA的编辑能力的精确测量。用Cas9和各种组合的gRNA表达质粒转染细胞，并使用JCV特异性引物扩增基因组DNA。图4A示出了编辑之后对应于T-Ag基因的切割点的位置和所得DNA片段的预期长度。

如图4B所示，用Cas9和gRNA ml和m3(泳道1)；ml、m2和m3(泳道2)；和m2和m3(泳道3)的表达质粒转染BsB8细胞，除了预期的完整1465碱基对序列(泳道4)之外，还造成较小片段的出现。如图4C所示，用Cas 9和gRNA ml和m2，或ml、m2和m3的表达质粒转染HJC-2细胞也造成切割产物的出现。图4B和4C显示了当使用gRNA ml和m3的组合来指导DNA切割时，出现了327bp的较小片段而不是预期的完整1465bp序列。进一步的分析表明，一旦靶序列ml和m3靶位点之间的DNA片段被切除，327bp片段就对应于剩余DNA序列(107+220)的重新连接。当多个m2和m3组合使用时，观察到类似的事件，导致824bp DNA的产生(604+220)。这些结果表明病毒基因组内两个gRNA靶向区域的切割，剩余的基因序列通过非同源末端连接(NHEJ)重新连接。

结果表明，当根据本发明的单独和组合的gRNA与Cas9组合表达时，诱导JCV DNA中的切割和大的缺失。这种DNA损伤可以破坏JCV T-Ag基因的完整性，并造成宿主细胞中病毒的消除。

实施例5：Cas9/gRNA***组分的稳定的、药物诱导型表达提供宿主细胞中T-Ag表达的药物诱导型消融

为了确定JCV是否可以在宿主细胞中药物诱导型地灭活，HJC-2细胞用编码Cas 9的多西环素诱导型慢病毒载体转导。建立稳定的衍生物。然后衍生的细胞用慢病毒载体转导，该慢性病毒载体编码对在JCV T-Ag的编码区中的靶位点特异性的gRNA。gRNA包括ml、m2和m3(其间隔序列分别与SEQ ID NO:1、5和9互补)。在强力霉素诱导后，提取总基因组DNA。通过PCR扩增T-Ag区域，克隆入TA载体并测序。

Surveyor测定用于检测PCR产物中的InDel突变(图6B)。ml、m2和m3gRNA都产生InDel突变，如由Surveyor核酸酶切割产物的存在所证明(图6B)。

48h后，通过对从PCR扩增产物得到的克隆进行测序，在从这些培养物中提取的基因组DNA的T-Ag基因的相应区域中检测到InDel突变。代表性的序列包括缺失或***，示于图6A(SEQ ID NO：31-34、35-36和39-41)。结果表明，大多数InDel接近PAM区域，并且由一个或两个核苷酸的***或缺失组成。这将被预测会导致影响T-Ag翻译的移码突变。如预期的那样，通过蛋白质印迹(WB)确定，当用多西环素诱导Cas9表达时，三种gRNA中的每一种都消融T-Ag表达(图7A)。图7B示出了蛋白质印迹(WB)结果的光密度定量分析。

还研究了Cas9和各种组合的gRNA ml、m2和m3的表达对HJC-2细胞克隆形成的影响。这些细胞中的克隆形成是依赖于T-Ag的表达的表型。gRNA ml、m2和m3(分别与SEQ IDNO:1、5和9互补)以各种组合表达。如图8所示，由多西环素诱导的Cas9表达连同gRNA严重地减少了由这些细胞形成的菌落数(图8A-8D)，表明细胞中T-Ag被Cas9和gRNA抑制。gRNA ml+m2、ml+m3、m2+m3和ml+m2+m3的组合都减少了菌落数。图8E示出了典型的集落形成测定结果。

为了评估在细胞基因组中发生的任何可能的脱靶事件，通过SURVEYOR测定脱靶基因中的InDel突变分析了稳定的Cas9和gRNA表达SVG-A细胞。通过在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的BLAST搜索，鉴定了与三个基序中的每一个具有最高同源性的人类细胞基因。对于每个基序，从具有最高同源性的前三个基因扩增PCR产物，并使用如实施例1中所述的SURVEYOR测定检查InDel突变。基序1gRNA的分析结果如图9A所示。基序2的分析结果如图9B所示。基序3的分析结果如图9C所示。在每个实验中，T-Ag的扩增用作阳性对照。由SURVEYOR核酸酶裂解产生的附加条带用星号表示。在所有情况下，没有检测到脱靶基因的切割，表明CRISPR/Cas9的特异性。

