CN107405318A - 用于治疗与nadph氧化酶相关的病况的化合物 - Google Patents

Abstract

一种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶相关的病况或病症。

Description

用于治疗与NADPH氧化酶相关的病况的化合物

发明领域

本发明涉及用于治疗与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Nox)相关的病况或病症的磺酰胺衍生物。更特别地，本发明涉及作为Nox抑制剂用于治疗由Nox活性升高导致或驱动的各种疾病的磺酰胺衍生物。特别地，本发明涉及对Nox4具有选择性的磺酰胺衍生物，其用于治疗与Nox4相关的病症。

发明背景

氧化应激的定义是活性氧生成和清除之间的体内失衡。细胞或组织中的正常氧化还原态变化可产生有害自由基，这些自由基可伤害细胞机构的成分，包括DNA、蛋白和脂质。如果化学改变细胞成分导致基因变化，一般认为这促进形成癌症或其它严重疾病。

氧自由基源 - 已确定可潜在引起氧化应激的很多体内氧自由基(O₂ ^-、H₂O₂和OH^-)的发生剂：线粒体中的复合体I和III、和NAD(P)H氧化酶、黄嘌呤氧化酶、细胞色素P450、金属离子(钴、钒、铬、铜和铁)和可氧化还原循环的一些有机化合物。

一般抗氧化剂 - 也有很多内源细胞抗氧化剂，例如过氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物氧化还原蛋白(peroxiredoxin)和硫氧化还原蛋白。也将食物提供的维生素认为是保护有机体不受有害氧自由基侵害的重要部分，在很多食物源中存在的重要抗氧化剂的最近发现已增大了抗氧化剂库。

抗氧化剂作为治疗剂 - 很清楚，一些抗氧化剂可有助于预防疾病和促进健康。不太清楚的是能够使用哪种类型的抗氧化剂。天然食物中存在的很多抗氧化剂为氧化还原活性的。如果这些类型的氧化还原活性物质分离并作为补充药物提供—这可能最终更有害，而不是有益。临床试验已显示，非定向应用广泛清除氧自由基的抗氧化剂，不仅低效，而且可能更有害。这在用六十七个随机试验进行的研究中说明，其中232,550个参与者包括健康的人和有不同疾病的患者(Bjelakovic G, Nikolova D, Simonetti RG, Gluud C.Cochrane Database Syst Rev. 2008 Jul 16; (3):CD004183. Epub 2008 Jul 16)。

因此，具有氧化还原活性的一般抗氧化剂可通过介导有害氧化还原循环实际增加细胞损伤。其它一般抗氧化剂会有害地阻断保持身体功能所必需的正常细胞体内活性。

活性氧的来源和作用 - 越来越清楚，在很多病理病况中，例如炎症、2型糖尿病、糖尿病并发症、***、中风、有害神经病况和癌症，导致活性氧过量产生和积累的不是一般渗漏氧自由基，例如线粒体中的复合体I或III，而是氧自由基的上调的强有力生产者，即，正常细胞信号转导***的部分。因此，氧化应激的定义不一定是将不可逆改变DNA、蛋白或脂质的氧自由基，而应是渐增干扰(如果上调的)“正常”信号转导，在细胞水平产生不平衡，最终可改变其它组织和全身功能。其一般实例是与以下疾病相关的代谢综合征：血管疾病、2型糖尿病、中风、肾病、神经病、心力衰竭和有胰岛素抵抗作为起始因子的中风(Reaven, “Role of insulin resistance in human disease”(胰岛素抵抗在人疾病中的作用), Diabetes 37(12), 1988)。胰岛素抵抗本身也是正常身体功能的部分，作为将能量储存选择性引导到适合接收器官的工具。然而，在代谢变化发生时，例如在摄食过度或其它失调中，例如在ob/ob-小鼠中有过量生长激素产生或功能障碍瘦蛋白的肢端巨大症，这会诱导伴有不受控制的胰岛素抵抗的有害病况，这可导致与代谢综合征相关的器官衰竭。不受控制的胰岛素抵抗的共同特点是过度产生局部和***性氧自由基(Houstis et al.,Nature 440, 2006; Katakam et al., J cereb blood Flow Metab, 2012 Jan 11)。

这种过度产生的最感兴趣的候选者之一是跨膜蛋白(酶)家族，也称为NAD(P)H氧化酶(Nox)。有确定的Nox的七个家族成员(Nox 1-5和Duox 1-2)，它们常常被识别为活性氧的主要或关键源，并且也在很多细胞事件中作为正常细胞信号转导***的部分起主要作用，包括增殖(Brar et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 282, 2002)、生长(Brar et al., Am J Physiol Cell Physiol, 282, 2002)、纤维变性(Grewal et al.,Am J Physiol, 276, 1999)、迁移(Sundaresan et al., Science, 270, 1995)、细胞凋亡(Lundqvist-Gustafsson et al., J Leukoc Biol, 65, 1999)、分化(Steinbeck et al.,J Cell Physiol, 176, 1998)、细胞骨架重排(Wu et al., J Virol, 78, 2004)和收缩(Rueckschloss et al., Exp Gerontol, 45, 2010)。

NADPH氧化酶和疾病 - 已识别具有减小的NADPH氧化酶活性的一些遗传病况– 缺损Nox2减小杀死和消除微生物侵害的免疫应答(慢性肉芽肿性疾病) – 内耳中缺损Nox3导致缺陷重力感受，且在甲状腺中具有不足酶活性的双NAD(P)H氧化酶Duox2引起甲状腺功能减退。

