CN107376015B - 一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管及其制备方法和应用 - Google Patents

一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管及其制备方法和应用，具有3D纤维网络结构，壳聚糖沉积在纳米纤维的表面和网络内部；肝素接枝在细菌纳米纤维素和壳聚糖上。制备方法包括：将预处理的细菌纳米纤维素BNC管置于壳聚糖CH酸性溶液中震荡，浸入碱性溶液中静置，清洗，得到BNC/CH复合管，置于缓冲液中震荡，再置于肝素Hep交联体系中震荡，清洗，得到BNC/CH‑Hep复合管，机械性能增强，有更好的抗凝血效果，防止血栓形成，且有利于细胞的黏附、增殖和生长，同时壳聚糖在体内降解可以达到肝素的缓释，维持更长的血管通畅率，在人工血管，人工气管，神经导管，导尿管等组织工程领域的应用极具潜力。

Description

一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于生物纳米材料技术领域，特别涉及一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管及其制备方法和应用。
背景技术
细菌纳米纤维素(Bacterial nono-cellulose,BNC)是由微生物(主要是以醋酸杆菌属细菌，如木葡糖酸醋杆菌)分泌到胞外的一种多糖类高分子聚合物。其化学组成与植物纤维素相同，是由吡喃葡萄糖单体以β-1，4糖苷键连接而成的葡聚糖高聚物，性质却与植物纤维素不同，包括高化学纯度(不掺杂木质素、半纤维素等其他多糖类杂志)、具有纳米纤维网络结构、高结晶度、良好的生物相容性等。由于其独特的性质，已引起世界范围的广泛关注，在造纸、食品、美容、医用敷料、人造皮肤等领域已经进入了实用化阶段，在人工血管等其他领域也存在着巨大的潜力。
甲壳素(Chitin)，是许多节肢动物如昆虫类、甲壳类动物外壳的组成部分，也存在与藻类和蕨类等低等植物的细胞壁中，是自然界最丰富的多糖之一。壳聚糖(Chitosan,CH)是由甲壳素脱乙酰基后获得的，不溶于水或碱液，在稀酸溶液中由于主链的-NH2转变为-NH3 +而溶解，可以被进一步加工成纤维、微球、膜、管、支架等。壳聚糖分子中的-NH2具有很强的反应活性，可在温和的条件下进行多种反应，形成不同的壳聚糖酰胺化合物，此外，也可以利用壳聚糖中-OH的化学活性，制备羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖和季铵化羟甲基壳聚糖。这些衍生物具有许多生物学特性，在生物、医药等领域有许多应用。壳聚糖具有良好的抑菌性，可扰乱细菌的正常生物性能，抑制细菌的生长和繁殖。另外，壳聚糖可促使血小板粘附和血栓的形成，具有很好的止血性能，而且作用于伤口之后，可以抑制Ⅰ型骨胶原的产生，并促进肉芽组织和上皮组织的形成，减少伤口收缩，缩小疤痕面积，因此，壳聚糖被研究应用于各种各样的医用敷料。除此之外，壳聚糖还具有良好的生物相容性和生物可降解性，可在体内溶菌酶的作用下降解为低聚糖等无害物质，最终被人体代谢和吸收。
肝素(Heparin,Hep)是一种常用的抗凝剂。早在20世纪60年代，利用肝素化来提高材料抗凝血性的研究就已经开始，复合肝素的方法可分为物理吸附和化学交联两种。物理吸附的肝素，抗凝血活性高，但极易爆释，很难达到肝素化效果的长期维持；化学交联法特别是共价结合的肝素，稳定性高，但复合后的肝素抗凝血活性有所下降，因此，在材料进行肝素化时，需综合考虑肝素固定化的牢固程度、肝素在材料表面的浓度以及是否保持肝素的生物活性等几方面，以求达到最好的效果。
目前，细菌纳米纤维素复合肝素的方法，主要有两种，第一种是直接用肝素溶液浸泡BNC，然后经过干燥去除水分，此种方法获得的肝素化BNC，在应用的过程中，肝素短时间内释放，很难长期起作用。第二种是在培养基中加入肝素，与细菌共培养后，随着细菌纳米纤维素的产生，肝素分子被包裹在纤维网络中，最终形成细菌纳米纤维素与肝素的共混物，此种方法得到的共混物，肝素分子与BNC依靠物理作用相互结合，且在后续一系列的纯化过程中，流失严重，肝素活性也受到影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管及其制备方法和应用，该复合管具有良好的机械性能，抗凝血活性，良好的生物相容性，同时可在体内缓慢降解，达到肝素的缓慢释放。
