CN107383013B - 作为btk抑制剂的吡唑并嘧啶衍生物及其制备方法和药物组合物 - Google Patents
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Abstract
作为BTK抑制剂的吡唑并嘧啶衍生物及其制备方法和药物组合物。本发明公开了一种如式(I)所示的新型吡唑并嘧啶化合物，及其立体异构体，或药学上可接受的盐，或溶剂化物，或前药，其中各取代基的定义详见说明书。此外，本发明还公开了上述化合物的制备方法、药物组合物及其用途。
Description
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体地说，涉及一种新型高效、选择性好、具有良好的药代动力学性质的、作为BTK抑制剂的吡唑并嘧啶类衍生物及其制备方法和药物组合物。
背景技术
蛋白激酶是人体内生物酶中的最大家族，包括超500种蛋白质。特别地，对于酪氨酸激酶，其酪氨酸残基上的酚官能团能被磷酸化，从而发挥重要的生物信号传导的作用。酪氨酸激酶家族拥有控制细胞生长、迁移和分化的成员。异常的激酶活性己经被阐明了与许多人体疾病密切相关，这些疾病包括癌症、自身免疫疾病和炎性疾病。
布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)是一种细胞质非受体酪氨酸激酶，属于TEC激酶家族(共有5个成员BTK，TEC，ITK，TXK，BMX)一员。BTK基因位于X-染色体的Xq21.33-Xq22，共有19外显子，跨越37.5kb基因组DNA。
除了T细胞和浆细胞外，BTK表达在几乎所有造血细胞上，尤其在B淋巴细胞发生，分化，信号和生存中发挥必不可少的作用。B细胞是通过B细胞受体(BCR)被活化的，而BTK在BCR信号通路中起到了决定性的作用。B细胞上的BCR被活化后，会引起BTK的激活，然后导致下游的磷脂酶C(PLC)浓度增加，并激活IP3和DAG信号通路。这一信号通路可以促进细胞的增殖、粘附和存活。BTK基因突变会导致一种罕见的遗传性B细胞特异性免疫缺陷疾病，被称为X-连锁无丙种球蛋白血症(X-Iinked agammaglobulinemia，XLA)。在这种疾病中，BTK的功能被抑制，从而导致了B细胞的产生或成熟受阻。患有XLA疾病的男性，体内基本没有B细胞，循环抗体也很少，容易出现严重甚至致命的感染。这有力证明了BTK在B细胞的生长和分化中起着极其重要的作用。
小分子BTK抑制剂能与BTK结合，抑制BTK自身磷酸化，阻止BTK的激活。这能阻断BCR通路的信号传导，抑制B淋巴瘤细胞的增殖，破坏瘤细胞的粘附，从而促进瘤细胞的凋亡。并诱导细胞凋亡。这使BTK在B细胞有关的癌症中成为引人注目的药物靶点，尤其是对于B细胞淋巴瘤和白血病，比如非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、和抗复发性或难治性套细胞淋巴瘤(MCL)等。
BTK抑制剂除了可以对抗B细胞淋巴瘤和白血病，还可以抑制B细胞自身抗体和细胞因子的产生。在自身免疫性疾病中，B细胞呈递自身抗原，促进T细胞活化分泌致炎症因，既造成组织损伤，同时又激活B细胞产生大量抗体，触发自身免疫反应。T和B细胞相互作用形成反馈调节链，导致自身免疫反应失控，加重组织病理损伤。所以，BTK可以作为自身免疫性疾病，比如类风湿性关节炎、***性红斑狼疮(SLE)、过敏性疾病(例如食道炎等疾病)的药物靶点。
此外也有报道BTK抑制剂可与化疗药或免疫检查点抑制剂联用，在临床试验中对多种实体瘤表现出较好的治疗效果。
在目前已上市的药物中，依鲁替尼是由Pharmacyclics和强生公司联合开发的一种不可逆BTK抑制剂，己分别于2013年11月和2014年2月获得FDA批准，用于治疗套细胞淋巴瘤(MCL)和慢性淋巴性白血病(CLL)。不可逆抑制剂，是以比较牢固的共价键(covalentbond)与酶蛋白中的基团结合的一种化学制剂，不可逆抑制剂通常可以使酶失去活性,从而发挥其独特的高生物学活性。依鲁替尼被FDA定为“突破性”新药，它通过与BTK中的半胱氨酸的巯基发生反应，并形成共价键，使BTK酶失活而发挥疗效。然而，依鲁替尼在给药过程中，易被代谢(被代谢酶氧化代谢成双羟化产物或者被其他含巯基的酶、半胱氨酸、谷胱甘肽等进攻而失活)而影响药效。其临床给药剂量达到了560mg每天，而使病人负担加重。此外，依鲁替尼对除BTK外的一些激酶也有一定的抑制作用，尤其是对EGFR的抑制可导致较严重的皮疹、腹泻等不良反应。因此，本领域仍需发展新一类更为高效、选择性好，良好的药代动力学性质的BTK抑制剂用于相关疾病的治疗。
发明内容
本发明人研发了一种新型吡唑并嘧啶类衍生物，这些新化合物是蛋白激酶BTK的有效、安全、选择性高的抑制剂。
本发明的目的是提供一种新型吡唑并嘧啶类衍生物。它是一种新的共价键抑制剂，通过改变其和半胱氨酸反应率，来改善与靶标的亲和性，以提高疗效，选择性和安全性。
本发明的第二个目的是提供上述衍生物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供含有上述衍生物的药物组合物。
本发明的第四个目的是提供上述衍生物的用途。
具体地说，第一方面，在本发明的实施方案中，本发明提供了一种新型吡唑并嘧啶化合物，如式(I)所示，其立体异构体、互变异构体，或药学上可接受的盐，或溶剂化物，或前药：
这里，
n，m独立地取自于0、1或2；
L是O，-C(O)-，-C(O)NH-，-CH2-，S，S(O)，NH或S(O)2；
A取自于取代或未取代的苯环、或者取代或未取代的杂芳环，并且与母核及L的连接位点可以任选；
B独立地取自于取代或未取代的脂肪环、取代或未取代的杂环、取代或未取代的苯环、或者取代或未取代的杂芳环，并且与L的连接位点可以任选；
R1和R2各自独立地选自氢、未取代的C1-C4烷基、卤素、氰基，或者R1和R2与它们相连的碳原子一起形成三元碳环或四元碳环，或者R1和R2合并为氧代基；
Y选自氰基、或
R3、R4、R5和R6各自独立地选自氢、未取代的C1-C4烷基、羟基取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基C1-4烷基、卤素、氰基、或-(CH2)qN(RaRb)，这里，q为1、2、3、或4，Ra和Rb各自独立地选自氢、未取代的C1-C4烷基；
并规定，当R1和R2都是氢时，A是苯基，L是O，B是4-氯苯基、3-氯吡啶-6-基、2,4-二氟苯基；Y是4-羟基丁-2-烯酰基、丁-2-炔酰基、或氰基；
或，当R1和R2都是氢时，A是苯基，L是C(O)-、或-CH2-，B是吗啉-4-基；Y为氰基；
或，当R1和R2都是氢时，A是吡唑基，L是S(O)2、或-CH2-，B是苯基、或环丙基；Y为氰基；
或，当R1和R2都是氢时，A是吡啶基，L是NH、或O，B是吡喃-4-基、或环己基；Y为氰基。
在本发明的一种实施方案中，本发明提供的一种如式(I)所示吡唑并嘧啶化合物，其中，n，m独立地取自于0、1或2；L为O，-C(O)-，-C(O)NH-，-CH2-，NH或S，更优选地为O，-C(O)NH-，NH。
在本发明的一种实施方案中，本发明提供的一种如式(I)所示吡唑并嘧啶化合物，其中，A取自于取代或未取代的苯环或杂芳环，并且与母核及L的连接位点可以任选；B独立地取自于取代或未取代的脂肪环、取代或未取代的杂环、取代或未取代的苯环、或者取代或未取代的杂芳环，并且与L的连接位点可以任选；这里：
所述取代的苯环是指苯环上任意位置被任选的下列取代基所取代，所述取代基选自氢、甲基、甲氧基、氟、氯、三氟甲基、三氟甲氧基或氰基；优选地，所述取代的苯基为氟取代的苯基、或氯取代的苯基，更优选地为2,4-二氟苯基、或4-氯苯基；
所述未取代的杂芳环是指呋喃、吡咯、噻吩、恶唑、异恶唑、吡唑、咪唑、噻唑、异噻唑、恶二唑、三氮唑、噻二唑、四氮唑、吡啶、嘧啶、吡嗪、哒嗪、三嗪；所述取代的杂芳环是指以上基团上任意位置被任选的下列取代基所取代，所述取代基选自氢、甲基、甲氧基、氟、氯、三氟甲基、三氟甲氧基或氰基；更优选地，所述取代的吡啶为氯代吡啶，特别优选地为4-氯-吡啶-2-基；
所述未取代的脂肪环是指环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷、环辛烷；所述取代的脂肪环是指以上基团上任意位置被任选的下列取代基所取代，所述取代基选自氢、甲基、甲氧基、氟、氯、三氟甲基、三氟甲氧基或氰基；
所述未取代的杂环是指四氢呋喃、四氢吡喃、四氢吡咯、哌啶、
其中w取自0、1或2；所述取代的杂环是指以上基团上任意位置被任选的下列取代基所取代，所述取代基选自氢、甲基、甲氧基、氟、氯、三氟甲基、三氟甲氧基或氰基。
在本发明的一种实施方案中，本发明提供的一种如式(I)所示吡唑并嘧啶化合物，其中，优选地，R1和R2其中一个为氢、而另一个为未取代的C1-C4烷基(甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、或叔丁基)，或者R1和R2与它们相连的碳原子一起形成环丙基；更优选地，R1和R2都是氢，或者其中一个是氢而另一个为甲基，或者R1和R2与它们相连的碳原子一起形成环丙基。
在本发明的一种优选实施方案中，本发明提供了一种如式(II)所示吡唑并嘧啶化合物，其立体异构体、互变异构体，或药学上可接受的盐，或溶剂化物，或前药：
这里，L、A、B和Y的定义如上述式(I)；
并规定，A是苯基，L是O，B是4-氯苯基、3-氯吡啶-6-基、2,4-二氟苯基；Y是4-羟基丁-2-烯酰基、丁-2-炔酰基、或氰基；
或，A是苯基，L是C(O)-、或-CH2-，B是吗啉-4-基；Y为氰基；
或，A是吡唑基，L是S(O)2、或-CH2-，B是苯基、或环丙基；Y为氰基；
或，A是吡啶基，L是NH、或O，B是吡喃-4-基、或环己基；Y为氰基。
在本发明的一种更优选实施方案中，本发明提供的一种如式(II)所示吡唑并嘧啶化合物为下列化合物中的一种：
这里，式(II-1)或(II-2)中L、B和Y的定义如上述式(I)；
并规定，L是O，B是4-氯苯基、3-氯吡啶-6-基、2,4-二氟苯基；Y是4-羟基丁-2-烯酰基、丁-2-炔酰基、或氰基；
或，L是C(O)-、或-CH2-，B是吗啉-4-基；Y为氰基。
在本发明的一种优选实施方案中，本发明提供了一种如式(III)所示的吡唑并嘧啶化合物，其立体异构体、互变异构体，或药学上可接受的盐，或溶剂化物，或前药：
这里，L、A、B和Y的定义如上述式(I)。
在本发明的一种更优选实施方案中，本发明提供的一种如式(III)所示吡唑并嘧啶化合物为下列化合物中的一种：
这里，式(III-1)、(III-2)、(III-3)和(III-4)中L、B和Y的定义如上述式(I)。
在本发明的一种优选实施方案中，本发明提供了一种如式(IV)所示的吡唑并嘧啶化合物，其立体异构体、互变异构体，或药学上可接受的盐，或溶剂化物，或前药：
这里，L、A、B和Y的定义如上述式(I)。
在本发明的一种更优选实施方案中，本发明提供的一种如式(IV)所示的吡唑并嘧啶化合物为下列化合物中的一种：
这里，式(IV-1)或(IV-2)中L、B和Y的定义如上述式(I)。
在本发明的一种更优选实施方案中，本发明提供的式(I)、(II)、(II-1)、(II-2)、(III)、(III-1)、(III-2)、(III-3)、(III-4)、(IV)、(IV-1)、或(IV-2)化合物，其中，L为O；
B为
和
Y选自氰基、或
R3、R4、R5和R6各自独立选自未取代的C1-C4烷基、羟基取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基C1-4烷基、卤素、氰基、或-(CH2)qN(RaRb)，这里，q为1、2、3、或4，Ra和Rb各自独立地选自氢、未取代的C1-C4烷基。
在本发明的一种特别优选实施方案中，本发明提供一种选自下列化合物中的一种的吡唑并嘧啶类化合物，或其药学上可接受的盐，或溶剂化物，或前药：
在本发明的实施方案中，所述“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐：
所述“药学上可接受的酸加成盐”是指能够保留游离碱的生物有效性而无其他副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。无机酸盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；有机酸盐包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐和水杨酸盐等。这些盐可通过本领域已知的方法制备。
所述“药学上可接受的碱加成盐”是指能够保持游离酸的生物有效性而无其它副作用的盐。这些盐是通过将无机碱或有机碱添加至游离酸而制备的。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐，钾盐，钙盐和镁盐等。衍生自有机碱的盐包括但不限于铵盐，三乙胺盐，赖氨酸盐，精氨酸盐等。这些盐可通过本领域已知的方法制备。
在本发明的实施方案中，所述“溶剂化物”是指本发明的化合物与溶剂形成的配合物。它们或者在溶剂中反应或者从溶剂中沉淀析出或者结晶出来。例如，一个与水形成的配合物称为“水合物”。