然而，有非常多也似乎以指数方式增加的出版物作为证明，强有力证明了增加的Nox活性是一些疾病的部分或甚至成因(Lambeth JD, Review Article “Nox enzymes, ROS, and chronic disease:An example of antagonistic pleiotrpy”(Nox酶、ROS和慢 性疾病：拮抗性多效性的实例), Free Radical Biology & Medicine 43, 2007;Takac Iet al., “The Nox Family of NADPH Oxidases:Friend or Foe of the Vascular System”(Nox家族NADPH氧化酶：血管***的友还是敌), Curr Hypertens Rep.2011 Nov10; Montezano AC, “Novel Nox homologues in the vasculature:focusing on Nox4 and Nox5”(血管***中的新Nox同源物：聚焦Nox4和Nox5), Clin Sci London 2011;Bedard K et al., “The Nox family of ROS-generating NADPH oxidases:physiology and pathophysiology”(Nox家族ROS-产生NADPH氧化酶：生理学和病理生理学) PhysiolRev. 2007; Camici M et al., “Obesity-related glomerulopathy and podocyte injury:a mini review”(肥胖症相关的肾小球病和足状突细胞损伤：微评), FrontBiosci 2012; Nabeebaccus A et al., “NADPH oxidases and cardiac remodeling” (NADPH氧化酶和心脏重塑) Heart Fai Rev. 2011; Kuroda J et al., “NADPH oxidase and cardiac failure”(NADPH氧化酶和心力衰竭) J Cardiovasc Transl Res. 2010;Kuroda J et al., “NADPH oxidase 4 is a major source of oxidative stress in the failing heart”(NADPH氧化酶4是衰竭心脏中氧化应激的主要来源) Proc Natl AcadSci USA 2010; Maejima Y et al., “Regulation of myocardial growth and death by NADPH oxidase”(由NADPH氧化酶调节心肌生长和死亡) J Mol Cell Cardiol.2011;Barnes JL et al., “Myofibroblst differentiation during fibrosis:role of NAD (P)H oxidases”(纤维变性期间的肌成纤维细胞分化:NAD(P)H氧化酶的作用) Kidneyinternational, 2011; Alison Cave “Selective targeting of NADPH oxidase for cardiovascular protection”(NADPH氧化酶对心血管保护的选择靶向) Current Opinionin Pharmacology 2009; Albert van der Vliet “Nox enzymes in allergic airway inflammation”(过敏性呼吸道炎症中的Nox酶) Biochimica et Biophysica Acta 1810,2011; Pendyala S et al., “Redox regulation of Nox proteins”(Nox蛋白质的氧化还 原调节) Respiratory Physiology & Neurobiology 174, 2010; Nair D et al.,“Intermittent Hypoxia-Induced Cognitive Deficits Are Mediated by NADPH oxidase Activity in a Murine Model of Sleep Apnea”(在睡眠窒息鼠模型中由NADPH 氧化酶活性介导间歇低氧诱导的认知缺陷) PLoS ONE, vol. 6, Issue 5, 2011年5月;Chia-Hung Hsieh et al., “NADPH oxidase Subunit 4-Mediated Reactive Oxygen species Contribute to Cycling Hypoxia-Promoted Tumor Progression in Glioblastoma Multiforme”(NADPH氧化酶亚基4-介导的活性氧物质促成多形性胶质母细 胞瘤的循环缺氧促进的肿瘤进程) PloS ONE, vol 6, issue 9, 2011年9月; Sedeek Met al., “Molecular mechanisms of hypertension:role of nox family NADPH oxidase”(高血压的分子机制：Nox家族NADPH氧化酶的作用) Current Opinion inNephrology and Hypertension 2009; Augusto C et al., “Novel Nox homologues in the vasculature:focusing on Nox4 and Nox5”(血管***中的新Nox同源物：聚焦Nox4和 Nox5) Clinical Science 2011; Briones AM et al., “Differential regulation of Nox1, Nox2 and Nox4 in vascular smooth muscle cells from WKY and SHR”(来自WKY 和SHR的血管平滑肌细胞中Nox1、Nox2和Nox4的差别调节) Journal of the AmericanSociety of Hypertension 5:3, 2011)。

最近显示，Nox酶，特别是Nox 4和NAD(P)H-氧化酶，高度涉及肺纤维变性。现已充分认识纤维变性中氧化应激的作用(Kinnula VL, Fattman CL, Tan RJ, Oury TD (2005)Oxidative stress in pulmonary fibrosis:a possible role for redox modulatorytherapy(肺纤维变性中的氧化应激：氧化还原调节治疗的可能作用) Am J Respir CritCare Med 172:417–422)，因为有重要的并且越来越多的证据表明，在肺纤维变性和多器官***纤维变性的病理发展中氧化应激起重要作用(Kuwano K, Nakashima N, Inoshima I,Hagimoto N, Fujita M, Yoshimi M, Maeyama T, Hamada N, Watanabe K, Hara N(2003) Oxidative stress in lung epithelial cells from patients withidiopathic interstitial pneumonias(有特发性间质性肺炎的患者的肺上皮细胞的氧化应激) Eur Respir J 21:232–240)。因此，Nox酶，特别是Nox4，似乎也涉及肺感染、急性肺损伤、肺动脉高压、阻塞性肺病、纤维变性肺病和肺癌。

NADPH氧化酶同工酶、相似性、差异和功能 - NADPH氧化酶的所有七种同工酶(已识别)在具有NADPH和FAD结合位点和六个跨膜结构域方面是类似的，并且在于它们包括两种血红素复合体。

所有NADPH氧化酶形式使用产生活性氧的相同基本机制，但亚细胞定位和作用方式显著不同。

酶的Nox-家族产生的活性氧物质为过氧化物O₂ ^-或过氧化氢H₂O₂。

Nox1和2在组成上连接到p22phox，并且为了活化酶复合体，完全Nox1活性需要其它组分，例如Rac、p47phox、p67phox。为了完全活化，Nox2需要Rac、p40phox、p47phox和p67phox。在活化时，Nox1和2产生O₂ ^-。

Nox3也需要装配胞质蛋白而具有活性(Cheng et al., J Biol Chem, 279(33),2004)。

Nox4也与p22phox相关，并且以此形式在组成上是活性的。然而，Nox4活性通过表达调节–不通过装配或配体活化，这使此同工型区别于其它同工型(Serrander et al.,Biochem J. 406, 2007)。在诱导时，Nox4一般在比Nox1和2更高的水平表达(Ago et al.,Circulation, 109, 2004)。Nox4似乎主要产生H₂O₂而不是O₂ ^-作为其它Nox-变体(Takac etal., J. Biol. Chem. 286, 2011)。这使此同工型独特，因为H₂O₂有能力跨过膜，并因此在比具有很短半衰期的O₂ ^-更长的距离起作用。

Nox5、Doux1和Doux2由Ca²⁺活化(De Deken, Wang et al., J.Biol Chem., 275(30), 2000)。

Nox4和疾病 - 与其它同工型相比，Nox4的独特性也与作为治疗靶标的独特性相关，因为它似乎在过量表达时涉及多种不同的疾病。

Nox4普遍在很多细胞类型中表达，虽然在很低水平，直至被诱导。它主要发现于肾、内皮细胞、外膜成纤维细胞、胎盘、平滑肌细胞、破骨细胞，并且是肿瘤中表达的主要Nox(Chamseddine et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285, 2003; Ellmark etal., Cardiovasc Res. 65, 2005; Van Buul et al., Antioxid Redox Signal. 7,2005; Kawahara et al., BMC Evol Biol. 7, 2007; Krause et al., Jpn J Infectis. 57(5), 2004; Griendling, Antioxid Redox Signal. 8(9), 2006)。已发现，Nox4过量表达于大部分乳腺癌细胞系和原发性乳腺肿瘤。Nox4在已转化的乳腺肿瘤细胞中过量表达显示增加的致瘤性，并在其线粒体中鉴别了Nox4。提示Nox4作为治疗乳腺癌的靶标(Graham et al., Cancer Biol Ther 10(3), 2010)。

Nox4介导脑血管内皮细胞中TNF-a引起的氧化应激和细胞凋亡(Basuroy et al.,Am J Physiol Cell Physiol vol. 296, 2009)。在缺血性中风后它的副作用充分在动物模型和人组织中证明。Nox4的敲减实验显著减小神经元损伤的面积(Sedwick, PLosBiology, vol. 8 issue 9, 2010; Kleinschnitz et al., vol. 8 issue 9, 2010)。

