CN107402306A - 一种磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法 - Google Patents

一种磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法 Download PDF

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CN107402306A CN201710829906.8A CN201710829906A CN107402306A CN 107402306 A CN107402306 A CN 107402306A CN 201710829906 A CN201710829906 A CN 201710829906A CN 107402306 A CN107402306 A CN 107402306A
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Abstract

本发明涉及一种磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒，包括如下试剂：含有5~100ng/mL的生物素标记的心磷脂抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原、为5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的混合溶液；浓度为10~1000ng/mL的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液；浓度为0.1~1 mg/mL的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液。本试剂盒的灵敏度高、精密度高、线性范围宽、稳定性好、有效期长，环保性能大大提高。

Description

一种磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法 和检测方法
技术领域
本发明属于医疗器械体外诊断试剂化学发光免疫分析领域，特别是涉及一种磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法。
背景技术
人体内的磷脂主要包括带负电荷的心磷脂(Cardiolipin,CL)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PI)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PS)，带中性电荷的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)等。抗磷脂抗体(Anti-phospholipids,APL)是一族针对自身抗原包括磷脂或带负电荷磷脂与载体蛋白复合物的病理性抗体。抗磷脂抗体综合症 (antiphospholipidsyndrome,APS)，是一组与抗磷脂抗体有关的自身免疫性疾病。典型的临床表现有动脉静脉血栓、血小板减少以及习惯性流产等，多见于年轻人，60％-80％为女性患者，女性中位年龄为30岁。APS可分为原发性APS和继发性APS，继发性APS多见于***性红斑狼疮(SLE)或类风湿关节炎(RA)等自身免疫病。此外，还有一种少见的恶性APS(catastrophic APS)，表现为短期内进行性广泛血栓形成，造成多器官功能衰竭甚至死亡。 APS患者血中检出APL(IgG型和/或IgM型)是确立APS诊断的必要条件。
放射免疫分析(RIA)的高放射性、有效期短、给操作者带来的健康隐患及对环境的污染，普通微孔板酶联免疫分析(EIA)精密度差、灵敏度差、无法实现定量检测，也不容易实现全自动化。传统的ELISA灵敏度较低。
传统的抗磷脂抗体综合征检测项目为心磷脂抗体，其存在灵敏度低的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高的磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒。
本发明所要解决的另一技术问题是提供上述试剂盒的制备方法。
本发明所要解决的再一技术问题是提供采用上述试剂盒进行检测的检测方法。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
本发明的一个目的是一种磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒，包括如下试剂：
含有5～100ng/mL的生物素标记的心磷脂抗原、5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原、5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原、 5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的混合溶液；
浓度为10～1000ng/mL的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液；
浓度为0.1～1mg/mL的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液。
优选地，所述的混合溶液中所述的生物素标记的心磷脂抗原的浓度为 10～20ng/mL。
优选地，所述的混合溶液中所述的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原的浓度为10～20ng/mL。
优选地，所述的混合溶液中所述的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原的浓度为10～20ng/mL。
