CN107385024B

CN107385024B - 水稻育性恢复基因辅助育种分子标记及其应用

Info

Publication number: CN107385024B
Application number: CN201710538053.2A
Authority: CN
Inventors: 郑秀婷; 彭佩; 吴云天; 李宙炜; 李为国; 李继明; 肖金华
Original assignee: Huazhi Rice Bio Tech Co ltd
Current assignee: Huazhi Rice Bio Tech Co ltd
Priority date: 2017-07-04
Filing date: 2017-07-04
Publication date: 2020-10-13
Anticipated expiration: 2037-07-04
Also published as: CN107385024A

Abstract

本发明提供水稻育性恢复基因辅助育种分子标记，所述分子标记是分别与水稻育性恢复基因Rf3及Rf4共分离的SNP标记RSRF30121、FRF4‑10‑01。标记RSRF30121检测水稻第1号染色体5606898位碱基，标记FRF4‑10‑01检测水稻第10号染色体18838172位碱基；基于KASP技术开发的标记RSRF30121的引物序列如SEQ ID NO:1‑3所示；基于KASP技术开发的标记FRF4‑10‑01的引物序列如SEQ ID NO:4‑6所示。本发明还提供SNP标记RSRF30121、FRF4‑10‑01在水稻育性恢复基因辅助选择育种中的应用。采用本发明的标记组合能够快速鉴定水稻是否含有育性恢复基因，对促进Rf3和Rf4育性恢复基因在商业化育种中的应用具有重要意义。

Description

水稻育性恢复基因辅助育种分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及作物育种技术领域，具体地说，涉及水稻育性恢复基因辅助育种分子标记及其应用。

背景技术

分子标记辅助选择育种是现代生物技术与传统育种技术相结合的产物，它使育种技术由传统的粗放型，经验型向现代的精准型转变，使育种变得更加具有可操作性及可预见性。

在三系杂交水稻育种中，根据恢保关系的不同，细胞质雄性不育类型主要有三类，野败型(WA-CMS)、包台型(BT-CMS)和红莲型(HL-CMS)。多数研究者认为水稻野败型细胞质雄性不育性由2对隐性基因控制。Bharaj等(1995)认为野败型雄性不育受2对效力不同的恢复基因控制，其中一对强恢复基因位于第7染色体上，而弱恢复基因位于第10染色体上。Zhang等(1997)利用RAPD和RFLP分子标记技术将IR24的一个恢复基因座位Rf3定位于第1染色体RG532和RG140、RG458之间。Yao等(1997)利用RFLP分子标记技术将明恢63的两个恢复基因分别定位于第1染色体RG532与RG173之间和第10染色体长臂C234与G4003之间，已证明第10染色体长臂的基因座位的效应值大于第1染色体的恢复基因座位。张桂权等(1994)以珍汕97A、珍汕97B、IR24，以及9个以IR24为恢复基因供体、以珍汕97A为轮回亲本选育的近等基因系为材料，用随机引物扩增的方法，发现6个与育性恢复相关的RAPD分子标记；以F2群体为作图群体，通过连锁分析将与育性恢复相关的基因命名为Rf3、Rf4，并将Rf3定位于第1染色体。张群宇等(2002)用珍汕97A和恢复基因近等基因系的杂种F2分离群体中的117株完全不育株进行连锁分析，表明Rf4定位于第10染色体，从YAC4892获得的亚克隆Y38与Rf4座位的连锁距离为0.9cM，从YAC4630获得的亚克隆Y110与Rf4座位的连锁距离为3.2cM。

对Rf3及Rf4恢复基因的鉴定，现有报道主要利用的标记类型为SSR和InDel标记，在育种中存在多态率较低，差异较小的缺点。检测过程中使用EB或聚炳烯酰胺易对环境造成污染，对人体产生危害。而传统育种中使用的主要鉴定方法则是通过结实率等表型观测鉴定为主，耗费时间长，且易受环境条件的限制，鉴定结果存在误差，选择效率较低。