在本实施例中公开的结果表明，根据本发明的诱导型CRISPR***可引起JCV T-Ag的药物诱导型消融并减轻JCV感染的影响，而不会对类似的正常基因造成有害的脱靶效应。总之，所有前述实施例的结果表明，根据本发明的CRISPR***对消除PML患者中的活跃复制JCV有用，从JCV的无症状宿主中除去潜在JCV，并且防止处于JCV风险中的未感染个体获得病毒。

本发明已经以说明性方式描述，并且应当理解，已经使用的术语意指说明性而不是限制性的词语。显然，根据上述教导，本发明的许多修改和变化是可能的。因此，应当理解，在所附权利要求范围内，本发明可以以不同于具体描述的方式实施。

序列表

<110> 英联邦高等教育***天普大学

<120> RNA指导的人类JC病毒和其他多瘤病毒的根除

<130> 0392-07

<160> 49

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 1

aaatgcaaag aactccaccc tgatgaaggt g 31

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 2

aaatgcaaag aactccaccc tgatgaaggt gggg 34

<210> 3

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<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 3

cacctttatc agggtggagt tctttgcatt t 31

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 4

ccccaccttt atcagggtgg agttctttgc attt 34

<210> 5

<211> 40

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gatgaatggg aatcctggtg gaatacattt aatgagaagt 40

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 6

gatgaatggg aatcctggtg gaatacattt aatgagaagt ggg 43

<210> 7

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<212> DNA

<213> JC Virus

<400> 7

acttctcatt aaatgtattc caccaggatt cccattcatc 40

<210> 8

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<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 8

cccacttctc attaaatgta ttccaccagg attcccattc atc 43

<210> 9

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<212> DNA

<213> JC 病毒

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aaggtactgg ctattcaagg ggccaataga cag 33

<210> 10

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<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 10