在本发明的实施方案中，本发明的化合物可以含有一个或多个手性中心，并以不同的光学活性形式存在。当化合物含有一个手性中心时，化合物包含对映异构体。本发明包括这两种异构体和异构体的混合物，如外消旋混合物。对映异构体可以通过本专业已知的方法拆分，例如结晶以及手性色谱等方法。当式(I)化合物含有多于一个的手性中心时，可以存在非对映异构体。本发明包括拆分过的光学纯的特定异构体以及非对映异构体的混合物。非对映异构体可由本领域已知方法拆分，比如结晶以及制备色谱。
在本发明的实施方案中，所述的前药是指已知的氨基保护基和羧基保护基，在生理条件下被水解或经由酶反应释放得到母体化合物。具体的前药制备方法可参照(Saulnier,M.G.；Frennesson,D.B.；Deshpande,M.S.；Hansel,S.B and Vysa,D.M.Bioorg.Med.Chem Lett.1994,4,1985-1990.Greenwald,R.B.；Choe,Y.H.；Conover,C.D.；Shum,K.；Wu,D.；Royzen,M.J.Med.Chem.2000,43,475.)。
第二方面，本发明提供了上述如式(I)所示的吡唑并嘧啶化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将式(V)化合物与式(VI)化合物反应，得到式(VII)化合物；
(2)将式(VII)化合物与式(VIII)化合物反应，得到式(IX)化合物；
(3)将式(IX)化合物经脱保护基PG得到式(X)化合物；
(4)将式(X)化合物与式(XI)化合物反应，得到式(I)化合物；
在上述的式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)和式(XI)中涉及的取代基R1、R2、L、A、B、Y和n、m的定义如上面的式(I)，PG为氨基保护基(合适的氨基保护基包括酰基(例如乙酰基)、碳甲酰胺类(carbamate)(例如2',2',2'-三氯乙氧基羰基、Cbz苄氧基羰基或BOC叔丁氧基羰基)和芳基烷基(例如Bn苄基)，其可在适当时通过水解(例如使用酸，例如二噁烷中的盐酸或二氯甲烷中的三氟乙酸)或通过还原方式(例如苄基或苄氧基羰基的氢解、或使用乙酸中的锌还原性除去2',2',2'-三氯乙氧基羰基)而除去。其它合适的氨基保护基包括三氟乙酰基(-COCF3)，其可通过碱催化的水解除去苄氧基、羰基或叔丁氧基羰基，本领域技术人员可参考T.W.Greene‘Protective Groups in Organic Synthesis’(第4版，J.Wiley and Sons，2006))，X为氯、溴或羟基。
在本发明的实施方案中，本发明提供的上述如式(I)所示的吡唑并嘧啶化合物的制备方法，其中，式(V)化合物可以参考下列的方法来制备：
在本发明的实施方案中，本发明还提供了用于上述吡唑并嘧啶化合物合成的中间体化合物，包括但不限于：
第三方面，本发明提供了一种包含有效剂量的一种或多种本发明上述吡唑并嘧啶化合物或其立体异构体、互变异构体、溶剂化物或其药学上可接受的盐的药物组合物，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
本发明的药物组合物可以被配制为固态、半固态、液态或气态制剂，如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球及气溶胶。
本发明的药物组合物可以通过制药领域中公知的方法制备。例如，制备药物组合物的实际方法为本领域技术人员所已知，例如可参见The Science and Practice ofPharmacy(制药科学与实践)，20th Edition(Philadelphia College of Pharmacy andScience,2000)。
本发明的药物组合物的给药途径包括但不限于口服、局部、经皮、肌肉、静脉、吸入、肠胃外、舌下、直肠、***及鼻内。例如，适合口服给药的剂型包括胶囊、片剂、颗粒剂以及糖浆等。这些制剂中包含的本发明的式(I)化合物可以是固体粉末或颗粒；水性或非水性液体中的溶液或是混悬液；油包水或水包油的乳剂等。上述剂型可由活性化合物与一种或多种载体或辅料经由通用的药剂学方法制成。上述的载体需要与活性化合物或其他辅料兼容。对于固体制剂，常用的无毒载体包括但不限于甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、葡萄糖、蔗糖等。用于液体制剂的载体包括但不限于水、生理盐水、葡萄糖水溶液、乙二醇和聚乙二醇等。活性化合物可与上述载体形成溶液或是混悬液。具体的给药方式和剂型取决于化合物本身的理化性质以及所应用疾病的严重程度等。本领域技术人员能够根据上述因素并结合其自身具有的知识来确定具体的给药途径。例如可参见：李俊，《临床药理学》，人民卫生出版社，2008.06；丁玉峰，论临床剂型因素与合理用药，医药导报，26(5)，2007；HowardC.Ansel,Loyd V.Allen,Jr.,Nicholas G.Popovich著，江志强主译，《药物剂型与给药体系》，中国医药科技出版社，2003.05。
本发明的药物组合物可以以每单位剂量含有预定量的活性成分的单位剂型存在。优选的单位剂量组合物为含有日剂量或亚剂量、或其适当分数的活性成分的那些。因此，这种单位剂量可以一天给药多于一次。优选的单位剂量组合物为含有本文如上所述的日剂量或亚剂量(一天给药多于一次)、或其适当分数的活性成分的那些。
本发明的药物组合物以符合医学实践规范的方式配制，定量和给药。本发明化合物的“治疗有效量”由要治疗的具体病症、治疗的个体、病症的起因、药物的靶点以及给药方式等因素决定。通常，经胃肠道外给药的剂量可以是1-200mg/kg，口服给药的剂量可以是1-1000mg/kg。
本文中所提供的有效剂量的范围并非意图限制本发明的范围，而是代表优选的剂量范围。但是，最优选的剂量可针对个别个体而进行调整，这是本领域技术人员所了解且可决定的(例如参阅Berkow等人编著，Merck手册，第16版，Merck公司，Rahway,N.J.,1992)。
第四方面，本发明提供了上述吡唑并嘧啶化合物或其立体异构体、互变异构体、溶剂化物或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗由BTK介导疾病的药物中的用途。
本发明提供了一种抑制BTK活性的方法，包含给予生物体系本发明上述吡唑并嘧啶化合物或其立体异构体、互变异构体、溶剂化物或其药学上可接受的盐或包含本发明上述吡唑并嘧啶化合物或其立体异构体、互变异构体、溶剂化物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
在一些实施方式中，所述生物体系是酶、细胞或哺乳动物。
本发明还提供了一种预防或治疗由BTK介导的疾病的方法，其包括对有需要的患者联合给予治疗有效剂量的一种或多种本发明的上述吡唑并嘧啶化合物或其立体异构体、互变异构体、溶剂化物或其药学上可接受的盐和一种或多种选自以下的药物：免疫调节剂、免疫检查点抑制剂、糖皮质激素、非甾体抗炎药、Cox-2特异性抑制剂、TNF-α结合蛋白、干扰素、白细胞介素和化疗药物。
在本发明的实施方式中，所述由BTK介导的疾病包括自身免疫性疾病、炎性疾病、异种免疫性情况或疾病、血栓栓塞疾病和癌症。在一些具体实施方式中，所述癌症包括B细胞性慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、实体瘤。在一些具体实施方式中，所述自身免疫性疾病和炎性疾病选自类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年关节炎、慢性阻塞性肺疾病、多重硬化、***性红斑狼疮、银屑病、银屑病关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎和肠道易激综合症。在一些具体实施方式中，所述异种免疫性情况或疾病包括移植物抗宿主病、移植、输血、过敏反应、***反应、I型超敏反应、过敏性结膜炎、过敏性鼻炎或特应性皮炎。
实验数据证明，本发明提供的上述吡唑并嘧啶化合物是蛋白激酶BTK的有效、安全的抑制剂。
具体实施方式
下文所描述的实验、合成方法以及所涉及的中间体是对本发明的阐明，并不限制本发明的范围。
本发明中实验所使用的起始原料或购买自试剂供应商或经由本领域公知的方法由已知原料制备。除非另有说明，本文的实施例应用下述条件：
温度的单位是摄氏度(℃)；室温的定义是18-25℃；
有机溶剂使用无水硫酸镁或无水硫酸钠干燥；使用旋转蒸发仪在减压升温条件下旋干(例如：15mmHg，30℃)；
快速柱色谱分离时使用200-300目硅胶作为载体，薄层色谱表示薄层色谱法；
通常情况下，反应的进度通过薄层色谱或LC-MS监测；
最终产品的鉴定由核磁共振(Bruker AVANCE 300，300MHz)和LC-MS(Brukeresquine 6000，Agilent 1200series)完成。
实施例1
(R)-3-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-腈(WS-300)的制备
第一步(R)-3-(4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯的制备：
(S)-3-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.7g,8.5mmol)和3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(2g,7.7mmol)溶于四氢呋喃(100mL)。冰浴下一次加入三苯基膦(2.5g,9.5mmol)，缓慢滴加偶氮二甲酸二异丙酯(2.1g,10.40mmol)。撤去冰浴，反应液室温搅拌18小时，减压蒸干。粗产物过硅胶柱纯化(乙酸乙酯:石油醚＝1：1),得产品(R)-3-(4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(3.5g,100％)。
第二步(R)-3-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯的制备：
(R)-3-(4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.3g,2.9mmol)和5-氯-2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯氧基)吡啶(1g,3.0mmol)溶于95％乙醇(50mL)。加入碳酸钠(600mg,5.7mmol)和二(三苯基膦)二氯化钯(200mg,0.28mmol)，氩气保护下回流反应18小时，减压蒸干。粗品用乙酸乙酯(50mL)和水(50mL)萃取。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干。残余物制备板纯化(二氯甲烷:甲醇＝50：1)，得产品(R)-3-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(960mg,63％)。
第三步(R)-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺的制备：
(R)-3-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(960mg,1.8mmol)溶于四氢呋喃(10mL)，加入浓盐酸(0.5mL)，反应液60℃搅拌3小时，减压蒸干得粗产物(R)-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐(1.1g,100％)。直接用于下一步反应。
第四步(R)-3-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-腈的制备：
(R)-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐(500mg,1.1mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)，加入碳酸铯(600mg,1.9mmol)和溴化氰(400mg,3.8mmol)，反应液室温搅拌5小时，反应液倒入乙酸乙酯(50mL)，水洗(30mL*3)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干。粗产物制备板纯化(二氯甲烷:甲醇＝50：1)，得产品(R)-3-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-腈(130mg,27％)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.29-8.25(m,2H),8.02-7.99(m,1H),7.72(d,J＝8.4,2H),7.32(d,J＝8.4,2H),7.18(d,J＝8.8,1H),4.90-4.85(m,1H),3.64-3.62(m,1H),3.56-3.53(m,1H),3.42-3.39(m,1H),3.20-3.15(m,1H),2.17-2.08(m,2H),1.95-1.81(m,2H).
