CN107404907A - 用于改进饲料消化率和生长性能的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于改进动物生长性能的方法。具体地，本发明的发明人发现如果补充蛋白水解酶并且将蛋白酶与维生素C组合，则向常规动物膳食中添加蛋白水解酶(蛋白酶)导致生长性能的显著改进。

Description

用于改进饲料消化率和生长性能的方法
技术领域
本发明涉及用于改进动物生长性能的方法。具体地，本发明涉及用于改进动物生长性能的方法，所述方法是通过向动物施用至少一种与维生素C、其衍生物或其代谢物组合的蛋白水解酶(proteolytic enzyme)来进行。
背景技术
在动物饲料中使用蛋白水解酶(蛋白酶)是熟知的，例如从以下文件中：
W095/28850公开了包含植酸酶和蛋白水解酶的动物饲料添加剂。各种蛋白水解酶在第7页指出。
W096/05739公开了包含木聚糖酶和蛋白酶的酶饲料添加剂。合适的蛋白酶在第25页列出。W095/02044公开了来源于棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的蛋白酶以及其在动物饲料中的用途。
US 3966971公开了一种从蔬菜蛋白质来源获得蛋白质的方法，所述方法是通过用酸性植酸酶和任选地蛋白水解酶处理来进行的。合适的蛋白酶在第2列中指出。
维生素C指在动物中具有维生素C活性的许多同效维生素，包括抗坏血酸及其盐以及分子的氧化形式如脱氢抗坏血酸。
维生素C或L-抗坏血酸或，简单地，抗坏血酸盐是所有动物和植物中的一系列必需代谢反应所需要的。抗坏血酸盐不能被人类和一些种类的禽和鱼所合成。在另一方面，抗坏血酸盐或维生素C是被几乎所有农场动物内部合成的。动物，例如猪和家禽，完全能够合成足够的维生素C(抗坏血酸)来满足正常的每日需求。
这就是为何在商业条件下维生素C不能用作常规动物膳食的饲料添加剂的原因。维生素C仅在特殊情况下加入到动物膳食中，例如加入到家禽膳食中以抵抗热应激以及在应激时间段过程(早期断奶)中加入到猪膳食中。
出乎意料地，本发明的发明人发现如果补充蛋白水解酶并且将蛋白水解酶与维生素C组合，则向常规动物膳食中添加蛋白水解酶(蛋白酶)导致生长性能的显著改进。
发明内容
在本发明中，术语“动物”包括所有农场动物。动物的实例包括非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括但不限于绵羊、山羊和牛；以及非反刍动物包括但不限于马、兔、猪，猪包括但不限于乳猪、猪仔、生长肥育猪、母猪和公猪；以及家禽，例如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉鸡和产蛋鸡)等等。
在本发明中，术语“生长性能”指动物的平均每日体重增加(ADWG)的增长、平均每日饲料摄取(ADFI)的增长和/或饲料转化率(FCR)的改进。
术语饲料转化率是基于生长试验来确定的，所述生长试验包括第一处理，其中根据本发明的组合物以每kg饲料的合适浓度添加到动物饲料中，以及第二处理(对照)，其中没有添加所述组合物到动物饲料中。FCR越低，饲料利用的越好。在具体实施方案中，与对照相比，FCR改进(即，减少)了至少1.0％，优选地至少1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％或至少2.5％。在另外的具体实施方案中，与对照相比，FCR改进(即，减少)了至少2.6％、2.7％、2.8％、2.9％或至少3.0％。在其他的具体实施方案中，与对照相比，FCR改进(即，减少)了至少3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％或至少3.8％。
改进的体重增加指相对于没有添加维生素C和蛋白酶的对照，改进的每日、每周、每两周或每月体重增加(以g或kg/相关时间段计)。
根据本发明的方法，与维生素C组合的蛋白酶的施用可以提供协同作用，以改进动物的生长性能。术语“协同作用”指1+1>2的现象，即两种或更多种物质相互提供较之由这些物质中的每一种产生的作用的总和更大的作用，或者“相互促进作用”的现象，即由一种物质产生的作用在其他物质存在下得到增强。
施用可以向动物一天一次或一天两次或更多次地进行。另外，维生素C和蛋白酶可以同时施用或单独地施用。
维生素C和蛋白酶可以作为饲料组合物或者作为动物饲料混合物的组分和/或在动物的饮用水中直接施用于动物。
具体实施方式