aaggtactgg ctattcaagg ggccaataga cagtgg 36

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 11

ctgtctattg gccccttgaa tagccagtac ctt 33

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 12

ccactgtcta ttggcccctt gaatagccag tacctt 36

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 13

cttgtcttcg tccccacctt tatcagggtg gagttctttg cattttttca 50

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 14

tgaaaaaatg caaagaactc caccctgatg aaggtgggga cgaagacaag 50

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 15

ttcatcccac ttctcattaa atgtattcca ccaggattcc cattcatctg 50

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 16

cagatgaatg ggaatcctgg tggaatacat ttaatgagaa gtgggatgaa 50

<210> 17

<211> 50

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 17

tttgccactg tctattggcc ccttgaatag ccagtacctt ttttttggaa 50

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 18

ttccaaaaaa aaggtactgg ctattcaagg ggccaataga cagtggcaaa 50

<210> 19

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TM1 正向引物 px260

<400> 19

aaacaaatgc aaagaactcc accctgataa aggtggt 37

<210> 20

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TM1 反向引物 px260

<400> 20

taaaaccacc tttatcaggg tggagttctt tgcattt 37

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TM2 正向引物 px260

<400> 21

aaacgatgaa tgggaatcct ggtggaatac atttaatgag aagtgt 46

<210> 22

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TM2 反向引物 px260

<400> 22

taaaactctt ctcattaaat gtattccacc aggattccca ttcatc 46

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TM2 正向引物 px260

<400> 23

aaacaaaggt actggctatt caaggggcca atagacaggt 40

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TM3 反向引物 px260

<400> 24

taaaacctgt catttggccc cttgaatagc cagtaccttt 40

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TM1 正向引物 px330

<400> 25

caccgcacca ccctgataaa ggtg 24

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TM1 反向引物 px330

<400> 26

aaaccacctt tatcagggtg gtgc 24

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TM2 正向引物 px330

<400> 27

caccgaatac atttaatgag aagt 24

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TM2 反向引物 px330

<400> 28

aaacacttct cattaaatgt attc 24

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TM3 正向引物 px330

<400> 29

caccgtcaag gggccaatag acag 24

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TM3 反向引物 px330

<400> 30

aaacctgtct attggcccct tgac 24

<210> 31

<211> 51

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 31

cttgtcttcg tccccaccct ttatcagggt ggagttcttt gcattttttc a 51

<210> 32

<211> 51

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 32

cttgtcttcg tccccaccct ttatcagggt ggagttcttt gcattttttc a 51

<210> 33

<211> 51

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 33

cttgtgttcg tccccaccct ttatcagggt ggagttcttt gcattttttc a 51

<210> 34

<211> 48

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 34

cttgtcttcg tccccattta tcagggtgga gttctttgca ttttttca 48

<210> 35

<211> 49

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 35

ttcatcccac tctcattaaa tgtattccac caggattccc attcatctg 49

<210> 36

<211> 48

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 36

ttcatcccat ctcattaaat gtattccacc aggattccca ttcatctg 48

<210> 37

<211> 49

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 37

ttcatcccac tctcattaaa tgtattccac caggattccc attcatctg 49

<210> 38

<211> 49

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 38

ttcatcccac tctcattaaa tgtattccac caggattccc attcatctg 49

<210> 39

<211> 48

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 39

tttgccactg tattggcccc ttgaatagcc agtacctttt ttttggaa 48

<210> 40

<211> 49

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 40

tttgccactg ttattggccc cttgaatagc cagtaccttt tttttggaa 49

<210> 41

<211> 51

<212> DNA

<213> JC 病毒

<400> 41

tttgccactg gtctattggc cccttgaata gccagtacct tttttttgga a 51

<210> 42

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

tatgggccca cgcgtgaggg cctatttccc atgattcc 38

<210> 43

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

tgtggatcct cgaggcgggc catttaccgt aagttatg 38

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

gcttatgcca tgccctgaag gt 22

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

atggacaaag tgctgaatag gga 23

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

ctctggtcat gtggatgctg t 21

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

atggacaaag tgctgaatag gga 23

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

gcttatgcca tgccctgaag gt 22

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

acagcatcca catgaccaga g 21

Claims

1.一种用于从感染JCV的宿主细胞中消除约翰·坎宁安病毒(JCV)的组合物，所述组合物包含：

至少一个编码规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)相关核酸内切酶的分离的核酸序列，和

至少一个靶向JCV DNA的大T-抗原(T-Ag)编码区的指导RNA(gRNA)。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一个靶向JCV DNA的所述大T-抗原(T-Ag)编码区的gRNA包含靶向SEQ ID NO:13-18中的任何一个序列。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述CRISPR相关核酸内切酶选自野生型Cas9、人优化Cas9或切口酶突变体Cas9。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述CRISPR相关核酸内切酶是Cpf1。

5.一种用于从感染JCV的宿主细胞中消除约翰·坎宁安病毒(JCV)的载体组合物，包含：

至少一个靶向JCV DNA的大T-抗原(T-Ag)编码区的gRNA，

至少一个表达载体中包含所述至少一个gRNA和至少一个分离的核酸序列；

其中所述至少一个表达载体在宿主细胞中诱导所述CRISPR相关核酸内切酶和所述至少一个gRNA的表达。

6.根据权利要求5所述的载体组合物，其中所述至少一个靶向JCV DNA的所述大T-抗原(T-Ag)编码区的gRNA包含SEQ ID NO:13-18中的任何一个序列。

7.根据权利要求5所述的载体组合物，其中所述CRISPR相关核酸内切酶选自野生型Cas9、人优化Cas9或切口酶突变体Cas9。

8.根据权利要求5所述的组合物，其中所述CRISPR相关核酸内切酶Cas9是Cpf1。

9.根据权利要求5所述的组合物，其中所述表达载体选自所述组，该组由慢病毒表达载体、药物诱导型慢病毒表达载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体和质粒载体组成。

10.根据权利要求5所述的表达载体组合物，其中所述CRISPR相关核酸内切酶和所述至少一个gRNA并入到单个表达载体中。

11.根据权利要求5所述的表达载体组合物，其中所述CRISPR相关核酸内切酶和所述至少一个gRNA并入到单独的慢病毒表达载体中。

12.一种药物组合物，包含：

至少一个分离的核酸序列，其编码至少一个靶向具有与约翰·坎宁安病毒(JCV)基因组中的大T-抗原(T-Ag)编码区的指导RNA(gRNA)；

至少一个表达载体中包含所述分离的核酸序列。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述至少一个靶向约翰·坎宁安病毒(JCV)基因组中的所述大T-抗原(T-Ag)编码区的gRNA包含SEQ ID NO:13-18中的任何一个序列。

14.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述CRISPR相关核酸内切酶选自野生型Cas9、人优化Cas9或切口酶突变体Cas9。

15.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述CRISPR相关核酸内切酶Cas9是Cpf1。

16.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述表达载体选自所述组，该组由慢病毒表达载体、药物诱导型慢病毒表达载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体和质粒载体组成。

17.一种用于治疗或预防约翰·坎宁安病毒(JCV)感染的试剂盒，包括：实测数量的组合物，所述组合物包含至少一个编码规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)相关核酸内切酶的分离的核酸序列和至少一个编码至少一个或多个指导RNA(gRNA)的核酸序列，其中所述一个或多个gRNA靶向具有与约翰·坎宁安病毒(JCV)基因组中的大T-抗原(T-Ag)编码区；和

一个或多个选自以下组合的项目：包装材料，包括使用说明书的包装插页，无菌流体，注射器和无菌容器。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述表达载体是慢病毒表达载体。