优选地，所述的混合溶液中所述的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的浓度为10～20ng/mL。
优选地，所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液的浓度为 90～110ng/mL。优选地，所述的心磷脂抗原、所述的磷脂酰乙醇胺抗原、所述的磷脂酰肌醇抗原、所述的磷脂酰丝氨酸抗原分别经过氨基修饰。
优选地，所述的生物素为N-羟基琥珀酰亚胺。
优选地，所述的心磷脂抗原与所述的生物素的投料摩尔比为1：10～100；所述的磷脂酰乙醇胺抗原与所述的生物素的投料摩尔比为1：10～100；所述的磷脂酰肌醇抗原与所述的生物素的投料摩尔比为1：10～100；所述的磷脂酰丝氨酸抗原与所述的生物素的投料摩尔比为1：10～100；所述的碱性磷酸酶与所述的鼠抗人IgM单克隆抗体的投料质量比为1～10：1；所述的纳米磁微粒的羧基含量不低于0.4mmol/g。
进一步优选地，所述的心磷脂抗原与所述的生物素的投料摩尔比为1： 18～22；所述的磷脂酰乙醇胺抗原与所述的生物素的投料摩尔比为1：18～22；所述的磷脂酰肌醇抗原与所述的生物素的投料摩尔比为1：18～22；所述的磷脂酰丝氨酸抗原与所述的生物素的投料摩尔比为1：18～22；所述的碱性磷酸酶与所述的鼠抗人IgM单克隆抗体的投料质量比为1～2：1。
优选地，所述的试剂盒还包括两个或两个以上不同浓度水平的抗磷脂 IgM抗体溶液的质控品、两个或两个以上不同浓度水平的抗磷脂IgM抗体溶液的校准品、标准曲线、样本稀释液和化学发光底物。
进一步优选地，所述的质控品包括抗磷脂IgM抗体，0.005～0.1mol/L、 pH为7～8的磷酸盐缓冲液，质量浓度为0.1～5％的牛血清蛋白和质量浓度为 0.01～1％的防腐剂；
所述的校准品包括抗磷脂IgM抗体，0.005～0.1mol/L、pH为7～8的磷酸盐缓冲液，质量浓度为0.1～5％的牛血清蛋白和质量浓度为0.01～1％的防腐剂；
所述的样本稀释液包括0.005～0.1mol/L、pH为7～8的磷酸盐缓冲液，质量浓度为0.1～5％的牛血清蛋白和质量浓度为0.01～1％的防腐剂。
更为优选地，所述的质控品包括抗磷脂IgM抗体，0.009～0.011mol/L、 pH为7～7.5的磷酸盐缓冲液，质量浓度为0.9～1.1％的牛血清蛋白和质量浓度为0.01～1％的防腐剂；
所述的校准品包括抗磷脂IgM抗体，0.009～0.011mol/L、pH为7～7.5 的磷酸盐缓冲液，质量浓度为0.9～1.1％的牛血清蛋白和质量浓度为0.01～1％的防腐剂；
所述的样本稀释液包括0.009～0.011mol/L、pH为7～7.5的磷酸盐缓冲液，质量浓度为0.9～1.1％的牛血清蛋白和质量浓度为0.01～1％的防腐剂。
进一步优选地，一个所述的质控品中的抗磷脂IgM抗体的浓度为 4～21RU/mL，另一个所述的质控品中的抗磷脂IgM抗体的浓度为 50～100RU/mL；一个所述的校准品中的抗磷脂IgM抗体的浓度为 10～40RU/mL，另一个所述的校准品中的抗磷脂IgM抗体的浓度为100～300RU/mL。更为优选地，一个所述的质控品中的抗磷脂IgM抗体的浓度为9～11RU/mL，另一个所述的质控品中的抗磷脂IgM抗体的浓度为 72～88RU/mL；一个所述的校准品中的抗磷脂IgM抗体的浓度为 18～22RU/mL，另一个所述的校准品中的抗磷脂IgM抗体的浓度为180～220RU/mL。
本发明的另一个目的是提供一种所述的磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，
所述的含有5～100ng/mL的生物素标记的心磷脂抗原、5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原、5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原、5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的混合溶液的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)、将所述的心磷脂抗原、所述的磷脂酰乙醇胺抗原、所述的磷脂酰肌醇抗原、所述的磷脂酰丝氨酸抗原分别用0.01～0.03mol/L、pH为 7～7.5的磷酸盐缓冲液，在2～8℃下透析过夜，分别配制成心磷脂抗原溶液、磷脂酰乙醇胺抗原溶液、磷脂酰肌醇抗原溶液、磷脂酰丝氨酸抗原溶液，
步骤(2)、将所述的生物素溶于二甲基亚砜中配制成物质的量浓度为 8～12mM的生物素溶液，
步骤(3)、将所述的心磷脂抗原溶液、所述的磷脂酰乙醇胺抗原溶液、所述的磷脂酰肌醇抗原溶液、所述的磷脂酰丝氨酸抗原溶液分别与所述的生物素溶液混合均匀，在15～40℃下放置20～40分钟，然后分别加入0.05～1.1M 的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，终止反应，在15～40℃下放置8～12分钟，然后用含质量比为0.1～5％的牛血清白蛋白、pH为7～8、物质的量浓度为0.005～0. 1mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释分别得到所述的生物素标记的心磷脂抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原溶液；
步骤(4)、将所述的生物素标记的心磷脂抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原溶液进行混合得到所述的含有 5～100ng/mL的生物素标记的心磷脂抗原、5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原、5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原、5～100ng/mL 的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的混合溶液；