本发明的一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管，具有3D纤维网络结构，壳聚糖沉积在纳米纤维的表面和纤维网络内部；肝素接枝在细菌纳米纤维素和壳聚糖上。
本发明的一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管的制备方法，包括：
(1)通过原位培养得到细菌纳米纤维素BNC管，置于碱性溶液中水浴反应，然后清洗，得到预处理的BNC管；其中碱性溶液的浓度为0.5～5％(w/v)；
或通过原位培养得到BNC充分粉碎得到BNC匀浆，灌注到模具中，反复冻融，然后冷冻，经冷冻干燥得到预处理的BNC管；其中BNC匀浆中的纤维素干重含量为0.5～1％；
(2)将步骤(1)得到的预处理的BNC管置于壳聚糖CH的酸性溶液中，水浴震荡，然后浸入碱性溶液中静置3～5h，然后清洗，得到壳聚糖/细菌纳米纤维素BNC/CH复合管；其中壳聚糖的浓度为0.1～5％(w/v)，酸性溶液的浓度为0.5～5％(v/v)，碱性溶液的浓度为0.5～5％(w/v)；
(3)将步骤(2)得到的BNC/CH复合管置于pH＝5～6的缓冲液中，水浴震荡，然后置于肝素Hep交联体系中再次水浴震荡，然后清洗，得到肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖BNC/CH-Hep复合管。
所述步骤(1)中的通过原位培养得到的BNC管的内径为2～15mm，外径为8～20mm，长度为30～200mm，其中内径、外径和长度可以根据需要进行调整。所述BNC管也可以为15mm，25mm的大口径血管。
所述步骤(1)中的碱性溶液为NaOH溶液。
所述步骤(1)中的模具为直径为2～3mm的玻璃棒与内径为5～8mm，厚度为0.8～1.2mm的聚丙烯管之间的空腔，两端用橡胶塞固定，或为外径为2～3mm，厚度为0.5～1mm的聚四氟乙烯管/硅胶管与内径为5～8mm，厚度为0.5～1.2mm的聚丙烯管之间的空腔，两端用硅胶塞固定。
所述步骤(1)中原位培养为原位静置培养或原位动态培养。
所述步骤(1)中水浴反应的工艺参数为：反应温度为75～85℃，反应时间为3～5h。
所述步骤(1)中冻融的工艺参数为：在-20℃和30℃反复冻融3～5次。
所述步骤(1)中冷冻的工艺参数为：冷冻温度为-85～-75℃，冷冻时间为3～5h。
所述步骤(1)、(2)和(3)中清洗的工艺为：用超纯水反复清洗至中性。
所述步骤(2)中的酸性溶液为醋酸、盐酸或柠檬酸溶液中的一种或几种。
所述步骤(2)中的碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钙、碳酸钠或碳酸氢钠溶液中的一种或几种。
所述步骤(2)中水浴震荡的工艺参数为：震荡温度为25～35℃，震荡转速为90～110rpm，震荡时间为10～14h。
所述步骤(3)中的缓冲液为浓度为0.01～0.1M的2-吗啉乙磺酸MES缓冲液。
所述步骤(3)中的肝素交联体系为碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺EDC/NHS肝素交联体系，其中含有0.5～10mg/mL的肝素钠，0.2～0.3M的NaCl，0.03～0.1M的NHS，0.03～0.2M的EDC以及0.01～0.1M的MES缓冲液。
所述步骤(3)中水浴震荡的工艺参数为：震荡温度为25～35℃，震荡转速为90～110rpm，震荡时间为2～4h。
所述步骤(3)中再次水浴震荡的工艺参数为：震荡温度为25～35℃，震荡转速为90～110rpm，震荡时间为12～24h。
本发明的一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管的应用，用于人工血管，神经导管，人工气管，导尿管，尿道修复的医疗器械和组织工程领域。
本发明提供的技术先让壳聚糖化学沉积在BNC管的3D纤维网络内，形成复合均匀的BNC-CH管，再通过肝素分子上的-COOH，既可以与壳聚糖上的-NH2生成酰胺键，又可与BNC上的-OH发生酯化反应的特点，提高肝素的上载量，从而形成均匀肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖BNC/CH-Hep复合管。该种方法复合了大量的肝素，其抗凝血活性得到显著的提升。同时壳聚糖具有生物可降解性，可在体内缓慢降解，达到肝素的缓慢释放。
