CN107365785B - 一种调控细胞内NF-κB活性的基因表达载体及其调控方法和应用 - Google Patents

一种调控细胞内NF-κB活性的基因表达载体及其调控方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种调控细胞内NF‑κB活性的基因表达载体及其调控方法和应用，该载体包含两个序列元件，调控基因表达的启动子序列和启动子下游miRNA编码序列；所述启动子序列由一段NF‑κB诱骗子序列和最小启动子序列组成；所述miRNA编码序列为一段可编码靶向NF‑κB mRNA的miRNA的编码序列。该基因表达载体的转染可温和而有效地降低NF‑κB活性过度活化的细胞内的NF‑κB活性，且对正常细胞的活力无明显影响，从而避免副作用。本发明的基因表达载体的调控方法简单、快速、有效；该基因表达载体用于制备基因治疗NF‑κB过度活化密切相关疾病的NF‑κB活性调控试剂或药物分子，作为一种新的基因治疗试剂。

Description

一种调控细胞内NF-κB活性的基因表达载体及其调控方法和 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种调控细胞内NF-κB(kappaB)活性的基因表达载体及其调控方法和应用。
背景技术
核因子kappaB(NF-κB)是一类重要的调控性转录因子，在许多生理和病理过程中起关键作用，如免疫、细胞增殖、凋亡、炎症、尤其是肿瘤发生。一些研究表明许多疾病与NF-κB及其信号通路的异常活化有关。例如，NF-κB在许多人类癌症中异常激活，通过上调抗细胞凋亡基因来促进生存和恶性肿瘤。已经发现，NF-κB的核聚集和高NF-κB靶基因特征导致大多数多发性骨髓瘤细胞系的NF-κB通路富集，并对细胞凋亡敏感。因此，许多制药公司和科学家一直致力于开发用于癌症治疗的NF-κB抑制剂。
化学药物是开发NF-κB活性抑制剂的重要领域。例如。Kim等人用一种新型合成化合物MCAP处理原代小鼠小胶质细胞和BV2小胶质细胞。然后用LPS进行诱导孵育，通过RT-PCR、蛋白质印迹和ELISA分析细胞中诱生型一氧化氮合酶(iNOS)、COX-2、促炎性细胞因子、NF-κB和p38MAPK信号分子的表达，并使用相差荧光显微镜观察小胶质细胞的形态学变化和NF-κB的核易位。结果表明，MCAP可以抑制LPS诱导的iNOS和COX-2的表达，说明MCAP通过抑制NF-κB信号通路，p38MAPK信号通路和促炎反应发挥抗炎作用。但是，遗憾的是这些化学药物的特异性低。
如今，基因治疗成为理想的疾病治疗策略，因为人类的绝大部分疾病均是由基因结构变异或是表达异常引起的，所以最理想的疾病治疗策略就是从基因水平上进行矫正。诱骗子策略和RNA干扰策略属于利用基因治疗的方法来抑制细胞内NF-κB的活性。诱骗子策略是指合成一种与NF-κB的顺式调控元件序列相一致的双链DNA序列，将其导入到细胞中后，此DNA序列就可以和活化后的NF-κB特异性的结合，以此可以干扰活化后的NF-κB进入到细胞核，减少其与靶基因上的NF-κB结合位点的特异性结合，从而达到抑制NF-κB活性调控靶基因表达的目的。报道发现诱骗子序列通过抑制NF-κB的活性来调节NF-κB相关靶基因的表达，导致破骨细胞凋亡。利用合成的诱骗子可通过直接抑制NF-κB活性来抑制纤维肉瘤细胞生长。一旦靶向NF-κB的合成诱骗子被引入类风湿患者的滑膜细胞，细胞因子和粘附因子的表达都减少了，并且滑膜细胞的增殖也受到抑制。N-κB诱饵可以同时调控由相同的顺式调节元件控制的许多基因。同时，诱骗子具有高度的特异性和相对简单的合成。然而，NF-κB诱骗子容易被身体中的一些酶降解，需要重复和高剂量给药以维持NF-κB及其信号通路的活性抑制。
RNA干扰(RNAi)是基因治疗的另一种策略，它是指利用双链RNA分子在mRNA水平上介导的序列特异性转录后基因沉默过程。广泛用于敲除内源基因表达的当前RNA是小干扰RNA(siRNA)，其有两种作用形式。一种是转染体外化学合成的双链RNA(dsRNA)，通过细胞中RNA诱导的沉默复合物(RISC)将其加工成成熟的siRNA。另一种是转染可由RNA聚合酶III(Pol III)启动子转录的小发夹RNA(shRNA)表达载体，并通过细胞中dicer和RISC产生成熟siRNA。SiRNA分子可以特异性结合靶基因的mRNA从而抑制其表达。研究发现用siRNA抑制NF-κB活性后，炎性细胞因子的诱导被抑制了。此外，siRNA也导致肿瘤坏死因子(TNF-α)处理的人原代滑膜细胞的凋亡明显上升。研究证明用RNA干扰技术治疗类风湿关节炎取得较好疗效。还有研究发现将合成的NF-κB p65特异性siRNA导入用IL-1β和TNF-α诱导的小鼠中软骨细胞后，COX-2，NOS-2和MMP-9的表达受到抑制，表明NF-κB p65特异性siRNA可能成为骨关节炎的预防和治疗药物。然而，化学合成的siRNA在体内的递送及其效果持续性是其在临床应用中绊脚石。