维生素C可以来自任何来源，包括商业途径或直接合成。根据本发明使用的维生素C制剂可以以商品名50商购获得，由DSM Nutritional Products,Kaiseraugst,瑞士)供应。
维生素C如果与蛋白酶组合使用则以有效量应用，即以足以改进动物的生长性能的量应用，所述量取决于动物种类。
在肉鸡膳食的优选的实例中，维生素C的预期剂量是50-500mg维生素C/kg最终饲料。
蛋白酶基于其催化机制被分类为以下组：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)以及未知的或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbookof Proteolytic Enzymes,A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(eds),AcademicPress(1998)，具体地，一般介绍部分。
在一个具体实施方案中，根据本发明使用的蛋白酶是微生物蛋白酶，术语微生物指示所述蛋白酶是来源于或起源于微生物；或者是来源于微生物的类似物、片段、变体、突变体，或合成的蛋白酶。它可以是在原始的野生型微生物菌株、另一种微生物菌株或者植物中产生或表达的；即该术语涵盖了野生型天然存在的蛋白酶的表达以及重组的、遗传工程化的或合成的蛋白酶在任何宿主中的表达。根据本发明使用的蛋白酶属于如Handbook ofProteolytic Enzymes所定义的组之一(参见上文)。
微生物的实例是细菌，例如放线菌门的细菌，例如I类细菌：放线菌纲，例如V子类放线菌纲：放线菌亚纲，例如I目放线菌亚纲：放线菌目，例如XII子目放线菌目：链孢囊菌亚目，例如家族II链孢囊菌亚目：拟诺卡菌科，例如I属拟诺卡菌科：拟诺卡氏菌属，例如拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262，以及白拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis alba)；或其表现出蛋白酶活性的突变体或变体；以及芽孢杆菌属细菌或表现出蛋白酶活性的其突变体或其变体，例如Bacillus licheniformis。该分类是基于Berge's Manual of SystematicBacteriology,第2版，2000,Springer(前版:Road Map to Bergey's)。
微生物的其他实例是真菌，诸如酵母或丝状真菌。
根据本发明的蛋白酶的预期剂量被限定为并计算为mg蛋白酶蛋白/kg膳食或蛋白酶活性/kg膳食。
蛋白酶活性可以使用任何测定来测量，其中采用下述底物，所述底物包含与讨论中的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定-pH和测定-温度同样适于讨论中的蛋白酶。测定-pH-值的实例是pH 5、6、7、8、9、10或11。测定-温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃。
蛋白酶底物的实例是酪蛋白和pNA-底物，例如Suc-AAPF-NA(例如可获自SigmaS7388)。该pNA-底物中的大写字母是单字母氨基酸密码。另一个实例是Protazyme AK(蓝黑色染料染色的交联酪蛋白，由Megazyme T-PRAK制备为片剂)。对于pH-活性和pH-稳定性研究，优选pNA-底物，而对于温度活性研究，优选Protazyme AK底物。
pNA蛋白酶活性测定的原理如下：蛋白酶裂解底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，从而释放色原对硝基苯胺(pNA)。反应条件是：底物浓度＝0.56mg/ml，pH＝9.0，温度＝37℃，孵育时间＝250s。释放的黄色pNA的量与酶的蛋白酶活性成比例并且在405nm波长下以光度测定方式测量。最后，蛋白酶活性使用蛋白酶标准物的标准曲线测定。由pNA活性测定测量和计算的一个蛋白酶单位(PROT)是酶在pH 9.0和37℃下每分钟从1mM底物(Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA)释放1μmol对硝基苯胺的量。
根据本发明的蛋白酶的实例是酸稳定性蛋白酶，具体地是酸稳定性丝氨酸蛋白酶或者来源于Bacillus例如Bacillus licheniformis PWD-1的蛋白酶。