缺血性中风大约占所有中风病例的80%，并且是世界上第二大主要死亡原因。用KO小鼠已经表明，Nox4是急性中风的有效治疗靶标。在最近的报告中(Kleinschnitz et al,同上)公布了令人信服的数据，表明Nox4活性的显著增加是在缺血性中风中发生的神经元细胞死亡的主要原因。已表明，在缺血时，在人以及小鼠脑中诱导Nox4活性升高。高度特异性的Nox4抑制剂具有成为安全药物的可能性。在小鼠中Nox4的全部敲除证实了没有明显的表型。然而，KO显著改进在诱导的缺血性中风中的神经元细胞存活，与野生型相比超过70%。中风患者的治疗也可在对其它类型的中风例如出血性中风没有任何风险的情况下进行，因此治疗可在不需要CAT扫描的情况下开始。

此外，在微血管和脐静脉二者的内皮细胞中通过敲减和过度表达的研究已证实，增加的Nox4活性在内皮细胞的增殖和迁移中起着重要作用(Datla et al., ArteriosclerThrom Vasc Biol. 27(11), 2007)。最初认为，Nox2是造成糖尿病中血管生成缺陷的原因，但焦点已更多地移向Nox4 (Zhang et al., PNAS, 107, 2010；Garriodo-Urbani et al.,Plos One 2011；Takac et al., Curr Hypertens Rep, 14, 2012)。

在肺纤维化的发展期间，Nox4在上皮细胞死亡中起关键作用(Camesecchi etal., Antiox Redox Signal. 1:15(3), 2011)。

已证实，Nox4的siRNA-介导的敲减显著减小来自系膜细胞和肾皮质的纯化线粒体中的NADPH氧化酶活性。该敲减阻止葡萄糖诱导的线粒体超氧化物产生。提示Nox4作为氧化应激的中心介质，它可导致糖尿病中的线粒体功能障碍和细胞损伤(Block et al., PNASvol. 106, no. 34, 2009)。

已证实，Nox4在饮食引起的大鼠肥胖症中***性上调(Jiang, redox rep, 16(6), 2011)。

Nox4已强力关连衰竭心脏的病理。(Nabeebaccus A et al. “NADPH oxidasesand cardiac remodeling”(NADPH氧化酶和心脏重塑) Heart Fai Rev. 2011; Kuroda Jet al., “NADPH oxidase and cardiac failure (NADPH氧化酶和心力衰竭) CardiovascTransl Res. 2010; Kuroda J et al., “NADPH oxidase 4 is a major source ofoxidative stress in the failing heart”(NADPH氧化酶4是衰竭心脏中氧化应激的主要来源) Proc Natl Acad Sci USA 2010)。已提出增加的线粒体Nox4活性和“心脏衰老”功能障碍之间的联系(Tetsuro Ago et al., AGING, 2010年12月, vol.2 No 12)。

胞外基质积累促成慢性肾病的病理。生长因子IGF-I活性是此过程的主要促成因素，Nox4是在此过程中的介质(New et al., Am J Physiol Cell Physiol. 302(1),2012)。在此过程中，肾素-血管紧张素慢性活化和肾损伤***进展之间的关系已充分建立，其中Nox4和血管紧张素II作为合作者(Chen et al., Mol Cell Biol. 2012)。

因此，从上面可以看出，Nox酶在活体中有数种功能，并且它们也可涉及多种病症。这些疾病和病症的实例为心血管病症、呼吸病症、代谢病症、内分泌病症、皮肤病症、骨病症、神经炎性病症、肾病、生殖病症、影响眼和/或晶状体的疾病和/或影响内耳的病况、炎性病症、肝病、疼痛、癌症、变应性病症、创伤、败血性、出血性和过敏性休克、胃肠***疾病或病症、血管生成、血管生成依赖性病况。也似乎尤其发现Nox4涉及这些病症。因此认为能够抑制Nox的化合物(特别是能够选择性抑制Nox4的化合物)会非常有利地用于治疗涉及Nox酶(特别是Nox4)的疾病和病症。

发明简述

根据一个方面，提供作为Nox抑制剂的化合物，其用于治疗与Nox活性升高、更特别是Nox4活性升高相关(例如由其导致或驱动)的疾病。

根据另一方面，提供作为Nox抑制剂、更特别是Nox4抑制剂的化合物，其用于治疗与Nox活性升高、更特别是Nox4活性升高相关的病症。

因此，根据第一方面，提供式(I)的化合物

或其药学上可接受的盐，其中

p是0-2的整数；

q是0-2的整数；

m是1-3的整数；

n是0-3的整数；

每个R¹独立地选自C1-C3烷基-X-；

每个X独立地选自直接的键、O和S；

每个R²独立地选自C1-C3烷基-Y-和苯基-(CH₂)z-Y-；

每个Y独立地选自O和S；和

每个z独立地选自0和1；

其用于治疗与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶活性相关的病况或病症，例如选自内分泌病症、心血管病症、呼吸病症、代谢病症、皮肤病症、骨病症、神经炎性病症、肾病、生殖病症、影响眼和/或晶状体的疾病和/或影响内耳的病况、炎性病症、肝病、疼痛、癌症、变应性病症、创伤、败血性、出血性和过敏性休克、胃肠***疾病或病症、异常血管生成、血管生成依赖性病况。

根据另一方面，提供药物组合物，其包含上文定义的式(I)化合物或其药学上可接受的盐，和任选的药学上可接受的赋形剂，用于治疗任何上述病况。

此类病况和病症的实例例如为本文以上关于Nox (特别是Nox4)提到的那些或由其介导的那些，例如，选自以下的病况和病症：心血管病症、内分泌病症、呼吸病症、代谢病症、皮肤病症、骨病症、神经炎性病症、肾病、生殖病症、内分泌病症、影响眼和/或晶状体的疾病和/或影响内耳的病况、炎性病症、肝病、疼痛、癌症、变应性病症、创伤、败血性、出血性和过敏性休克、胃肠***疾病或病症、血管生成、血管生成依赖性病况以及肺感染、急性肺损伤、肺动脉高压、阻塞性肺病、纤维变性例如纤维变性肺病、脑血管意外和肺癌。

根据一个方面，提供上文定义的抑制哺乳动物中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Nox)、特别是Nox4的式(I)化合物，用于治疗与Nox、特别是Nox4的表达相关的病症。

根据一个方面，提供了通过给予有需要的哺乳动物上文定义的式(I)化合物，在所述哺乳动物中抑制Nox、特别是Nox4的活性的方法。所述方法可用于治疗上文所定义的与Nox活性、特别是Nox4活性相关的病症。

根据另一方面，提供上文定义的化合物在制备用于治疗上文定义的与Nox活性、特别是Nox4活性相关的病症的药物中的用途。

附图简述

图1显示在Nox4-转染的TRex-293细胞中，以通过1:3连续稀释以下试验化合物的200 µM溶液获得的11个浓度，本发明的4种不同的化合物的剂量反应曲线：A) 2,4,6-三甲基-N-苯乙基苯磺酰胺，B) 4-甲氧基-N-苯乙基苯磺酰胺，C) N-(4-乙氧基苯基)-3,4-二甲氧基苯磺酰胺和D) N-(4-(苯甲氧基)苯基)-3,4-二甲氧基苯磺酰胺。

图2是显示分别在A) PLB985细胞和B) PBMC细胞中，在给定浓度的2,4,6-三甲基-N-苯乙基苯磺酰胺的存在下，以相对于PMA (30 ng/ml)对照(=100%)的%，作为自Nox2产生ROS的度量的异鲁米诺(isoluminol)-依赖性化学发光的图。