MS:m/z 446.8[M+1]
实施例2
(R,E)-1-(3-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-4-羟基丁-2-烯-1-酮(WS-301)的制备
以实施例1第三步反应的产物为起始物，实施例2经过以下的步骤制备：
第一步(R,E)-1-(3-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-4-羟基丁-2-烯-1-酮的制备：
(R)-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐(400mg,0.87mmol)和4-羟基-2-丁烯酸(130mg,1.27mmol)溶于四氢呋喃(20mL)，加入HATU(550mg,1.45mmol)和三乙胺(200mg,1.98mmol)，反应液室温搅拌18小时，减压蒸干。残余物溶于乙酸乙酯(50mL)，水洗(30mL*3)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干。粗产物制备板纯化(二氯甲烷:甲醇＝10：1)，得产品化合物(R,E)-1-(3-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-4-羟基丁-2-烯-1-酮(110mg,22％)。
H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.43(s,1H),8.26(d,J＝2.8,1H),8.03-7.99(m,1H),7.72(d,J＝8.0,2H),7.34(d,J＝8.4,2H),7.19(d,J＝8.8,2H),6.80-6.42(m,2H),4.76(brs,1H),4.57-4.54(m,0.5H),4.22-3.98(m,3.3H),3.75(brs,0.3H),3.23-3.21(m,1H),3.05-3.03(m,0.4H),2.32-2.15(m,2H),1.96-1.93(m,1H),1.62-1.58(m,1H).
MS:m/z 506.2[M+1]
实施例3
(R)-3-(4-氨基-3-(4-(4-氯苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-腈(WS-302)的制备
实施例3从对应的起始物开始，采用与实施例1类似的方法制备而得。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.27(s,1H),7.67-7.69(d,J＝8Hz,2H),7.46-7.48(d,J＝8Hz,2H),7.14-7.20(m,4H),4.84-4.89(m,1H),3.64-3.65(d,J＝4Hz,1H),3.50-3.54(m,1H),3.38-3.41(m,1H),3.14-3.20(m,1H),2.08-2.18(m,2H),1.79-1.93(m,2H).
MS:m/z 446.2[M+1]
实施例4
(R,E)-1-(3-(4-氨基-3-(4-(4-氯苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-4-羟基丁-2-烯-1-酮(WS-303)的制备
实施例4从对应的起始物开始，采用与实施例2类似的方法制备而得。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.43(s,1H),7.66-7.68(d,J＝8Hz,2H),7.47-7.49(d,J＝8Hz,2H),7.14-7.20(m,4H),6.50-6.75(m,2H),4.54-4.72(m,2H),4.21-4.40(m,6H),4.14(brs,1H),3.18-3.23(brs,1H),2.50(s,1H),2.39-2.42(m,1H),2.21-2.98(m,1H),1.92(brs,1H),1.58-1.60(m,1H).
MS:m/z 505.2[M+1]
实施例5
(R)-3-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-腈(WS-304)的制备
实施例5从对应的起始物开始，采用与实施例1类似的方法制备而得。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.27(s,1H),7.66-7.50(m,5H),7.40-7.36(m,1H),7.35-7.11(m,3H),4.87-4.85(m,1H),3.65-3.60(m,1H),3.54-3.48(m,1H),3.41-3.38(m,1H),3.19-3.16(m,1H),2.15-2.17(m,2H),1.90-1.82(m,2H).
MS:m/z 448.2[M+1]
实施例6
(R,E)-1-(3-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-4-羟基丁-2-烯-1-酮(WS-305)的制备
实施例6从对应的起始物开始，采用与实施例2类似的方法制备而得。
1H-NMR(400MHz,CDCl3-d6):δppm 8.46(s,1H),7.62-7.64(m,2H),7.16-7.18(m,1H),7.06-7.18(m,2H),6.93-7.06(m,3H),6.51-6.63(m,1H),5.41-5.46(brs.,1H),4.82-4.89(m,2H),4.28-4.38(m,2H),4.19-4.23(m,1H),3.36-3.77(m,1H),2.32-2.39(m,2H),1.98-2.02(m,2H),2.32-2.39(m,2H).
MS:m/z 506.2[M+1]
实施例7
5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈(WS-306)的制备
第一步6-甲基哌啶-3-醇的制备
将5-羟基-2-甲基-吡啶(1.5g,13.7mmol)溶在20ml乙酸里加入0.4g二氧化铂,混合物在50psi氢气的压强下搅拌16个小时。抽干溶剂得到化合物。
第二步5-羟基-2-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯的制备
将6-甲基哌啶-3-醇(1.10g，7.8mmol)和碳酸钠(1.6g,15.7mmol)加入到二氯甲烷(100mL)溶液中，然后将二碳酸二叔丁酯(1.71g，7.8mmol)滴加到上述反应体系中，反应液在室温条件下反应18小时，薄层色谱(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)检测反应完毕，将反应液萃取，滤液旋干，过柱纯化，得到产品5-羟基-2-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.7g)。
第三步5-(4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯的制备：
5-羟基-2-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯(7g,32.6mmol)和3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(8.5g,32.6mmol)溶于四氢呋喃(100mL)。冰浴下一次加入三苯基膦(11g,41.5mmol)，缓慢滴加偶氮二甲酸二异丙酯(9.6g,47.5mmol)。撤去冰浴，反应液室温搅拌18小时，减压蒸干。粗产物过硅胶柱纯化(乙酸乙酯:石油醚＝1：1)，得产品5-(4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯(12.2g,82％)。
MS:m/z 459.2[M+1]
第四步5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯的制备：
5-(4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯(1g,2.2mmol)和5-氯-2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯氧基)吡啶(800mg,2.4mmol)溶于95％乙醇(50mL)。加入碳酸钠(500mg,4.7mmol)和二(三苯基膦)二氯化钯(150mg,0.21mmol)，氩气保护下回流反应18小时，减压蒸干。粗品在二氯甲烷(50mL)和水(50mL)中进行萃取。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干。残余物制备板纯化(二氯甲烷:甲醇＝50：1)，得产品5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯(700mg,60％)。
MS:m/z 536.3[M+1]
第五步3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1-(6-甲基哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐的制备：
5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯(700mg,1.3mmol)溶于四氢呋喃(10mL)，加入浓盐酸(1mL)，反应液60℃搅拌3小时，减压蒸干得粗产物3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1-(6-甲基哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐(550mg,89％)。直接用于下一步反应。
MS:m/z 436.4[M+1]
第六步5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈的制备：
3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1-(6-甲基哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐(250mg,0.53mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3mL)，加入碳酸铯(250mg,0.77mmol)和溴化氰(250mg,2.36mmol)，反应液室温搅拌6小时，反应液倒入乙酸乙酯(50mL)，水洗(30mL*3)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干。粗产物制备板纯化(二氯甲烷:甲醇＝50：1)，得产品5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈(120mg,49％)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 11.67(brs,1H),8.20(s,1H),8.06(d,J＝2.4,1H),7.68-7.64(m,3H),7.28(d,J＝8.8,2H),6.95(d,J＝8.4,1H),6.43(brs,1H),4.94-4.91(m,1H),3.92-3.87(m,1H),3.48-3.44(m,3H),2.49-2.46(m,1H),2.02-1.88(m,3H),1.37(d,J＝6.8,3H).