所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)、将鼠抗人IgM单克隆抗体加入到浓度为8～12mg/ml的2-亚胺基硫烷盐酸盐偶联剂中，在15～40℃下静置18～25分钟，加入 0.01～0.11mol/L的甘氨酸溶液，在15～40℃下静置4～6分钟，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后的鼠抗人IgM单克隆抗体，2～8℃保存备用，
步骤(2)、将碱性磷酸酶溶液加入到1～10mg/ml的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，在15～40℃下静置10～100分钟，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，2～8℃保存备用，
步骤(3)、将所述的活化后的鼠抗人IgM单克隆抗体与所述的活化后碱性磷酸酶混合，在2～8℃下静置12～24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得连接物浓溶液，在2～8℃保存备用，
步骤(4)、将所述的连接物浓溶液用含质量比为0.1～5％的牛血清白蛋白、pH为5.8～8.2、物质的量浓度为0.01～0.1mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液进行稀释制得所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液；
所述的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液通过采用质量比为0.1～5％的牛血清白蛋白、pH为7～8、物质的量浓度为0.005～0.1mol/L的磷酸盐缓冲液对链霉亲和素标记的纳米磁微粒进行重悬制得。
优选地，所述的含有5～100ng/mL的生物素标记的心磷脂抗原、 5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原、5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原、5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的混合溶液的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)、将所述的心磷脂抗原、所述的磷脂酰乙醇胺抗原、所述的磷脂酰肌醇抗原、所述的磷脂酰丝氨酸抗原分别用0.01～0.03mol/L、pH为 7～7.5的磷酸盐缓冲液，在2～8℃下透析过夜，分别配制成心磷脂抗原溶液、磷脂酰乙醇胺抗原溶液、磷脂酰肌醇抗原溶液、磷脂酰丝氨酸抗原溶液，
步骤(2)、将所述的生物素溶于二甲基亚砜中配制成物质的量浓度为 8～12mM的生物素溶液，
步骤(3)、将所述的心磷脂抗原溶液、所述的磷脂酰乙醇胺抗原溶液、所述的磷脂酰肌醇抗原溶液、所述的磷脂酰丝氨酸抗原溶液分别与所述的生物素溶液混合均匀，在15～40℃下放置20～40分钟，然后分别加入0.9～1.1M 的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，终止反应，在15～40℃下放置8～12分钟，然后用含质量比为0.9～1.1％的牛血清白蛋白、pH为7～7.5、物质的量浓度为 0.009～0.011mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释分别得到所述的生物素标记的心磷脂抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原溶液；
步骤(4)、将所述的生物素标记的心磷脂抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原溶液进行混合得到所述的含有 5～100ng/mL的生物素标记的心磷脂抗原、5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原、5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原、5～100ng/mL 的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的混合溶液。
优选地，所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)、将鼠抗人IgM单克隆抗体加入到浓度为8～12mg/ml的2-亚胺基硫烷盐酸盐偶联剂中，在15～40℃下静置18～25分钟，加入 0.09～0.11mol/L的甘氨酸溶液，在15～40℃下静置4～6分钟，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后的鼠抗人IgM单克隆抗体，2～8℃保存备用，
步骤(2)、将碱性磷酸酶溶液加入到4～6mg/ml的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，在15～40℃下静置25～35分钟，用 G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，2～8℃保存备用，
步骤(3)、将所述的活化后的鼠抗人IgM单克隆抗体与所述的活化后碱性磷酸酶混合，在2-8℃下静置12～24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得连接物浓溶液，在2～8℃保存备用，