有益效果
(1)本发明制备得到的肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管，由于采用化学沉积法先复合壳聚糖，复合均匀，方法简单易行，易推广。
(2)本发明通过细菌纳米纤维素管复合了壳聚糖和肝素，管壁密度增加，在不损坏延展性和弹性的同时，拉伸强度等机械性能增强。
(3)本发明引入壳聚糖，增加了肝素的接枝复合位点，使复合管接枝了大量的肝素，抗凝血活性大幅度增强。而且可以通过调节壳聚糖的浓度来调控机械性能和抗凝血活性。同时壳聚糖具有生物可降解性，可在体内缓慢降解，达到肝素的缓慢释放。
(4)本发明制备得到的肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管有利于细胞的黏附、铺展和生长，具有良好的细胞相容性，在人工血管、神经修复支架、尿道修复等组织工程领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1得到的BNC/0.1％CH-Hep的场发射扫描电镜图。
图2为本发明实施例2得到的BNC/1％CH-Hep的场发射扫描电镜图。
图3为本发明对比例1得到的BNC-Hep的场发射扫描电镜图。
图4为本发明实施例1～2和对比例1得到的三种复合管的甲苯胺蓝染色对比图，其中A为对比例1得到的BNC-Hep的甲苯胺蓝染色图；B为实施例1得到的BNC/0.1％CH-Hep的甲苯胺蓝染色图；C为实施例2得到的BNC/1％CH-Hep的甲苯胺蓝染色图。
图5为本发明实施例1得到的BNC/0.1％CH-Hep、实施例2得到的BNC/1％CH-Hep、对比例1得到的BNC-Hep的肝素含量对比图。
图6为本发明实施例1得到的BNC/0.1％CH-Hep、实施例2得到的BNC/1％CH-Hep、对比例1得到的BNC和BNC-Hep的轴向拉伸强度对比图。
图7为本发明实施例1得到的BNC/0.1％CH-Hep、实施例2得到的BNC/1％CH-Hep、对比例1得到的BNC和BNC-Hep的血小板黏附定量分析(MTT)。
图8为本发明实施例1得到的BNC/0.1％CH-Hep、实施例2得到的BNC/1％CH-Hep、对比例1得到的BNC和BNC-Hep的动态血浆复钙。
图9为本发明实施例1得到的BNC/0.1％CH-Hep、对比例1得到的BNC和BNC-Hep的猪髋内皮细胞(PIEC)的形态，其中A为对比例1得到的BNC管的PIEC形态；B为对比例1得到的BNC-Hep复合管的PIEC形态；C为实施例1得到的BNC/0.1％CH-Hep复合管的PIEC形态。
图10为本发明实施例2中原位静置培养生物反应器示意图。
图11为本发明实施例3中灌注模具示意图。
图12为本发明实施例4中原位动态培养生物反应器示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)通过原位静置培养，获得内径为3mm，外径为8mm，长度为50mm的BNC管，置于1％的NaOH溶液中，80℃，水浴4h，然后用超纯水反复置换至中性得到预处理的BNC管。
(2)用超纯水配置浓度为1％的醋酸溶液100mL，将0.1g的壳聚糖溶解于上述醋酸溶液中。将步骤(1)得到的BNC管套在外径为3mm的硅胶管上置于上述壳聚糖的醋酸溶液中，30℃，100rpm，水浴震荡12h，然后浸入1％的NaOH溶液中静置4h，然后清洗，用超纯水反复置换至中性，得到细菌纳米纤维素/0.1％壳聚糖BNC/0.1％CH复合管。
(3)将步骤(2)得到的BNC/0.1％CH复合管置于pH＝5.5的0.05M的MES缓冲液中，30℃，100rpm，水浴震荡2h，然后将BNC/0.1％CH复合管置于EDC/NHS的交联体系中(1mg/mL肝素钠，0.25M的NaCl，0.03M的NHS，0.06M的EDC，0.05M的MES缓冲液)，再次30℃，100rpm，水浴震荡12h，然后清洗，用超纯水反复清洗至中性，去除可溶性杂质后得到肝素化的细菌纳米纤维素/0.1％壳聚糖BNC/0.1％CH-Hep复合管。