发明内容

本发明的目的是开发一组育性恢复基因Rf3和Rf4的分子标记，其能用于Rf3和Rf4基因的鉴定及辅助选择。

本发明水稻育性恢复基因分子标记的开发流程见图1。由于Rf3基因未被克隆，根据相关文献将Rf3基因位置确定在水稻1号染色体的5598557-6278465区间，利用Rf3的供体材料与非供体材料的重测序数据对此基因区间及其附近两侧的SNP位点进行挖掘。同时，根据已克隆的Rf4基因序列与日本晴序列进行比对，筛选SNP位点。提取候选SNP位点侧翼序列，并利用在线引物设计网站BatchPrimer3对其进行引物设计。针对这些候选SNP标记，对9份含有Rf3和Rf4基因的水稻供体品种和14份基因非供体水稻品种进行KASP反应验证，挑选出与Rf3和Rf4供体材料共分离及扩增效果好的SNP标记RSRF30121和FRF4-10-01。随后利用Rf3和Rf4供体亲本中恢8015与受体亲本内香5A的F2杂交群体进行了遗传位置验证及表型验证。

为了实现本发明目的，本发明提供水稻育性恢复基因辅助选择育种分子标记，包括水稻育性恢复基因Rf3辅助育种分子标记和水稻育性恢复基因Rf4辅助育种分子标记。

本发明还提供基于KASP技术开发的用于鉴定水稻育性恢复基因的引物，包括特异引物X、特异引物Y和通用引物C，引物序列分别如SEQ ID NO:1-3所示。

所述分子标记是分别与水稻育性恢复基因Rf3、Rf4共分离的SNP标记RSRF30121、FRF4-10-01，标记RSRF30121检测水稻第1号染色体5606898位碱基，标记FRF4-10-01检测水稻第10号染色体18838172位碱基。

基于KASP技术开发的该SNP标记RSRF30121的引物，包括特异引物X3、特异引物Y3和通用引物C3，引物序列分别如SEQ ID NO:1-3所示。

基于KASP技术开发的该SNP标记FRF4-10-01的引物，包括特异引物X4、特异引物Y4和通用引物C4，引物序列分别如SEQ ID NO:4-6所示。

本发明还提供含有上述引物的检测试剂或试剂盒。

本发明还提供所述分子标记、引物、检测试剂或试剂盒在鉴定水稻育性恢复基因中的应用。

本发明还提供所述分子标记、引物、检测试剂或试剂盒在水稻育性恢复基因辅助选择育种中的应用。

本发明还提供所述分子标记、引物、检测试剂或试剂盒在筛选具有育性恢复基因的水稻资源中的应用。

所述应用包括以下步骤：

1)提取待测水稻样品的DNA；

2)取20ng干燥模板DNA，100UM特异引物X 0.005μl，100UM特异引物Y 0.005μl，100UM通用引物C 0.0125μl，2×KASP Master Mix1.4792μl，H₂O 1.4983μl，进行PCR扩增；

3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物基因型。

步骤2)PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应：94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。

步骤3)具体为：利用生物学软件对PCR扩增产物进行分型，等位位点RSRF30121-G、FRF4-10-01-G为具有育性恢复性状优异等位类型的水稻植株。

采用本发明的引物组合能够快速鉴定水稻的育性恢复基因，对水稻材料的选择由盲目变为精确，大幅度减少了人力资源的浪费，提高了工作效率，有利于建立高效、环境友好的相关检测体系，对促进Rf3和Rf4育性恢复基因在商业化育种中的应用具有重要意义。基于KASP的基因分型方法是通过计算机记录并分析PCR过程中产生的荧光信号，实现对突变位点监测。检测结果与表现型一致，检测过程无需电泳，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染、甲醛对环境的污染以及EB对人体的危害。

附图说明

图1为本发明水稻育性恢复基因辅助育种分子标记的开发流程图。

图2为本发明实施例2中SNP标记RSRF30121在水稻第1号染色体上的遗传位置验证。

图3为本发明实施例2中SNP标记FRF4-10-01在水稻第10号染色体上的遗传位置验证。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1水稻育性恢复基因辅助育种分子标记的获得