MicroRNA(miRNA)是一种天然的小RNA(～22nt)，它也可以通过阻断靶mRNA的翻译或者像siRNA一样诱导靶mRNA降解来调节基因表达。MiRNA的表达由RNA聚合酶II(Pol II)调控，而Pol II也负责mRNA的表达,不同于siRNA的表达由RNA Polymerase III(Pol III)调控。MiRNA最初由Pol II转录为长的初级miRNA(pri-miRNA)前体,再由Drosha和Dicer核酸酶加工,而siRNA在Pol III启动子(如U6)调控下被广泛转录为的短发夹RNA(shRNA)。因此，miRNA的表达如mRNA一样也受到由转录因子限制的元件的调节。此外，与RNA聚合酶II驱动的启动子相比，Pol III启动子的调节表达通常更加困难。而且，每个Pol III启动子仅表达单个shRNA，因此多个基因的抑制需要多个启动子或载体。因此，通过使用标准的Pol II启动子(例如人巨细胞病毒(CMV)主要即时早期启动子(MIEP))开发新的表达载体，有效表达靶向mRNA的miRNA。
化学药物，诱骗子策略，RNA干扰策略是抑制细胞内NF-κB及其信号通路活性的三种主要方法。很明显，它们的各自应用都有缺点。同时，值得注意的是，过度抑制NF-κB活性可能会产生明显的毒性。NF-κB对癌细胞起关键作用。然而，它对于正常细胞也是必不可少的。研发的NF-κB抑制剂抑制癌细胞中的NF-κB活性的同时也阻断正常健康细胞中NF-κB调控的一些必需细胞过程，从而导致显着的剂量限制性毒性和低治疗指数。因此，这些传统的NF-κB抑制剂仍然受到来自过度抑制细胞内NF-κB活性的副作用的限制。
鉴于NF-κB普遍存在的性质和多效的生理功能，使用这些传统抑制剂时，难以避免在抑制NF-κB的致病活性的同时对NF-κB正常生理功能的影响。
转录因子NF-κB的过度活化是炎症、肿瘤等疾病的关键事件，与炎症、免疫应答、肿瘤发生等生理、病理过程关系密切。因此发展各种NF-κB活性抑制剂以抑制NF-κB活性成为炎症及肿瘤治疗的一个重要途径。其中包括可抑制NF-κB活性的小分子核酸物质，如诱骗子(decoy)和小干扰RNA(siRNA)。但因基础NF-κB活性水平对细胞的正常生理是必须的，向细胞导入这些小分子核酸物质，因无法控制其数量，往往造成NF-κB活性的过度抑制，从而产生严重的副作用。因此，需要对目前小分子核酸物质抑制NF-κB活性的技术策略进行改造，以便克服其缺陷，发展具有临床应用价值的新型NF-κB活性抑制核酸分子。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明一种细胞内核因子NF-κB活性调控的基因表达载体，该载体可以感知和调控细胞内NF-κB的活性，可温和而有效地降低NF-κB活性过度活化的细胞内的NF-κB活性，且对正常细胞的活力无明显影响。本发明解决了现有技术中小分子NF-κB抑制剂对NF-κB活性的过度抑制，从而产生严重的副作用的问题。
本发明还提供了该基因表达载体的调控方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种调控细胞内NF-κB活性的基因表达载体，包含两个序列元件，调控基因表达的启动子序列和启动子下游miRNA(microRNA，miRNA也称小RNA)编码序列；所述启动子序列由一段NF-κB诱骗子(decoy)序列和最小启动子(minimal promoter)序列组成；所述miRNA编码序列为一段靶向NF-κB信使RNA(messenger RNA，mRNA)的miRNA的编码序列。
其中，所述NF-κB诱骗子序列也称为NF-κB应答元件(NF-κB responsive element)包括各种序列的NF-κB诱骗子，为一段可与NF-κB蛋白特异性结合的DNA序列，其主要序列特征为含有数量不同的各种NF-κB结合靶点，如GGGACTTTCC。
其中，所述最小启动子包括各种基因来源的最小启动子序列；优选单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK)启动子最小启动子；其主要作用是与基础转录因子及RNA聚合酶II结合，形成通用转录机器，构成基因表达的基本条件。
作为优选，所述NF-κB信使RNA(mRNA)为RelA mRNA，也称p65。
其中，所述靶向NF-κB mRNA的miRNA指miRNA通过核酸杂交与NF-κBmRNA结合，这种结合可引起NF-κB mRNA的降解或阻止NF-κB mRNA翻译成NF-κB蛋白。
作为优选，所述靶向NF-κB mRNA的miRNA包括天然miRNA或人工设计miRNA，优选采用人工设计miRNA，包括amiR349、amiR531或amiR533，其编码序列分别为SEQ ID NO.1：5′-CTT CTT CAC ACA CTG GAT TCC-3′，SEQ ID NO.2：5′-AAG ATG GGA TGA GAA AGG ACA-3′，SEQ ID NO.3：5′-CAA AGA TGG GAT GAG AAA GGA-3′。
作为优选，所述基因表达载体为一线性(linear)或环状(circular)核酸分子。
更进一步地，所述核酸分子为脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)分子，包括双链DNA(如腺病毒DNA分子)、单链DNA(腺相关病毒分子)或单链RNA分子(如慢病毒RNA分子)等。