MS:m/z 461.4[M+1]
实施例8
(E)-1-(5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-基)-4-羟基丁-2-烯-1-酮(WS-307)的制备
以实施例7第五步反应的产物为起始物，实施例8经过以下的步骤制备：
第一步(E)-1-(5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-基)-4-羟基丁-2-烯-1-酮的制备：
3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1-(6-甲基哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐(250mg,0.53mmol)和4-羟基-2-丁烯酸(100mg,0.98mmol)溶于四氢呋喃(10mL)，加入HATU(300mg,0.79mmol)和三乙胺(100mg,0.99mmol)，反应液室温搅拌18小时，减压蒸干。残余物溶于乙酸乙酯(50mL)，水洗(30mL*3)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干。粗产物制备板纯化(二氯甲烷:甲醇＝10：1)，得产品(E)-1-(5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-基)-4-羟基丁-2-烯-1-酮(155mg,50％)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.35(d,J＝7.6,1H),8.14(d,J＝2.8,1H),7.75-7.69(m,3H),7.31(d,J＝7.6,2H),6.99-6.95(m,2H),6.60-6.50(m,1H),5.75(brs,1.7H),5.05(brs,0.4H),4.82-4.70(m,1.6H),4.50-4.35(m,2.5H),4.10-4.05(m,0.5H),3.90-3.80(m,0.5H),3.50-3.45(m,0.7H),3.10-3.00(m,0.2H),2.60-2.50(m,1.3H),2.07-1.75(m,5.4H),1.43-1.25(m,3.2H).
MS:m/z 520.4[M+1]
实施例9
5-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈(WS-308)的制备
实施例9从对应的起始物开始，采用与实施例7类似的方法制备而得。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):8.39(s,1H),7.68(d,J＝8.8,1H),7.19-7.08(m,3H),7.03-6.90(m,2H),5.57(brs,2H),4.98-4.94(m,1H),3.97-3.92(m,1H),3.57-3.46(m,2H),2.56-2.51(m,1H),2.06-1.95(m,3H),1.43(d,J＝7.8,3H).
MS:m/z 462.3[M+1]
实施例10
(2S,5R)-5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈(WS-309)和(2R,5S)-5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈(WS-310)的制备
实施例10是实施例7的产物经手性拆分后制得。拆分条件为：Supercriticalfluid chromatography(ChiralPak AD 5μ,21x 250mm col,27％甲醇,70mL/分钟)。
WS-309谱图数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 11.67(brs,1H),8.20(s,1H),8.06(d,J＝2.4,1H),7.68-7.64(m,3H),7.28(d,J＝8.8,2H),6.95(d,J＝8.4,1H),6.43(brs,1H),4.94-4.91(m,1H),3.92-3.87(m,1H),3.48-3.44(m,3H),2.49-2.46(m,1H),2.02-1.88(m,3H),1.37(d,J＝6.8,3H).
MS:m/z 461.4[M+1]
WS-310谱图数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 11.67(brs,1H),8.20(s,1H),8.06(d,J＝2.4,1H),7.68-7.64(m,3H),7.28(d,J＝8.8,2H),6.95(d,J＝8.4,1H),6.43(brs,1H),4.94-4.91(m,1H),3.92-3.87(m,1H),3.48-3.44(m,3H),2.49-2.46(m,1H),2.02-1.88(m,3H),1.37(d,J＝6.8,3H).
MS:m/z 461.4[M+1]
实施例11
(E)-1-((2S,5R)-5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-基)-4-羟基丁-2-烯-1-酮(WS-311)和(E)-1-((2R,5S)-5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-基)-4-羟基丁-2-烯-1-酮(WS-312)的制备
实施例11是实施例8的产品经手性拆分后制得。拆分条件为：Supercriticalfluid chromatography(ChiralPak AD 5μ,21x 250mm col,27％甲醇,70mL/分钟)。
WS-311谱图数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.35(d,J＝7.6,1H),8.14(d,J＝2.8,1H),7.75-7.69(m,3H),7.31(d,J＝7.6,2H),6.99-6.95(m,2H),6.60-6.50(m,1H),5.75(brs,1.7H),5.05(brs,0.4H),4.82-4.70(m,1.6H),4.50-4.35(m,2.5H),4.10-4.05(m,0.5H),3.90-3.80(m,0.5H),3.50-3.45(m,0.7H),3.10-3.00(m,0.2H),2.60-2.50(m,1.3H),2.07-1.75(m,5.4H),1.43-1.25(m,3.2H).
MS:m/z 520.4[M+1]
WS-312谱图数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.35(d,J＝7.6,1H),8.14(d,J＝2.8,1H),7.75-7.69(m,3H),7.31(d,J＝7.6,2H),6.99-6.95(m,2H),6.60-6.50(m,1H),5.75(brs,1.7H),5.05(brs,0.4H),4.82-4.70(m,1.6H),4.50-4.35(m,2.5H),4.10-4.05(m,0.5H),3.90-3.80(m,0.5H),3.50-3.45(m,0.7H),3.10-3.00(m,0.2H),2.60-2.50(m,1.3H),2.07-1.75(m,5.4H),1.43-1.25(m,3.2H).
MS:m/z 520.4[M+1]
实施例12
(2S,5R)-5-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈(WS-313)和(2R,5S)-5-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈(WS-314)的制备
实施例12是实施例9的产品经手性拆分后制得。拆分条件为：Supercriticalfluid chromatography(ChiralPak AD 5μ,21x 250mm col,27％甲醇,70mL/分钟)。
WS-313谱图数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):8.39(s,1H),7.68(d,J＝8.8,1H),7.19-7.08(m,3H),7.03-6.90(m,2H),5.57(brs,2H),4.98-4.94(m,1H),3.97-3.92(m,1H),3.57-3.46(m,2H),2.56-2.51(m,1H),2.06-1.95(m,3H),1.43(d,J＝7.8,3H).
MS:m/z 462.3[M+1]
WS-314谱图数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):8.39(s,1H),7.68(d,J＝8.8,1H),7.19-7.08(m,3H),7.03-6.90(m,2H),5.57(brs,2H),4.98-4.94(m,1H),3.97-3.92(m,1H),3.57-3.46(m,2H),2.56-2.51(m,1H),2.06-1.95(m,3H),1.43(d,J＝7.8,3H).
MS:m/z 462.3[M+1]
实施例13
6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-腈(WS-315)的制备
第一步4-羟基丁酸甲酯的制备：
将二氢呋喃-2(3H)-酮(100g，1.163mol)和三乙胺(460g,4.65mol)加入到甲醇(1L)溶液中，反应液在60℃的条件下反应24小时，薄层色谱(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)检测反应完毕，将反应液旋干，得到4-羟基丁酸甲酯(120g，87.6％，黄色液体)，直接用于下一步反应。
第二步4-氧代丁酸甲酯的制备：
将4-羟基丁酸甲酯(120g，1.02mol)加入到二氯甲烷(1.2L)溶液中，然后将氯铬酸吡啶(330g，1.53mol)加入到上述反应液中，室温条件下反应12小时，薄层色谱(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)检测反应完毕，将反应液通过硅藻土过滤，旋干，得到4-氧代丁酸甲酯(60g，50％，黄色液体)，直接用于下一步反应。
第三步4-羟基-5-硝基戊酸甲酯的制备：
冰水浴中，将4-氧代丁酸甲酯(60g，0.46mol)，硝基甲烷(42g，0.69mol),四氢呋喃(300mL)和叔丁醇(300mL)加入到反应瓶中，然后将叔丁醇钾(5g)缓慢加入上述反应体系中，升至室温，反应2小时，薄层色谱(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)检测反应完毕，加水(30mL)淬灭反应，旋干溶剂，加入水(300mL)和乙酸乙酯(300mL)分液，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，得到粗品4-羟基-5-硝基戊酸甲酯(45g，淡黄色油状液体)直接用于下一步。
第四步5-羟基哌啶-2-酮的制备：
将4-羟基-5-硝基戊酸甲酯(45g，0.23mol)和钯碳(2.1g)加入到甲醇(500mL)溶液中，反应液在60℃，氢气存在的条件下反应24小时，薄层色谱(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)检测反应完毕，将反应液通过硅藻土过滤，滤液旋干，得到5-羟基哌啶-2-酮(10g，黄色固体,38％)，直接用于下一步反应。
第五步1-苄基-5-(苄氧基)哌啶-2-酮的制备：
室温下，将5-羟基哌啶-2-酮(10g，0.1mol)加入到二甲基亚砜(100mL)中，然后将氢化钠(10g，0.25mol)缓慢加入到上述反应体系中，加入完毕后，将苄溴(43.5g，0.25mol)加入到反应液中，搅拌过夜，薄层色谱(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)检测反应完毕，向反应体系中加入饱和氯化铵(100ml)淬灭反应，乙酸乙酯(100mL*3)萃取三次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱纯化，得到1-苄基-5-(苄氧基)哌啶-2-酮(16g，黄色固体，54％)。
第六步4-苄基-6-(苄氧基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷的制备：
-78℃氮气保护下，将1-苄基-5-(苄氧基)哌啶-2-酮(15g，50mmol)溶于无水四氢呋喃(150mL)中，然后向反应瓶中缓慢滴加乙基溴化镁(150mL)，滴加完毕后，再将钛酸四丙酯(45g，150mmol)加入到上述反应体系中，滴加完毕，将反应液升至室温，搅拌2小时，薄层色谱(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)检测反应完毕，向反应体系中加入饱和氯化铵(100ml)淬灭反应，乙酸乙酯(100mL*3)萃取三次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱纯化，得到4-苄基-6-(苄氧基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷(5.1g，黄色固体,31％)。
第七步4-氮杂螺[2.5]辛-6-醇的制备：
将4-苄基-6-(苄氧基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷(5.5g，18mmol)和钯碳(2g,1.8mmol)加入到甲醇(200mL)和氯化氢(2mL)溶液中，反应液在60℃，氢气条件下反应48小时，薄层色谱(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)检测反应完毕，将反应液通过硅藻土过滤，滤液旋干，得到4-氮杂螺[2.5]辛-6-醇(2.5g，黄色固体)，直接用于下一步反应。
第八步6-羟基-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-甲酸叔丁酯的制备：
将4-氮杂螺[2.5]辛-6-醇(1g，7.8mmol)和碳酸钠(1.6g,15.7mmol)加入到二氯甲烷(100mL)溶液中，然后将二碳酸二叔丁酯(1.71g，7.8mmol)滴加到上述反应体系中，反应液在室温条件下反应18小时，薄层色谱(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)检测反应完毕，将反应液萃取，滤液旋干，过柱纯化，得到6-羟基-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-甲酸叔丁酯(1.7g)。
第九步6-(4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-甲酸叔丁酯的制备：
6-羟基-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-甲酸叔丁酯(2.5g,11.0mmol)和3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(3.4g,13.0mmol)溶于四氢呋喃(200mL)。冰浴下一次加入三苯基膦(4.5g,17.2mmol)，缓慢滴加偶氮二甲酸二异丙酯(3.5g,17.3mmol)。撤去冰浴，反应液室温搅拌18小时，减压蒸干。粗产物过硅胶柱纯化(EA:PE＝1：1)，得产品6-(4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-甲酸叔丁酯(3.6g,70％)。
第十步6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-甲酸叔丁酯的制备：
6-(4-氨基-3-碘-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-甲酸叔丁酯(500mg,1.1mmol)和5-氯-2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯氧基)吡啶(500mg,1.5mmol)溶于95％乙醇(20mL)中。加入碳酸钠(230mg,2.2mmol)和二(三苯基膦)二氯化钯(120mg,0.2mmol)，氩气保护下回流反应18小时，减压蒸干。粗品用二氯甲烷(50mL)和水(50mL)萃取。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干。残余物制备板纯化(二氯甲烷:甲醇＝50：1)，得产品6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-甲酸叔丁酯(420mg,76％)。
第十一步3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1-(4-氮杂螺[2.5]辛-6-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐的制备：
6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-甲酸叔丁酯(420mg,0.8mmol)溶于四氢呋喃(10mL)，加入浓盐酸(1mL)，反应液60℃搅拌5小时，减压蒸干得粗产物3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1-(4-氮杂螺[2.5]辛-6-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐(450mg)。直接用于下一步反应。
第十二步6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-腈的制备：
3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1-(4-氮杂螺[2.5]辛-6-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐(200mg,0.44mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)，加入碳酸铯(200mg,0.62mmol)和溴化氰(200mg,1.89mmol)，反应液室温搅拌6小时，反应液倒入乙酸乙酯(50mL)，水洗(30mL*3)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干。粗产物制备板纯化(二氯甲烷:甲醇＝50：1)，得产品化合物6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-腈(31mg,15.9％)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.30-8.26(m,2H),8.02-7.99(m,1H),7.73(d,J＝8.4,2H),7.32(d,J＝8.4,2H),7.18(d,J＝8.8,1H),5.03-5.01(m,1H),3.67-3.57(m,2H),2.39-2.36(m,1H),2.19-2.15(m,2H),1.57-1.53(m,1H),0.98-0.77(m,4H).