发明详述

通常本文所用任何术语应作为本发明所属领域内接受的一般意义给出。然而，为了清楚，一些定义在本文下面给出，并应用于整个说明书和所附权利要求书，除非另外规定或从上下文明显看出。

术语“内分泌病症”是指内分泌***病症，并且也可以为内分泌腺分泌过少或分泌过多或内分泌腺肿瘤。糖尿病和***为内分泌病症的实例。

术语“心血管病症或疾病”包括动脉粥样硬化、尤其与内皮功能障碍相关的疾病或病症(包括但不限于高血压)、I型或II型糖尿病的心血管并发症、内膜增生、冠心病、脑、冠状动脉或动脉血管痉挛、内皮功能障碍、心力衰竭(包括充血性心力衰竭)、外周动脉病、再狭窄、由支架引起的创伤、中风、缺血性发作、血管并发症(例如，在器官移植后)、心肌梗塞、高血压、形成动脉粥样斑块、血小板聚集、心绞痛、动脉瘤、主动脉夹层、缺血性心脏病、心脏肥大、肺栓塞、血栓形成事件(包括深静脉血栓形成)、由血流或氧输送恢复在局部缺血后引起的损伤(例如，在器官移植、开放心脏手术、血管成形术、出血性休克、缺血器官(包括心脏、脑、肝、肾、视网膜和肠)的血管成形术)。

术语“呼吸病症或疾病”包括支气管哮喘、支气管炎、过敏性鼻炎、成人呼吸综合征、囊性纤维化、肺病毒感染(流感)、肺动脉高压、特发性肺纤维变性和慢性阻塞性肺病(COPD)。

术语“变应性病症”包括花粉症和哮喘。

术语“创伤”包括多发性损伤。

术语“影响代谢的疾病或病症”包括肥胖症、代谢综合征和II型糖尿病。

术语“皮肤疾病或病症”包括银屑病、湿疹、皮炎、伤口愈合和疤痕形成。

术语“骨病症”包括骨质疏松症(osteoporosis)、osteoporasis、骨硬化症、牙周炎和甲状旁腺功能亢进。

术语“脱髓鞘”是指包括在轴突周围髓鞘质变性的CNS状态或疾病。在本发明背景下，术语脱髓鞘病旨在包括包含细胞脱髓鞘的过程的病况，例如多发性硬化、渐进性多病灶脑白质病(PML)、脊髓病、涉及CNS内自体反应白细胞的任何神经炎性病况、先天性代谢病症、有异常髓鞘化的神经病、药物引起的脱髓鞘、辐射引起的脱髓鞘、遗传性脱髓鞘病况、朊病毒引起的脱髓鞘病况、脑炎引起的脱髓鞘或脊髓损伤。优选，所述病况为多发性硬化。

术语“肾疾病或病症”包括糖尿病性肾病、肾衰竭、肾小球肾炎、氨基糖苷和铂化合物的肾毒性和膀胱过度活动。在一个具体实施方案中，本发明的这一术语包括慢性肾病或病症。

术语“生殖病症或疾病”包括***功能障碍、生育障碍、***肥大和良性***肥大。

术语“影响眼和/或晶状体的疾病或病症”包括白内障(包括糖尿病性白内障)、白内障术后晶状体的重新混浊、糖尿病和其它形式的视网膜病。

术语“影响内耳的病况”包括老年性耳聋、耳鸣、美尼尔病和其它平衡问题、椭圆囊性结石病(utriculolithiasis)、前庭性偏头痛和噪音引起的听力丧失及药物引起的听力丧失(耳毒性)。

术语“炎性病症或疾病”是指炎性肠病、败血症、败血性休克、成人呼吸窘迫综合征、胰腺炎、创伤引起的休克、支气管哮喘、过敏性鼻炎、类风湿性关节炎、慢性类风湿性关节炎、动脉硬化、脑内出血、脑梗塞、心力衰竭、心肌梗塞、银屑病、囊性纤维化、中风、急性支气管炎、慢性支气管炎、急性细支气管炎、慢性细支气管炎、骨关节炎、痛风、脊髓炎、强直性脊柱炎、Reuter综合征、银屑病性关节炎、脊椎关节炎、青少年关节炎或青少年强直性脊柱炎、反应性关节炎、感染性关节炎或感染后关节炎、淋病性关节炎、梅毒性关节炎、莱姆病、“脉管炎综合征”引起的关节炎、结节性多动脉炎、过敏性脉管炎、Luegenec肉芽肿病、类风湿性多肌痛、关节细胞风湿病、钙结晶沉积关节炎、假痛风、非关节炎性风湿病、滑囊炎、腱鞘炎、上髁炎(网球肘)、腕管综合征、由反复使用(打字)引起的病症、混合型关节炎、神经性关节病、出血性关节炎、血管性紫癜、肥大性骨关节病、多中心网状组织细胞增生症、特定疾病引起的关节炎、血液色素沉着、镰形细胞病和其它血红蛋白异常、高脂蛋白血、异常γ球蛋白血症、甲状旁腺功能亢进、肢端巨大症、家族性地中海热、***、***性自身免疫病红斑狼疮、多发性硬化和克罗恩氏病或疾病如复发性多软骨炎、慢性炎性肠病(IBD)，或需要以抑制NADPH氧化酶的足够剂量给予哺乳动物治疗有效剂量由式(I)表示的化合物的相关疾病。

术语“肝病或病症”包括肝纤维变性、酒精引起的纤维变性、脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎。

术语“关节炎”指急性风湿性关节炎、慢性类风湿性关节炎、衣原体性关节炎、慢性吸收性关节炎、乳糜性关节炎(anchylous arthritis)、基于肠病的关节炎、丝虫性关节炎、淋病性关节炎、痛风性关节炎、血友病性关节炎、增生性关节炎、青少年慢性关节炎、莱姆关节炎、新生儿关节炎(neonatal foal arthritis)、结节性关节炎、褐黄病性关节炎、银屑病性关节炎或化脓性关节炎，或需要以抑制NADPH 氧化酶的足够剂量给予哺乳动物治疗有效剂量的式(I)表示的化合物的相关疾病。

术语“疼痛”包括与炎性疼痛相关的痛觉过敏。

术语“癌症”指癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、***肉瘤、***内皮瘤、骨膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、***癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、***瘤、胚胎性癌、维耳姆斯瘤、子***、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、膀胱癌或上皮癌)或需要以抑制NADPH氧化酶的足够剂量给予哺乳动物治疗有效剂量的式(I)表示的化合物的相关疾病。

术语“胃肠***疾病或病症”包括胃粘膜病症、缺血性肠病控制、肠炎/结肠炎、癌症化疗或嗜中性白血球减少症。

术语“血管生成”包括出芽式血管生成、套叠式血管生成(intussusceptiveangiogenesis)、血管发生、动脉生成和***生成。血管生成是从原有毛细管或毛细管后微静脉形成新血管，并且发生于病理病况中，例如癌症、关节炎和炎症。多种组织或包含组织化组织的器官可支持疾病病况的血管生成，包括皮肤、肌肉、肠、***、关节、骨和血管可在血管生成刺激时侵入的类似组织。本文所用术语“血管生成依赖性病况”意欲指血管生成或血管发生过程维持或扩大病理状况的病况。血管发生是由于从成血管细胞产生的新血管的生成，成血管细胞是内皮细胞前体。两种过程均导致新血管生成，并且包括在术语血管生成依赖性病况的意义内。同样，本文所用术语“血管生成”旨在包括从头形成血管，例如，产生于血管发生的那些以及产生于现有血管、毛细管和微静脉分支和出芽的那些。

