CN107384856A - 一种制备血小板裂解液的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备血小板裂解液的方法及其应用，制备血小板裂解液的方法其包括以下步骤：将浓缩血小板在800‑1000rpm的离心机下离心处理15‑25min，离心处理后上层为富含血小板血浆，底层为红细胞层，将底层红细胞层分离出；将上层的富含血小板血浆成批地充分混合均匀，采用反复冻融发充***解血小板；去除细胞碎片，得到最终的血小板裂解液。本发明还提供一种细胞培养方法，其采用上述方法所制得的血小板裂解液培养细胞。通过本发明的方法可将浓缩血小板中提取的血小板的裂解液率提高至95％，缩短了操作的时间，且可使用临床过期产品重复开发利用。

Description

一种制备血小板裂解液的方法

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体地涉及一种制备血小板裂解液的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stromal cells,MSCs)在细胞治疗、组织工程、再生医学、免疫及炎症调节等方面具有广泛应用前景。来源于骨髓、脐血、脂肪及牙髓的MSCs在临床应用前，尚需体外扩增至一定数量。目前，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)是干细胞体外培养最为常用的添加物。作为异种来源，FBS可能带来免疫反应、携带异种病原等缺点，且其均一性也广受质疑。血小板α颗粒含有丰富的趋化因子及生长因子，如PDGF、TGF-β、IGF-1、SDF-1、VEGF、EGF、bFGF、BMP-2/4/6等，在激活过程中通过脱颗粒而大量释放。研究表明，血小板裂解液(platelet lysate,PL)能有效替代FBS，在体外扩增培养成纤维细胞、内皮细胞、肿瘤细胞系及间充质干细胞。当前有关PL研究均属小规模制备，血小板来源、质量标准等缺乏统一，导致研究结果缺乏一致性。

间充质干细胞由于其多向分化潜能及组织来源优势，具有广泛临床应用前景，体外扩增以达到应用级的细胞数量是其重要前提。目前，FBS是干细胞体外培养最为常用的添加物。然而，FBS有其不可避免的缺点：(1)MSCs培养过程中可能引入异种成分，产生免疫排斥从而导致移植失败；(2)由FBS所可能引入的动物源性传染病。近年来，由于SARS、H7N9、MERS-Cov等动物感染人疾病的前车之鉴，部分机构提倡体外扩增MSCs时弃用包括FBS在内的动物源性添加物。除此之外，胎牛血清的制备也受到一些动物保护组织的关注与批评。与此同时，随着细胞治疗、疫苗工业的发展，胎牛血清的供应也远不能满足需求。

血小板作为血液主要有形成分之一，在止血过程中发挥重要作用。血小板α颗粒中富含生长因子，在血小板激活脱颗粒过程中，大量因子释放，参与炎性反应、组织修复。丰富的生长因子使得血小板成为FBS有效替代物。富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)一度成为研究热点。由于PRP中仍含有血小板，在MSCs培养过程中易黏附在细胞上难以去除，临床应用中增加血小板排斥风险，也影响细胞培养过程中的观察。培养过程中需额外加入血小板激活剂，生长因子释放也不完全。血小板裂解液(platelet lysate,PL)能够有效解决上述问题，从而提供了较好的解决途径。

目前，PL用于替代FBS扩增MSCs的研究过程中，主要有以下技术要点尚待解决：(1)血小板来源。当前研究主要采用少数志愿者外周血分离浓缩血小板或单采血小板制备，无法形成规模，满足需求。因此也带来PL均一性的问题。(2)目前为止，PL或PRP相关临床研究已有近200项，但由于缺乏PL制备及产品的严格标准，制备方法不一致，导致研究结果之间差异巨大，缺乏可比性，重复性也较差。(3)现有技术中采用的制备血小板裂解液的方法中血小板的裂解并不完全，从而使得相关因子并未完全释放。

