CN107402197A - 一种延迟发光的扫描探测方法及设备 - Google Patents

Abstract

一种延迟发光的扫描探测方法及设备，构建不相交的激发光路和探测光路，在扫描探测过程中，移动样品或者光路，使样品先位于激发光路上，再转移到探测光路上，这样就可以探测样品的延迟发光信号。相对于传统的时间分辨检测，该方法不需要脉冲、延迟、快门控制，省略了TTL控制、脉冲发生器、斩波器等设备，实现了用稳态光源扫描式探测延迟发光信号，简化了仪器并降低了成本。该方法适用于扫描成像装置，可用于孔板检测、时间分辨成像等。该方法可用于共聚焦显微镜，无需脉冲和快门控制就可实现超分辨成像。

Description

一种延迟发光的扫描探测方法及设备

技术领域

本发明涉及光致发光的测量方法，该方法可以用于相关的设备仪器的设计和制造中，可以用于延迟发光的测量和成像。属于光学仪器制造领域。

背景技术

在光致发光现象中，分子受光照激发跃迁到激发态，激发态的分子可通过释放光子回到基态，即分子的荧光或磷光。分子的激发态存在寿命，即激发态的分子要在过一段时间之后才释放光子回到基态，且不同分子的激发态寿命各不不同，分子激发态寿命越长，其发光持续时间越长。通常情况下，分子的荧光寿命在纳秒级，磷光寿命可以达到微秒级以上。延迟荧光分子，其寿命也可以达到微秒级甚至毫秒级。近些年发展的一些磷光分子，寿命可以达到秒级。此外一些无机纳米材料，其寿命在毫秒级以上。这些长寿命的发光统称为延迟发光，也被称为辉光。

在荧光和磷光的测量中，一般需要构建两个光路：光路一是激发光路，即激发光照射样品的光路，其目的是使样品中的分子受光照激发；光路二是探测光路，即样品发光到达探测器的光路，其目的是探测样品发光的光谱、强度等信息。两条光路相交于同一点，将样品置于该交点上，以探测样品的荧光和磷光。

在稳态的测量过程中，光路一和光路二同时打开，即激发光一直照射样品的条件下测量，这种方式可以获得样品发光光谱和强度的信息，但是不能得到样品激发态寿命的信息。

为了测量样品延迟发光的信号，通常需要在关闭激发光路之后打开探测光路，即在停止激发后，测量样品的发光。基于这样的思路，人们发展了许多测量延迟发光的方法和仪器。（参考专利公开说明书CN201310392018.6、CN200510092520.0、CN201180017387.6、CN201110005032.7等。）其中比较常用的方法是采用脉冲光源，一个周期中，光照时间很短，其余时间的发光信号即为延迟发光信号；利用时间相关的单光子计数器可探测样品发光强度随时间变化的曲线。另外一种常用的方法也是采用脉冲光源，用具有门控功能的CCD探测延迟发光信号。

还有一种常用的方法，利用斩波器控制其中一个或两个光路的开关时间，以达到探测延迟发光信号的目的。（参考文献Biophysical Journal 1994, 67, 957-965、Biophysical Journal 1998, 74, 2210–2222、Anal. Chem. 2011, 83, 2294-2300、CN205484048U等。）由于许多样品的发光寿命在毫秒以下，因而两个光路开关需要精确的时间控制，为此，许多瞬态光谱仪和时间分辨的成像装置采用TTL调制、脉冲发生器、延时发生器等控制两个光路的开关时机。此外，为了避免杂散光干扰，还需要光源的脉冲、探测器快门、斩波器控制等都具有较高的时间分辨率。

上述各种零部件的添加增加了仪器的复杂度，此外许多高时间分辨率的零部件价格非常高，如皮秒激光器、高速相机、单光子计数器、高精度的TTL控制器等。

为了简化仪器并降低成本，专利US6839134B2、CN205080051U和CN106066317A公开了使用一个斩波器同时控制激发光路和探测光路的方法，不使用激光器、高速相机、TTL控制也可以实现延迟发光的探测。该方法具有一定的适用性，然而为了获得高的时间分辨率，斩波器的通光孔要尽量狭窄，这直接降低了激发光的光通量，也就降低了发光信号。此外，针对一些特殊的样本或装置，增加斩波器的同时还需要改变光路才能实现延迟发光的探测。