更进一步地，所述线性核酸分子包括普通线性DNA分子(如PCR扩增片段、酶切片段)、病毒DNA分子(如腺病毒DNA分子、腺相关病毒分子)或病毒RNA分子(如慢病毒RNA分子)等；所述环状核酸分子包括质粒DNA等。
本发明所述的调控细胞内NF-κB活性的方法，具体步骤为向细胞导入所述的基因表达载体。
其中，所述细胞导入方法包括各种类型的核酸细胞导入方法；优选通过病毒载体、纳米载体、脂质体、电转移、基因枪等导入方式。
本发明所述调控细胞内NF-κB活性的基因表达载体在制备用于基因治疗NF-κB过度活化密切相关疾病(如炎症、肿瘤、自身免疫性疾病)的NF-κB活性调控试剂或药物分子中的应用。
本发明细胞内NF-κB活性调控方法，为一种新型的NF-κB活性调控技术，该技术可作为一种与NF-κB过度活化密切相关疾病(如炎症、肿瘤、自身免疫性疾病)的基因治疗技术。
本发明在研究当前诱骗子和siRNA的NF-κB抑制策略的优点和局限性的基础上，构建了能够在NF-κB特异性启动子调控下表达靶向NF-κB的人工miRNA(artificial miRNA，amiRNA)的转基因载体，该特异性启动子由NF-κB诱骗子(decoy)和一个最小启动子(minimal promoter)组成，本发明的基因表达载体被命名为DMP-amiRNA，即“诱骗子最小启动子-人工小RNA”(decoy minimal promoter-artificial miRNA)。本发明证实该载体作为新型的NF-κB抑制剂，可以感知和调控细胞内NF-κB的活性。该载体通过形成一个完美的反馈回路来实现细胞内NF-κB活性的自我调控。转染该载体的细胞中，NF-κB活性越高，DMP转录活性越高，miRNA表达越多。由此该载体可以作为细胞内NF-κB活性的传感器发挥其NF-κB抑制功能。该***结合了诱骗子和miRNA干扰的优点。
本发明的新型NF-κB抑制剂抑制NF-κB活性的机理如原理示意图(图1)所示。图1反映本发明所发展的新型NF-κB抑制剂(DMP-amiRNA)及其抑制细胞内NF-κB活性的原理。该图的上半部分显示了目前传统的小分子核酸物质抑制NF-κB活性的策略，即诱骗子(decoy)(短的含有NF-κB结合位点的双链DNA)和siRNA(由shRNA体内转录、加工产生或导入细胞的化学合成的dsRNA加工产生)。其中siRNA的转录由RNA聚合酶III完成。该图的下半部分显示了本发明设计的新型NF-κB抑制基因表达载体，该载体综合了诱骗子和siRNA策略，但赋予诱骗子新功能，即NF-κB特异性增强子功能，该增强与最小启动子融合，成为一种NF-κB特异性启动子。该特异性性启动子可以控制下游基因——靶向NF-κB的人工miRNA——的表达。所表达的miRNA可在翻译水平抑制NF-κB蛋白p65(具有转录激活功能的NF-κB家族成员)的产生，从而降低细胞内NF-κB的水平。该载体可以感知细胞内NF-κB的活性，决定miRNA的输出。细胞中NF-κB活性越高，NF-κB对DMP的结合越多，DMP转录活性越高，miRNA表达越多。反之，细胞内NF-κB活性低，则miRNA表达少，以此避免对胞内NF-κB活性的过度抑制，以免对正常细胞的NF-κB活性造成抑制，从而避免其副作用。需要指出的是，该载体中的诱骗子(decoy)除了发挥NF-κB特异性增强子功能外，也依然发挥诱骗子作用，即结合细胞内的NF-κB。但这种处于基因表达载体(双链环状DNA)中的诱骗子，相比与传统线性诱骗子，更能抵御细胞内核酸酶的降解，其诱骗子和增强子双功能更持久。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明设计了一种NF-κB特异性启动子(DMP)，设计筛选出3种人工miRNA(amiR349，amiR531和amiR533)分子。通过将所设计的NF-κB特异性启动子与miRNA表达载体进行融合，构建了一种可由细胞内NF-κB活性控制其表达水平的miRNA基因表达载体(pDMP-mCherry-amiR349、pDMP-mCherry-amiR531、pDMP-mCherry-amiR533)。通过细胞转染测试，发现该基因表达载体的转染可温和而有效地降低NF-κB活性过度活化的细胞内的NF-κB活性，并且产生NF-κB活性抑制后导致肿瘤细胞凋亡的细胞生理表型，说明该载体的有效性，由此验证了一种新的NF-κB抑制剂，发展了一种新的NF-κB活性抑制策略。本发明的新型NF-κB抑制载体，可以适度抑制降低NF-κB活性过度活化的细胞内的NF-κB活性，且对正常细胞活力无明显影响，克服了目前小分子NF-κB抑制剂的缺点，避免对胞内NF-κB活性的过度抑制，以免对正常细胞的NF-κB活性造成抑制，从而避免其副作用，同时该基因表达载体中的诱骗子相比与传统线性诱骗子，更能抵御细胞内核酸酶的降解，其诱骗子和增强子双功能更持久。
本发明的基因表达载体的调控方法简单、快速、有效；并且该基因表达载体可以用于在制备用于基因治疗NF-κB过度活化密切相关疾病的NF-κB活性调控试剂或药物分子中，作为一种新的基因治疗试剂，探索用于炎症、肿瘤的治疗。
附图说明
图1为本发明的载体DMP-amiRNA抑制原理示意图；其中上图显示了诱骗子和siRNA的NF-κB抑制途径(传统抑制)；下图显示了DMP-amiRNA的NF-κB抑制途径(DMP-amiRNA抑制)；