术语“血管生成抑制”意指有效减小新血管形成的范围、量或速率。组织中内皮细胞增殖或迁移的范围、量或速率实现减小是抑制血管生成的具体实例。血管生成抑制活性可特别用于治疗任何癌症，因为它靶向肿瘤生长过程，并且在肿瘤组织新血管形成不存在下，肿瘤组织得不到所需的营养，生长减慢，停止另外生长，退化并最终变得坏死，从而杀灭肿瘤。另外，血管生成抑制活性可特别用于治疗任何癌症，由于它特别有效地对抗转移形成，因为其形成也需要原发肿瘤的血管形成，以便转移癌细胞能够离开原发肿瘤，并且其在次级部位的建立需要新血管形成以支持转移生长。

本文所用“治疗”和“处理”等一般指获得所需的药理学和生理学作用。该作用可在预防或部分预防疾病、症状或其病况方面为预防性，并且/或者可在部分或完全治愈疾病、病况、症状或归因于该疾病的不良作用方面为治疗性。本文所用术语“治疗”涵盖对哺乳动物(特别是人)的疾病的任何治疗，并包括：(a)预防可能易患疾病但尚未诊断患有该病的受试者中发生疾病；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或缓解疾病，即，使疾病和/或其症状或病况消退。

本文所用术语“受试者”指哺乳动物。例如，本发明考虑的哺乳动物包括人、灵长类、驯养动物，例如牛、绵羊、猪、马等。

“有效量”或“治疗有效量”指给予治疗的受试者治疗效果的化合物量。治疗效果可以为客观性(即，可由某一试验或标记测量)或主观性(即，受试者给出效果指示或感受效果)。

在本发明上下文中使用的术语“抑制剂”定义为完全或部分抑制Nox (特别是Nox4)活性和/或抑制或减少活性氧物质(ROS)产生的分子。

“药学上可接受的”指可用于制备药物组合物，所述药物组合物一般安全、无毒且在生物学上和在其它方面都合乎需要，并且包括可用于兽医用途和人药用途。

术语Cn，其中n为整数，指定基团或部分包含n个碳原子。

术语Cn-Cm，其中m和n二者均为整数且m>n，是指包含至少n个和至多m个碳原子的基团或部分。因此，术语C1-C6烷基是指可包含1、2、3、4、5或6个碳原子的烷基。

根据本发明的C1-C3烷基更特别地是C1-C2烷基，例如甲基。

在式(I)的化合物中，m是1、2或3。在一些实施方案中，m是1。在一些其它的实施方案中，m是2。在仍其它的实施方案中，m是3。在一些其它的实施方案中，m是1或3。在仍其它的实施方案中，m是2或3。

在式(I)中，每个部分R¹独立地选自C1-C3烷基-X-，或选自C1-C2烷基-X-；例如CH₃-X-。

每个X独立地选自直接的键、O和S。在一些实施方案中，每个X选自直接的键和O。在一些实施方案中，每个X是直接的键。在一些实施方案中，每个X是O或S，例如每个X是O。

在一些具体的实施方案中，每个R¹选自C1-C3烷基和C1-C3烷氧基，例如甲基和甲氧基。在一些实施方案中，每个R¹选自C1-C3烷基，例如甲基。在一些其它的实施方案中，每个R¹选自C1-C3烷氧基，例如甲氧基。

在式(I)的化合物中，n是0-3的整数，例如n是0-2的整数。在一些实施方案中，n是0或1。在一些具体的实施方案中，n是0。在一些其它的实施方案中，n是1-3的整数，例如n是1或2，特别地n是1。

每个部分R²独立地选自C1-C3烷基-Y-和苯基-(CH₂)z-Y-。在一些实施方案中，每个R²是C1-C3烷基-Y-。在一些实施方案中，每个R²是苯基-(CH₂)z-Y-。

更特别地，任何C1-C3烷基-Y-可选自C1-C2烷基-Y-；例如任何C1-C3烷基-Y-可以是C₂H₅-Y-。

部分Y独立地选自O和S，例如每个Y是O。

在部分苯基-(CH₂)z-Y-中，z是选自0和1的整数。在一些实施方案中，z是0。在一些其它的实施方案中，z是1。

在一些实施方案中，n是0，或者n是1和R²是乙氧基或苯甲氧基。

在一些实施方案中，式(I)的化合物可由下式(Ia)表示

其中m, n, p, q, R¹和R²按上文所定义。例如，在式(Ia)化合物的一些实施方案中，p是0。在式(Ia)化合物的一些其它的实施方案中，p是0和q是1或2，特别地q是2。

在一些实施方案中，式(I)的化合物可由下式(Ib)表示

其中n, p, q, R¹和R²按上文所定义。例如，在式(Ib)化合物的一些实施方案中，p是0。在式(Ib)化合物的一些实施方案中，q是1或2，特别地q是2。在式(Ib)化合物的一些特别的实施方案中，p是0和q是1或2，特别地q是2。

在一些实施方案中，式(I)的化合物可由下式(Ic)表示

其中p, q,和R¹按上文所定义。在式(Ic)化合物的一些实施方案中，q是1或2，特别地q是2。

在一些实施方案中，式(I)的化合物可由下式(Id)表示

其中q和R¹按上文所定义。例如，在式(Id)化合物的一些实施方案中，q是1或2。

在一些具体的实施方案中，式(I)的化合物可由下式(Ie)表示

其中每个R¹按上文所定义。

在一些实施方案中，式(I)的化合物选自

2,4,6-三甲基-N-苯乙基苯磺酰胺，

4-甲氧基-N-苯乙基苯磺酰胺，

N-(4-乙氧基苯基)-3,4-二甲氧基苯磺酰胺，和

N-(4-(苯甲氧基)苯基)-3,4-二甲氧基苯磺酰胺。

式(I)的化合物可市售获得，或者可使用通用方法和程序，自容易获得的原料，通过本领域众所周知的方法制备。

例如，式(I)的化合物可按以下反应流程所述，通过使磺酰氯1与胺2在合适的溶剂介质中反应来制备：

本发明的化合物为Nox抑制剂。更具体地讲，本发明的化合物为Nox4抑制剂。由于Nox同工型不仅涉及疾病，例如Nox4，而且在活体中具有多种重要的生物功能，主要抑制一种具体Nox同工型(即，Nox4)的能力被认为是本发明化合物的重要优势。

根据过程条件，以中性或盐形式得到式(I)的最终产物。游离碱和游离酸二者和这些最终产物的盐均在本发明的范围内。使用碱性试剂，例如碱，或者通过离子交换，可以本身已知的方式使本发明化合物的酸加成盐转变成游离碱。得到的游离碱也可与有机或无机酸生成盐。通过使用酸性试剂，例如酸，或者通过离子交换，可以本身已知的方式使本发明化合物的碱加成盐转变成游离酸。得到的游离酸也可与有机或无机碱生成盐。