扫描式探测在扫描仪、共聚焦扫描显微镜中有重要的应用。在传统的扫描荧光探测***中，需要探测多个样品点的荧光信号，这样的多个样品点往往排列成矩阵式，如生物芯片、多孔平板等。检测过程中，激发光路和探测光路聚焦于同一样品点，每次探测一个样品点的荧光信号，然后沿着行的方向移动至光路聚焦于下一个样品点探测，如此移动至该行所有的样品点都测完后，再以同样的方式探测下一行上所有样品点的信号直到所有点的荧光信号都探测完毕。

这种扫描探测***广泛应用于高通量的荧光检测。当样品点足够密集的时候，这种扫描***也应用于成像，如扫描仪、荧光共聚焦显微镜。

然而这些扫描成像设备主要用于非延迟的荧光测量，为了测量样本的延迟发光，需要对激发光路进行脉冲控制，对探测进行延迟控制。在一种通用的方法中，利用时间相关的单光子计数器对样品的每一点进行寿命测量，从而获得荧光寿命的图像。这种时间分辨的方法结合受激辐射损耗（stimulated emission depletion）技术，也用于超分辨的荧光成像（Scientific Reports，6，19419）。

然而脉冲光源、单光子计数器的引入增加了设备成本，还需要使光源和计数器同步，增加了操作的复杂度。此外，由于一个点的寿命测量需要累积多次脉冲信号，这种成像方式往往需要较长的时间才能获得一张图像。

发明内容

为了进一步简化仪器，以更加便捷的测量延迟发光的信号，本发明构建了不同于传统思路的测量方法。在以往的方案中，激发光路和探测光路相交或聚焦于同一点，样品需置于该交点上进行测量，这种方式必须使用脉冲、快门分别控制激发光路和探测光路才能测量样品的延迟发光。

为了省略脉冲和快门控制，本发明采用的方法是：

构建激发光路和探测光路，使两条光路不相交，这样，当样品在激发光路上的时候，其发光不在探测光路上；当样品在探测光路上的时候，激发光不能照射样品；

在延迟发光的测量中，移动样品，使样品先位于激发光路上，再转移到探测光路上，这样就可以探测样品的延迟发光信号。

其中，激发光路和探测光路可参考现有的技术构建，激发光路包含光源，探测光路包含探测器，还可以根据需要，在光路上设置狭缝、光阑、棱镜、光栅、滤光元件、透镜、光纤等光学元件。

该方法测量延迟发光的原理显而易见：当样品位于激发光路上，样品的荧光或磷光被激发，由于激发光路和探测光路不相交，因而，非延迟的发光不会被探测到；再将样品转移到探测光路上，由于转移需要经历一段时间，因而探测的是延迟的发光信号；其中：该方法中的转移指的是改变样品相对于光路的位置，既可以是转移样品，也可以是转移光路；该转移过程经历的时间就是延迟时间，延迟时间的长短与移动的相对距离和相对速率有关。

该方法探测延迟发光的优势显而易见：不需要对光源进行脉冲控制，省略了TTL控制、脉冲发生器、斩波器等设备，任何稳态的光源都可以作为激发光源；不需要对探测器进行时间、快门控制，省略了斩波器、快门等附件；在一些情况下，不需要周期性激发、延迟、测量的过程，只要重复移动样品或光路、增加曝光时间即可增强探测信号。

本方法适用于扫描探测***，有两种实现途径。

一种是固定光路，移动样品。该***包括激发光路、探测光路、移动平台；其中激发光路和探测光路的聚焦点不重合，移动平台由电路或计算机控制移动。

优选的，激发光路和探测光路上有针孔或狭缝，用来限制光路焦点以外的光通过。

设点A为激发光路的聚焦点，点B为探测光路的聚焦点，A、B两点不重合，当移动平台以从A到B的方向移动时，可以探测平台上固定样品的延迟发光。

原理如下：

在某一时刻，位于点A处的样品点受激发光光照，然而该点不在探测光路上，因而该点此时的荧光不能进入探测器；当平台移动了|AB|距离时，原先位于点A处的样品点移动到了点B处，此时，该样品点的发光可以被探测，移动|AB|距离经历的时间为延迟时间，因而这一时刻，探测到的是该样品点的延迟发光。