MS:m/z 473.2[M+1]
实施例14
(R)-6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-腈(WS-316)和(S)-6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-腈(WS-317)的制备
实施例13第十二步反应的产物经手性拆分后可得实施例14化合物。拆分条件为：Supercritical fluid chromatography(ChiralPak AD 5μ,21x 250mm col,27％甲醇,70mL/分钟)。
WS-316谱图数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.30-8.26(m,2H),8.02-7.99(m,1H),7.73(d,J＝8.4,2H),7.32(d,J＝8.4,2H),7.18(d,J＝8.8,1H),5.03-5.01(m,1H),3.67-3.57(m,2H),2.39-2.36(m,1H),2.19-2.15(m,2H),1.57-1.53(m,1H),0.98-0.77(m,4H).
MS:m/z 473.2[M+1]
WS-317谱图数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.30-8.26(m,2H),8.02-7.99(m,1H),7.73(d,J＝8.4,2H),7.32(d,J＝8.4,2H),7.18(d,J＝8.8,1H),5.03-5.01(m,1H),3.67-3.57(m,2H),2.39-2.36(m,1H),2.19-2.15(m,2H),1.57-1.53(m,1H),0.98-0.77(m,4H).
MS:m/z 473.2[M+1]
实施例15
(E)-1-(6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛-4-基)-4-羟基丁-2-烯-1-酮(WS-318)的制备
以实施例13第十一步反应的产物为起始物，实施例15经过以下的步骤制备：
第一步(E)-1-(6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛-4-基)-4-羟基丁-2-烯-1-酮的制备：
3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1-(4-氮杂螺[2.5]辛-6-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐(220mg,0.48mmol)和4-羟基-2-丁烯酸(80mg,0.78mmol)溶于四氢呋喃(5mL)，加入HATU(230mg,0.61mmol)和三乙胺(100mg,0.99mmol)，反应液室温搅拌18小时，减压蒸干。残余物溶于乙酸乙酯(50mL)，水洗(30mL*3)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干。粗产物制备板纯化(二氯甲烷:甲醇＝10：1),得产品(E)-1-(6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛-4-基)-4-羟基丁-2-烯-1-酮(30mg,12％)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.32(s,1H),8.26(d,J＝2.8,1H),8.02-7.99(m,1H),7.73-7.71(m,2H),7.34-7.31(m,2H),7.21-7.17(m,2H),7.08-6.81(m,3H),4.80-4.50(m,3H),4.20-4.00(m,2H),3.55-3.53(m,2H),2.20-2.00(m,2H),1.40-1.10(m,2H),0.90-0.70(m,2H)
MS:m/z 532.2[M+1]
实施例16
(R,E)-1-(6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛-4-基)-4-羟基丁-2-烯-1-酮(WS-319)和(S,E)-1-(6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛-4-基)-4-羟基丁-2-烯-1-酮(WS-320)制备
实施例15的化合物经手性拆分后可得实施例16的化合物。拆分条件为：Supercritical fluid chromatography(ChiralPak AD 5μ,21x 250mm col,27％甲醇,70mL/分钟)。
WS-319谱图数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.32(s,1H),8.26(d,J＝2.8,1H),8.02-7.99(m,1H),7.73-7.71(m,2H),7.34-7.31(m,2H),7.21-7.17(m,2H),7.08-6.81(m,3H),4.80-4.50(m,3H),4.20-4.00(m,2H),3.55-3.53(m,2H),2.20-2.00(m,2H),1.40-1.10(m,2H),0.90-0.70(m,2H)
MS:m/z 532.2[M+1]
WS-320谱图数据：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.32(s,1H),8.26(d,J＝2.8,1H),8.02-7.99(m,1H),7.73-7.71(m,2H),7.34-7.31(m,2H),7.21-7.17(m,2H),7.08-6.81(m,3H),4.80-4.50(m,3H),4.20-4.00(m,2H),3.55-3.53(m,2H),2.20-2.00(m,2H),1.40-1.10(m,2H),0.90-0.70(m,2H)
MS:m/z 532.2[M+1]
实施例17
6-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-腈(WS-321)的制备
实施例17从对应的起始物开始，采用与实施例13类似的方法制备而得。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.28(s,1H),7.69-7.53(m,6H),7.39-7.37(m,1H),7.18-7.11(m,2H),5.03-4.98(m,1H),3.64-3.56(m,2H),2.19-2.16(m,1H),2.15-2.06(m,2H),1.34-1.32(m,1H),0.97-0.78(m,4H).
MS:m/z 474.2[M+1]
实施例18
(E)-1-(6-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛-4-基)-4-羟基丁-2-烯-1-酮的制备(WS-322)的制备
实施例18从对应的起始物开始，采用与实施例15类似的方法制备而得。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 8.40(s,1H),7.70-7.68(m,2H),7.30-7.04(m,7H),4.75-4.70(m,0.73H),4.55-4.50(m,0.17H),4.13-4.10(m,2H),3.61-3.58(m,2H),3.01-2.95(m,0.65H),2.72-2.60(m,0.81H),2.43-2.38(m,1H),1.84-1.78(m,3H),1.31-1.26(m,2H),0.98-0.70(m,2H)
MS:m/z 533.2[M+1]
实施例19
(2S,5R)-5-(4-氨基-3-(4-(4-氯苯氧)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈(WS-323)和(2R,5S)-5-(4-氨基-3-(4-(4-氯苯氧)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈(WS-324)的制备
实施例19从对应的起始物开始，采用与实施例7类似的方法先制备得到5-(4-氨基-3-(4-(4-氯苯氧)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈，该化合物经手性拆分后可得化合物WS-323和WS-324。拆分条件为：Supercritical fluidchromatography(ChiralPak AD 5μ,21x 250mm col,27％甲醇,70mL/分钟)。
WS-323谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.35(d,J＝11.2Hz,1H),7.72-7.67(m,2H),7.36-7.31(m,2H),7.16-7.04(m,2H),7.02-6.99(m,2H),5.54(s,2H),4.96-4.94(m,1H),3.99-3.91(m,1H),3.54-3.45(m,2H),2.54-2.53(m,1H),2.07-1.97(m,3H),1.44-1.40(m,3H).
MS:m/z 460.4[M+H]
WS-324谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.35(d,J＝11.2Hz,1H),7.72-7.67(m,2H),7.36-7.31(m,2H),7.16-7.04(m,2H),7.02-6.99(m,2H),5.54(s,2H),4.96-4.94(m,1H),3.99-3.91(m,1H),3.54-3.45(m,2H),2.54-2.53(m,1H),2.07-1.97(m,3H),1.44-1.40(m,3H).
MS:m/z 460.4[M+H]
实施例20
(2S,5R)-5-(4-氨基-3-(4-苯氧苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈(WS-325)和(2S,5R)-5-(4-氨基-3-(4-苯氧苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈(WS-326)的制备
实施例20从对应的起始物开始，采用与实施例9类似的方法先制备得到5-(4-氨基-3-(4-苯氧苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈，该化合物经手性拆分后可得化合物WS-325和WS-326。拆分条件为：Supercritical fluid chromatography(ChiralPak AD 5μ,21x 250mm col,27％甲醇,70mL/分钟)。
WS-325谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.37(s,1H),7.70-7.66(m,2H),7.42-7.38(m,2H),7.20-7.15(m,3H),7.11-7.08(m,2H),5.51(s,2H),4.99-4.94(m,1H),3.99-3.93(m,1H),3.58-3.47(m,2H),2.56-2.52(m,1H),2.06-1.96(m,3H),1.43(d,J＝6.8,3H).
MS:m/z 426.5[M+H]
WS-326谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.37(s,1H),7.70-7.66(m,2H),7.42-7.38(m,2H),7.20-7.15(m,3H),7.11-7.08(m,2H),5.51(s,2H),4.99-4.94(m,1H),3.99-3.93(m,1H),3.58-3.47(m,2H),2.56-2.52(m,1H),2.06-1.96(m,3H),1.43(d,J＝6.8,3H).
MS:m/z 426.5[M+1]
实施例21
1-((2S,5R)-5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-基)-2-丙烯基-1-酮(WS-327)和1-((2R,5S)-5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-基)-2-丙烯基-1-酮(WS-328)的制备
以实施例7第五步反应的产物为起始物，实施例21经过以下的步骤制备：
3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1-(6-甲基哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐(300mg,0.63mmol)和丙烯酸(70mg,0.98mmol)溶于THF(10mL)，加入HATU(362mg,0.95mmol)和三乙胺(192mg,1.91mmol)，反应液室温搅拌18h，减压蒸干。残余物溶于乙酸乙酯(50mL)，水洗(30mL*3)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干。粗产物制备板纯化(DCM:MeOH＝10：1),得5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-基)-2-丙烯基-1-酮(58mg,29％)。该化合物经手性拆分后可得实施例21化合物WS-327和WS-328。拆分条件为：Supercritical fluid chromatography(ChiralPak AD 5μ,21x 250mm col,27％甲醇,70mL/分钟)。
WS-327谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.38(s,1H),8.14(s,1H),7.75-7.73(m,3H),7.31-7.26(m,2H),6.98(d,J＝8.8Hz,1H),6.62-6.59(m,1H),6.30(d,J＝8.4Hz,1H 1H),5.72-5.65(m,1H),5.55(s,2H),4.87-4.80(m,2H),4.14-4.03(m,1H),3.53-3.47(m,1H),2.67-2.57(m,1H),2.08-1.96(m,2H),1.86-1.83(m,1H),1.34(d,J＝8.8Hz,3H).