术语丝氨酸蛋白酶指丝氨酸肽酶及其氏族，如以上Handbook中所定义的。在1998版的该手册中，丝氨酸肽酶及其氏族是在第1-175章中讨论的。丝氨酸蛋白酶可以被定义为肽酶，其中催化机制取决于充当攻击肽键的亲核试剂的丝氨酸残基的羟基。根据本发明使用的丝氨酸蛋白酶的实例是氏族SA的蛋白酶，例如家族S2(Streptogrisin)，例如子-家族S2A(α-裂解蛋白酶)，如以上Handbook所定义的。
对于根据本发明使用的酸稳定性丝氨酸蛋白酶的来源没有限制。因此，术语蛋白酶不仅包括天然或野生型蛋白酶，而且包括表现出蛋白酶活性的其任何突变体、变体、片段等，以及合成的蛋白酶，诸如改组的蛋白酶(shuffled protease)和共有蛋白酶(consensusprotease)。这样的遗传工程化的蛋白酶可以如本领域一般已知的方式制备，例如通过定点诱变、通过PCR(使用含有所需突变的PCR片段作为PCR反应中的引物之一)或者通过随机诱变。共有蛋白质的制备描述于例如EP 0 897 985。
根据本发明使用的酸稳定性蛋白酶的实例是来源于拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262和白拟诺卡氏菌的蛋白酶以及与任何这些蛋白酶具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％氨基酸同一性的蛋白酶。
为了计算同一性百分比，可以使用本领域已知的任何计算机程序。此类计算机程序的实例是Clustal V算法(Higgins,D.G.和Sharp,P.M.(1989),Gene(Amsterdam),73,237-244；以及在GCG第8版程序包中提供的GAP程序(Program Manual for the WisconsinPackage，第8版，Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needleman,S.B.和Wunsch，C.D.,(1970),Journal of Molecular Biology,48,443-453.
在本发明上下文中，术语酸稳定性指在37℃下，在下列缓冲液中孵育2小时之后，稀释度相当于A280＝1.0的纯蛋白酶的蛋白酶活性至少是参考活性的40％：
·100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES，
·100mM CABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％X-100、pH 3.5，
使用如本文的实施例1所述的测定测量(底物：Suc-AAPF-pNA，pH 9.0，25℃)。
在以上酸稳定性定义的具体实施方案中，蛋白酶活性是参考活性的至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少97％。
术语参考活性是稀释度相当于A280＝1.0的纯品形式的相同蛋白酶在5℃下在以下缓冲液：100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％X-100，pH 9.0中孵育2小时之后的蛋白酶活性，其中活性按以上所述地被确定。
换言之，确定酸稳定性的方法包括以下步骤：
a)将待测试的蛋白酶样品(以纯品形式，A280＝1.0)分为两个等份(I和II)；
b)将等份I在37℃和pH 3.5下孵育2小时；
c)测量等份I的残余活性(pH 9.0和25℃)；
d)将等份II在5℃和pH 9.0下孵育2小时；
e)测量等份II的残余活性(pH 9.0和25℃)；
f)计算等份I的残余活性相对于等份II的残余活性的百分比。
在以上酸稳定性的定义中，术语A280＝1.0指在光程长度为1cm的样品池中，在280nm处相对于缓冲液空白对照的光吸收值为1.0的所述纯蛋白酶的浓度(稀释度)。
并且在以上酸性-稳定性定义中，术语纯蛋白酶指具有大于或等于1.70的A280/A260比率的样品。
在另一个具体实施方案中，根据本发明使用的蛋白酶除了是酸稳定性的之外，也是热稳定性的。
术语热稳定性指以下一个或多个：温度最适值至少为50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃或至少70℃。
对于根据本发明的用途，蛋白酶不需要那样纯；它可以例如包含其他酶，甚至其他酸稳定性蛋白酶，在此情况下其可以被称为酶或蛋白酶制备物。然而，定义明确的酶/蛋白酶制备物是有利的。例如，更容易向饲料恰当地给予蛋白酶，基本上不会干扰或污染其他蛋白酶。术语恰当地给予具体地指获得一致且恒定的结果的目标和基于所需作用的优化剂量的能力。