同理，移动平台沿着AB方向移动，就可以探测该方向上所有样品点的延迟发光，如果平台移动速率恒定，则所有被探测的样品点的延迟时间相同。该***可以以同样的方向扫描同一平面上的其它样品点，从而可以探测同一平面上所有样品点的延迟发光。

另外一种途径是固定样品，移动光路。这种***包括激发光路、探测光路，其中激发光路和探测光路的聚焦点不重合，并且，激发光路和探测光路都经过扫描反光镜反射，扫描反光镜由电路或计算机控制移动或转动。

优选的，激发光路和探测光路上有针孔或狭缝，用来限制光路焦点以外的光通过。

设点A为激发光路的聚焦点，点B为探测光路的聚焦点，A、B两点不重合，当电路或计算机控制扫描反光镜移动或转动时，使激发光路和探测光路在样品上的聚焦点同时沿着从B到A的方向移动，则可以探测平台上固定样品的延迟发光。

原理如下：

在某一时刻，激发光路聚焦点移动到某一样品点上，该点的荧光不能进入探测器；而在下一时刻，激发光路聚焦点移动到其它样品点，而探测光路聚焦点正好移动到该点上，此时，该样品点的发光可以被探测，光路聚焦点移动|AB|距离经历的时间为延迟时间，因而这一时刻，探测到的是该样品点的延迟发光。

光路的聚焦点沿着BA方向持续在样品上移动，就可以探测该方向上所有样品点的延迟发光；同理，通过改变扫描反光镜的位置或角度，可以使光路沿着其它线路扫描，并获得平面上所有点的延迟发光。

从上述两种途径的原理可知，延迟时间与AB距离成正比，与移动或扫描速率成反比，即可以通过调节光路聚焦的位置、平台移动速率或光路扫描速率来改变延迟时间，从而获得不同延迟时间的发光探测。

此外，只要聚焦的范围足够小，使探测的景深浅，上述两种方法也可以逐层扫描多个平面上的样品点，应用于三维的延迟发光成像。

利用线阵CCD或CMOS传感器，也可以逐行扫描样品的延迟发光。

上述方法不限于行列扫描方式，也适用于旋转扫描方式。

在旋转扫描方式中，可先固定扫描半径，扫描一圈上所有的样品点，再逐渐改变半径以扫描其它圈上的样品点。优选的，每一圈可循环扫描多次，以累积信号强度。

上述扫描***与现有的扫描***所采用的零部件大致相同，本质的不同在于，激发光路先沿着扫描线路扫描样品，延迟一段时间后，探测光路再沿着同样的扫描线路扫描样品，因而探测的是样品的延迟发光。

实现这种探测的方式仅仅需要使激发光路和探测光路的聚焦点不重合，相对于其它时间分辨的扫描探测***，上述扫描***不需要任何脉冲、快门或TTL控制，就可以探测延迟发光信号，并且因为省略了上述调制过程，也就省去了延迟时间和快门时间，因而在高通量的时间分辨检测中更加便捷迅速。扫描的速度决定了探测的延迟时间，最短的延迟时间就是光路从一个点移动到相邻的下一个点的时间。如果每秒钟扫描一千个点，则最短的延迟时间就是1毫秒，可以检测寿命在毫秒级的延迟发光，这样的材料有稀土纳米材料、稀土配合物、有机磷光材料。

如果每秒钟扫描一百万个点，则最短的延迟时间就是1微秒，可以检测寿命在微秒级的延迟发光，大部分的过渡金属磷光、延迟荧光材料都可以检测。现有的许多激光共聚焦荧光显微镜的扫描速度都超过这个速度，因而将该方法用于这些显微镜，可以获得微秒级的延迟发光图像，并且成像速度与稳态成像相同，相对于其它基于共聚焦的时间分辨成像方法，该方法成像速度快，且不需要额外添置任何附件，成本优势显著。

