CN107385036B - 一种arr3基因t239c、c298t和c893a位点的检测引物组、试剂盒及应用 - Google Patents

一种arr3基因t239c、c298t和c893a位点的检测引物组、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种ARR3基因T239C、C298T和C893A位点的检测引物组、试剂盒及应用。本发明基于Sanger测序的原理，具有高度的敏感性、稳定性和准确性的特点，可以同时检测ARR3基因三个致高度近视的突变位点，用于高度近视的早期筛查、辅助诊断，为患者实施早期预防和治疗提供依据，具有良好的市场应用前景。

Description

一种ARR3基因T239C、C298T和C893A位点的检测引物组、试剂 盒及应用
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种ARR3基因T239C、C298T和C893A位点的检测引物组、试剂盒及应用。
背景技术：
近视是危害视力的常见原因，其中，高度近视(屈光度在-6.00D以上的近视)并发症(青光眼、白内障、玻璃体混浊、视网膜脱离等)是致盲的第二大原因；中国人的近视患病率远高于其他种族，且终身受累。更严峻的是，随着城市化的推进和生活方式的转变，近视的发病率还在逐年增高，居住于经济发达地区的亚洲人群尤甚。大量证据表明高度近视与遗传密切相关，家族遗传性高度近视，尤其是学龄前已有的早发高度近视，受环境因素影响小，大多由基因突变所致，这类患者近视度数进行性增加，眼底视网膜脉络膜病变逐年加重，且代代相传，给患者带来沉重的心理和经济负担。如果对这类高度近视患者进行致病基因突变检测，是其早期诊断和防治的基础。
目前已有的对早发性高度近视的致病基因检测试剂盒，仅有ZNF644基因的六个致病位点的检测(CN102732607A)，但是这六个致病位点仅在很少数病人中检测到，而绝大多数的早发性高度近视患者的致病突变不明，还需要对更多的致病基因进行突变检测。因此找到更多可导致早发性高度近视的突变位点并开发成检测试剂盒，将对早发性高度近视的精准诊疗具有重要意义。
发明内容：
本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、稳定性强的ARR3基因T239C、C298T和C893A位点的检测引物组、试剂盒及应用。
本发明的第一个目的是提供一种ARR3基因T239C、C298T和C893A位点的检测引物组，所述的检测引物组如下所示：
针对ARR3基因T239C和C298T位点：
ARR3-1F：5’-GCCAGCCTTCGATCATATTACAT-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
ARR3-1R：5’-TGGCGATGAGGCTGTGGAGGTTA-3’(如SEQ ID NO.2所示)；
针对ARR3基因C893A位点：
ARR3-2F：5’-AGGATTTCCCACCAGAACTAAT-3’(如SEQ ID NO.3所示)；
ARR3-2R：5’-GGCTTTACTGAACATGAAACCT-3’(如SEQ ID NO.4所示)。
本发明的第二个目的是提供一种ARR3基因T239C和C298T位点和/或C893A位点的检测试剂盒，包括上述的针对ARR3基因T239C和C298T位点的上下游引物和/或针对ARR3基因C893A位点的上下游引物。
优选，所述的检测试剂盒还包括2*Master Mix、ddH2O、阳性质控品和阴性质控品。
优选，所述的阳性质控品包括含有SEQ ID NO.5所示序列的质粒DNA、含有SEQ IDNO.6所示序列的质粒DNA和含有SEQ ID NO.7所示序列的质粒DNA。
本发明的第三个目的是提供一种ARR3基因T239C、C298T和C893A位点的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)分别以上述的针对ARR3基因T239C和C298T位点的上下游引物和针对ARR3基因C893A位点的上下游引物对步骤(1)提取的基因组DNA进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增产物进行测序，然后与野生型ARR3基因序列进行比对，确定是否存在基因突变位点。
所述的测序的方法优选为Sanger测序法。
Sanger测序原理，DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)存在下进行复制时，在反应体系中分别按照一定的比例引入四种荧光染色剂标记的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，当ddNTP掺入链的末端时，该链就会停止延伸。如此每管反应体系中就产生了一系列长度不等的以ddNTP为3’端的DNA片段。反应终止后，在毛细管中进行凝胶电泳以分离长短不一的DNA片段，相邻的片段长度相差一个碱基，在毛细管电泳中的迁移率就不同，激光检测器可对荧光分子逐个进行检测，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。
所述的PCR扩增，其反应体系优选为20μL，包含基因组DNA 60ng，2*Master Mix 10μL，10μM上游引物0.3μL，10μM下游引物0.3μL，ddH2O补足至20μL。
所述的PCR扩增，其反应程序优选为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，重复30个循环；72℃延伸5min。
本发明的第四个目的是提供上述的检测引物组或上述的检测试剂盒在检测早发性高度近视中的应用。