蛋白酶如果连同维生素C一起使用则以有效量应用，即以足以改进动物的性能的量应用。
目前考虑有效量低于200mg酶蛋白/kg膳食干物质，优选地低于150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、9、8或低于7mg酶蛋白/kg膳食干物质(ppm)。另一方面，有效量可以高于0.01mg酶蛋白/kg膳食干物质，优选地高于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.75、1、2、3或高于4mg酶蛋白/kg膳食干物质(ppm)。因此，优选的剂量范围的非限制性实例是：0.10-50mg酶蛋白/kg，优选地0.50-10、1-9、2-8、3-8或4-7mg酶蛋白/kg。
在一个优选的实施方案中，蛋白酶和维生素C以饲料添加剂的形式使用。
本文以上所例举的饲料添加剂组合物掺入到动物饲料例如家禽饲料中实际上是使用浓缩物或预混合物进行的。预混合物指一种或多种微成分与稀释剂和/或载体的优选地均匀的混合物。使用预混合物来促进微成分在较大混合物中的均匀分散。根据本发明的预混合物可以作为固体(例如作为水溶性粉末)或液体添加到饲料成分或饮用水中。
除了酸稳定性蛋白酶和维生素C，本发明的动物饲料预混合物含有至少一种脂溶性维生素、和/或至少一种其他水溶性维生素、和/或至少一种微量矿物质、和/或至少一种常量矿物质。
另外，任选的，饲料添加剂成分是着色剂，例如类葫萝卜素，诸如β-胡萝卜素、虾青素、角黄素、阿卜酯和叶黄素；芳香化合物；稳定剂；抗微生物肽；多不饱脂肪酸(PUFA)；生成活性氧的物质；和/或至少一种选自以下的酶：植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4.、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(EC3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶，例如像α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。
抗微生物肽(AMP)的实例是CAP18、Leucocin A、内源性抗微生物多肽(Protegrin-1)、死亡素、防御素、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽以及卵旋素诸如新旋素(Robert Lehrer，2000)、菌丝霉素(Plectasin)和他汀类。
多不饱和脂肪酸的实例是C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，诸如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚油酸。
生成活性氧的物质的实例是化学剂，诸如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐；以及酶类，诸如氧化酶、氧合酶或合成酶。
通常，脂溶性和水溶性维生素以及微量矿物质形成将要用于添加到饲料中的所谓预混合物的一部分，而常量矿物质通常单独地添加到饲料中。
以下是这些组分的实例的非穷尽的列表：
-脂溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E以及维生素K，例如维生素K3。
-另外的水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸以及泛酸盐例如Ca-D-泛酸盐。
-微量矿物质的实例是锰、锌、铁、铜、碘、硒以及钴。
-常量矿物质的实例是钙、磷和钠。
如以上所述的饲料添加剂或预混合物被最终添加到动物饲料组合物中。其被制备和添加来使得蛋白酶的量对应于预期添加0.1-200g蛋白酶蛋白/t饲料/膳食并且维生素C的量对应于预期添加100-200mg维生素C/kg饲料/膳食。
动物饲料组合物或膳食具有相对高的蛋白质含量。根据以上提及的国家研究委员会(National Research Council,NRC)出版物，家禽和猪膳食可以如WO 01/58276的表B所指示地表征。根据本发明的动物饲料组合物具有50-800g/kg的粗蛋白质含量，并且另外包含至少一种如本文要求保护的蛋白酶。
另外或者在(以上所指示的粗蛋白质含量的)替代方案中，本发明的动物饲料组合物具有的可代谢能量含量是10-30MJ/kg；和/或钙含量是0.1-200g/kg；和/或可用的磷含量是0.1-200g/kg；和/或甲硫氨酸含量是0.1-100g/kg；和/或甲硫氨酸加上半胱氨酸的含量是0.1-150g/kg；和/或赖氨酸含量是0.5-50g/kg。