此外，在扫描显微镜的应用中，增加延迟时间有助于提高图像的分辨率，实现超分辨的成像。传统的共聚焦显微镜受限于光的衍射，激发光会在聚焦点形成艾里斑，样品稳态荧光的光斑大小与艾里斑相等，因而该光斑内的荧光差异无法探测，限制了成像分辨率。而在本发明的延迟探测的方法中，样品荧光或磷光光斑的大小会随时间减小，因而可以突破衍射极限，实现超分辨成像。与受激辐射损耗的方法相比，该方法不需要额外添加光路和时间门控制。

从该测试的原理可知，该方法可以搭配任意的稳态光源使用，如汞灯、氙灯等，相对于使用单一波长的脉冲激光器，其激发波长可以使用光栅调节，范围覆盖广，可以测试不同激发波长的物质，大大降低了成本。该方法也可以搭配大功率的近红外激光器，可以用于上转换材料或近红外发射材料的时间分辨检测。

附图说明

图1为测量孔板延迟发光的示意图，101为光源，102为扫描反射镜，103为扫描反射镜，104为探测器，105为孔板。

图2为测量孔板发光的示意图，201为光源，202为二向色镜，203为透镜，204为反光镜，205为孔板，206为挡板，207为透镜，208为反光镜，209和210为滤光片，211和212为探测器。

图3为线扫描测量延迟发光的示意图，301为挡板，302为狭缝，303为二向色镜，304为透镜，305为扫描反光镜，306为透镜，307为芯片，308和309为样品，310为挡板，311为狭缝，312为探测器。

图4为扫描显微镜的结构示意图，11为光阑，12为针孔，13为二向色镜，14为透镜，15为样品，16为光阑，17为针孔，18为探测器，19为移动平台。

图5为扫描显微镜的结构示意图，501为透镜502为光阑，503为针孔，504为二向色镜，505为透镜，506为光阑，507为针孔，508和509为扫描反光镜，510为物镜，511为载物台，512为透镜，513为滤光片，514为二向色镜，515和516为探测器。

图6为扫描成像装置的结构示意图，601为透镜，602为透镜，603为载物台，604为样品，605为反射光栅，606为探测器，其余零部件与附图5相同。

图7为扫描显微镜的结构示意图，701为光阑，702和703为针孔，704为透镜，705为透镜，706为透镜，707为二向色镜，708和709为探测器，710为透镜，711为探测器，其余零部件与附图5相同。

图8为旋转式扫描显微镜的结构示意图，801为转盘，802为二向色镜，803为转盘，804为物镜，805为载物台，806为透镜，807为图像传感器。

图9为旋转式扫描显微镜的结构示意图，各零部件与附图8相同。

具体实施方式

为了说明本发明的原理以及其优势，下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，其目的在于帮助更好的理解本发明的内容，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。 在实际应用中，可以根据具体情况实施最合适的方案。

实施实例1 ，扫描式孔板检测仪。

一种扫描式检测仪检测24孔板的过程如附图1所示，该孔板检测仪包括光源101、扫描反光镜102和103、探测器104，其中反光镜102和103构成一个可移动的整体，可以水平移动，起扫描探头的作用。24孔板105有A、B、C、D四行，分为6列。

其中激发光路为光源101射出的光经过扫描反光镜102反射后照射样品，探测光路为样品发光经过扫描反光镜103反射后进入探测器104。

检测过程中，反光镜102和103按图中的扫描方向移动，首先，光源101射出的光经过反光镜102反射后照射在孔板105的B4孔，此时反光镜103在B6孔上方，因而不能检测B4孔的发光；随着扫描的过程，当反光镜103移动到B4上方时，探测器104可以检测该孔中的发光信号，此时反光镜已经移动到B2孔的上方，不再激发B4孔，因而探测器104检测的是延迟发光的信号。反光镜102和103保持匀速移动，可以检测B行的所有孔，且延迟时间相等。按同样的原理，只要移动整个光路就可以检测孔板上所有孔的延迟发光信号。

从上述检测过程和原理可知，该方法在扫描的过程中就实现了延迟发光的探测，相对于其它延迟发光的探测方法，该方法不需要脉冲光源、斩波器、TTL控制、快门等，简化了仪器、降低了成本。