采用场发射扫描电镜测试本实施例得到的BNC/0.1％CH-Hep的微观形貌，如图1所示。测试其甲苯胺蓝染色，结果如图4B所示。测试接枝的肝素密度约74.2±5.23μg/cm(每厘米管上的肝素密度)，如图5所示，所复合的肝素密度较未复合壳聚糖的肝素化管更高，因此其抗凝血活性提高明显，并有助于细胞的黏附、铺展和生长。测试拉伸强度，结果如图6所示，可见比较纯的BNC和BNC-Hep拉伸强度有明显提高。进行血小板黏附定量分析(MTT)，结果如图7所示，可知BNC/0.1％CH-Hep在492nm的吸光度约0.1355，而BNC的吸光度约0.1577，可见壳聚糖的复合一定程度上影响着血小板的黏附，但是相较于纯的BNC管，由于肝素的复合，黏附血小板的数量减少。动态血浆复钙结果如图8所示(以达到最大吸光度一半的时间为血浆复钙时间)，可知BNC的血浆复钙时间约6min，BNC/0.1CH-Hep的血浆复钙时间明显大于40min，可见复合管的血浆复钙时间更长，血浆复钙时间是内源凝血途径的表征，复合管的抗凝血性能提高。猪髋内皮细胞(PIEC)的形态如图9C所示，可知PIEC已经密集分布在复合管材料表面，细胞呈梭形，呈良好的铺展状态。
实施例2
(1)通过原位静置培养，获得内径为10mm，外径为15mm，长度为200mm的原始的BNC管(原位静置培养生物反应器示意图如图10所示)，置于1％的NaOH溶液中，80℃，水浴4h，然后用超纯水反复置换至中性得到预处理的BNC管。
(2)用超纯水配置浓度为1％的柠檬酸溶液100mL，将1g的壳聚糖溶解于上述柠檬酸溶液中。将步骤(1)得到的BNC管套在外径为10mm的硅胶管上置于上述壳聚糖的柠檬酸溶液中，30℃，100rpm，水浴震荡12h，然后浸入1％的Na2CO3溶液中静置4h，然后清洗，用超纯水反复置换至中性，得到细菌纳米纤维素/1％壳聚糖BNC/1％CH复合管。
(3)将步骤(2)得到的BNC/1％CH复合管置于pH＝5.5的0.05M的MES缓冲液中，30℃，100rpm，水浴震荡2h，然后将BNC/1％CH复合管置于EDC/NHS的交联体系中(1mg/mL肝素钠，0.25M的NaCl，0.03M的NHS，0.06M的EDC，0.05M的MES缓冲液)，再次30℃，100rpm，水浴震荡12h，然后清洗，用超纯水反复清洗至中性，去除可溶性杂质后得到肝素化的细菌纳米纤维素/1％壳聚糖BNC/1％CH-Hep复合管。
采用场发射扫描电镜测试本实施例得到的BNC/1％CH-Hep的微观形貌，如图2所示。测试其甲苯胺蓝染色，结果如图4C所示。测试接枝的肝素密度约124.35±4.22μg/cm(每厘米管上的肝素密度)，如图5所示，较未复合壳聚糖的肝素化管肝素密度更高，血浆复钙时间长，因此其抗凝血活性提高明显。测试拉伸强度，结果如图6所示，可见比较预处理的BNC和BNC-Hep拉伸强度有明显提高。进行血小板黏附定量分析(MTT)，结果如图7所示，可知BNC/1％CH-Hep在492nm的吸光度约0.1326，较BNC的吸光度0.157低，可见肝素复合管黏附的血小板少，抗凝血性更好。动态血浆复钙结果如图8所示，可知BNC/1％CH-Hep的血浆复钙时间明显超过40min，比纯的BNC管的血浆复钙时间更长，因此肝素复合管的抗凝血性能比纯的BNC管更好。
实施例3
(1)将原位静置培养得到的细菌纳米纤维素膜充分粉碎后，得到纤维素干重含量为0.5％的BNC匀浆，灌注到玻璃棒(直径为3mm)与聚丙烯管(内径为8mm，厚度为1mm)之间的空腔中，两端用橡胶塞固定(模具示意图如图11所示)。-20℃和30℃反复冻融5次后，-80℃冷冻4h，打开模具两端的橡胶塞，冷冻干燥，得到预处理的BNC管。
(2)用超纯水配置浓度为1％的盐酸溶液100mL，将5g的壳聚糖溶解于上述盐酸溶液中。将步骤(1)得到的BNC管套在外径为3mm的硅胶管上置于上述壳聚糖的盐酸溶液中，30℃，100rpm，水浴震荡12h，然后浸入1％的Na2CO3溶液中静置4h，然后清洗，用超纯水反复置换至中性，得到细菌纳米纤维素/5％壳聚糖BNC/5％CH复合管。
(3)将步骤(2)得到的BNC/5％CH复合管置于pH＝5.5的0.05M的MES缓冲液中，30℃，100rpm，水浴震荡2h，然后将BNC/5％CH复合管置于EDC/NHS的交联体系中(5mg/mL肝素钠，0.25M的NaCl，0.06M的NHS，0.12M的EDC，0.05M的MES缓冲液)，再次30℃，100rpm，水浴震荡12h，然后清洗，用超纯水反复清洗至中性，去除可溶性杂质后得到肝素化的细菌纳米纤维素/5％壳聚糖BNC/5％CH-Hep复合管。