步骤(4)、将所述的连接物浓溶液用含质量比为0.9～1.1％的牛血清白蛋白、pH为5.8～6.2、物质的量浓度为0.045～0.0.055mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液进行稀释制得所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液。
优选地，所述的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液通过采用质量比为 0.9～1.1％的牛血清白蛋白、pH为7～7.5、物质的量浓度为0.009～0.0.011mol/L 的磷酸盐缓冲液对链霉亲和素标记的纳米磁微粒进行重悬制得。
本发明的第三个目的是提供一种所述的磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤(1)、将样本原液与样本稀释液按体积比为1：10～100的比例混合得到稀释后待测样本；
步骤(2)、在检测管中加入所述的稀释后待测样本，所述的含有 5～100ng/mL的生物素标记的心磷脂抗原、5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原、5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原、5～100ng/mL 的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的混合溶液和所述的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液，在25～40℃下温育10～30min得到第一溶液；其中，所述的稀释后待测样本的添加量为10～60μL，所述的稀释后待测样本，所述的含有5～100ng/mL的生物素标记的心磷脂抗原、5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原、5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原、 5～100ng/mL的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的混合溶液和所述的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的投料体积比为1：0.5～4：0.5～4；
步骤(3)、添加磁场，使所述的第一溶液在磁场中沉降，去除上清液，然后经清洗液多次清洗后，去除磁场，得到第二溶液；
步骤(4)、向所述的第二溶液中加入所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM 单克隆抗体溶液，在25～40℃下孵育10～30min得到第三溶液；其中，所述的稀释后待测样本与所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液的投料体积比为1：1.5～10.5；
步骤(5)、添加磁场，使所述的第三溶液在磁场中沉降，去除上清液，然后经清洗液多次清洗后，去除上清液，加入所述的化学发光底物，去除磁场，充分混悬后，在25～40℃下孵育1～10min，检测3秒内的相对发光强度值；其中，所述的稀释后待测样本与所述的化学发光底物的投料体积比为1： 1～15。
优选地，所述的检测方法，包括如下步骤：
步骤(1)、将样本原液与样本稀释液按体积比为1：18～22的比例混合得到稀释后待测样本；
步骤(2)、在检测管中加入所述的稀释后待测样本，含有所述生物素标记的心磷脂抗原溶液、生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原、生物素标记的磷脂酰肌醇抗原、生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的混合溶液和所述的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液，在36～38℃下温育10～20min得到第一溶液；其中，所述的待测样本稀释液的添加量为18～22μL，所述的稀释后待测样本、所述的生物素标记的心磷脂抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原溶液和所述的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的投料体积比为1：2.4～2.6：2.4～2.6；
步骤(3)、添加磁场，使所述的第一溶液在磁场中沉降，去除上清液，然后经清洗液多次清洗后，去除磁场，得到第二溶液；
步骤(4)、向所述的第二溶液中加入所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM 单克隆抗体溶液，在36～38℃下孵育10～20min得到第三溶液；其中，所述的稀释后待测样本与所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液的投料体积比为1：4.5～5.5；
步骤(5)、添加磁场，使所述的第三溶液在磁场中沉降，去除上清液，然后经清洗液多次清洗后，去除上清液，加入所述的化学发光底物，去除磁场，充分混悬后，在36～38℃下孵育4～6min，检测3秒内的相对发光强度值；其中，所述的稀释后待测样本与所述的化学发光底物的投料体积比为1： 9～11。
优选地，所述的检测方法在全自动化学发光仪上自动检测或手动检测。