发明内容

有鉴于此，为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种制备血小板裂解液的方法。

本发明提供的一种制备血小板裂解液的方法，其包括以下步骤：

将浓缩血小板在800-1000rpm的离心机下离心处理15-25min，离心处理后上层为富含血小板血浆，底层为红细胞层，将底层红细胞层分离出；

将上层的富含血小板血浆成批地充分混合均匀，采用反复冻融发充***解血小板；

去除细胞碎片，得到最终的血小板裂解液。

进一步地，所述反复冻融法的具体操作为：按-80℃，12h，37℃水浴或孵育直至完全融化的顺序，反复冻融5-6次，充***解血小板。

进一步地，在得到最终的血小板裂解液的步骤以后还包括细菌培养和致热源检测的步骤。

进一步地，所述去除细胞碎片的具体操作为：在大于等于3000rpm的离心机下离心分离8-15分钟，将细胞碎片分离出。

进一步地，在该步骤之后还包括通过0.2μm滤器过滤除菌，进一步去除细胞碎片。

进一步地，所述去除细胞碎片的具体操作为：所述离心机的转速为大于5000rpm。

进一步地，所述浓缩血小板来源自无偿献血者外周血，在22±2℃振荡保存5天后报废处理，并冻存待用。

另外，本发明还提供一种细胞培养方法，其采用上述方法所制得的血小板裂解液培养细胞。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.与现有技术相比，本发明的血小板裂解充分，血小板裂解率超过95％，大大提高了裂解率；

2.本发明采用浓缩血小板，其可使用临床过期产品重复开发利用，充分利用可利用的资源，减少资源的浪费，相较于必须在临床有效期内的单采血小板，增大了可利用资源的范围。

3.本发明通过去除细胞碎片的操作，保证了血小板裂解液的纯度且确保无菌产生；

4.本本发明的操作方法中对制作PC有明确的质量标准，且根据国家标准提炼出质量特性，因而PC具有较好的钧一特性，可作为良好的PL制作来源。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明的血小板反复冻融裂解效率的线形图，图1左侧的线形图反应了冻融次数、血小板计数在不同时间下的裂解效率，图1右侧的线形图反应了冻融次数、血小板残留率在不同时间下的裂解效率；

图2为本发明的TP、ALB及各细胞因子浓度线形图。

具体实施方式

本发明公开了一种制备血小板裂解液的方法及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明的仪器和试剂来源参考如下：

-80℃储血冰箱，(SANYO，日本)；37℃隔水式培养箱(上海一恒)；

FE20pH计(Mettler-Toledo，美国)；

AU2700生化分析仪(Olympus，日本)；

TP、ALB检测试剂盒(宁波美康)；

PDGF-AA/AB/BB、VEGF、EGF、TGF-β、IGF-1ELISA检测试剂盒(R&D Systems，美国)；

血培养仪(BD BACTEC，美国)。

实施例

本发明的制备血小板裂解液的方法包括以下步骤：

第一步：将浓缩血小板在800-1000rpm的离心机下离心处理15-25min，离心处理后上层为富含血小板血浆，底层为红细胞层，将底层红细胞层分离出。其浓缩血小板的来源于400mL无偿献血者外周血PC，在22±2℃振荡保存5天后报废处理，冻存待用，即，本发明的浓缩血小板可来源于临床过期产品的重复开发利用，充分利用资源，减少资源的浪费。

第二步：将上层的富含血小板血浆成批地充分混合均匀，采用反复冻融法充***解血小板。

在操作实验中，PL冻融条件多人份PC均匀混合，按照-80℃冻存8h/12h/24h，37℃空气浴融化程序分为3组，每组50mL，反复冻融6次，每次冻融后取样进行血小板重复计数3次，计算平均裂解效率，以达到血小板裂解率＞95％所用最短时间为最优冻融程序。

PL制备40份PC经计数后，以上述最优冻融程序裂解(经验证为-80℃12h，37℃反复冻融6次)，血小板冻融条件经反复冻融6次，血小板裂解效率见图1。6次裂解后冰冻12h和24h组血小板残留率分别为3.12±0.41％VS 3.03±0.43％，两组均小于5％。冰冻8h组血小板残留仍超过20％，故以-80℃12h，37℃反复冻融6次为最适裂解方案，并得到后续多次验证。因而，本发明的反复冻融法采用的具体操作为：按-80℃，12h，37℃水浴或孵育直至完全融化的顺序，反复冻融5-6次，充***解血小板，其裂解超过95％，较现有技术所公开的文献中裂解率大大的提升。

第三步：去除细胞碎片，得到最终的血小板裂解液。具体地，该去除细胞碎片的具体操作为：在大于等于3000rpm(优选为大于5000rpm)的离心机下离心处理8-15分钟(优选为10分钟)，收集上清；然后通过0.2μm滤器过滤除菌，进一步去除细胞碎片(如果上一步的离心去除碎片的效率不够，则本步骤的较难过滤)。