本实施例得到的BNC/5％CH-Hep复合管机械性能改善，抗凝血活性提高，是一种潜在的人工血管。
实施例4
(1)通过原位动态培养，获得内径为10mm，外径约14mm，长度为150mm的原始BNC管(原位动态培养生物反应器示意图如图12所示)，置于1％的NaOH溶液中，80℃，水浴4h，然后用超纯水反复置换至中性得到预处理的BNC管。
(2)用超纯水配置浓度为3％的醋酸溶液100mL，将1g的壳聚糖溶解于上述醋酸溶液中。将步骤(1)得到的BNC管套在外径为10mm的硅胶管上置于上述壳聚糖的醋酸溶液中，30℃，100rpm，水浴震荡12h，然后浸入1％的NaOH溶液中静置4h，然后清洗，用超纯水反复置换至中性，得到细菌纳米纤维素/1％壳聚糖BNC/1％CH复合管。
(3)将步骤(2)得到的BNC/1％CH复合管置于pH＝5.5的0.05M的MES缓冲液中，30℃，100rpm，水浴震荡2h，然后将BNC/1％CH复合管置于EDC/NHS的交联体系中(2mg/mL肝素钠，0.25M的NaCl，0.03M的NHS，0.06M的EDC，0.05M的MES缓冲液)，再次30℃，100rpm，水浴震荡12h，然后清洗，用超纯水反复清洗至中性，去除可溶性杂质后得到肝素化的细菌纳米纤维素/1％壳聚糖BNC/1％CH-Hep复合管。
对比例1
(1)通过原位静置培养，获得内径为3mm，外径为8mm，长度为50mm的BNC管，置于1％的NaOH中，80℃，水浴4h，然后用超纯水反复置换至中性，得到预处理的BNC管。测试拉伸强度，结果如图6所示。进行血小板黏附定量分析(MTT)，结果如图7所示，动态血浆复钙结果如图8所示，猪髋内皮细胞(PIEC)的形态如图9A所示。
(2)将步骤(1)得到的BNC管置于pH＝5.5的0.05M的MES缓冲液中，30℃，100rpm，水浴震荡2h，然后将BNC管置于EDC/NHS的交联体系中(1mg/mL肝素钠，0.25M的NaCl，0.03M的NHS，0.06M的EDC，0.05M的MES缓冲液)，再次30℃，100rpm，水浴震荡12h，然后清洗，用超纯水反复清洗至中性，去除可溶性杂质后得到肝素化的细菌纳米纤维素(BNC-Hep)复合管。
采用场发射扫描电镜测试本对比例得到的BNC-Hep的微观形貌，如图3所示。测试其甲苯胺蓝染色，结果如图4A所示。测试接枝的肝素密度约42.5±3.43μg/cm(每厘米管上的肝素密度)，如图5所示。测试拉伸强度，结果如图6所示。进行血小板黏附定量分析(MTT)，结果如图7所示，可知本对比例得到的小口径BNC-Hep复合管能减少血小板的黏附，动态血浆复钙结果如图8所示，血浆复钙时间增加，猪髋内皮细胞(PIEC)的形态如图9B所示，一定程度提高抗凝血活性。
对比例2
(1)将原位静态培养得到的细菌纳米纤维素膜充分粉碎后，得到纤维素干重含量为1％的BNC匀浆，灌注到玻璃棒(直径为2mm)与聚丙烯管(内径为5mm，厚度为1mm)之间的空腔中，两端用橡胶塞固定。-20℃和30℃反复冻融5次后，-80℃冷冻4h，打开模具两端的橡胶塞，冷冻干燥，得到预处理的BNC管。
(2)将步骤(1)得到的BNC管置于pH＝5.5的0.05M的MES缓冲液中，30℃，100rpm，水浴震荡2h，然后将BNC管置于EDC/NHS的交联体系中(5mg/mL肝素钠，0.25M的NaCl，0.06M的NHS，0.12M的EDC，0.05M的MES缓冲液)，再次30℃，100rpm，水浴震荡12h，然后清洗，用超纯水反复清洗至中性，去除可溶性杂质后得到肝素化的细菌纳米纤维素BNC-Hep复合管。

Claims (10)

1.一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管，其特征在于：具有3D纤维网络结构，先让壳聚糖沉积在纳米纤维的表面和纤维网络内部，然后肝素接枝在细菌纳米纤维素和壳聚糖上，所述肝素与壳聚糖生成酰胺键，又与细菌纳米纤维素生成酯键。
2.一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管的制备方法，包括：