附图2给出了一种优选的方案，由光源201射出的光经二向色镜202反射后，再经过透镜203会聚于24孔板205的孔中，即为激发光路。由孔板发出的光经过透镜203、二向色镜202，再经过反光镜204反射，经过滤光片210到达探测器213，即为第一探测光路，用于非延迟发光的探测。

由孔板发出的光经过透镜207，再经过反光镜208反射，经过滤光片209到达探测器211，即为第二探测光路，用于延迟发光的探测。

其中，二向色镜202、透镜203、反光镜204、挡板206、透镜207、反光镜208构成一个可以移动的整体，可以水平移动，起扫描探头作用；其中挡板206将激发光路和第二探测光路隔开，以降低杂散光。

该装置测量延迟发光的过程和原理与附图1的装置相同，不同的是，附图2的装置有两条探测光路，可以同时测量稳态和延迟的发光信号，此外，在光路上增加的透镜可以使光路聚焦于样品点上，增加了检测信号强度。

实施实例2 ，线扫描式延迟发光检测。

本实例通过旋转反光镜实现光路的扫描。如附图3所示。

激发光路为：激发光通过挡板301上的狭缝302后，被二向色镜303反射，经过透镜304后被扫描反光镜305反射，经过透镜306后聚焦于芯片307的样品上。

探测光路为：样品发光经过透镜306后被扫描反光镜305反射，经过透镜304、二向色镜303、挡板310上的狭缝311后进入探测器。其中探测器选自阵列型探测器，如CCD、CMOS、光电管阵列。

当反光镜305沿着弯箭头的方向转动时，可实现芯片307上样品的延迟发光探测。

过程如下：

在某一时刻，反光镜305与二向色镜303平行，如附图3中实线位置所示，此时，激发光聚焦于第c列样品308上，根据光路可逆原理，样品308此时的发光经过二向色镜303后聚焦于挡板310上，不能进入探测器。

在扫描过程中，反光镜305转动了一个角度，使入射光沿着点线箭头方向聚焦于第b列样品309上，根据光路可逆原理，样品309此时的发光经过二向色镜303后聚焦于挡板310上，不能进入探测器，而样品308此时的发光被反光镜305反射后沿着虚线箭头方向聚焦于狭缝311处，因而可以进入探测器312。由于反光镜305转动经历了时间，因而此时探测的是延迟发光。

反光镜305持续转动，可以探测芯片307上所有点的延迟发光。

如果将挡板301和310换成针孔光阑，则是逐点探测方式。在这种方式中，探测器可使用光电倍增管。

实施实例3，时间分辨的扫描显微镜。

传统的共聚焦扫描显微镜的入射针孔和出射针孔的位置共轭，出射针孔为入射针孔在二向色镜中的投影位置上，即从两个针孔经过的光线可以聚焦于同一点，因而被称为共聚焦。

为了实现延迟发光的探测，本实施实例的显微镜的两个针孔位置不共轭，并且，在扫描过程中，前一时刻经过入射针孔的光线与后一时刻经过出射针孔的光线聚焦于同一点，这样就可以探测样品的延迟发光。其中从前一时刻到后一时刻的时间为延迟时间。

根据这种思路设计的一种时间分辨的显微镜，包括：入射光阑11、二向色镜13、物镜14、出射光阑16、探测器18、移动平台19，如附图4所示。

激发光路：入射光经过针孔12，经过二向色镜13反射，经过物镜14聚焦于点A；

探测光路：点B的发光经过物镜14，经过二向色镜13，聚焦于针孔17，进入探测器18；根据光线路径可逆原理，经过针孔17的光线聚焦于点B，与点A不重合。

样品15置于移动平台19上，跟随移动平台的移动，当移动平台19沿着空心箭头的方向移动时，该装置可以探测位于AB直线上的所有点的延迟发光。

原理如下：

在某一时刻，样品15的位置如附图3所示，激发光聚焦于点A，A点发出的荧光经过物镜、二向色镜13会聚于光阑16上的点C处，不能被探测器408检测。

在扫描过程中，样品15随着移动平台19沿着扫描方向移动了|AB|的距离，使原先在A点受光照激发的样品点移动到了点B处，此时，点B处发出的延迟发光信号正好会聚于光阑16的针孔17上，因而可以被探测器检测。由于移动平台移动|AB|的距离需要时间，因而探测器探测的是延迟发光信号。同时，移动到点A处的样品点被激发光激发，但是点A处发出的光会聚于点C处，只要保持针孔17位置不变，不论移动平台位置在哪，都不会使非延迟的发光信号透过光阑，因而降低了散射光干扰。