本发明针对ARR3基因T239C、C298T和C893A三个突变位点设计了一套检测引物组，开发了一个包含检测引物组的试剂盒以及使用该试剂盒的检测方法。本试剂盒采用经典的Sanger双脱氧链终止测序法，该方法结果精准、直观可视、重复性高，且特异性强和灵敏度高，是基因诊断的金标准。
本发明基于Sanger测序的原理，具有高度的敏感性、稳定性和准确性的特点，可以同时检测ARR3基因三个致高度近视的突变位点，用于高度近视的早期筛查、辅助诊断，为患者实施早期预防和治疗提供依据，具有良好的市场应用前景。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1、特异性引物的设计
根据NCBI数据库中ARR3基因(GeneBank序列号为Gene ID:407；NC_000023)T239C(即SEQ ID NO.5所示序列自5’端起第202位碱基为T/C)、C298T(即SEQ ID NO.6所示序列自5’端起第261位碱基为C/T)和C893A(即SEQ ID NO.7所示序列自5’端起第293位碱基为C/A)位点的上下游序列设计特异性引物，所设计的特异性引物如表1所示。
表1特异性引物序列
Figure BDA0001356128880000041
2、基因组DNA提取
使用酚/氯仿法或试剂盒提取法分别提取200名正常人和200名早发性高度近视患者外周血白细胞基因组DNA。具体步骤如下：
2.1向15mL离心管加入200μL Proteinase K(20mg/mL)溶液；
2.2处理材料：提取血液样本，直接加入3mL血液样本，混匀；
2.3向装有血液样本的离心管中加入3.6mL缓冲液GE，振荡30sec混匀；
2.4 65℃放置10min，每隔3min振荡一次，以助裂解。简短离心以收集管盖内壁的水珠；
2.5向样本中加入3mL无水乙醇，混匀，此时可能出现絮状沉淀；
2.6将上一步所得溶液和絮状沉淀的一半转移至一个吸附柱CB5中(吸附柱放入15mL收集管中)，3,000rpm(～1,850×g)离心3min，倒掉废液，将吸附柱CB5放回收集管中；
2.7将步骤2.6剩余的溶液再转入同一个吸附柱中，重复步骤2.6操作；
2.8向吸附柱CB5中加入2mL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，5,000rpm(～4,500×g)离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB5放回收集管中；
2.9向吸附柱CB5中加入2mL缓冲液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，5,000rpm(～4,500×g)离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB5放回收集管中，收集的DNA备用。
3、制备质粒
将SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7分别克隆至PMD19-T载体上后测序验证克隆子，得到突变型质粒PMD19-T1、突变型质粒PMD19-T2和突变型质粒PMD19-T3，将SEQID NO.8和SEQ ID NO.9分别克隆至PMD19-T载体上后测序验证克隆子，得到野生型质粒PMD19-T4和野生型质粒PMD19-T5；提取质粒DNA。
4、PCR扩增
4.1以步骤2提取的基因组DNA为模板，分别以表1所示的引物对ARR3-1F/R和ARR3-2F/R进行PCR扩增。阳性对照分别为突变型质粒PMD19-T1和突变型质粒PMD19-T2。阴性对照为PMD19-T。以2μL纯水为模板，作空白对照。
4.2PCR反应体系：总体系为20μL，包含浓度为30ng/μL的基因组DNA 2μL，2*MasterMix 10μL，10μM上游引物0.3μL，10μM下游引物0.3μL，ddH2O 7.4μL；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，重复30个循环；72℃延伸5min。
4.3PCR扩增产物检测：取3μL的PCR扩增产物，在20g/L琼脂糖凝胶(含0.5μg/mLEB)，50V电泳45-60min，紫外灯下直接观察结果：以ARR3-1F/R为引物进行扩增，200名正常人和200名早发性高度近视患者的基因组DNA和阳性对照均扩增出一条873bp左右的条带；以ARR3-2F/R为引物进行扩增，200名正常人和200名早发性高度近视患者的基因组DNA和阳性对照均扩增出一条400bp左右的条带。
4.4PCR扩增产物纯化：
操作步骤：使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
4.4.1柱平衡步骤：向吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)。
4.4.2估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。
4.4.3将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。注意：吸附柱容积为800μL，若样品体积大于800μL可分批加入。
4.4.4向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW静置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
4.4.5重复操作步骤4.4.4。
4.4.6将离心吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。收集纯化产物。
4.4.7测序反应：按一定顺序向反应混合液中分别加入经纯化DNA扩增产物样品、阳性对照、阴性对照各2μL。
测序PCR反应程序：94℃，预变性5min；94℃变性10s，61℃退火4min，重复30个循环。
4.5测序扩增产物纯化：