图2为质粒载体图谱；显示了本发明中使用的6种主要质粒载体的DNA元件图谱。
图3为NF-κB miRNA对报告基因表达的干扰作用；从左到右：明场，绿色通道，红色通道及融合图像，放大倍率：200×；
图4为NF-κB特异性启动子的评估示意图；其中A和C表示用pDMP-EGFP和pCMV-EGFP转染的293T细胞图像，放大倍率：200×，A和C中：上为明场；下为绿色荧光通道；B和D表示细胞荧光强度的流式细胞分析关系图；各图中C为对照；DE为293T细胞转染pDMP-EGFP；BDE为用BAY11-7082预处理并用pDMP-EGFP转染的293T细胞；CE为293T细胞转染pCMV-EGFP；BCE为用BAY11-7082预处理并用pCMV-EGFP转染的293T细胞(*，p<0.05；**，p<0.01)；
图5为NF-κB活性自控型质粒的干扰效应示意图；其中A表示转染的293T细胞图像，放大倍率：200×；B表示转染细胞的流式细胞分析关系图；A从上到下：明场，绿色荧光通道，红色荧光通道和绿色和红色融合图像；各图中C为对照；R为pCMV-EGFP-RelA；D为pDMP-mCherry-amiR533和pCMV-EGFP-RelA；CR为pCMV-mCherry-amiR533和pCMV-EGFP-RelA(*，p<0.05；**，p<0.01)；
图6为pDMP-mCherry-amiR533调节RelA及其靶基因关系图；通过qPCR检测基因表达，其中C为对照；T为TNF-α；DT为pDMP-mCherry-amiR533加TNF-α；CT为pCMV-mCherry-amiR533加TNF-α(*,p<0.05；**,p<0.01)；
图7为pDMP-mCherry-amiR533对细胞活力的影响关系图；流式细胞术检测细胞凋亡；其中A为93T和HepG2细胞；B为HL7702和HepG2细胞；对照：用洗脱缓冲液作为空白对照转染细胞；BAY 11-7082：细胞用50μM BAY 11-7082处理1小时；pDMP-mCherry-amiR533和pCMV-mCherry-amiR533：分别用pDMP-mCherry-amiR533和pCMV-mCherry-amiR533转染细胞。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例1
靶向NF-κB的miRNA效应评价
方法：
材料与试剂：载体pIRES2-EGFP购自Clontech公司、pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-Neg购自Invitrogen公司、pEGFP-C1购自Clontech公司、pGL4.10-MP购自Promega公司。质粒p-mCherry、p-RelA由东南大学生物科学与医学工程学院王进科课题组实验室构建提供，其中质粒p-mCherry、p-RelA仅用于提供mCherry及RelA蛋白编码序列，其序列同公共基因数据库中的序列；限制性内切酶NheI、EcoRI、NotI、BamHI、KpnI、HindIII、NcoI、XbaI购自Takara公司；
Figure BDA0001404399740000071
HS(Premix)、rTaq、T4Polynucleotide Kinase、T-Vector pMD19(Simple)、DNA Markers购自Takara公司；限制性内切酶AseI和NheI、二型内切酶BsmBI、T4DNA Ligase购自NEB公司；LipofectamineTM2000、Opti-MEM培养基购自Invitrogen公司；BAY 11-7082(NF-κB抑制剂)购于碧云天公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)购于Sigma公司；cDNA反转录试剂盒购自Takara公司；Fast
Figure BDA0001404399740000072
Green Master Mix购自ABI公司；氯仿、异丙醇等常规化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于凯基公司；293T、HepG2细胞购自中科院上海生命科学研究院。
NF-κB miRNA表达载体的构建：利用载体p-mCherry克隆得到mCherry片段，并在这段序列上游引入NheI，下游引入EcoRI，将mCherry片段连入到载体pIRES2-EGFP上，构成重组载体pCMV-mCherry。利用载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-Neg克隆得到含miR-155骨架和TK polyadenylation signal的片段，将其命名为amiR，并在这段序列上游引入EcoRI，下游引入NotI，同时在miR155骨架中引入二型内切酶识别位点BsmBI的linker，将amiR片段连入到载体pCMV-mCherry中，构成通用miRNA干扰载体pCMV-mCherry-amiR。同时直接从载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-Neg上扩增得到miR-Neg片段，并在上游引入EcoRI，下游引入NotI，将miR-Neg片段连入到载体pCMV-mCherry中，构成对照载体pCMV-mCherry-miR-Neg。