(1)通过原位培养得到细菌纳米纤维素BNC管，置于碱性溶液中水浴反应，然后清洗，得到预处理的BNC管；其中碱性溶液的浓度为0.5～5％(w/v)；
或通过原位培养得到BNC充分粉碎得到BNC匀浆，灌注到模具中，反复冻融，然后冷冻，经冷冻干燥得到预处理的BNC管；其中BNC匀浆中的纤维素干重含量为0.5～1％；
(2)将步骤(1)得到的预处理的BNC管置于壳聚糖CH的酸性溶液中，水浴震荡，然后浸入碱性溶液中静置3～5h，然后清洗，得到壳聚糖/细菌纳米纤维素BNC/CH复合管；其中壳聚糖的浓度为0.1～5％(w/v)，酸性溶液的浓度为0.5～5％(v/v)，碱性溶液的浓度为0.5～5％(w/v)；
(3)将步骤(2)得到的BNC/CH复合管置于pH＝5～6的缓冲液中，水浴震荡，然后置于肝素Hep交联体系中再次水浴震荡，然后清洗，得到肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖BNC/CH-Hep复合管。
3.根据权利要求2所述的一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的通过原位培养得到的BNC管的内径为2～15mm，外径为8～20mm，长度为30～200mm；碱性溶液为NaOH溶液；模具为直径为2～3mm的玻璃棒与内径为5～8mm，厚度为0.8～1.2mm的聚丙烯管之间的空腔，两端用橡胶塞固定，或为外径为2～3mm，厚度为0.5～1mm的聚四氟乙烯管/硅胶管与内径为5～8mm，厚度为0.5～1.2mm的聚丙烯管之间的空腔，两端用硅胶塞固定。
4.根据权利要求2所述的一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中原位培养为原位静置培养或原位动态培养；水浴反应的工艺参数为：反应温度为75～85℃，反应时间为3～5h；冻融的工艺参数为：在-20℃和30℃反复冻融3～5次；冷冻的工艺参数为：冷冻温度为-85～-75℃，冷冻时间为3～5h。
5.根据权利要求2所述的一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)、(2)和(3)中清洗的工艺为：用超纯水反复清洗至中性。
6.根据权利要求2所述的一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的酸性溶液为醋酸、盐酸或柠檬酸溶液中的一种或几种；碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钙、碳酸钠或碳酸氢钠溶液中的一种或几种。
7.根据权利要求2所述的一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中水浴震荡的工艺参数为：震荡温度为25～35℃，震荡转速为90～110rpm，震荡时间为10～14h。
8.根据权利要求2所述的一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的缓冲液为浓度为0.01～0.1M的2-吗啉乙磺酸MES缓冲液；肝素交联体系为碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺EDC/NHS肝素交联体系，其中含有0.5～10mg/mL的肝素钠，0.2～0.3M的NaCl，0.03～0.1M的NHS，0.03～0.2M的EDC以及0.01～0.1M的MES缓冲液。
9.根据权利要求2所述的一种肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中水浴震荡的工艺参数为：震荡温度为25～35℃，震荡转速为90～110rpm，震荡时间为2～4h；再次水浴震荡的工艺参数为：震荡温度为25～35℃，震荡转速为90～110rpm，震荡时间为12～24h。
10.一种如权利要求1所述的肝素化的细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管的应用，其特征在于：用于人工血管，神经导管，人工气管，导尿管，尿道修复的医疗器械和组织工程领域。
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