4.5.1在96孔板中加入测序反应扩增产物5μL和70％无水乙醇35μL，4,000rpm离心30min，96孔板反过来500rpm，short 30sec。
4.5.2室温放置40min晾干。
4.6上机测序：
上机样本准备：晾干后的样品加Hi-Di去离子甲酰胺10μL，95℃5min变性，然后马上置于冰上冷却5min。然后放到测序仪的样本板基座上测序。
Sanger测序原理，DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)存在下进行复制时，在反应体系中分别按照一定的比例引入四种荧光染色剂标记的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，当ddNTP掺入链的末端时，该链就会停止延伸。如此每管反应体系中就产生了一系列长度不等的以ddNTP为3’端的DNA片段。反应终止后，在毛细管中进行凝胶电泳以分离长短不一的DNA片段，相邻的片段长度相差一个碱基，在毛细管电泳中的迁移率就不同，激光检测器可对荧光分子逐个进行检测，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。
测序结果分析：导出原始数据，使用“DNAStar”软件，把测序序列和原始正常序列(Gene ID:407NC_000023，即野生型ARR3基因序列)进行比对。
结果表明：200名正常人的T239C、C298T和C893A位点均未发生突变，均为阴性；200名早发性高度近视患者中1名患者T239C位点突变、1名C298T位点突变和1名患者C893A位点突变，我们进而对以上三个患者的家系成员用相同的方法进行分析，发现：T239C家系8名成员中的4名含有此位点突变的均为高度近视患者，另外4名正常人均没有此位点突变；C298T家系12名成员中的10名携带此位点突变的均为高度近视患者，另外2名正常人均没有此位点突变；C893A家系30名成员中的15名携带此位点突变的均为高度近视患者，另外15名正常人均不携带此位点突变。说明了T239C、C298T和C893A这三个位点的突变与早发性高度近视显著相关。
实施例2：
1、灵敏度检测
1.1质粒稀释
分别将突变型质粒PMD19-T1、PMD19-T2和PMD19-T3，野生型质粒PMD19-T4、PMD19-T5，稀释至终浓度5ng/μL，然后将突变型质粒与其对应的野生型质粒按体积比0.2:9.8、0.5:9.5、1:9、1.5:8.5、2:8、3:7和4:6进行混合，配制成突变丰度为2％、5％、10％、15％、20％、30％和40％的阳性样本(表2)。以不同突变丰度的阳性样本作为模板，按照实施例1所述的方法进行PCR扩增并测序。结果如表3所示。结合测序图及表3判断，初步结果显示本发明的检测试剂盒(Sanger测序法)检测灵敏度为突变丰度为10％。
表2突变质粒的质粒信息
Figure BDA0001356128880000091
表3灵敏度检测结果(正反向测试)
突变质粒突变丰度 2％ 5％ 10％ 15％ 20％ 30％ 40％
T239C -/- -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
C298T -/- -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
C893A -/- -/- +/+ +/+ +/+ +/+ +/+
1.2灵敏度验证
合格标准：检测突变丰度10％的阳性样本10次，至少9次检测结果符合检测下限，即检出率大于或者等于90％。
验证突变体丰度10％检测灵敏度
取步骤1.1制得的突变丰度10％的突变质粒PMD19-T1/PMD19-T4、PMD19-T2/PMD19-T4、PMD19-T3/PMD19-T5用本发明的检测试剂盒(Sanger测序法)对其进行基因突变检测。10次重复测序，检出率为100％(表4)。灵敏度验证通过。
表4灵敏度验证检测结果(突变丰度10％)
检测样本(突变丰度10％) 检测次数 检出次数
T239C 10 10
C298T 10 10
C893A 10 10
2、特异性测试：
2.1特异性验证方法：将表1所示的引物对ARR3-1F/R在人、猕猴、野猪、家猪和白犀牛基因组序列中用电子模拟PCR进行匹配。将表1所示的引物对ARR3-2F/R在人、野猪、家猪和白犀牛基因组序列中用电子模拟PCR进行匹配。
结果表明：ARR3-1F/R引物在人基因组序列中可以生成特异性产物，在猕猴、野猪、家猪和白犀牛基因组序列中没有生成扩增产物；ARR3-2F/R引物在人基因组序列中可以生成特异性产物，在猕猴、野猪、家猪和白犀牛基因组序列中没有生成扩增产物。因此本发明的检测试剂盒具有高度的特异性。
3、重复性测试：
3.1重复性测试方法：将突变型质粒PMD19-T1、PMD19-T2和PMD19-T3按照步骤2.1的方法稀释为10％、30％两个突变丰度的样本作为模板，按照实施例1的方法进行PCR扩增，10次重复测序，并计算其阳性结果重复率(见表5)。
表5ARR3基因3位点两种不同突变丰度样本重复测序结果
Figure BDA0001356128880000111
3.2结论：综合测序图及表5显示，ARR3基因3位点10％和30％两种突变丰度各10次重复测序阳性结果重复率均为100％，该扩增引物及PCR反应条件检测重复性好，并能对比突变丰度10％的样本实现稳定检测。
序列表
<110> 中山大学中山眼科中心
<120> 一种ARR3基因T239C、C298T和C893A位点的检测引物组、试剂盒及应用
<160> 9