按同样的速率扫描下去，该方法可以对位于直线AB上的样品点的延迟发光进行探测。同理，该方法可以沿着其它直线扫描样品，并获得样品的平面成像图。调节移动平台，改变样品到物镜的距离，再按照上述方式扫描，可以获得其它平面的延迟发光图像。

从上述原理可知，延迟时间与AB距离成正比，与移动速率成反比，而AB的距离可以通过平移光阑16来改变，针孔17 越接近针孔在二向色镜中的投影，则AB距离越短，延迟时间越短。

在实际的扫描显微镜中，为了尽量减少样品的振动，通常采用移动光路的方式实现扫描，可以采取附图5的方案：

激发光路为：激发光经过透镜501会聚到入射光阑502上的针孔503处，经过二向色镜504反射后，经过准直透镜505转变为平行光，再经过扫描反光镜508和509反射后，经过物镜510聚焦于载物台511上的样品上；

探测光路为：样品发光经过物镜510，再经过扫描反光镜509和508反射，再经过透镜505、二向色镜504、出射光阑506上的针孔507、透镜512、滤光片513，经过二向色镜514分光后，不同颜色的光分别进入探测器515和516；

其中，出射光阑506的位置可以调节。

扫描反光镜508和509以移动或转动方式来实现光路扫描。

为了方面理解，以移动扫描方式来说明探测原理，不作为本发明的限制。

一种优选的方案中，扫描反光镜508与x轴、y轴呈45度夹角，扫描反光镜509与y轴、z轴呈45度夹角；同时，调节光阑位置，使针孔507沿着y方向偏离主光轴，如图5所示，使探测光路与激发光路的聚焦点不同；这种状态下，保持扫描反光镜509不动，使扫描反光镜508沿着x轴匀速扫描，该装置就可以用于延迟发光的显微扫描成像。

检测延迟发光的原理如下：

在某一时刻，扫描反光镜508位于虚线处，此时，激发光沿着虚线箭头，经过物镜聚焦于某一点，该点的发光沿着虚线箭头的反方向会聚于光阑506上，被光阑挡住，因而不能进入探测器。

在扫描过程中，当扫描反光镜508沿着-x方向移动至实线处时，激发光被反光镜408反射后，沿着实线箭头，经过物镜聚焦与另外的一样品点，此时，原先样品点的延迟发光沿着虚线箭头的反方向到达反光镜508后，偏离主光轴反射到针孔507处，因而可以被探测器检测。由于扫描经历了一段时间，因而进入探测器的光信号是样品的延迟发光。

扫描反光镜508持续扫描，即可以检测同一直线上的所有样品点的延迟发光，沿着y轴方向改变扫描反光镜509的位置，再让反光镜508沿着x轴扫描，则可以检测同一平面上其它直线的样品点，并获得完整的二维平面图像。同理，沿着z轴移动物镜510或者载物台511，就可以扫描其它平面上的样品点，并获得三维的延迟发光成像。

根据同样的原理，调节光阑506的位置，使之偏离到合适的位置上，保持扫描反光镜508不动，移动扫描反光镜509，也可以实现延迟发光的探测。

在扫描速率不变的情况下，针孔的位置偏离主光轴越远，则延迟时间越长，即通过调节针孔位置可以获得不同延迟时间的发光图像。

相对于现有的稳态激光共聚焦显微镜，上述装置仅仅改变了出射针孔的位置就可以实现延迟发光的成像，因而具有显著的成本优势。

此外，根据上述原理，保持针孔位置不变，扫描速率越快，可探测的延迟时间越短，同时，成像速度也越快，比起现有的许多时间分辨成像显微镜，成像的速度快，对光的利用率高，降低了光漂白。