本发明的检测原理为：采用间接法原理：生物素标记的磷脂抗原(包括心磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸)、样本中的APL IgM 与包被链霉亲和素的磁微粒通过免疫反应，形成免疫复合物，通过磁分离***，洗涤去除未结合的抗原、抗体和杂质后，加入碱性磷酸酶标记的鼠抗人 IgM单克隆抗体与上述免疫复合物结合。通过磁分离***，洗涤去除未结合的抗体后加入发光底物，该复合物催化发光底物发出光子，发光强度与APLIgM的含量成正比。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明克服了放射免疫分析的高污染、有效期短和普通微孔板酶联免疫分析精密度差、灵敏度差的缺点，与传统的抗磷脂抗体综合征检测项目心磷脂抗体相比，本发明从多种磷脂抗体中选出磷脂酰乙醇胺抗体、磷脂酰肌醇抗体、磷脂酰丝氨酸抗体与心磷脂抗体一起使用，从而大大提高了临床检测的灵敏度。
本发明进一步通过使用碱性磷酸酶酶促化学发光***、磁微粒分离***、独特的抗原抗体偶联技术，并对试剂盒的组成及各试剂配制工艺等的各种关键技术的优化，使得本试剂盒的灵敏度高、精密度高、线性范围宽、稳定性好、有效期长，环保性能大大提高。
附图说明
附图1为本发明的内置标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用试剂均可市购获得。
实施例1：本发明利用磁微粒的载体和分离技术，采用试剂盒A与试剂盒B配套使用，当然也可以将所有试剂放于一个试剂盒内共同销售。
试剂盒A包括如下试剂：
(1)、含有15ng/mL的生物素标记的心磷脂抗原、15ng/mL的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原、15ng/mL的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原、15ng/mL 的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的混合溶液；
(2)、浓度为100ng/mL的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液；
(3)、浓度为0.4mg/mL的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液。
试剂盒B包括如下试剂：
(1)、质控品：浓度为10RU/mL的抗磷脂IgM抗体溶液、浓度为 80RU/mL的抗磷脂IgM抗体溶液；
(2)、校准品：浓度为20RU/mL的抗磷脂IgM抗体溶液、浓度为 200RU/mL的抗磷脂IgM抗体溶液；
(3)、标准曲线，参见附图1；
(4)、样本稀释液；
(5)、化学发光底物。
实施例2：实施例1所示试剂盒的制备
(一)、生物素标记的心磷脂抗原溶液、生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原溶液、生物素标记的磷脂酰肌醇抗原溶液、生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原溶液的制备方法相同，下面详述生物素标记的心磷脂抗原溶液的制备方法，其他溶液的制备方法不再赘述。
生物素标记的心磷脂抗原溶液的制备方法包括如下步骤：
1.将氨基修饰的心磷脂抗原用0.02mol/L、pH7.4的PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)在4℃下透析过夜，中间换液一次。
2.将BNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)平衡至室温(20℃)，用万分之一分析天平(最大称量200g)称取1.5mg BNHS溶于326μL DMSO(二甲基亚砜) 中，配制成10mM的BNHS溶液(现用现配)；
3.按照氨基修饰的心磷脂抗原与BNHS摩尔比为1:20的比例在步骤1 所得的溶液中加入步骤2所得的溶液，混合均匀，室温放置反应30分钟；
4.向步骤3中加入1M的TRIS(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液至终浓度为10mM，终止反应，室温放置反应10min，即获得生物素标记的心磷脂抗原浓溶液，用含1％牛血清白蛋白、PH 7.4、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液将生物素标记的心磷脂抗原浓缩液稀释到15ng/ml，完成生物素标记的心磷脂抗原溶液的制备。
(二)、含有15ng/mL的生物素标记的心磷脂抗原、15ng/mL的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原、15ng/mL的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原、 15ng/mL的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的混合溶液的制备方法为：将按上述步骤(一)的方法制得的生物素标记的心磷脂抗原溶液、生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原溶液、生物素标记的磷脂酰肌醇抗原溶液、生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原溶液进行混合制得。
(三)、碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液的制备包括如下步骤：
1.取1mg鼠抗人IgM单克隆抗体，加入10mg/ml的偶联剂2-IT(2- 亚胺基硫烷盐酸盐)溶液3μl，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μl，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，2-8℃保存备用；