MS:m/z 490.2[M+H]
WS-328谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.38(s,1H),8.14(s,1H),7.75-7.73(m,3H),7.31-7.26(m,2H),6.98(d,J＝8.8Hz,1H),6.62-6.59(m,1H),6.30(d,J＝8.4Hz,1H 1H),5.72-5.65(m,1H),5.55(s,2H),4.87-4.80(m,2H),4.14-4.03(m,1H),3.53-3.47(m,1H),2.67-2.57(m,1H),2.08-1.96(m,2H),1.86-1.83(m,1H),1.34(d,J＝8.8Hz,3H).
MS:m/z 490.2[M+H]
实施例22
1-((2S,5R)-5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-基)-2-丁炔基-1-酮(WS-329)和1-((2R,5S)-5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-基)-2-丁炔基-1-酮(WS-330)的制备
以实施例7第五步反应的产物为起始物，实施例22经过以下的步骤制备：
3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1-(6-甲基哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐(230mg,0.53mmol)和丁-2-炔酸(80mg,0.98mmol)溶于THF(10mL)，加入HATU(300mg,0.79mmol)和三乙胺(100mg,0.99mmol)，反应液室温搅拌18h，减压蒸干。残余物溶于乙酸乙酯(50mL)，水洗(30mL*3)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干。粗产物制备板纯化(DCM:MeOH＝10：1),得1-((2S,5R)-5-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-基)-2-丁炔基-1-酮(130mg,50％)。该化合物经手性拆分后可得实施例22化合物WS-329和WS-330。拆分条件为：Supercritical fluidchromatography(ChiralPak AD 5μ,21x 250mm col,27％甲醇,70mL/分钟)。
WS-329谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.38(s,1H),8.14(s,1H),7.77-7.69(m,3H),7.33-7.29(m,2H),7.00-6.96(m,1H),5.50(s,2H),4.98-4.81(m,3H),3.89-3.87(m,1H),2.57-2.53(m,1H),2.05(s,3H),1.85-1.76(m,3H),1.41(d,J＝6.8Hz,3H).
MS:m/z 502.3[M+H]
WS-330谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.38(s,1H),8.14(s,1H),7.77-7.69(m,3H),7.33-7.29(m,2H),7.00-6.96(m,1H),5.50(s,2H),4.98-4.81(m,3H),3.89-3.87(m,1H),2.57-2.53(m,1H),2.05(s,3H),1.85-1.76(m,3H),1.41(d,J＝6.8Hz,3H).
MS:m/z 502.3[M+H]
实施例23
1-((2S,5R)-5-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-基)-2-丙烯基-1-酮(WS-331)和1-((2R,5S)-5-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-基)-2-丙烯基-1-酮(WS-332)的制备
实施例23从对应的起始物开始，采用与实施例21类似的方法制备而得。
WS-331谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.37(s,1H),7.64(d,J＝8.8Hz,2H),7.19-7.13(m,1H),7.09(d,J＝8.4Hz,2H),7.04-6.97(m,1H),6.94-6.90(m,1H),6.66-6.54(m,1H),6.31-6.25(m,1H),5.72-5.65(m,1H),5.45(s,2H),4.85-4.78(m,1H),3.85-3.44(m,2H),2.59-2.53(m,1H),2.12-1.89(m,2H),1.85-1.77(m,1H),1.33(d,J＝8.8Hz,3H).
MS:m/z 491.4[M+H]
WS-332谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.37(s,1H),7.64(d,J＝8.8Hz,2H),7.19-7.13(m,1H),7.09(d,J＝8.4Hz,2H),7.04-6.97(m,1H),6.94-6.90(m,1H),6.66-6.54(m,1H),6.31-6.25(m,1H),5.72-5.65(m,1H),5.45(s,2H),4.85-4.78(m,1H),3.85-3.44(m,2H),2.59-2.53(m,1H),2.12-1.89(m,2H),1.85-1.77(m,1H),1.33(d,J＝8.8Hz,3H).
MS:m/z 491.4[M+H]
实施例24
1-((2S,5R)-5-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-基)-2-丁炔基-1-酮(WS-333)和1-((2R,5S)-5-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-基)-2-丁炔基-1-酮(WS-334)的制备
实施例24从对应的起始物开始，采用与实施例22类似的方法制备而得。
WS-333谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.37(s,1H),7.67-7.62(m,2H),7.19-7.13(m,1H),7.11-7.08(m,2H),7.02-6.98(m,1H),6.97-6.90(m,1H),5.49(s,1H),4.81-4.77(m,2H),3.87-3.46(m,1H),2.56-2.53(m,1H),1.98(s,3H),1.32(d,J＝7.2Hz,3H).
MS:m/z 503.4[M+H]
WS-334谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.37(s,1H),7.67-7.62(m,2H),7.19-7.13(m,1H),7.11-7.08(m,2H),7.02-6.98(m,1H),6.97-6.90(m,1H),5.49(s,1H),4.81-4.77(m,2H),3.87-3.46(m,1H),2.56-2.53(m,1H),1.98(s,3H),1.32(d,J＝7.2Hz,3H).
MS:m/z 503.4[M+H]
实施例25
(R)-1-(6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-基)-2-丙烯基-1-酮(WS-335)和(S)-1-(6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-基)-2-丙烯基-1-酮(WS-336)的制备
以实施例13第十一步反应的产物为起始物，实施例25经过以下的步骤制备：
3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1-(4-氮杂螺[2.5]辛-6-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺盐酸盐(50mg,0.11mmol)和丙烯酸(8.03mg,0.11mmol)溶于THF(5mL)，加入HATU(63.67mg,0.17mmol)和三乙胺(33.89mg,0.33mmol)，反应液室温搅拌18h，减压蒸干。残余物溶于乙酸乙酯(50mL)，水洗(30mL*3)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干。粗产物制备板纯化(DCM:MeOH＝10：1),得1-(6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-基)-2-丙烯基-1-酮(38mg,67％)。该化合物经手性拆分后可得实施例25化合物WS-335和WS-336。拆分条件为：Supercritical fluidchromatography(ChiralPak AD 5μ,21x 250mm col,27％甲醇,70mL/分钟)。
WS-335谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.40(s,1H),8.17(s,2H),7.78-7.71(m,2H),7.21(d,J＝8.4Hz,2H),6.99(d,J＝8.8Hz,1H),6.91-6.90(m,1H),6.42-6.38(m,1H),5.75-5.73(m,1H),5.61(s,2H),4.98-4.94(m,1H),3.78-3.75(m,1H),2.54-2.49(m,1H),2.30-2.22(m,2H),1.28-1.20(m,3H),1.14-1.10(m,1H),0.90-0.82(m,2H).
MS:m/z 502.3[M+H]
WS-336谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.40(s,1H),8.17(s,2H),7.78-7.71(m,2H),7.21(d,J＝8.4Hz,2H),6.99(d,J＝8.8Hz,1H),6.91-6.90(m,1H),6.42-6.38(m,1H),5.75-5.73(m,1H),5.61(s,2H),4.98-4.94(m,1H),3.78-3.75(m,1H),2.54-2.49(m,1H),2.30-2.22(m,2H),1.28-1.20(m,3H),1.14-1.10(m,1H),0.90-0.82(m,2H).
MS:m/z 502.4[M+H]
实施例26
(R)-1-(6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-基)-2-丁炔基-1-酮(WS-337)和(S)-1-(6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-基)-2-丁炔基-1-酮(WS-338)的制备
实施例26从对应的起始物开始，采用与实施例22类似的方法制备而得。
WS-337谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3-d6):δppm 8.40(s,1H),8.15(s,1H),7.79-7.69(m,3H),7.32-7.29(m,2H),6.99-6.96(m,1H),5.54(s,1H),5.04-5.02(m,1H),4.58-4.56(m,1H),4.07-4.05(m,1H),2.53-2.44(m,1H),2.26-2.20(m,2H),2.06(s,3H),2.01-1.98(s,1H),1.43-1.41(m,1H),1.06-1.05(m,1H),1.05-1.04(m,2H).
MS:m/z 514.3[M+H]
WS-338谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3-d6):δppm 8.40(s,1H),8.15(s,1H),7.79-7.69(m,3H),7.32-7.29(m,2H),6.99-6.96(m,1H),5.54(s,1H),5.04-5.02(m,1H),4.58-4.56(m,1H),4.07-4.05(m,1H),2.53-2.44(m,1H),2.26-2.20(m,2H),2.06(s,3H),2.01-1.98(s,1H),1.43-1.41(m,1H),1.06-1.05(m,1H),1.05-1.04(m,2H).
MS:m/z 514.3[M+H]
实施例27
(R)-1-(6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-基)-4-羟基-2-丁炔基-1-酮(WS-339)和(S)-1-(6-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-基)-4-羟基-2-丁炔基-1-酮(WS-340)的制备
实施例27从对应的起始物开始，采用与实施例21类似的方法制备而得。
WS-339谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.38(s,1H),8.13(d,J＝2.4Hz,1H),7.76-7.69(m3H),7.31-7.29(m,2H),6.97(d,J＝8.8Hz,1H),5.63-5.53(m,1H),5.01-4.96(m,1H),4.46-4.40(m,1H),4.26-4.23(m,1H),3.84-3.83(m,1H),2.27-2.21(m,1H),2.12-2.08(m,3H),1.28-1.25(m,1H),1.04-1.02(m,1H),0.93-0.75(m,2H).
MS:m/z 530.3[M+H]
WS-340谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.38(s,1H),8.13(d,J＝2.4Hz,1H),7.76-7.69(m3H),7.31-7.29(m,2H),6.97(d,J＝8.8Hz,1H),5.63-5.53(m,1H),5.01-4.96(m,1H),4.46-4.40(m,1H),4.26-4.23(m,1H),3.84-3.83(m,1H),2.27-2.21(m,1H),2.12-2.08(m,3H),1.28-1.25(m,1H),1.04-1.02(m,1H),0.93-0.75(m,2H).
MS:m/z 530.3[M+H]
实施例28
4-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-腈(WS-341)的制备
实施例28从对应的起始物开始，采用与实施例1类似的方法制备而得。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm 8.37(s，1H),7.64(d,J＝8.4Hz,2H),7.19-7.13(m,1H),7.09(d,J＝8.4Hz,2H),7.02-6.97(m,1H),6.94-6.90(m,1H),5.63(s,2H),4.92-4.86(m,1H),3.66-3.63(m,2H),3.31-3.25(m,2H),2.54-2.44(m,2H),2.10-2.01(m,2H).