在制备酸或碱加成盐中，优选使用适合生成治疗上可接受的盐的这些酸或碱。这些酸的实例为氢卤酸、硫酸、磷酸、硝酸、脂族、脂环族、芳族或杂环羧酸或磺酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、丙酮酸、对羟基苯甲酸、扑酸、甲磺酸、乙磺酸、羟基乙磺酸、卤苯磺酸、甲苯磺酸或萘磺酸。碱加成盐包括从无机碱(例如，铵或碱金属或碱土金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)和有机碱(例如醇盐、烷基酰胺、烷基和芳基胺等)得到的那些盐。用于制备本发明的盐的碱的实例包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾等。

本发明的化合物可以有多种立体异构体，包括对映异构体和非对映异构体。对映异构体可以它们的纯形式存在，或者作为两种对映异构体的外消旋(相等)或不等混合物。非对映异构体可以它们的纯形式存在，或者作为非对映异构体的混合物。非对映异构体也包括几何异构体，几何异构体可以它们的纯顺式或反式存在，或者作为这些异构体的混合物。

根据进一步的方面，本文提供了药物组合物，包含治疗有效量的上文定义的式(I)化合物或其药学上可接受的盐和任选的药学上可接受的赋形剂。

通常通过混合活性物质(即，本发明的化合物或其药学上可接受的盐)与常规药用赋形剂制备药物制剂。可进一步通过已知方法制备制剂，例如制粒、压缩、微包囊、喷涂等。可通过常规方法以片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂、混悬剂、栓剂或注射剂剂型制备制剂。通过活性物质溶于或悬浮于水或其它适合的媒介物，可制备液体制剂。片剂和颗粒剂可以常规方式包衣。

为了临床使用，本发明的化合物配制成用于口服、直肠、胃肠外或其它给药方式的药物制剂。这些药物制剂为本发明的另一个目的。

通常，活性化合物的有效量在制剂重量的0.1-95%重量之间，在用于胃肠外用途的制剂中优选在0.2-20%重量之间，在用于口服给药的制剂中优选在1和50%重量之间。

具体化合物的剂量水平和给药频率根据多种因素而变化，包括所用具体化合物的效力、化合物的代谢稳定性和作用时间长度、患者的年龄、体重、一般健康、性别、饮食、给药方式和时间、***速率、药物组合、要治疗病况的严重性和接受疗法的患者。日剂量可以为例如约0.001mg至约100mg/kg体重，可以单个或多个剂量给药，例如每个约0.01mg至约25mg。一般此剂量经口服给予，也可选择胃肠外给药。

在以用于口服给药的剂量单位形式制备包含本发明化合物的药物制剂中，选择的化合物可与固体粉状成分(例如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、支链淀粉、纤维素衍生物、明胶或其它适合成分)与崩解剂和润滑剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂基富马酸钠和聚乙二醇蜡)混合。然后将混合物加工成颗粒或压成片剂。

利用包含本发明的一种或多种活性化合物、植物油、脂肪或用于软明胶胶囊的其它适合媒介物的混合物的胶囊，可制备软明胶胶囊。硬明胶胶囊可包含活性化合物的颗粒。硬明胶胶囊也可包含活性化合物与固体粉状成分(例如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、马铃薯淀粉、玉米淀粉、支链淀粉、纤维素衍生物或明胶)的组合。

用于直肠给药的剂量单位可以以下的形式制备：(i)栓剂形式，包含与中性脂肪基质混合的活性物质；(ii)明胶直肠胶囊剂形式，包含与植物油、石蜡油或用于明胶直肠胶囊的其它适合媒介物混合的活性物质；(iii)现成微型灌肠剂形式；或(iv)恰好在给药前重构于适合溶剂的干燥微型灌肠剂制剂形式。

用于口服给药的液体制剂可以糖浆剂或混悬剂剂型制备，例如，溶液或混悬剂，其包含0.2%重量至20%重量活性成分，其余由糖或糖醇和乙醇、水、甘油、丙二醇和聚乙二醇的混合物组成。如果需要，这些液体制剂可包含着色剂、矫味剂、糖精和羧甲基纤维素或其它增稠剂。用于口服给药的液体制剂也可以在使用前用适合溶剂重构的干粉剂型制备。

用于胃肠外(例如静脉内)给药的溶液可作为药学上可接受的溶剂中的本发明化合物的溶液，优选以0.1%重量至10%重量的浓度制备。这些溶液也可包含稳定成分和/或缓冲成分，并以安瓿或小瓶的形式分配成单位剂量。用于胃肠外给药的溶液也可作为在使用前临时用适合溶剂重构的干燥制剂制备。

本发明的化合物也可与一种或多种另外的治疗活性剂组合使用或给药。组分可在相同的制剂中或分开的制剂中同时或依次给药。

因此，在本发明的另一个方面，提供一种组合产品，包含：

(A)根据本发明使用的本发明的化合物；和

(B)另一种治疗剂，其中(A)和(B)与药学上可接受的赋形剂混合配制。

这些组合产品提供本发明的化合物与其它治疗剂的联合给药，因此，可作为分开的制剂呈现，其中那些制剂中至少一个包含本发明的化合物，且至少一个包含其它治疗剂；或者可作为组合的制剂(即，作为包括本发明的化合物和其它治疗剂的单一制剂存在)呈现(即，配制)。

因此，进一步提供：

(1)一种药物制剂，所述药物制剂包含本文以上限定的根据本发明使用的化合物、另一种治疗剂和药学上可接受的赋形剂(例如，助剂、稀释剂或载体)；和

(2)各部分的试剂盒，所述试剂盒包含以下作为组分：

(a) 药物制剂，所述药物制剂包含本文限定的根据本发明使用的化合物与药学上可接受的赋形剂(例如，助剂、稀释剂或载体)的混合物；和

(b) 药物制剂，所述药物制剂包含另一种治疗剂与药学上可接受的赋形剂(例如，助剂、稀释剂或载体)的混合物，所述组分(a)和(b)各自以适用于相互组合给药的形式提供。

本发明的化合物也可与治疗癌症的其它治疗方式(例如照射)组合使用或给予。

根据一个方面，提供上文定义的抑制哺乳动物的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Nox)、特别是Nox4的式(I)化合物，用于治疗与Nox、特别是Nox4的表达相关的病症。所述病症可选自例如，内分泌病症、心血管病症、呼吸病症、代谢病症、皮肤病症、骨病症、神经炎性病症、肾病、生殖病症、影响眼和/或晶状体的疾病和/或影响内耳的病况、炎性病症、肝病、疼痛、癌症、变应性病症、创伤、败血性、出血性和过敏性休克、胃肠***疾病或病症、异常血管生成和血管生成依赖性病况。在一些实施方案中，所述病症选自糖尿病、中风、纤维变性例如肺纤维变性、神经性疼痛和糖尿病并发症例如神经病；例如所述病症是糖尿病，或者所述病症是中风。