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gccagccttc gatcatatta cat 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tggcgatgag gctgtggagg tta 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aggatttccc accagaacta at 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggctttactg aacatgaaac ct 22
<210> 5
<211> 873
<212> DNA
<213> 人
<400> 5
gccagccttc gatcatatta catcacctct ctgtgtcttc ttgacccagt taagattccc 60
cttcccactc aggcctgaca gaccactctc ttcctcctat gcctgcagtg tttgtcatgt 120
tgacatgtgc ctttcgctat ggccgtgatg acttggaagt gattggtctg acgttccgaa 180
aagatctgta tgtgcagacc ccgcaagtgg tcccagctga atccagcagc cctcaggggc 240
ccctcacagt cctacaggag cgactactgc acaagctagg ggacaatgcc taccccttta 300
ccctgcaggt actgacccca agccctgggc aggcaaggtc tccagggaag attaagagag 360
gaagctcaag aaggacaaca agggagaggg ttccccattt cttttgtatt tgtttgtatt 420
cttttctact tcttttctga tctccttttt gtcccctaga tggtgaccaa cctgccctgt 480
tctgtgacac tgcagccagg tcctgaagat gcaggaaagg tgaggactgg gttctaagaa 540
agagggatag gtagtgccag ggaagaggaa cagtgggaca gtcaagactg gagaaatgga 600
cagctaagga aagaggtcag gcattttctt ataggcccat gaggaaggga ggacagcact 660
ggaaatgagc tctctttgcc cttgtccctt tacagccctg tgggattgac tttgaagtga 720
agagtttctg tgctgaaaac ccagaggaga cagtctccaa gaggtattct ttggttgtcc 780
ccaaaaatcc ctgcctccag cctctgccag gaaacagatc ctgctctcat gacagaaata 840
gccccacttc taacctccac agcctcatcg cca 873
<210> 6
<211> 873
<212> DNA
<213> 人
<400> 6
gccagccttc gatcatatta catcacctct ctgtgtcttc ttgacccagt taagattccc 60
cttcccactc aggcctgaca gaccactctc ttcctcctat gcctgcagtg tttgtcatgt 120
tgacatgtgc ctttcgctat ggccgtgatg acttggaagt gattggtctg acgttccgaa 180
aagatctgta tgtgcagacc ctgcaagtgg tcccagctga atccagcagc cctcaggggc 240
ccctcacagt cctacaggag tgactactgc acaagctagg ggacaatgcc taccccttta 300
ccctgcaggt actgacccca agccctgggc aggcaaggtc tccagggaag attaagagag 360
gaagctcaag aaggacaaca agggagaggg ttccccattt cttttgtatt tgtttgtatt 420
cttttctact tcttttctga tctccttttt gtcccctaga tggtgaccaa cctgccctgt 480
tctgtgacac tgcagccagg tcctgaagat gcaggaaagg tgaggactgg gttctaagaa 540
agagggatag gtagtgccag ggaagaggaa cagtgggaca gtcaagactg gagaaatgga 600
cagctaagga aagaggtcag gcattttctt ataggcccat gaggaaggga ggacagcact 660
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<212> DNA
<213> 人
<400> 7
aggatttccc accagaacta atttctccca gtcttcagtt aaacatgtta cctctcttgg 60
atactccagt aggttcttgt ataatcttgt acaagatact cttgggagta aaagtatgct 120
tagtcagcaa gcccagccta aattcttctc ttgttcttct tttgtaggga gactgtagct 180
gctaattcca gcttctccca gagctttgca gtaaccccaa tcctggctgc cagctgccag 240
aaacggggcc tggcactgga tggcaaactt aagcatgaag ataccaacct ggactctagc 300
acaatgtaag ctcaaatata actctcagcc tccatttcct acccctcaac cattccacat 360