MS:m/z 448.3[M+H]
实施例29
5-(4-氨基-3-(1-苄基-1H-吡唑-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈(WS-342)的制备
实施例29从对应的起始物开始，采用与实施例7类似的方法制备而得。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.34(s,1H),7.85(d,J＝16.8Hz，2H),7.41-7.26(m,5H),5.54(s,2H),5.39(s,2H),4.92-4.90(m,1H),3.94-3.88(m,1H),3.74-3.72(m,1H),3.57-3.49(m,1H),3.48-3.42(m,1H),2.49(m，1H)，2.00-1.90(m,1H)，1.63-1.54(m,3H).
MS:m/z 414.3[M+H]
实施例30
5-(4-氨基-3-(4-(吗啉甲基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈(WS-343)的制备
实施例30从对应的起始物开始，采用与实施例7类似的方法制备而得。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.34(s,1H),7.69(d,J＝7.6Hz，2H),7.53(d,J＝7.6Hz，2H),5.54(s,2H),4.97(m,1H),3.97-3.93(m,1H),3.75-3.74(m,4H),3.60-3.47(m,5H),2.56-2.52(m,4H),2.49(m，1H)，2.01-1.96(m,3H)，1.44-1.52(d,J＝6.8Hz,3H).
MS:m/z 433.3[M+H]
实施例31
5-(4-氨基-3-(4-苄基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈(WS-344)的制备
实施例31从对应的起始物开始，采用与实施例7类似的方法制备而得。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.36(s,1H),7.65-7.63(m，2H),7.38-7.36(m,2H),7.25-7.23(m,2H),5.55(s,2H),4.97-4.94(m,1H),3.97-3.92(m,1H),3.74-3.72(m,1H),3.58-3.52(m,1H),2.54-2.52(m,1H),2.05-1.96(m,2H)，1.61-1.56(m,3H).
MS:m/z 424.3[M+H]
实施例32
5-(4-氨基-3-(4-(苯氨基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲基哌啶-1-腈(WS-345)的制备
实施例32从对应的起始物开始，采用与实施例7类似的方法制备而得。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.36(s,1H),7.60(d,J＝8.4Hz，2H),7.35-7.29(m,2H),7.20-7.15(m,4H),7.04-7.00(m,1H),5.91(s,2H),5.57(s,1H),4.97-4.93(m,1H),3.98-3.93(m,1H),3.59-3.55(m,1H),3.50-3.46(m,1H),2.58-2.52(m,1H),2.05-2.03(m,2H)，2.00-1.97(m,2H),1.44(d,J＝6.8Hz，3H).
MS:m/z 425.4[M+H]
实施例33
(R)-1-(6-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-基)-2-丙烯基-1-酮(WS-346)和(S)-1-(6-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-基)-2-丙烯基-1-酮(WS-347)的制备
实施例33从对应的起始物开始，采用与实施例21类似的方法制备而得。
WS-346谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.37(s,1H),7.65(d,J＝8.4Hz,2H),7.19-7.13(m,1H),7.02-6.97(m,1H),6.94-6.90(m,1H),6.39-6.35(m,1H),5.72-5.69(m,1H),5.49-5.46(m,2H),4.95-4.94(m,1H),3.78-3.74(m,1H),2.52-2.47(m,1H),2.30-2.22(m,1H),1.82-1.69(m,2H),1.28-1.20(m,1H),1.14-1.10(m,1H),0.90-0.79(m,2H).
MS:m/z 503.4[M+H]
WS-347谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.37(s,1H),7.65(d,J＝8.4Hz,2H),7.19-7.13(m,1H),7.02-6.97(m,1H),6.94-6.90(m,1H),6.39-6.35(m,1H),5.72-5.69(m,1H),5.49-5.46(m,2H),4.95-4.94(m,1H),3.78-3.74(m,1H),2.52-2.47(m,1H),2.30-2.22(m,1H),1.82-1.69(m,2H),1.28-1.20(m,1H),1.14-1.10(m,1H),0.90-0.79(m,2H).
MS:m/z 503.4[M+H]
实施例34
(R)-1-(6-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-基)-2-丁炔基-1-酮(WS-348)和(S)-1-(6-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-基)-2-丁炔基-1-酮(WS-349)的制备
实施例34从对应的起始物开始，采用与实施例26类似的方法制备而得。
WS-348谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.37(s,1H),7.69-7.65(m,2H),7.16-7.13(m,1H),7.11-7.07(m,2H),7.02-6.97(m,1H),6.94-6.92(m,1H),5.47(s,2H),5.04-4.91(m,1H),4.59-4.30(m,1H),4.06-3.65(m,1H),2.52-2.45(m,1H),2.25-2.17(m,2H),2.05(s,3H),1.09-0.95(m,1H),0.89-0.86(m,2H),0.77-0.72(m,1H).
MS:m/z 515.4[M+H]
WS-349谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.37(s,1H),7.69-7.65(m,2H),7.16-7.13(m,1H),7.11-7.07(m,2H),7.02-6.97(m,1H),6.94-6.92(m,1H),5.47(s,2H),5.04-4.91(m,1H),4.59-4.30(m,1H),4.06-3.65(m,1H),2.52-2.45(m,1H),2.25-2.17(m,2H),2.05(s,3H),1.09-0.95(m,1H),0.89-0.86(m,2H),0.77-0.72(m,1H).
MS:m/z 515.4[M+H]
实施例35
(R)-1-(6-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-基)-4-羟基-2-丁炔基-1-酮(WS-350)和(S)-1-(6-(4-氨基-3-(4-(2,4-二氟苯氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-基)-4-羟基-2-丁炔基-1-酮(WS-351)的制备
实施例35从对应的起始物开始，采用与实施例21类似的方法制备而得。
WS-350谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.37(s,1H),7.66(d,J＝8,2H),7.21-7.15(m,1H),7.11-7.08(m,2H),7.02-6.97(m,1H),6.94-6.86(m,1H),5.44(s,2H),5.03-4.92(m,1H),4.56-4.39(m,2H),4.32-4.13(m,2H),3.85-3.72(m,1H),2.70-2.43(m,1H),2.33-2.24(m,1H),2.09-2.03(m,2H),1.11-1.00(m,2H),0.88-0.68(m,2H).
MS:m/z 531.4[M+H]
WS-351谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.37(s,1H),7.66(d,J＝8,2H),7.21-7.15(m,1H),7.11-7.08(m,2H),7.02-6.97(m,1H),6.94-6.86(m,1H),5.44(s,2H),5.03-4.92(m,1H),4.56-4.39(m,2H),4.32-4.13(m,2H),3.85-3.72(m,1H),2.70-2.43(m,1H),2.33-2.24(m,1H),2.09-2.03(m,2H),1.11-1.00(m,2H),0.88-0.68(m,2H).
MS:m/z 531.4[M+H]
实施例36
3-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-腈(WS-352)制备
实施例36从对应的起始物开始，采用与实施例1类似的方法制备而得。
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δppm 8.37(s，1H),7.72(d,J＝8.8Hz,2H),7.32-7.26(m,1H),7.21-7.18(m,1H),7.16(d,J＝8.4Hz,2H),7.06-7.01(m,1H),5.62-5.32(s,1H),3.97-3.92(m,1H),3.87-3.80(m,2H),3.71-3.68(m,1H),2.53-2.48(m,2H),2.20-2.00(m,1H).
MS:434.2[M+H]
实施例37
(R)-3-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-腈(WS-353)和(S)-3-(4-氨基-3-(4-((5-氯吡啶-2-基)氧基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡咯烷-1-腈(WS-354)的制备
实施例36的化合物经手性拆分后可得实施例37的化合物WS-353和WS-354。拆分条件为：Supercritical fluid chromatography(ChiralPak AD 5μ,21x 250mm col,27％甲醇,70mL/分钟)。
WS-353谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δppm 8.37(s，1H),7.72(d,J＝8.8Hz,2H),7.32-7.26(m,1H),7.21-7.18(m,1H),7.16(d,J＝8.4Hz,2H),7.06-7.01(m,1H),5.62-5.32(s,1H),3.97-3.92(m,1H),3.87-3.80(m,2H),3.71-3.68(m,1H),2.53-2.48(m,2H),2.20-2.00(m,1H).
MS:434.2[M+H]
WS-354谱图数据：
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δppm 8.37(s，1H),7.72(d,J＝8.8Hz,2H),7.32-7.26(m,1H),7.21-7.18(m,1H),7.16(d,J＝8.4Hz,2H),7.06-7.01(m,1H),5.62-5.32(s,1H),3.97-3.92(m,1H),3.87-3.80(m,2H),3.71-3.68(m,1H),2.53-2.48(m,2H),2.20-2.00(m,1H).