在一些实施方案中，所述病症是内分泌病症。在一些实施方案中，所述病症是心血管病症。在一些实施方案中，所述病症是呼吸病症。在一些实施方案中，所述病症是代谢病症。在一些实施方案中，所述病症是皮肤病症。在一些实施方案中，所述病症是骨病症。在一些实施方案中，所述病症是神经炎性病症。在一些实施方案中，所述病症是肾病。在一些实施方案中，所述病症是生殖病症。在一些实施方案中，所述病症是影响眼和/或晶状体的疾病和/或影响内耳的病况。在一些实施方案中，所述病症是炎性病症。在一些实施方案中，所述病症是创伤。在一些实施方案中，所述病症是败血性、出血性和过敏性休克。在一些实施方案中，所述病症是胃肠***疾病或病症。在一些实施方案中，所述病症是或涉及异常血管生成。在一些实施方案中，所述病症是血管生成依赖性病况。

根据一个方面，提供了通过给予有此需要的患者治疗有效量的如本文限定的式(I)的化合物，在所述患者中抑制Nox(特别是Nox4)的活性的方法。患者可以为任何哺乳动物，但优选为人。

要治疗的患者可以是患有与Nox(特别是Nox4)提高活性相关的病况或病症的患者，或者是有发展此病况或病症风险的患者。

实施例

实施例1

基于细胞的测定和分析化学

1细胞存活力

1.1 Celltiter-Blue细胞存活力测定(Promega)

测定基于细胞将刃天青还原成试卤灵的能力作为存活力的量度。在T-225烧瓶中培养TREx^TM-293 Nox4细胞，通过胰蛋白酶消化收集，并重新悬浮于细胞培养基。将90µl中的20,000个细胞接种到96孔细胞培养平板(黑色，有透明底部)。也制备只有90µl细胞培养基的一个背景平板。

24小时后，将在37℃细胞培养基中稀释到10倍最终浓度的10µl化合物加到细胞和背景平板。以10µM最终浓度一式两份对化合物进行试验。作为阳性对照加入100µM最终浓度的氯丙嗪。处理24小时后，加入20µl CellTiter-Blue试剂，并将平板在37℃孵育120min。在Victor2V平板读取器中读取试卤灵荧光。在细胞存活力分析前，所有试验值关于背景校正。

1.2 CytoTox 96®非放射性细胞毒性测定(Promega)

测定基于周围细胞培养基中乳酸脱氢酶(LDH)活性作为膜完整性的量度。膜完整性可受细胞凋亡、坏死或化学物质影响。在T-225烧瓶中培养TREx^TM-293 Nox4细胞，通过胰蛋白酶消化收集，并重新悬浮于HBSS至100,000个细胞/ml。将90µl细胞悬浮液加到V形底聚丙烯96孔平板的各孔。只用HBSS制备一个背景平板。将化合物在HBSS中稀释到10倍最终浓度，且每孔加入10µl。以10µM最终浓度一式两份对化合物进行试验。

在37℃孵育平板3小时。在孵育时间结束前的45分钟，向所有的对照孔加入10µl裂解液(Triton X-100)，以估计细胞的总LDH含量。用未处理细胞测定自发LDH渗漏。

使细胞平板在250 x g离心5分钟，并将50µl上清液转移到96孔Spectraplate平板。加入50µl重构的底物混合物，并在室温孵育平板30分钟。加入50µl终止液，并在SpectraMax®在490nm波长读平板。减去化合物特定背景，如下计算%细胞毒性：

[(试验 – 自发) / (总 - 自发)] * 100 %。

在两个细胞存活力测定中试验时，本发明化合物均不显示任何显著细胞毒性作用。

2剂量-反应曲线

利用基于Amplex® Red的测定如下进行剂量-反应测量：

使用基于液体处理Janus®(Perkin Elmer)的***和计划软件(schedulingsoftware) Overlord (Process Analysis and Automation)(过程分析和自动化)，进行化合物连续稀释。

从含有在DMSO中15µl 10mM化合物储备溶液的化合物平板开始，将10µl DMSO加到化合物平板列(Flexdrop)。通过将5µl化合物溶液加到10µl DMSO (1:3)进行连续稀释，得到11个浓度。向化合物平板的各孔加入90µl测定缓冲液。混合后，将10µl从化合物平板的各孔转移到测定平板的孔，随后加入20µl检测混合物和20µl TREx^TM-293 Nox4细胞悬浮液。然后在室温孵育测定平板40-60min。

在Activitybase XE(IDBS)中用自定义计算模板分析数据。用嵌入公式使原始荧光数据转换成%抑制：

利用四参数逻辑公式，用非线性回归拟合剂量-反应曲线。图1显示了本发明的化合物的剂量-反应曲线。

3身份、纯度和稳定性(IPS)分析

在PBS, pH 7.4中将DMSO溶液稀释至终浓度100 µM。制备两份样品，一份用于直接分析，和另一份在37℃贮存24 h。

在具有UV和ESI-MS检测的反相HPLC***上，进行分析。纯度定义为在220 nm处样品峰的相对面积。在样品色谱图的MS中通过分子离子的存在确定身份。稳定性是24小时后样品峰的相对面积与0小时色谱图的样品峰的相对面积的比率。纯度和稳定性值经舍位处理以10%增量报告(即，96%报告为90%)。

在IPS分析中，测试的化合物具有明确的身份，90%或更高的纯度，和80%或更高的稳定性。

实施例2

本发明的化合物对Nox2的活性

为了评价本发明的化合物的Nox4特异性，测试了大量的本发明的化合物对自Nox2产生的活性氧物质(ROS)的潜在抑制效果。

1 研究设计

在PLB985细胞(人急性髓细胞样白血病细胞系)和人外周血单核细胞(PBMC)上，使用异鲁米诺增强的化学发光，评价了在用佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA) (30ng/ml)刺激后自Nox2产生ROS的抑制。本发明的化合物和二亚苯基氯化碘鎓(DPI)以范围200μM-0.01μM的3倍稀释系列滴定。

所有样品按一式两份进行分析。

2 分析测定法

2.1 异鲁米诺测定法

使用异鲁米诺-依赖性化学发光测量ROS的水平(Dahlgren et al. 1999)。异鲁米诺是一种疏水染料，其不能穿过生物膜。因此，细胞外ROS使用这种方法测量。异鲁米诺受ROS激发，和测量当激发的分子回到基态时相对于释放的ROS的量发射的光。该反应通过过氧化物酶催化和放大。天然存在的过氧化物酶可实现这一点，然而其分泌有限，因此需要加入另外的过氧化物酶，在目前的情况下为辣根过氧化物酶级分II。

2.2 数据收集和分析

使用FluoStar Optima (BMG Labtech)和白色96-孔平板检测发光。在67秒的23个循环期间，在37°C下同时摇动进行测量。

根据23个循环计算曲线下面积(AUC)值。结果作为相对于未添加抑制剂时PMA刺激的细胞的百分比变化进行评价。

使用用于Mac OS X的Prism 5，进行非线性回归和IC50计算。

3 材料和方法

3.1 人PBMC

人血以一日龄的血沉棕黄层购自Komponentlab, Sahlgrenska Universityhospital, Göteborg, Sweden。

3.1.1 PBMC分离

通过葡聚糖沉降，从全血中除去红细胞。使用Ficoll-Paque Plus (补充有0.75 mg/mlNaCl)，根据制造商的说明书，通过密度梯度离心分离无红细胞的级分。PBMC自血浆和Ficoll-Paque Plus试剂之间的界面分离。PBMC在HBSS中洗涤，直到除去污染的血小板。细胞计数和存活力通过锥虫蓝排除法来确定。