在具体实施方案中，可代谢能量、粗蛋白质、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加上半胱氨酸和/或赖氨酸的含量是在如WO 01/58276的表B中所公开的范围2、3、4或5中任一个范围内。
为了确定mg蛋白酶蛋白/kg饲料，将蛋白酶从饲料组合物中纯化，并且使用相关测定确定纯化的蛋白酶的比活性(参见蛋白酶活性、底物和测定)。还使用同一测定确定所述饲料组合物的蛋白酶活性，并且在这两个确定的基础上，计算以mg蛋白酶蛋白质/kg饲料计的剂量。
相同的原理适用于测定饲料添加剂中的mg蛋白酶蛋白质。
根据本发明的拟诺卡氏菌属菌种NRRL 18262的蛋白酶可以使用常规方法来制备，大体上如WO01/58276所述的。包含拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262的蛋白酶的饲料添加剂也是可商业获得的(例如作为ProAct，由DSM Nutritional Products,Kaiseraugst，瑞士供应)或者可以容易由本领域技术人员使用本领域已熟知的工艺和方法来制备。ProAct的特征在于所关注的pNA蛋白酶活性。75’000PROT/g并且含有6.5％-8％蛋白酶蛋白质。
本文所述且要求保护的发明的范围不会被本文所公开的特定实施方案所限制，因为这些实施方案旨在作为本发明的若干方面的说明。任何等同实施方案旨在处于本发明的范围内。实际上，除了本文所示和所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员通读以上描述将是明显的。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围之内。
以下实施例进一步说明了本发明。
实施例1pH-稳定性测定
可以使用Suc-AAPF-pNA(Sigma S-7388)来获得pH稳定性曲线。
测定缓冲液：100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％X-100，用HCl或NaOH调节至pH-值2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或11.0。
蛋白酶样品的制备：应将样品(在1mM琥珀酸、2mM CaCl2、100mM NaCl、pH 6.0中并且具有A280吸收率>10)在每个pH值下在测定缓冲液稀释并且测试至A280＝1.0。
在37℃下孵育2小时之后，应将蛋白酶样品在100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mMCHES、100mM CABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％X-100、pH 9.0中稀释，使所有样品的pH为pH 9.0。
对于在25℃下的活性测量，将300μl稀释的蛋白酶样品与1.5ml pH 9.0测定缓冲液混合并且通过添加1.5ml pNA底物(50mg溶解于1.0ml DMSO并且用0.01％X-100进一步稀释45倍)来开始活性反应。在混合之后，通过分光光度计监控A405的增加，作为(残余)蛋白酶活性测量值。
实施例2–蛋白水解酶和维生素C的组合对肉鸡的性能的作用
实验设计
产品
蛋白水解酶(ProAct)和维生素C(50)均以粉末形式提供并且准备好使用DSM Nutritional Products的制剂。
鸟类和膳食处理
数天大的雄性肉鸡仔(Ross 308)从当地孵卵处获得并且在环境控制室的笼中饲养。在d 0，单独称量鸡仔并且在体重基础上将640只鸡分配到80只笼(8只鸡/笼)中。然后将8个膳食处理(表1)各自随机分配到10个重复笼中。从0-21天和22-35天进食实验膳食。
在第1周，经由饮用水向所有鸡仔给予肉鸡球虫病疫苗(Immucox,Pacificvet,Christchurch,新西兰)。
在d 1将温度维持在32℃并且然后逐渐降低至24℃至第21天。鸡接受20小时的荧光照射并且自由摄取膳食和水。将鸡每天检查至少三次(9.00am、1.00pm和4.00pm)并且记录鸡行为或状况的异常方面。称量患病或受伤动物并且将它们从研究中去除。
表1.膳食处理和酶鉴别的详情
包含率：RONOZYME PROACT，200g/t(＝大约15.5g蛋白酶蛋白质/t)；维生素C，200mg/kg。所有膳食均具有100g/t RONOZYME HIGHPHOS(GT)和100g/t RONOZYME WX的背景。