2.取1.5mg的ALP(碱性磷酸酶)溶液，加入5mg/ml的SMCC(4-(N- 马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)溶液15μl，室温静置 30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，4℃保存备用；
3.将活化的鼠抗人IgM单克隆抗体与活化的ALP混合，4℃条件下静置18h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得连接物浓溶液，4℃保存备用。
4.将连接物浓溶液用含1％牛血清白蛋白、PH6.0、0.05mol/L的MES (2-吗啉乙磺酸)冲液稀释到100ng/ml，完成碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM 单克隆抗体溶液的制备。
(四)、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的制备为：
用含质量比1％的牛血清白蛋白、PH7.4、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液将链霉亲和素标记磁微粒重悬到0.4mg/ml，完成链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的制备。链霉亲和素标记磁微粒采购于Life Technologies。
(五)、质控品的制备
质控品1：含抗APL-IgM抗体的商业血清，并且抗APL-IgM抗体在质控品中的浓度为10RU/mL，pH 7.4、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，质量浓度为1％的牛血清白蛋白，质量浓度为0.5％的防腐剂。
质控品2：含抗APL-IgM抗体的商业血清，并且抗APL-IgM抗体在质控品中的浓度为80RU/mL，pH 7.4、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，质量浓度为1％的牛血清白蛋白，质量浓度为0.5％的防腐剂。
(六)、校准品的制备
校准品1：含抗APL-IgM抗体的商业血清，并且抗APL-IgM抗体在质控品中的浓度为00RU/mL，pH 7.4、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，质量浓度为1％的牛血清白蛋白，质量浓度为0.5％的防腐剂。
校准品2：含抗APL-IgM抗体的商业血清，并且抗APL-IgM抗体在质控品中的浓度为200RU/mL，pH 7.4、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，质量浓度为1％的牛血清白蛋白，质量浓度为0.5％的防腐剂。
(七)、样本稀释液的制备
pH 7.4、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，质量浓度为1％的牛血清白蛋白，质量浓度为0.5％的防腐剂。
实施例3：检测方法，由全自动化学发光分析仪自动完成，也可手工操作完成。
步骤1：在检测管中加入20ul稀释后待测样本(样本原液与样本稀释液体积比为1:20，混匀)，然后加入50ul混合有生物素标记的心磷脂抗原，生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原，生物素标记的磷脂酰肌醇抗原溶液，生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的溶液和50ul链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液，混匀，在37℃下温育15分钟；
步骤2：添加磁场，使步骤1温育后的体系在磁场中沉降，去除上清液，经清洗液多次清洗后，去除磁场；
步骤3：然后向步骤2洗涤后的体系中加入100ul碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液，混匀，在37℃下温育15分钟；
步骤4：添加磁场，使步骤3温育后的体系在磁场中沉降，去除上清液，经清洗液多次清洗后，去除上清液；
步骤5：加入200ul化学发光底物，去除磁场，充分混悬后，在37℃下温育5分钟，检测3秒内相对发光强度值(RLU)。
实施例4：
本发明所制备的试剂盒的性能检测：
(一)灵敏度评价(最低检测限LOD)
检测“0”浓度样本，重复检测20次，计算相对发光强度(RLU)的平均值(M)和标准差(SD)，并计算M+2SD值，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。本方法的灵敏度不大于 1RU/mL。
(1)A点发光值，结果参见表1。
表1
A点发光均值X＝32589
SD＝1850
X+2SD＝34439
(2)B点发光值，结果参见表2。
表2
APL gG-STD-B(RLU)
113362
107396
113260
118489
108697
B点发光均值X＝112241
(3)灵敏度＝0.232RU/mL。
(二)精密度评价
(1)分析内精密度
将实施例1中的试剂盒一批，分别测定低、中、高三种不同浓度的血清， 10孔平行测定，结果参见表3，得出批内变异系数为3.11％～5.69％。
表3
测定血清浓度(RU/mL) 测定次数 分析内CV(％)
10 10 3.11
20 10 4.32
80 10 5.69
(2)分析间精密度
取实施例1中制备的试剂盒测定低、中、高三种不同浓度的血清，4孔平行测定，上午下午各测试一次，连续测试10天，每份血清得到80个浓度测值。统计分析间变异系数为5.36％～6.78％，结果见表4。
表4
测定血清浓度(RU/mL) 测定次数 分析内CV(％)