将RelA/p65mRNA(NCBI BC014095)的完整序列上载到BLOCK-iT TM RNAi在线设计软件(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)设计miRNA基因序列，并经BLAST序列比对软件进行同源性分析，依据miRNA靶向的位置和其抑制效率，确定并合成了针对RelA基因的3对用于制备靶向RelA的miRNA表达载体的单链DNA(ssDNA)，如表1中的SEQ ID NO.4-9所示。将碱基互补配对的3对单链DNA(amiR349-F与amiR349-R、amiR531-F与amiR531-R、amiR533-F与amiR533-R)分别变性，然后退火以形成双链DNA(dsDNA)。然后将dsDNA与用BsmBI切割的线性pCMV-mCherry-amiR载体连接。构建的靶向RelA/p65基因的三个miRNA表达载体分别命名为pCMV-mCherry-amiR349、pCMV-mCherry-amiR531、pCMV-mCherry-amiR533。通过PCR扩增检测和DNA测序验证。
NF-κB RNAi报告载体构建：利用载体p-RelA克隆得到RelA全长片段，并在这段序列上游引入EcoRI，下游引入BamHI，将RelA片段连入到载体pEGFP-C1上，构成重组载体pCMV-EGFP-RelA(图2)。通过DNA测序验证载体。
细胞培养：293T细胞用含有10％(v/v)FBS(HyClone)，100units/mL青霉素和100g/mL链霉素的DMEM在含有5％(v/v)CO2的加湿培养箱中37℃培养。将细胞以1×105个细胞/cm2的密度接种在24孔板，孵育24小时(汇合度约80％)。用EndoFree质粒试剂盒(CWBio)分离用于转染的所有载体。在转染前，小心地取出培养基，用500μL PBS冲洗细胞。然后，向每个孔中加入500μLOPTI-MEM培养基并孵育2小时。通过使用基于脂质的转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen)将表达载体转染到细胞中。6小时后，除去混合物，加入完全培养基，继续培养细胞至24小时。
细胞转染：将pCMV-mCherry-amiR349/amiR531/amiR53/及pCMV-mCherry-miR-Neg4种质粒分别与报告载体pCMV-EGFP-RelA的质粒以质量数为500ng和250ng进行混合。按Lipofectamine 2000操作说明，将上述混合好的质粒分别共转染到293T细胞中。
细胞检测：将培养至24h的293T细胞放于倒置荧光显微镜下观测并拍照，通过荧光的表达情况来初步评价靶向RelA基因的miRNA干扰载体的干扰效果，并筛选出干扰效果最好的miRNA。
结果：
通过miRNA设计，载体重组和测序验证，成功构建了三个NF-κB miRNA干扰载体，分别是pCMV-mCherry-amiR349、pCMV-mCherry-amiR531和pCMV-mCherry-amiR533，一个阴性对照载体pCMV-mCherry-miR-Neg和一个报道载体pCMV-EGFP-RelA(图2)。为了评估三种miRNA对RelA表达的干扰作用，分别将三种miRNA表达载体和报道载体pCMV-EGFP-RelA共转染至293T细胞。通过EGFP和红色荧光蛋白(RFP)产生的绿色和红色荧光强度来判断干扰效果。结果表明，三种miRNA所产生的红色荧光强度基本一致，说明转染细胞中三种miRNA类似表达(图3)。然而，三种miRNA产生的绿色荧光强度明显不同。阴性对照组细胞的绿色荧光最强，表明阴性对照miRNA不影响报道基因表达。相比之下，三种靶向NF-κB的miRNA都干扰了报告基因表达。其中，amiR533导致最显着的干扰效应(图3)。结果表明，RelA基因的表达受到这些人造miRNA的干扰，特别是amiR533。因此，这些miRNA可用于随后的实验。
表1用于制备靶向RelA的miRNA表达载体的单链DNA(ssDNA)
Figure BDA0001404399740000091
实施例2
NF-κB特异性启动子的效应评价
方法：
载体构建：克隆载体pGL4.32上的一段含有NF-κB经典结合位点的52-bp片段并命名为诱骗子，其序列SEQ ID NO.10：5'-GGG AAT TTC CGG GGA CTT TCC GGG AAT TTC CGGGGA CTT TCC GGG AAT TTC C-3'，将其作为NF-κB特异性调节元件。根据该序列设计并合成两条单链寡核苷酸，其序列如表2的SEQ ID NO.11-12所示。将两条单链寡核苷酸变性并退火形成双链DNA；该双链DNA的上游和下游分别引入了可与KpnI和HindIII酶切粘性末端序列退火的序列。然后将该双链DNA与KpnI和HindIII双酶切割的线性pGL4.10-MP(MP，最小启动子)连接，重组载体命名为pGL4.10-DMP。由此，pGL4.10-DMP含有的最小的启动子(序列SEQ ID NO.13：5'-TAG AGG GTA TAT AAT GGA AGC TCG ACT TCC AG-3')，其结合诱骗子形成NF-κB特异性启动子。通过pEGFP-C1克隆EGFP片段。在其上游和下游分别引入NcoI和XbaI酶切位点。将该片段连接到pGL4.10-DMP中构建NF-κB特异性启动子载体，命名为pDMP-EGFP(图2)。通过PCR检测和DNA测序验证载体。将载体pEGFP-C1命名为pCMV-EGFP(图2)，以便与pDMP-EGFP进行比较。