1、引物设计

根据已发表的连锁标记及与参照基因组比对，基因Rf3位于Chr.1,5598557-6278465区间。我们以基因定位区间为中心向两侧各扩大50Kb，利用3000份水稻重测序数据库提取扩大区间内SNP位点。利用基因供体与受体重测序数据进行分析，SNP位点挖掘,同时，根据已克隆的Rf4基因序列与日本晴序列进行比对，并根据PIC值及SNP位点周边50bp是否含有其他SNP位点等进行挑选。挑选出的SNP位点，提取侧翼序列，并利用在线引物设计网站BatchPrimer3(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对其进行引物设计。每个标记有三条引物，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光序列。引物委托Invitrogen公司合成。

基于KASP反应原理及抗感材料的单碱基差异设计的标记能高通量地对水稻材料进行育性恢复基因检测，如果样品中只检测到FAM荧光，则该样品的碱基为Allele X；如果只检测到HEX荧光，则该样品的碱基为Allele Y；如果同时检测到两种荧光，则该位点碱基为杂合状态(表1)。

表1

2、DNA提取：从水稻叶片中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。

①取样放入2.0ml Tube中，预先加入两粒钢珠和750uL CTAB溶液，震荡匀浆样品1.5min；

②65℃震荡加热0.5h(0.5-1h)；

③冷却至室温，在通风橱中加入750ml氯仿︰异戊醇(24︰1)溶液混匀；

④12000rmp离心10min，取上清约500ml转移至新的1.5ml离心管中；

⑤加入等体积异丙醇溶液轻摇混匀，于-20℃沉淀1小时以上，12000rmp离心10min，去上清；

⑥加入1000ml 70％乙醇，轻弹沉淀，1000rmp离心3min，去上清；

⑦加300uL H₂O过夜溶解备用。

3、KASP反应测试

KASP反应测试在LGC SNPline基因分型平台上进行。在微孔反应板中加入20ngDNA样品，烘干后加入KASP反应混合液，反应体系见表2。PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。

本发明中使用的LGC SNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。

表2 KASP检测的反应体系

	终浓度	体积(μl)
			100UM Primer C	0.42UM	0.0125
100UM Primer X	0.17UM	0.0050
			100UM Primer Y	0.17UM	0.0050
2×KASP Master Mix	1×	1.4792
			超纯水		1.4983
总体积		3

4、标记分型数据

用标记RSRF30121和FRF4-10-01对含有Rf3和Rf4基因的水稻品种明恢63、R308、中恢8006等共9份基因供体材料和其它不含恢复基因的14个水稻品种进行KASP初筛反应验证，结果见表3。含Rf3和Rf4基因的水稻品种在标记测试位点检测出G型碱基，14份非供体水稻品种均在测试位点检测出碱基A。

表3标记RSRF30121和FRF4-10-01初筛分型数据

实施例2与水稻育性恢复基因共分离的SNP标记RSRF30121和FRF4-10-01的遗传位置验证及表型验证

1、标记遗传位置验证

将Rf3和Rf4供体亲本中恢8015与受体亲本内香5A的F2杂交群体(88个单株)用于标记遗传位置验证。利用15个在父母本中具有多态性的SNP标记以及本发明中的RSRF30121和FRF4-10-01进行遗传位置分析，结果显示本发明的标记RSRF30121被定位到1号染色体21.6cM位置。利用13个在父母本中具有多态性的SNP标记以及本发明中的FRF4-10-01进行遗传位置验证，本发明的标记FRF4-10-01被定位到10号染色体96.2cM位置。

2、标记表型验证

利用供体亲本中恢8015与受体亲本内香5A的F2群体对本发明中的两个分别与Rf3和Rf4连锁标记进行表型验证。在水稻结实期，对群体72个单株及2个亲本品种调查结实率，Rf3Rf3Rf4Rf4型单株都表现出很好的结实率，而rf3rf3rf4rf4型单株都表现出很差的结实率。表型与基因型一致性对应，验证了本发明的可行性和准确性。