gctacattta cagctctgag gtttcatgtt cagtaaagcc 400
<210> 8
<211> 873
<212> DNA
<213> 人
<400> 8
gccagccttc gatcatatta catcacctct ctgtgtcttc ttgacccagt taagattccc 60
cttcccactc aggcctgaca gaccactctc ttcctcctat gcctgcagtg tttgtcatgt 120
tgacatgtgc ctttcgctat ggccgtgatg acttggaagt gattggtctg acgttccgaa 180
aagatctgta tgtgcagacc ctgcaagtgg tcccagctga atccagcagc cctcaggggc 240
ccctcacagt cctacaggag cgactactgc acaagctagg ggacaatgcc taccccttta 300
ccctgcaggt actgacccca agccctgggc aggcaaggtc tccagggaag attaagagag 360
gaagctcaag aaggacaaca agggagaggg ttccccattt cttttgtatt tgtttgtatt 420
cttttctact tcttttctga tctccttttt gtcccctaga tggtgaccaa cctgccctgt 480
tctgtgacac tgcagccagg tcctgaagat gcaggaaagg tgaggactgg gttctaagaa 540
agagggatag gtagtgccag ggaagaggaa cagtgggaca gtcaagactg gagaaatgga 600
cagctaagga aagaggtcag gcattttctt ataggcccat gaggaaggga ggacagcact 660
ggaaatgagc tctctttgcc cttgtccctt tacagccctg tgggattgac tttgaagtga 720
agagtttctg tgctgaaaac ccagaggaga cagtctccaa gaggtattct ttggttgtcc 780
ccaaaaatcc ctgcctccag cctctgccag gaaacagatc ctgctctcat gacagaaata 840
gccccacttc taacctccac agcctcatcg cca 873
<210> 9
<211> 400
<212> DNA
<213> 人
<400> 9
aggatttccc accagaacta atttctccca gtcttcagtt aaacatgtta cctctcttgg 60
atactccagt aggttcttgt ataatcttgt acaagatact cttgggagta aaagtatgct 120
tagtcagcaa gcccagccta aattcttctc ttgttcttct tttgtaggga gactgtagct 180
gctaattcca gcttctccca gagctttgca gtaaccccaa tcctggctgc cagctgccag 240
aaacggggcc tggcactgga tggcaaactt aagcatgaag ataccaacct ggcctctagc 300
acaatgtaag ctcaaatata actctcagcc tccatttcct acccctcaac cattccacat 360
gctacattta cagctctgag gtttcatgtt cagtaaagcc 400

Claims (4)

1.一种ARR3基因T239C、C298T和C893A位点的检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组如下所示：
针对ARR3基因T239C和C298T位点：
ARR3-1F：5’-GCCAGCCTTCGATCATATTACAT-3’；
ARR3-1R：5’-TGGCGATGAGGCTGTGGAGGTTA-3’；
针对ARR3基因C893A位点：
ARR3-2F：5’-AGGATTTCCCACCAGAACTAAT-3’；
ARR3-2R：5’-GGCTTTACTGAACATGAAACCT-3’。
2.一种ARR3基因T239C和C298T位点和/或C893A位点的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的针对ARR3基因T239C和C298T位点的上下游引物和/或针对ARR3基因C893A位点的上下游引物。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括2*Master Mix、ddH2O、阳性质控品和阴性质控品。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控品包括含有SEQ IDNO.5所示序列的质粒DNA、含有SEQ ID NO.6所示序列的质粒DNA和含有SEQ ID NO.7所示序列的质粒DNA。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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X-linked heterozygous mutations in ARR3 cause female-limited early onset high myopia;Xueshan Xiao等;《Molecular Vision》;20161026;第22卷;摘要 *

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