细胞培养：293T细胞用含有10％(v/v)FBS(HyClone)，100units/mL青霉素和100g/mL链霉素的DMEM在含有5％(v/v)CO2的加湿培养箱中37℃培养。将细胞以1×105个细胞/cm2的密度接种在24孔板，孵育24小时(汇合度约80％)。用EndoFree质粒试剂盒(CWBio)分离用于转染的所有载体。在转染前，小心地取出培养基，用500μL PBS冲洗细胞。然后，向每个孔中加入500μL OPTI-MEM培养基并孵育2小时。通过使用基于脂质的转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen公司)将表达载体转染到细胞中。6小时后，除去混合物，加入完全培养基，继续培养细胞18h或42h。
细胞转染：293T细胞用25μM BAY 11-7082(BAY)处理1小时。然后，将pDMP-EGFP和pCMV-EGFP转染到经处理的293T细胞中，分别培养24小时。
细胞检测：通过荧光显微镜对转染的细胞进行成像，然后用10mg/mL胰蛋白酶/EDTA溶液消化，进行流式细胞术分析。
结果：
将NF-κB诱骗子序列连接到最小启动子上从而构建NF-κB特异性启动子，命名为DMP启动子。然后构建了DMP调控的表达EGFP的报道载体pDMP-EGFP，用于评估DMP的转录活性。本实施例还构建了在人CMV MIEP调控下表达EGFP的报道载体pCMV-EGFP进行比较。分别将此两个载体转染至293T细胞。结果表明，DMP成功诱导了报告基因的表达；然而，其转录活性远低于强启动子MIEP(图4)。
为了验证DMP的NF-κB特异性，用pDMP-EGFP和pCMV-EGFP分别转染用NF-κB抑制剂BAY11-7082预处理的293T细胞。结果发现BAY11-7082的处理均导致转染两个载体的细胞中报道基因下调(图4)。然而，在转染有pDMP-EGFP的细胞中，EGFP表达降低至70.1％(p<0.05)，而转染pCMV-EGFP的细胞则为45.8％(p<0.01)。结果显示，相比CMV启动子，DMP对NF-κB更具特异性，表明了DMP的NF-κB特异性。
表2 NF-κB诱骗子序列
Figure BDA0001404399740000111
实施例3
NF-κB自控型miRNA表达载体的效应评价
方法：
载体构建：通过载体pDMP-EGFP克隆DMP片段，分别在上游和下游***AseI和NheI酶切位点。将DMP片段连接到去除CMV启动子的重组载体pCMV-mCherry-amiR533中，构建NF-κB自控型miRNA表达载体，命名为pDMP-mCherry-amiR533(图2)。通过PCR扩增及基因测序进行载体验证。同时，还构建了pCMV-mCherry-amiR533作为对照(图2)，通过DNA测序验证载体。
细胞培养：293T细胞用含有10％(v/v)FBS(HyClone公司)，100units/mL青霉素和100g/mL链霉素的DMEM在含有5％(v/v)CO2的加湿培养箱中37℃培养。将细胞以1×105个细胞/cm2的密度接种在24孔板，孵育24小时(汇合度约80％)。用EndoFree质粒试剂盒(CWBio)分离用于转染的所有载体。在转染前，小心地取出培养基，用500μL PBS冲洗细胞。然后，向每个孔中加入500μL OPTI-MEM培养基并孵育2小时。通过使用基于脂质的转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen)将表达载体转染到细胞中。6小时后，除去混合物，加入完全培养基，继续培养细胞48h。
细胞转染：用pCMV-EGFP-RelA和pDMP-mCherry-amiR533或pCMV-mCherry-amiR533共转染293T细胞，并孵育24小时。pCMV-EGFP-RelA和洗脱缓冲液分别作为阳性和空白对照。
细胞检测：通过双荧光成像和流式细胞术分析评估干扰效应。
结果：
为了构建NF-κB自控型miRNA表达载体，将上述验证的NF-κB特异性启动子(DMP)和靶向NF-κB miRNA(amiR533)重组成新的质粒载体pDMP-mCherry-amiR533。使用该载体，amiR533表达水平预期由细胞内NF-κB自身调控。amiR533表达水平将取决于细胞内的NF-κB活性。类似的pCMV-mCherry-amiR533被构建为对照载体。为了评估NF-κB自控型miRNA表达载体的干扰效应，分别用pDMP-mCherry-amiR533，pCMV-mCherry-amiR533与pCMV-EGFP-RelA共转染293T细胞。结果表明，pCMV-mCherry-amiR533导致amiR533的表达高于pDMP-mCherry-amiR533。相应地，pCMV-mCherry-amiR533对报告基因表达的抑制效果比pDMP-mCherry-amiR533更显着(图5A)。