膳食
实验设计是处理的2×2×2因子排列，其具有两个基础对照膳食(阳性对照和阴性对照)、两个水平的酶(具有和不具有)和两个水平的维生素C(具有和不具有)。
对于每个研究阶段(0-21和22-35d)，将基于小麦和豆粕的两个对照膳食(阳性和阴性)混合(表2)。然后使用PC和NC膳食，通过添加ProAct酶和维生素C混合物来开发8个膳食处理。所有膳食均以球粒形式进食。
表2.阳性和阴性对照膳食的组成百分比和计算的分析(0-21和22-35d)
1以每千克膳食供应：抗氧化剂，100mg；生物素，0.2mg；泛酸钙，12.8mg；胆钙化醇，60μg；氰钴胺，0.017mg；叶酸，5.2mg；甲萘醌，4mg；烟酸，35mg；吡哆醇，10mg；反式-视黄醇，3.33mg；核黄素，12mg；硫胺素，3.0mg；dl-α-生育酚乙酸酯，60mg；氯化胆碱，638mg；Co，0.3mg；Cu，3.0mg；Fe，25mg；I，1mg；Mn，125mg；Mo，0.5mg；Se，200μg；Zn，60mg。
测量
生长性能：饲料和水在35天实验时间段期间随意可用。在第7、14、21、28和35天记录体重和饲料摄取。每日记录死亡率。对于在实验过程中死亡或剔除的任何鸡的体重，校正饲料/增加值。
统计学分析
使用SAS(2004)的通用线性模型程序使数据进行ANOVA。显著性差异被认为是在P<0.05处。当检测显著F-检验时，使用最小显著性差异检验分离平均值。
结果
性能数据
在1-21和1-35d时间段期间的平均死亡率分别是1.3％和5.8％。孵化后1-21d和1-35d期间膳食处理对肉鸡的体重增加、饲料摄取和饲料/增加的作用分别总结在表3和表4中，并且1-35d时间段的FCR计算呈现在图1中。
表3.膳食处理对进食小麦-大豆膳食的雄性肉鸡的性能的影响(孵化后1-21d)
P<0.10>0.05；*P<0.05；**P<0.01；****P<0.0001。
1关于处理的详情参见表1。每个均值代表来自十次重复(8只鸡/重复)的值。
2根据死亡率进行校正。
表4.膳食处理对进食小麦-大豆膳食的雄性肉鸡的性能的影响(孵化之后1-35d)
*P<0.05；**P<0.01；****P<0.0001。
1关于处理的详情参见表1。每个均值代表来自十次重复(8只鸡/重复)的值。
2根据死亡率进行校正。
结果显示确实维生素C与ProAct的组合在早期性能方面具有添加剂的益处。蛋白酶作用(作为主要作用)是显著的，因为它是PC相对于NC的主要作用。ProAct/维生素C相互作用具有0.07的P值，该值是显著的，即ProAct在具有高剂量维生素C的情况下作用更佳并且确实维生素C本身的作用取决于处于膳食中的ProAct。另外，直至d35未看到对BWG的明显作用，但仍有FCR作用。
实施例3–补充有维生素C的两种蛋白水解酶对肉鸡的性能的作用
将490天大的Ross 308雄性肉鸡随机分成7个处理组(6个实验组加上一个对照组)，其中10次重复，每次重复有7只鸡。六个实验组具有两个水平的维生素C(0和300mg/kg饲料)和三次酶处理：
-没有饲料酶，
-Novus CIBENZA(在350mg/kg饲料的水平下的Bacillus licheniformis PWD-1)，
-DSMProAct(在200mg/kg饲料的水平下)，
这是在2×3因子设计加上一个阳性对照中。阳性对照(PC)的膳食是基于小麦和豆粕并且所有营养物均充足。其他6个实验组使用也基于小麦和豆粕但是含有比PC少的蛋白质(97.5％)和可消化氨基酸(95.5％)的阴性对照(NC)膳食饲养。在试验期间这些鸡进食开食料(starter diet)(1-14d)。
实验设计和膳食
所述鸡随意进食开食料(1-14d)并且在整个试验过程中随意喝水。在每个膳食中分别包含200和100mg/kg饲料的NP(CT)和WX。对于每种膳食制剂，基础膳食以糊状物形式制备，如表5所指示的，然后将基础NC膳食细分为六个实验膳食，将作为可消化标记的适当量的酶产品和TiO2(0.3％)与作为预混合物的少量基础膳食混合，然后将其添加到饲料中，以根据处理获得最终浓度。在混合之后，饲料在75℃-80℃下成球粒。
所有鸡均在环境控制室的笼中饲养并且在第一周接受23L:1D光照方案并且之后接受20L:4D，直到试验结束。在到达那天将该室的温度维持在32℃±1℃下并且根据鸡的年龄特异性要求进行调整。