在得到最终的血小板裂解液的步骤以后还包括细菌培养行业致热源检测的步骤。

接着根据第二步的实验进行检测得出数据：40份血小板裂解液pH值范围为6.72-7.38，TP、ALB及各细胞因子浓度见图2，其中TP、ALB浓度分别为50.01±3.26，31.3±4.07g/L，各因子浓度及与血小板计数之间相关性见表1。其中，PDGF-AA/AB/BB、VEGF、EGF浓度与血小板计数显著正相关，TGF-β、IGF-1与血小板计数相关性不明显。此外，经血培养5天，PL未见细菌生长，400X显微镜下观察，未见细胞碎片或其他杂质。

综合本发明的制备血小板裂解液的方法结合规范的实验操作可得出结果：

以95％区间作为定量指标参考区间，结合无偿献血志愿者血液筛查标准，PL初步质量特性见表2。

表1各细胞因子浓度及与血小板计数相关性

表2血小板裂解液初步质量特性

近年来，血小板相关制品包括富血小板血浆、血小板凝胶、血小板裂解液等在细胞培养方面已得到广泛应用。由于制备流程简单，无需加入血小板激活剂，PL应用后来居上，逐渐占据主导地位。截止目前，PL用于干细胞培养进行的临床研究已有近百项。由于血小板来源、制作方法等原因，造成众多研究之间存在较大差异，且制备的PL缺乏一致的质量标准。

本发明的操作实验在国家有关标准前提下，在PC基础上，进一步探讨PL制备流程及质量特性。目前国内外大多数血站采用的富血小板血浆法制备PC在《血站技术操作规程》中有明确制作规范，且对制作的PC也有明确的质量标准，因此PC具有较好的均一特性，可作为良好的PL制作来源。

PL制作方法主要有反复冻融和超声裂解两种，前者因为操作简便，对设备要求简单，应用更为普遍。目前对于反复冻融次数、时间间隔并没有相关研究报道。从本发明的操作实现研究结果来看，裂解次数及冻存时间对血小板裂解效率均有显著影响。在裂解6次情况下，冻存超过12h能够使血小板裂解超过95％，从后续血小板相关因子浓度检测来看，PDGF-AA/AB/BB、VEGF、TGF-β均高于现有技术公开文件中的报道，原因之一可能在于本研究中血小板裂解更完全，相关因子得到更大释放。PDGF-AA/AB/BB、VEGF、EGF浓度与血小板计数显著正相关，而TGF-β、IGF-1与血小板计数相关性不明显。

本发明的操作实验借鉴临床检验活动中确定参考区间的方法，对PL各相关定量指标做了95％参考区间计算，并结合有关国家标准，提炼出其质量特性(见表2)，本发明的操作实验在已有国家及行业标准基础上，制订出依从性好、可操作性强标准化PL制备规程，通过大量数据调查积累，制订PL质量标准，为PL相关科研研究及临床试验提供可靠产品来源。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种制备血小板裂解液的方法，其特征在于包括以下步骤：

将浓缩血小板在800-1000rpm的离心机下离心处理15-25min，离心处理后上层为富含血小板血浆，底层为红细胞层，将底层红细胞层分离出；

将上层的富含血小板血浆成批地充分混合均匀，采用反复冻融发充***解血小板；

去除细胞碎片，得到最终的血小板裂解液。

2.根据权利要求1所述的制备血小板裂解液的方法，其特征在于：所述反复冻融法的具体操作为：按-80℃，12h，37℃水浴或孵育直至完全融化的顺序，反复冻融5-6次，充***解血小板。

3.根据权利要求1所述的制备血小板裂解液的方法，其特征在于：在得到最终的血小板裂解液的步骤以后还包括细菌培养和致热源检测的步骤。

4.根据权利要求1所述的制备血小板裂解液的方法，其特征在于：所述去除细胞碎片的具体操作为：在大于等于3000rpm的离心机下离心分离8-15分钟，将细胞碎片分离出。

5.根据权利要求5所述的制备血小板裂解液的方法，其特征在于：在该步骤之后还包括通过0.2μm滤器过滤除菌，进一步去除细胞碎片。

6.根据权利要求4所述的制备血小板裂解液的方法，其特征在于：所述去除细胞碎片的具体操作为：所述离心机的转速为大于5000rpm。

7.根据权利要求4所述的制备血小板裂解液的方法，其特征在于：所述浓缩血小板来源自无偿献血者外周血，在22±2℃振荡保存5天后报废处理，并冻存待用。

8.一种细胞培养方法，其特征在于，采用权利要求1至7中任一项所述的方法所制得的血小板裂解液培养细胞。