流式细胞分析表明，pDMP-mCherry-amiR533转染仅导致荧光细胞数量的显著降低(p<0.01)，但细胞的相对荧光强度并没有显着减弱。相比之下，pCMV-mCherry-amiR533转染导致荧光细胞的数量和相对荧光强度均显著降低(图5B)。数据表明pDMP-mCherry-amiR533的调节活性比pCMV-mCherry-amiR533温和得多，预示着pDMP-mCherry-amiR533可用于调节NF-κB的细胞内活性。数据还表明，像人类CMV MIEP这样的强启动子不能用于调控NF-κB靶向miRNA的表达，因为其本身固有的高转录活性必然会过度抑制NF-κB活性，从而损害重要转录因子的正常生理功能。同时pDMP-mCherry-amiR349、pDMP-mCherry-amiR531的结果与pCMV-mCherry-amiR533类似，也可以用于温和调节NF-κB的细胞内活性。
实施例4
通过NF-κB自控型miRNA表达载体调控RelA及其靶基因
方法：
细胞培养：HepG2细胞用含有10％(v/v)FBS(HyClone)，100units/mL青霉素和100g/mL链霉素的DMEM在含有5％(v/v)CO2的加湿培养箱中37℃培养。将细胞以1×105个细胞/cm2的密度接种在6孔板，孵育24小时(汇合度约80％)。用EndoFree质粒试剂盒(CWBio)分离用于转染的所有载体。在转染前，小心地取出培养基，用500μL PBS冲洗细胞。然后，向每个孔中加入500μL OPTI-MEM培养基并孵育2小时。通过使用基于脂质的转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen)将表达载体转染到细胞中。6小时后，除去混合物，加入完全培养基，继续培养细胞48h。
细胞转染：分别用4000ng的pDMP-mCherry-amiR533或pCMV-mCherry-amiR533转染到6孔板中的HepG2细胞，洗脱缓冲液为空白对照。培养48h后，细胞用TNF-α(10ng/mL)刺激1小时。
基因表达检测：收集细胞，用Trizol提取总RNA，逆转录合成互补DNA(cDNA)。通过qPCR定量分析RelA及其靶基因，包括BCL3、NFKB1、CD54、NFKBIA、CXCL1、PTGS2、CCL2、NFKB2和MMP9的表达。用于qPCR的上下引物如SEQ ID NO.14-35所示，详见表3。
结果：
为了验证pDMP-mCherry-amiR533是否能调节内源性NF-κB及其靶基因的表达，将pDMP-mCherry-amiR533，pCMV-mCherry-amiR533分别转染HepG2细胞。为了改变细胞内的NF-κB活性，用TNF-α，一种已知的NF-κB刺激剂，刺激细胞。通过qPCR定量分析RelA及其一些典型靶基因的表达。结果表明，TNF-α成功诱导了RelA及其靶基因的表达(图6)。两种amiRNA表达载体在不同程度上抑制了RelA及其靶基因的诱导表达(图6)。然而，与pDMP-mCherry-amiR533(图6)相比，pCMV-mCherry-amiR533转染的细胞中，RelA及其靶基因的诱导表达受到更显着地抑制，表明pDMP-mCherry-amiR533对RelA及其靶基因的调节更温和。同时pDMP-mCherry-amiR349、
pDMP-mCherry-amiR531的结果与pCMV-mCherry-amiR533类似，对RelA及其靶基因的调节也温和。
表3检测NF-κB及其靶基因表达的qPCR引物
Figure BDA0001404399740000131
实施例5
自控型表达载体对细胞活力的影响
方法：
细胞培养：293T、HepG2和HL7702细胞用含有10％(v/v)FBS(HyClone公司)，100units/mL青霉素和100g/mL链霉素的DMEM在含有5％(v/v)CO2的加湿培养箱中37℃培养。将细胞以1×105个细胞/cm2的密度接种在24孔板或6孔板，孵育24小时(汇合度约80％)。用EndoFree质粒试剂盒(CWBio)分离用于转染的所有载体。在转染前，小心地取出培养基，用500μL PBS冲洗细胞。然后，向每个孔中加入500μL OPTI-MEM培养基并孵育2小时。通过使用基于脂质的转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen)将表达载体转染到细胞中。6小时后，除去混合物，加入完全培养基，继续培养细胞18h或42h。
细胞转染：分别用800ng的pDMP-mCherry-amiR533或pCMV-mCherry-amiR533转染293T、HepG2和HL7702细胞。用50μM BAY处理细胞1小时作为阳性对照。
细胞检测：将所有细胞消化、收集，通过流式细胞(ACEA NovoCyte公司)AnnexinV-FITC/PI双通道进行检测。
结果：