在d 4，经由口服施用向所有鸡给予肉鸡球虫病疫苗(MSD,Canada)作为轻度刺激。以每周间隔记录体重和饲料摄取。每日记录死亡率。使用死亡动物的体重调整饲料转化率(FCR)，所述饲料转化率是通过将总饲料摄取分别除以活鸡的体重增加加上每个笼中死鸡的重量来计算。
表5：基础膳食的成分和营养素组成
1所提供的维生素-矿物质预混合物(每kg膳食)＝维生素A 8250IU、维生素D32187.5IU、Hy-D 69μg、维生素E 41.25IU、维生素K3 5mg、维生素B1 2.5mg、维生素B28.75mg、维生素B6 5mg、维生素B12 0.025mg、生物素0.25mg、叶酸2.5mg、烟酰胺50mg、D-泛酸15mg、Fe 120mg、Cu 10mg、Mn 110mg、Zn 90mg、I 0.5mg、Se 0.25mg、乙氧喹66.6％5mg、氯化胆碱400mg。
结果
在表6中呈现了维生素C和酶补充剂对生长性能的作用。主要作用显示进食维生素C的鸡与未接受维生素C的鸡相比在d 1至7期间具有改进的FCR(1.156相对于1.209,P＝0.011)。对于时间段d 1至14观察到类似的作用(1.440相对于1.530，P＝0.016)并且作为时间段d 1至d 21的数值作用(1.478相对于1.516，P＝0.080)。
表6：生长性能(FCR)

Claims (11)

1.一种用于改进农场动物的生长性能的方法，所述方法包括用与维生素C、其衍生物或其代谢物组合的有效量的一种或多种蛋白水解酶(蛋白酶)处理常规动物膳食的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中所述生长性能被测量为所述动物的平均每日体重增加(ADWG)、平均每日饲料摄取(ADFI)和/或饲料转化率(FCR)。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶是酸稳定性丝氨酸蛋白酶，其来源于达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种DSM 43235(A1918L1)、葱绿拟诺卡氏菌DSM 15649(NN018335L1)、葱绿拟诺卡氏菌(先前的白)DSM 14010(NN18140L1)、拟诺卡氏菌属菌种DSM16424(NN018704L2)、嗜碱拟诺卡氏菌DSM 44657(NN019340L2)和卢森坦拟诺卡氏菌DSM44048(NN019002L2)，以及同源的蛋白酶。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述动物选自由非反刍动物和反刍动物组成的组，反刍动物包括但不限于绵羊、山羊和牛，并且非反刍动物包括但不限于马、兔、猪，猪包括但不限于乳猪、猪仔、生长肥育猪、母猪和公猪；以及家禽，例如火鸡、鸭和鸡。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述蛋白酶的预期剂量是0.01-200mg蛋白酶蛋白质/kg膳食。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中维生素C的预期剂量是50-500mg维生素C/kg膳食。
7.与维生素C、其衍生物或其代谢物组合的一种或多种蛋白水解酶在常规动物膳食中的用途，所述用途是用于增加农场动物的体重增加和/或改进饲料转化率。
8.根据权利要求7的用途，其中所述蛋白酶是酸稳定性丝氨酸蛋白酶，其来源于达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种DSM 43235(A1918L1)、葱绿拟诺卡氏菌DSM 15649(NN018335L1)、葱绿拟诺卡氏菌(先前的白)DSM 14010(NN18140L1)、拟诺卡氏菌属菌种DSM16424(NN018704L2)、嗜碱拟诺卡氏菌DSM 44657(NN019340L2)和卢森坦拟诺卡氏菌DSM44048(NN019002L2)，以及同源的蛋白酶。
9.根据权利要求7或8的用途，其中所述动物选自由非反刍动物和反刍动物组成的组，反刍动物包括但不限于绵羊、山羊和牛，并且非反刍动物包括但不限于马、兔、猪，猪包括但不限于乳猪、猪仔、生长肥育猪、母猪和公猪；以及家禽，例如火鸡、鸭和鸡。
10.根据权利要求7-9中任一项的用途，其中所述蛋白酶的预期剂量是0.01-200mg蛋白酶蛋白质/kg膳食。
11.根据权利要求7-10中任一项的用途，其中维生素C的预期剂量是50-500mg维生素C/kg膳食。
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