10 80 5.36
20 80 5.81
80 80 6.78
(三)准确度评价
在2例混合血清样本中添加不同量人APL IgM标准品，形成3个浓度水平的血清添加样本，添加物体积小于总体积的10％。检测样本浓度，按下述公式计算回收率。本方法血清基质回收率在85-115％之间。数据参见表5。
R：回收率；
V：加入标准溶液的体积；
V0：人源样品的体积；
C：人源样品加入标准溶液后的检测浓度；
C0：人源样品的检测浓度；
Cs：标准溶液的浓度。
表5
(四)方法学比对
用实施例1的试剂盒，常见的某商业公司市售的心磷脂检测试剂盒，仅添加生物素标记的心磷脂抗原和生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原的试剂盒 (其他均与实施例1的试剂盒相同)，仅添加生物素标记的心磷脂抗原、生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原和生物素标记的磷脂酰肌醇抗原的试剂盒(其他均与实施例1的试剂盒相同)同时检测254例已经确诊APS阳性或阴性的病人血清。其检测结果分别见表6，可见本发明灵敏性94.73％，特异性98.74％，总符合率97.24％；而某公司市售常见的心磷脂检测试剂盒灵敏性 42.11％，特异性98.74％，总符合率77.56％。与传统的抗磷脂抗体综合征检测项目心磷脂抗体相比，本发明加入了另外三种磷脂抗体(磷脂酰乙醇胺抗体、磷脂酰肌醇抗体、磷脂酰丝氨酸抗体)的检测能使临床灵敏度大大提高。
表6
(五)热稳定性评价
对实施例1的试剂盒分别进行4℃12个月和37℃7天的稳定性实验，结果表明试剂盒标准品发光强度的变化、分析内和分析间精密度、准确性等指标均在正常范围之内，试剂盒有效期可达12个月。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：包括如下试剂：
含有5~100ng/mL的生物素标记的心磷脂抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的混合溶液；
浓度为10~1000ng/mL的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液；
浓度为0.1~1 mg/mL的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液。
2.根据权利要求1所述的磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：所述的心磷脂抗原、所述的磷脂酰乙醇胺抗原、所述的磷脂酰肌醇抗原、所述的磷脂酰丝氨酸抗原分别经过氨基修饰。
3.根据权利要求1所述的磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：所述的生物素为N-羟基琥珀酰亚胺。
4.根据权利要求1所述的磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：所述的心磷脂抗原与所述的生物素的投料摩尔比为1：10~100；所述的磷脂酰乙醇胺抗原与所述的生物素的投料摩尔比为1：10~100；所述的磷脂酰肌醇抗原与所述的生物素的投料摩尔比为1：10~100；所述的磷脂酰丝氨酸抗原与所述的生物素的投料摩尔比为1：10~100；所述的碱性磷酸酶与所述的鼠抗人IgM单克隆抗体的投料质量比为1~10：1；所述的纳米磁微粒的羧基含量不低于0.4mmol/g。
5.根据权利要求1所述的磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括两个或两个以上不同浓度水平的抗磷脂IgM抗体溶液的质控品、两个或两个以上不同浓度水平的抗磷脂IgM抗体溶液的校准品、标准曲线、样本稀释液和化学发光底物。
6. 根据权利要求5所述的磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：所述的质控品包括抗磷脂IgM抗体，0.005~0.1 mol/L、pH为7~8的磷酸盐缓冲液，质量浓度为0.1~5%的牛血清蛋白和质量浓度为0.01~1%的防腐剂；
所述的校准品包括抗磷脂IgM抗体，0.005~0.1 mol/L、pH为7~8的磷酸盐缓冲液，质量浓度为0.1~5%的牛血清蛋白和质量浓度为0.01~1%的防腐剂；
所述的样本稀释液包括0.005~0.1 mol/L、pH为7~8的磷酸盐缓冲液，质量浓度为0.1~5%的牛血清蛋白和质量浓度为0.01~1%的防腐剂。
7.根据权利要求5或6所述的磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：一个所述的质控品中的抗磷脂IgM抗体的浓度为4~21RU/mL，另一个所述的质控品中的抗磷脂IgM抗体的浓度为50~100RU/mL；一个所述的校准品中的抗磷脂IgM抗体的浓度为10~40RU/mL，另一个所述的校准品中的抗磷脂IgM抗体的浓度为100~300RU/mL。
8.一种如权利要求1至7中任一项所述的磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于：
所述的含有5~100ng/mL的生物素标记的心磷脂抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的混合溶液的制备方法包括如下步骤：
步骤（1）、将所述的心磷脂抗原、所述的磷脂酰乙醇胺抗原、所述的磷脂酰肌醇抗原、所述的磷脂酰丝氨酸抗原分别用0.01~0.03mol/L、 pH为7~7.5的磷酸盐缓冲液，在2~8℃下透析过夜，分别配制成心磷脂抗原溶液、磷脂酰乙醇胺抗原溶液、磷脂酰肌醇抗原溶液、磷脂酰丝氨酸抗原溶液，
步骤（2）、将所述的生物素溶于二甲基亚砜中配制成物质的量浓度为8~12mM的生物素溶液，