本实例中，可在探测光路上增加二向色镜和探测器，以获得更多发光颜色的信息。本实例结合受激辐射损耗技术，无需脉冲和快门控制，就可以进一步降低成像分辨率。

实施实例4，时间分辨的扫描成像***

在实施实例3的附图5基础上，更换物镜可以实现大型样本的延迟发光扫描探测，如附图6所示，所采用的大部分光学元件与附图5相同。

激发光路为：激发光经过透镜501会聚到入射光阑502上的针孔503处，经过二向色镜504反射后，经过准直透镜505转变为平行光，再经过扫描反光镜508和509反射后，经过透镜601和602聚焦于载物台603的样品604上；

探测光路为：样品发光经过透镜602和601，再经过扫描反光镜509和508反射，再经过透镜505、二向色镜504、出射光阑506上的针孔507、透镜512，被反射光栅605反射为不同颜色的光，最后进入探测器606。探测器选自阵列型探测器，如CCD、CMOS、光电管阵列。

与附图5相同，出射光阑506的位置可以调节。

该装置实现延迟发光探测的原理与实施实例3附图5相同。

该装置可探测每个点的发光光谱。

实施实例5 ，倒置显微镜用于稳态发光和延迟发光的同时扫描

在实施实例3的附图5基础上，改变扫描反光镜509的方向，使激发光向上反射，经过物镜聚焦于样品上，就可实现倒置型扫描显微镜。

如附图7所示，采用具有两个针孔的光阑701，可实现稳态发光和延迟发光的同时探测。

附图7中针孔702位于主光轴上，针孔703偏离主光轴，稳态的发光和延迟发光分别聚焦于这两个针孔，再经过透镜704和705组成的扩束***后，分别进入各自的探测光路。

其中，主光轴的光线经过透镜706，经过二向色镜707分光后，不同颜色的光分别进入探测器708和709，这即是第一探测光路，用于稳态发光的探测。

偏离主光轴的光线经过透镜710后进入探测器711，这即是第二探测光路，用于延迟发光的探测。

该装置实现延迟发光探测的原理与实施实例4相同。

实施实例6，旋转式扫描成像***

相对于单点扫描方式，转盘共聚焦（spinning disk confocal）使用多点扫描，具有更高的探测效率。

本发明的方法也可以采用转盘扫描实现多点延迟发光的同时探测。如附图8所示，

激发光路：激发光经过转盘801上的针孔阵列后被二向色镜802反射，经过物镜804聚焦在载物台805上的样品上；

探测光路：样品发光经过物镜804、二向色镜803、转盘802上的针孔阵列、透镜806，最后进入图像传感器807。

其中，转盘801和803的针孔排列一一对映。

在稳态测量中，两个转盘同步转动，并且旋转相位时时相同，即以二向色镜为对称镜面，两个转盘的针孔阵列互为镜面中的像。

当两个转盘保持一定的相位差同步转动，使转盘803延迟一段时间转到转盘801映射在镜面中的虚像位置，就可以实现延迟发光的探测。

探测过程如下，

在某一时刻，如附图8所示，样品发光沿着入射激发光的反方向穿过二向色镜802，聚焦于转盘803上，被转盘挡住，不能进入探测器。

在下一个某时刻，如附图9所示，两个转盘转过了一个角度，使原先被激发的样品的延迟发光经过转盘803上的针孔，再经过透镜806聚焦于图像传感器807中。此时激发光激发的是其它的样品点，这些样品点此时的发光被转盘803挡住。

转盘持续转动，可扫描其它样品点的延迟发光，并成像在图像传感器807中。

优选的，转盘801的激发光一侧添加对应的微透镜阵列，可增加激发光利用率。

该实例中，转盘的针孔阵列不限于图中所画。

此外，实例1到实例6中的所有装置中，可以根据具体需要，在光路上添加挡板、狭缝、光阑、光栅、透镜、滤光片、分光片、衰减片等，还可以增加二向色镜、棱镜、反光镜或光纤以改变光路的方向。

Claims (10)