NF-κB经常通过抑制细胞凋亡的靶基因发挥抗凋亡作用。因此，通过流式细胞膜联蛋白V-FITC/PI双通道评估了pDMP-mCherry-amiR533对细胞凋亡的影响。用BAY 11-7082处理的细胞作阳性对照。结果显示，pDMP-mCherry-amiR533导致两个细胞的早期(右下象限)和晚期(右上象限)凋亡细胞代表的总细胞凋亡率最低(图7A)。载体pCMV-mCherry-amiR533相对pDMP-mCherry-amiR533导致了更高的凋亡率。BAY 11-7082作为抑制NF-κB活性的常见试剂，导致最高的凋亡率，远远高于两个miR533表达载体(图7A)。很明显，小分子化学抑制剂通过强烈过度抑制NF-κB活性导致高凋亡。NF-κB miRNA干扰产生的细胞凋亡远小于小分子化学抑制剂。强启动子(MIEP)调控的NF-κB miRNA干扰导致比由NF-κB特异性启动子(DMP)调控的干扰更高的凋亡。pDMP-amiR533的NF-κB miRNA干扰对细胞活力的影响最小。细胞凋亡分析还显示miRNA干扰导致293T细胞凋亡远低于HepG2细胞。原因是293T是基因改良的人类胚胎肾细胞，而HepG2是人肝癌细胞，前者具有比后者更低的NF-κB活性。
最后，进一步评估了pDMP-mCherry-amiR533对正常人肝细胞系HL7702细胞凋亡的影响。HL7702作为NF-κB过度活化的阴性对照(38-40),与人类肝癌细胞HepG2进行对比。同样的，用pCMV-mCherry-amiR533，pDMP-mCherry-amiR533和BAY 11-7082处理两种细胞系，通过Annexin V-FITC/PI双通道流式细胞术分析细胞凋亡。结果表明，pDMP-mCherry-amiR533不诱导HL7702细胞凋亡(图7B)。然而，pCMV-mCherry-amiR533诱导HL7702细胞显著凋亡。重要的是，BAY 11-7082也诱导了HL7702细胞的显著凋亡(图7B)。这些数据表明，pDMP-mCherry-amiR533具NF-κB特异性，而化学性NF-κB抑制剂BAY 11-7082和强启动子MIEP不是完全NF-κB特异性的，因此可能导致应用中的副作用。pDMP-mCherry-amiR533对正常人肝细胞HL7702活性没有影响意味着这种新的NF-κB抑制剂可以消除NF-κB过度激活的细胞(如癌症或炎性细胞)中NF-κB的过度活化，但不会对正常细胞产生影响。同时pDMP-mCherry-amiR349/amiR531的结果与pCMV-mCherry-amiR533类似，可以消除NF-κB过度激活的细胞中NF-κB的过度活化，但不会对正常细胞产生影响。
SEQUENCE LISTING
<110> 东南大学
<120> 一种调控细胞内NF-κB活性的基因表达载体及其调控方法和应用
<130> 2017
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<170> PatentIn version 3.3
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Claims (8)

1.一种调控细胞内NF-κB活性的基因表达载体，其特征在于，包含两个序列元件，调控基因表达的启动子序列和启动子下游miRNA编码序列；所述启动子序列由一段NF-κB诱骗子序列和最小启动子序列组成；所述miRNA编码序列为一段可编码靶向NF-κB 信使RNA的miRNA的编码序列，所述NF-κB诱骗子序列包括各种序列的NF-κB诱骗子，为一段可与NF-κB蛋白特异性结合的DNA序列，其主要序列特征为含有数量不同的各种NF-κB结合靶点；所述靶向NF-κB mRNA的miRNA为通过核酸杂交与NF-κB mRNA结合，可引起NF-κB mRNA降解或翻译阻止的miRNA。
2.根据权利要求1所述的基因表达载体，其特征在于，所述最小启动子包括各种基因来源的最小启动子序列。
3.根据权利要求1所述的基因表达载体，其特征在于，所述NF-κB 信使RNA为RelAmRNA。
4.根据权利要求1所述的基因表达载体，其特征在于，所述靶向NF-κB 信使RNA的miRNA，包括天然miRNA和人工设计miRNA；所述人工设计miRNA包括amiR349、amiR531或amiR533，其编码序列分别为SEQ ID NO.1：5ʹ-CTT CTT CAC ACA CTG GAT TCC-3ʹ，SEQ IDNO.2： 5ʹ -AAG ATG GGA TGA GAA AGG ACA-3 ʹ，SEQ ID NO.3： 5ʹ -CAA AGA TGG GATGAG AAA GGA-3ʹ。
5.根据权利要求1所述的基因表达载体，其特征在于，所述基因表达载体为一线性或环状核酸分子。
6.根据权利要求5所述的基因表达载体，其特征在于，所述核酸分子为脱氧核糖核酸或核糖核酸分子，包括双链DNA、单链DNA或单链RNA分子。
7.根据权利要求5所述的基因表达载体，其特征在于，所述线性核酸分子包括普通线性DNA分子、病毒DNA分子或病毒RNA分子；所述环状核酸分子包括质粒DNA。
8.一种权利要求1所述的调控细胞内NF-κB活性的基因表达载体在制备用于基因治疗NF-κB过度活化密切相关疾病的NF-κB活性调控试剂或药物分子中的应用。
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