MS:434.2[M+H]
实施例38～47
采用与本专利实施例1～37类似的方法，可制备实施例38～47所示结构的化合物。
实施例48
BTK激酶活性抑制实验
在基于时间分辨荧光共振能量转移方法的试验中，测试本文公开的化合物对BTK激酶活性的抑制作用。重组的Btk与本文公开的化合物在室温下在含有50mM Tris pH7.4、10mM MgCl2、2mM MnCl2、0.1mM EDTA、1mM DTT、20nM SEB、0.1％BSA、0.005％tween-20的试验缓冲液中预先温育1小时。通过加入ATP(在ATP Km浓度下)和肽底物(Biotin-AVLESEEELYSSARQ-NH2)来引发反应。在室温下温育1小时后，加入等体积的含有50mM HEPESpH7.0、800mM KF、20mM EDTA、0.1％BSA、连接Eu穴合物的p-Tyr66抗体和链霉亲和素标记的XL665的终止液以终止反应。盘在室温下再温育1小时，然后在BMG PHERAstar FS仪器上读取TR-FRET信号(ex337nm，em 620nm/665nm)。基于615nm处的荧光与665nm处的荧光的比值，计算化合物浓度增加情况下残余酶活性。各化合物的IC50通过Graphpad Prism软件的四参数逻辑方程拟合数据而得到。
按照上述的实验方法，本发明中的部分化合物表现出较强的BTK激酶抑制活性(IC50<1000nM)，其中一些优选化合物的激酶抑制活性很强(IC50<100nM)。具体结果见下表。
激酶抑制活性等级分为A、B、C，具体地A(IC50<100nM)，B(100nM<IC50<1000nM)，C(IC50>1000nM)
实施例49
体外激酶选择性实验
采用基于时间分辨荧光共振能量转移方法建立了EGFR，ITK激酶活性检测平台；采用Z’-Lyte方法建立了LCK，SRC，LYN激酶活性检测平台；采用Lance Ultra方法建立了TEC和JAK3激酶活性检测平台，分别测试本文公开的化合物对不同激酶活性的抑制作用。每个化合物分别在11个浓度下测定酶活性数据，用Graphpad Prism软件计算该化合物的IC50值。
按照上述的实验方法，本发明中的一些化合物表现出很强的激酶选择性，明显优于对照化合物依鲁替尼。结果见下表。
| 化合物编号 | LCK | SRC | LYN | EGFR | ITK | TEC |
| WS-311 | C | C | C | B | C | A |
| WS-349 | B | B | B | C | C | A |
| 依鲁替尼 | A | A | A | A | A | A |
激酶抑制活性等级分为A、B、C，具体地A(IC50<100nM)，B(100nM<IC50<1000nM)，C(IC50>1000nM)
实施例50
B细胞抑制实验
在活体外短暂暴露至BTK抑制剂足以抑制正常人类B细胞中的B细胞激活。此方案模拟活体内细胞至抑制剂的预测暴露，并且显示尽管清洗抑制剂但对B细胞的抑制仍得以保持。
CD B细胞是使用若赛特赛普(RosetteSep)人类B细胞富集混合剂通过阴性选择自健康供体血液纯化得到。将细胞铺板于生长培养基(10％RPMI+10％胎牛血清)中并添加指定浓度的抑制剂。于37℃下培育1小时后，将细胞洗涤三次，每次洗涤均利用于生长培养基中进行8倍稀释。随后将细胞用10μg/mL IgM F(ab')2在37℃下剌激18小时。随后用抗CD69-PE抗体对细胞进行染色并通过流式细胞术使用标准条件进行分析。依照以上的方法进行测定，本发明中优选的化合物对B细胞具有较强的抑制活性，其IC50值小于1nM。
实施例51
T细胞抑制实验
CD T细胞是使用若赛特赛普(RosetteSep)人类T细胞富集混合剂通过阴性选择自健康供体血液纯化得到。将细胞铺板于生长培养基(10％RPMI+10％胎牛血清)中并添加指定浓度的抑制剂。于37℃下培育1小时后，将细胞洗涤三次，每次洗涤均利用于生长培养基中进行10倍稀释。随后将细胞用anti-CD3/CD28包被珠(珠/细胞比例为1:1)在37℃下剌激18小时。随后用抗CD69-PE抗体对细胞进行染色并通过流式细胞术使用标准条件进行分析。
依照以上的方法进行测定，本发明中优选的化合物对T细胞具有很弱的抑制活性或无抑制，其IC50值大于4000nM。
实施例52
人全血B细胞抑制实验
人全血(hWB)获自健康志愿者，通过静脉穿刺将血液收集到用肝素钠抗凝化的Vacutainer管中。测试化合物在PBS中稀释至10倍所需初始药物浓度)，接着在10％的在PBS中的DMSO中三倍系列稀释，以得到9点的剂量响应曲线。将5.5μL的每种化合物稀释液一式两份添加到aiil 96孔V型底的板上；向对照和无刺激孔中添加5.5μL的10％在PBS中的DMSO。向每孔添加人全血(100μL)，在混合后将板在37C，5％CO2，100％湿度温育30分钟。在搅拌下向每孔(无刺激孔除外)添加羊F(ab')2抗人IgM(Southern Biotech)(10μL的500μg/mL溶液，50μg/mL最终浓度)，并且将板温育另外20小时。在20小时温育结束时，将样品与荧光探针标记的20μL APC小鼠抗人CD69(BD Pharmingen)在37C，5％CO2，100％湿度温育30分钟。包括用于补偿调节和初始电压设置的诱导对照、未染色的和单染色剂。然后将样品用1ml的IX Pharmingen Lyse Buffer(BD Pharmingen)裂解，并且将板在1500rpm离心5分钟。通过抽吸除去上清液，将残留的团粒用另外1ml的IX Pharmingen Lyse Buffer再次裂解，并且将板如前离心。吸出上清液，将残留的团粒在FACs缓冲液(PBS+1％FBQ中洗涤。离心后并除去上清液后，将团粒重悬浮在150μL的FACs缓冲液中。将样品转移至适于在BD LSR II流式细胞器的HTS 96孔体系上运行的96孔板。采用适合所用荧光团的激发和发射波长，获取数据并且采用Cell Quest Software获得百分比阳性细胞值。结果最初用FACS分析软件(Flow Jo)分析。IC50值使用XLfit v3，公式201计算。
依照以上的方法进行测定，本发明中优选的化合物对人全血中B细胞具有较强的抑制活性，其IC50值小于200nM。
实施例53
化合物在肝微粒体中的稳定性研究
1.待测化合物溶解在乙腈中，制成浓度为0.5mM的储备液。
2.2μL储备液加入1.5ml离心管中，然后加入148μL磷酸缓冲液(100mM，pH 7.4)和10μL肝微粒体(蛋白浓度为20mg/ml)悬液(BD Gentest公司)，肝微粒体的种属分别为人，狗，大鼠，小鼠；对照组加入158μL磷酸缓冲液(100mM，pH 7.4)。
3.步骤2中制备好的混合体系，于37℃水浴中预孵3分钟，然后加入40μL NADPH发生体系(含有NADP+：6.5mM，葡萄糖6-磷酸：16.5mM,MgCl2：16.5mM，葡萄糖6-磷酸脱氢酶:2U/ml)启动反应，并于37℃水浴中孵育1小时。
4.反应进行1小时后，将离心管从水浴中取出，并加入400μL乙腈终止反应，然后涡旋震荡3分钟，最后离心(13000rpm，4℃)5分钟，取上清液用HPLC检测剩余药物浓度Cr。
5.平行制备0分钟反应样品的制备方法：步骤2中制备好的混合体系，于37℃水浴中预孵3分钟后取出，加入400μL乙腈，然后加入40μL NADPH发生体系。涡旋震荡3分钟后，离心(13000rpm，4℃)5分钟，取上清液用HPLC检测药物浓度C0。
6.经60分钟孵育后，药物在孵育体系中的剩余百分比按照下式计算：
药物剩余(％)＝Cr÷C0×100％
按照上述的实验方法，本发明中的优选化合物表现出较好的微粒体稳定性，其在各种属的肝微粒体中的剩余百分比>30％。
实施例54
评价化合物对CYP酶抑制作用
CYP酶代谢是药物生物转化的主要途径，其数量和活性大小直接影响药物在体内的活化与代谢。作为外源性化合物的主要代谢酶，细胞色素CYP是重要的药物I相代谢酶，可以催化多种外源性化合物的氧化和还原代谢。CYP酶在药物的消除过程中起着非常重要的作用，同时也是引起联合用药时药物相互作用产生的主要因素。
方法：本实验采用cocktail探针药物法同时测定化合物对人源肝微粒体中五种CYP450酶的抑制作用，人源微粒体来自BD Gentest公司。
实验步骤如下：
反应在100mM磷酸盐缓冲液中进行，总体积200μL。反应体系中微粒体浓度为0.25mg/mL，待测化合物浓度为20μM、6.67μM、2.22μM、0.74μM、0.25μM，特异性探针底物及浓度分别为非那西汀(CYP1A2)40μM、右美沙芬(CYP2D6)5μM、双氯芬酸(CYP2C9)10μM、S-美芬妥英(CYP2C19)40μM、睾酮(CYP3A4)80μM。孵育体系在37度恒温振荡器中预孵育5分钟，加入NADPH发生体系(含1.3mM NADP+、3.3mM葡萄糖6-磷酸、0.4U/L葡萄糖6-磷酸脱氢酶、3.3mMMgCL2)开始反应。孵育45min后加入等体积的乙腈终止反应，涡旋，13000rpm离心，取上清LC-MS-MS进样测定代谢产物生成量。特异性代谢产物分别为对乙酰氨基酚(CYP1A2)、右啡烷(CYP2D6)、4-羟基双氯芬酸(CYP2C9)、4-羟基美芬妥英(CYP2C19)、6β-羟基睾酮(CYP3A4)。特异性抑制剂分别为呋拉茶碱(CYP1A2)、奎尼丁(CYP2D6)、磺胺苯吡唑(CYP2C9)、反苯环丙胺(CYP2C19)、酮康唑(CYP3A4)。本实验最终结果为计算半数抑制浓度IC50值。IC50＝((50％-低抑制率％)/(高抑制率％-低抑制率％))×(高浓度-低浓度)+低浓度。按照上述的实验方法，本发明的优选化合物对各种CYP酶均只有不强的抑制或无抑制，说明其对其它药物的代谢影响较小。
实施例55
化合物在大鼠体内的药物代谢动力学研究方法
1.雄性SD大鼠【华阜康】买入后，在本实验室适应性饲养7天。
2.9只SD大鼠随机分为3组，每组3只，一组用于灌胃给药，另一组用于尾静脉注射给药。灌胃给药组的大鼠，给药前需过夜禁食。
3.大鼠给药后，采用眼眶静脉丛采血的方法在以下时间点采集血样：I.V.:(给药前)，0.08小时，0.25小时，0.5小时，1小时，2小时，4小时，8小时，24小时。P.O.:0.08小时，0.25小时，0.5小时，1小时，2小时，4小时，8小时，24小时。每个采血时间点采血量约为300μl。
4.采集的血样在4℃以12000rpm的转速离心5分钟，然后采集上层血浆样品，并于-20℃冰箱中保存待测。
5.实验操作总结见表4：
表4、化合物在大鼠体内的药物代谢动力学试验设计
6.使用LC-MS/MS(UPLC-MS/MS:液相Waters Acquity UPLC(USA)和质谱5500QTrap(Applied Biosystem/MDS SCIEX)或者HPLC-MS\MS:液相Agilent 1200series(USA)和质谱API 4000(Applied Biosystem/MDS SCIEX))检测血浆中的化合物浓度。典型的检测条件见下表。
使用药代动力学专业软件WinNonlin【型号：PhoenixTM 
6.1厂家：Pharsight Corporation】计算药代动力学参数。【Phoenix 1.1User’s Guide:p251-p300】
按照上述的实验方法，本发明中已测定的化合物表现出较好的生物利用度(>40％)。
实施例56
hERG结合实验(Dofetillide法)
依照专利US20050214870A1上描述的方法，可测定化合物对hERG抑制的IC50值。本发明中优选的化合物对hERG只有很弱的抑制作用或无抑制作用，其IC50值大于1000nM。
Claims (4)
1.选自下列化合物的吡唑并嘧啶化合物，或其药学上可接受的盐：
2.包含权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
3.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐、或者权利要求2所述药物组合物在制备BTK抑制剂药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其中，BTK抑制剂是指预防或治疗由BTK介导的疾病，所述疾病选自自身免疫性疾病、炎性疾病、异种免疫性情况或疾病、血栓栓塞疾病和癌症。
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