1.一种扫描探测***，该***包括激发光路、探测光路、移动平台；

其中激发光路和探测光路的聚焦点不重合，移动平台由电路或计算机控制移动，设点A为激发光路的聚焦点，点B为探测光路的聚焦点，A、B两点不重合，当移动平台以从A到B的方向移动时，可以探测平台上固定样品的延迟发光。

2.一种扫描成像装置，采用如权利要求1所述的探测***，该装置特征在于：激发光路和探测光路上有针孔；

激发光路为：入射光经过针孔12，经过二向色镜13反射，经过物镜14聚焦于点A；

探测光路为：点B的发光经过物镜14，经过二向色镜13，聚焦于针孔17，进入探测器18。

3.一种扫描探测***，该***包括激发光路、探测光路；

其中激发光路和探测光路的聚焦点不重合，并且，激发光路和探测光路都经过扫描反光镜反射，扫描反光镜由电路或计算机控制移动或转动；

设点A为激发光路的聚焦点，点B为探测光路的聚焦点，A、B两点不重合，

当电路或计算机控制扫描反光镜移动或转动时，使激发光路和探测光路在样品上的聚焦点同时沿着从B到A的方向移动，则可以探测平台上固定样品的延迟发光。

4.如权利要求3所述的探测***，其特征在于：激发光路和探测光路上有针孔或狭缝。

5.一种扫描检测仪，采用如权利要求3所述的探测***，

该检测仪包括光源101、扫描反光镜102和103、探测器104，其中反光镜102和103构成一个可移动的整体，可以水平移动，起扫描探头的作用；

其中激发光路为光源101射出的光经过扫描反光镜102反射后照射样品，探测光路为样品发光经过扫描反光镜103反射后进入探测器104。

6.一种线扫描检测仪，采用如权利要求4所述的探测***，该检测仪特征在于：

激发光路为：激发光通过挡板301上的狭缝302后，被二向色镜303反射，经过透镜304后被扫描反光镜305反射，经过透镜306后聚焦于芯片307的样品上；

探测光路为：样品发光经过透镜306后被扫描反光镜305反射，经过透镜304、二向色镜303、挡板310上的狭缝311后进入探测器；

其中探测器选自阵列型探测器。

7.一种扫描成像装置，采用如权利要求4所述的探测***，该装置特征在于：

激发光路为：激发光经过透镜501会聚到入射光阑502上的针孔503处，经过二向色镜504反射后，经过准直透镜505转变为平行光，再经过扫描反光镜508和509反射后，经过物镜聚焦于样品上；

探测光路为：样品发光经过物镜，再经过扫描反光镜509和508反射，再经过透镜505、二向色镜504、出射光阑506上的针孔507、透镜512、滤光片513，经过二向色镜514分光后，不同颜色的光分别进入探测器515和516；

其中，出射光阑506的位置可以调节。

8.一种扫描成像装置，采用如权利要求4所述的探测***，该装置特征在于：

激发光路为：激发光经过透镜501会聚到入射光阑502上的针孔503处，经过二向色镜504反射后，经过准直透镜505转变为平行光，再经过扫描反光镜508和509反射后，经过透镜601和602聚焦于载物台603的样品604上；

探测光路为：样品发光经过透镜602和601，再经过扫描反光镜509和508反射，再经过透镜505、二向色镜504、出射光阑506上的针孔507、透镜512，被反射光栅605反射为不同颜色的光，最后进入阵列型探测器。

9.一种扫描成像装置，采用如权利要求3所述的探测***，其特征在于：

激发光路：激发光经过转盘801上的针孔阵列后被二向色镜802反射，经过物镜804聚焦在载物台805上的样品上；

探测光路：样品发光经过物镜804、二向色镜803、转盘802上的针孔阵列、透镜806，最后进入图像传感器807；

其中，转盘801和803的针孔排列一一对映，当两个转盘保持一定的相位差同步转动，使转盘803延迟一段时间转到转盘801映射在二向色镜803镜面中的虚像位置，就可以实现延迟发光的探测。

10.如权利要求1-9中任意一项所述的装置，其特征在于：光路上还包括一些光学元件，这些光学元件选自狭缝、光阑、光栅、透镜、滤光片、分光片、衰减片、二向色镜、棱镜、反光镜或光纤。