步骤（3）、将所述的心磷脂抗原溶液、所述的磷脂酰乙醇胺抗原溶液、所述的磷脂酰肌醇抗原溶液、所述的磷脂酰丝氨酸抗原溶液分别与所述的生物素溶液混合均匀，在15~40℃下放置20~40分钟，然后分别加入0.05~1.1M的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，终止反应，在15~40℃下放置8~12分钟，然后用含质量比为0.1~5%的牛血清白蛋白、pH 为7~8、物质的量浓度为0.005~0. 1mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释分别得到所述的生物素标记的心磷脂抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原溶液；
步骤（4）、将所述的生物素标记的心磷脂抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原溶液、所述的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原溶液进行混合得到所述的含有5~100ng/mL的生物素标记的心磷脂抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的混合溶液；
所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液的制备方法包括如下步骤：
步骤（1）、将鼠抗人IgM单克隆抗体加入到浓度为8~12mg/ml的2-亚胺基硫烷盐酸盐偶联剂中，在15~40℃下静置18~25分钟，加入0.01~0.11mol/L的甘氨酸溶液，在15~40℃下静置4~6分钟，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后的鼠抗人IgM单克隆抗体，2~8℃保存备用，
步骤（2）、将碱性磷酸酶溶液加入到1~10mg/ml的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，在15~40℃下静置10~100分钟，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，2~8℃保存备用，
步骤（3）、将所述的活化后的鼠抗人IgM单克隆抗体与所述的活化后碱性磷酸酶混合，在2~8℃下静置12~24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得连接物浓溶液，在2~8℃保存备用，
步骤（4）、将所述的连接物浓溶液用含质量比为0.1~5%的牛血清白蛋白、pH为5.8~8.2、物质的量浓度为0.01~0.1mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液进行稀释制得所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液；
所述的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液通过采用质量比为0.1~5%的牛血清白蛋白、pH为7~8、物质的量浓度为0.005~0. 1mol/L的磷酸盐缓冲液对链霉亲和素标记的纳米磁微粒进行重悬制得。
9.一种如权利要求1至7中任一项所述的磷脂IgM抗体的化学发光定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤（1）、将样本原液与样本稀释液按体积比为1：10~100的比例混合得到稀释后待测样本；
步骤（2）、在检测管中加入所述的稀释后待测样本，所述的含有5~100ng/mL的生物素标记的心磷脂抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的混合溶液和所述的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液，在25~40℃下温育10~30min得到第一溶液；其中，所述的稀释后待测样本的添加量为10~60μL；所述的稀释后待测样本，所述的含有5~100ng/mL的生物素标记的心磷脂抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰乙醇胺抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰肌醇抗原、5~100ng/mL的生物素标记的磷脂酰丝氨酸抗原的混合溶液和所述的链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的投料体积比为1：0.5~4： 0.5~4；
步骤（3）、添加磁场，使所述的第一溶液在磁场中沉降，去除上清液，然后经清洗液多次清洗后，去除磁场，得到第二溶液；
步骤（4）、向所述的第二溶液中加入所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液，在25~40℃下孵育10~30min得到第三溶液；其中，所述的稀释后待测样本与所述的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液的投料体积比为1：1.5~10.5；
步骤（5）、添加磁场，使所述的第三溶液在磁场中沉降，去除上清液，然后经清洗液多次清洗后，去除上清液，加入所述的化学发光底物，去除磁场，充分混悬后，在25~40℃下孵育1~10min，检测3秒内的相对发光强度值；其中，所述的稀释后待测样本与所述的化学发光底物的投料体积比为1：1~15。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述的检测方法在全自动化学发光仪上自动检测或手动检测。
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