在分子辅助育种中，如果分子标记能满足以下三点则可高效准确应用于分子育种：(1)该分子标记为共显性分子标记，如SSR，STS等标记。因为共显性分子标记可以区分杂合体和纯合体，这在下一步的材料杂交选育中可提供便利，节省选育时间；(2)该分子标记为共分离标记，与目的基因紧密连锁共分离，因为非紧密连锁分子标记与目的基因有一定距离，在育种中可能因为分离而导致检测结果不准确；(3)特异性标记，一些非特异性标记只能区分部分亲本，如果扩大选育亲本的范围，则不能将其用于分子辅助选育，而特异性分子则能用于该基因供体亲本与其他不含该基因亲本的杂交选育，更适用于产业化分子育种。

本发明提供的水稻育性恢复基因辅助育种分子标记为特异性标记，能广泛用于分子辅助选择选育，并且提供了检测水稻育性恢复基因Rf3和Rf4的引物及基因分型方法。采用本发明的标记进行KASP分型检测，实现对每个检测样品的SNP位点基因型判定，能够克服现有的形态学鉴定方法检测周期长、需要丰富经验和PCR、RAPD、PCR-RFLP、Southern杂交等检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、或特异性不强、或重复性不好等缺点，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染，以及甲醛对人体的危害，具有简便、可靠、快速、特异性强、灵敏度高、环境友好等显著优点。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 华智水稻生物技术有限公司

<120> 水稻育性恢复基因辅助育种分子标记及其应用

<130> KHP171113252.3

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtacctgctc ttaacgcacc 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgtacctgct cttaacgcac t 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgttgatatt ttggggttat ttc 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caccctggtc actaccaaca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caccctggtc actaccaacg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgcttgttgg ccatagtcat 20

Claims

1.SNP分子标记RSRF30121和FRF4-10-01在鉴定水稻育性恢复基因中的应用；其中，SNP分子标记RSRF30121、FRF4-10-01分别与水稻育性恢复基因Rf3、Rf4共分离，标记RSRF30121位于水稻第1号染色体5606898位碱基为G，标记FRF4-10-01位于水稻第10号染色体18838172位碱基为G；

基于KASP技术开发的该SNP标记RSRF30121的引物，包括特异引物X3、特异引物Y3和通用引物C3，引物序列分别如SEQ ID NO:1-3所示；

2.SNP分子标记RSRF30121和FRF4-10-01在水稻育性恢复基因辅助选择育种中的应用；其中，SNP分子标记RSRF30121、FRF4-10-01分别与水稻育性恢复基因Rf3、Rf4共分离，标记RSRF30121位于水稻第1号染色体5606898位碱基为G，标记FRF4-10-01位于水稻第10号染色体18838172位碱基为G；

3.SNP分子标记RSRF30121和FRF4-10-01在筛选具有育性恢复基因的水稻资源中的应用；其中，SNP分子标记RSRF30121、FRF4-10-01分别与水稻育性恢复基因Rf3、Rf4共分离，标记RSRF30121位于水稻第1号染色体5606898位碱基为G，标记FRF4-10-01位于水稻第10号染色体18838172位碱基为G；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取待测水稻样品的DNA；

2）取20ng干燥模板DNA，100uM所述特异引物X3和X4 0.005ul，100uM所述特异引物Y3和Y4 0.005ul，100uM所述通用引物C3和C4 0.0125ul，2×KASP Master Mix 1.4792ul，H₂O1.4983ul，进行PCR扩增；

3）采用荧光检测仪分析PCR扩增产物基因型。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2）PCR反应条件为：94°C预变性15分钟；第一步扩增反应：94°C变性20秒，65℃~57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，步骤3）具体为：利用生物学软件对PCR扩增产物进行分型，等位位点RSRF30121-G、FRF4-10-01-G为具有育性恢复性状等位类型的水稻植株。