3.1.2 PBMC的冷冻保存

根据Kreher等2003，冷冻保存细胞。简言之，将分离的细胞以20x10⁶个细胞/ml重悬浮于室温冷冻培养基A (60%胎牛血清，40% RPMI 1640)中。逐滴加入等体积的室温冷冻培养基B (20% DMSO, 80%胎牛血清)。将15x10⁶个细胞等分到冷冻管中并在-80°C下置于预冷却(4°C)的Cryogenic Controlled-Rate Freezing Container。24h后，将样品转移至-150°C冰箱用于无期限贮存。

3.1.3 PBMC的解冻

在37°C水浴中将细胞快速解冻，吸取到室温HBSS中并离心(250 x g, 20°C, 5min)。在HBSS中洗涤(2x)后，将细胞以浓度2x10⁶个细胞/ml重悬浮于HBSS。通过锥虫蓝排除法来确定细胞计数和存活力。

每测定板使用1小管，恰在分析前解冻和制备。

3.1.4 细胞计数：人PBMC

总细胞计数(每小管)：9-9.75x10⁶个细胞

存活力：92-95%

测定法的活细胞浓度：2x10⁶个细胞/ml

3.2 PLB985

在37°C, 5% CO₂下，将PLB985细胞在补充有10%胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素100U/ml的RPMI 1640中(=完全生长培养基)培养。大约每周两次将细胞传代。为了向嗜中性粒细胞分化，将细胞离心(250g, 5min, RT)和重悬浮于补充有1.25% DMSO的完全生长培养基中5天(Zhen et al.1993, Tucker et al.1987)。

在分析当天，将分化的细胞沉淀(250g, 5min, RT)，在HBSS中洗涤两次和以2x10⁶个细胞/ml重悬浮于HBSS。通过锥虫蓝排除法来确定细胞计数和存活力。将细胞在室温下贮存，直至使用。

3.2.1 细胞计数：PLB985

总细胞计数：94x10⁶个细胞

存活力：92%

测定法的活细胞浓度：2x10⁶个细胞/ml

3.3 试剂

测定板，白色96-孔(Nunc 236108)

葡聚糖T500 (Pharmacosmos 5510 0500 4006)

DMSO (Sigma: D5879)

DPI

胎牛血清(VWR: LONZ14-801F)

Ficoll Paque Plus (GE Healthcare 71-7167-00)

fMLF (Sigma: F3506)

HBSS (内部配制：5.4mM KCl, 0.3mM Na₂HPO₄ x 2H₂O, 0.4mM KH₂PO₄, 4.2mM NaHCO₃,1.3mM CaCl₂ x 2H₂O, 0.5mM MgCl₂ x 6H₂O, 0.6mM MgSO₄ x 7H₂O, 137mM NaCl, 5.6mMD-葡萄糖)

HRP级分II (Sigma P8250)

异鲁米诺(4-氨基邻苯二甲酰肼) (Sigma A8264)

PMA (Sigma P8139)

RPMI 1640 (VWR: LONZ12-702F/12 )

3.4 测试的化合物

本发明的化合物的100mM DMSO储备溶液用于试验。

3.5 异鲁米诺缓冲液

异鲁米诺缓冲液包含异鲁米诺(0.0175mg/ml)和HRP级分II (1.75U/ml)。该缓冲液通过将这些成分在HBSS中稀释至4x工作浓度制备。

4程序

4.1 物质制备

将待测试的化合物在DMSO中稀释至100x工作浓度，和以自200μM至0.01μM的3倍稀释系列作为终浓度滴定。

稀释DPI至100x工作浓度，和剂量以与试验化合物相同的稀释系列滴定。终浓度1µM的DPI还在所有平板上用作对照。然后在DMSO中稀释至100x工作浓度。

PMA在异鲁米诺缓冲液中稀释至4x工作浓度。

4.2 异鲁米诺测定法

在异鲁米诺缓冲液中稀释至4x工作浓度的25μl PMA加入各孔。向未刺激的对照孔中仅加入异鲁米诺缓冲液。随后向试验板的各孔中加入24μl HBSS和1μl的化合物试验溶液或DPI溶液(终DMSO浓度 = 1.25%)。最后，将50μl细胞悬浮液(2x10⁶个细胞/ml)加入各孔，接着立即开始发光测量。

5. 结果

化合物2,4,6-三甲基-N-苯乙基苯磺酰胺的结果表示为以相对于在PMA存在下的发光，在给定浓度的测试物质的存在下获得的发光%，参考图2。

Claims (15)

1.一种用于治疗与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶活性相关的病况或病症的式(I)化合物或其药学上可接受的盐，

其中

m是1-3的整数；

n是0-3的整数；

p是0-2的整数；

q是0-2的整数；

每个R¹独立地选自C1-C3烷基-X-；

每个X独立地选自直接的键、O和S；

每个R²独立地选自C1-C3烷基-Y-和苯基-(CH₂)z-Y-；

每个Y独立地选自O和S；和

每个z独立地选自0和1；

所述病况或病症选自内分泌病症、心血管病症、呼吸病症、代谢病症、皮肤病症、骨病症、神经炎性病症、肾病、生殖病症、影响眼和/或晶状体的疾病和/或影响内耳的病况、炎性病症、肝病、疼痛、癌症、变应性病症、创伤、败血性、出血性和过敏性休克、胃肠***疾病或病症、异常血管生成和血管生成依赖性病况。

2.根据权利要求1使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个X独立地选自直接的键和O。

3.根据权利要求1或2使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中p是0。

4.根据权利要求1-3中任一项使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个Y是O。

5.根据权利要求1-4中任一项使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中n是0或1。

6. 根据权利要求1-5中任一项使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个R¹选自甲基和甲氧基，并且每个R²选自乙氧基和苯甲氧基。

7.根据权利要求1-6中任一项使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物具有式(Ia)

。

8.根据权利要求1-7中任一项使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物具有式(Ib)

。

9. 根据权利要求1-8中任一项使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中q是2。

10.根据权利要求1-9中任一项使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物具有式(Ie)

。

11.根据权利要求1使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自

2,4,6-三甲基-N-苯乙基苯磺酰胺；

4-甲氧基-N-苯乙基苯磺酰胺；

N-(4-乙氧基苯基)-3,4-二甲氧基苯磺酰胺；和

N-(4-(苯甲氧基)苯基)-3,4-二甲氧基苯磺酰胺。

12.根据权利要求11使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物是2,4,6-三甲基-N-苯乙基苯磺酰胺。

13.根据权利要求1-12中任一项使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述病症选自糖尿病、中风、纤维变性例如肺纤维变性、神经性疼痛和糖尿病并发症例如神经病。

14.根据权利要求13使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述病症是中风。

15.根据权利要求13使用的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述病症是纤维变性。