CN1073626C - A型肉毒结晶毒素的生产工艺及生产该毒素所需的冻干保护液 - Google Patents

A型肉毒结晶毒素的生产工艺及生产该毒素所需的冻干保护液 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物毒素，所得制品属新的生物制品，主要用于神经科、眼科等领域的肌张力障碍性疾病如：眼睑痉挛、面肌痉挛、斜视及痉挛性斜颈等的治疗。其工艺为：产毒培养基—产毒培养—除菌过滤—毒素的精制提纯—毒素的稀释、冻干。利用本发明制取的制品具有毒素收获率高、质量好、有效期长、价格低等优点。

Description

A型肉毒结晶毒素的生产工艺及 生产该毒素所需的冻干保护液
本发明涉及微生物毒素，所得制品属新的生物制品，用于神经科、眼科等领域的肌张力障碍性疾病，如：眼睑痉挛、面肌痉挛、斜视及痉挛性斜颈等的治疗。
A型肉毒毒素系A型肉毒梭菌生长繁殖过程中产生的一种毒力极强的神经毒素，它能作用于运动神经末梢神经肌肉接点，抑制突触前膜释放乙酰胆碱，从而引起肌肉松驰性麻痹。这种独特的药理作用，80年代初被美国学者列入临床，对斜视、眼睑痉挛、面肌痉挛及痉挛性斜颈等疾病进行试验性治疗，并取得满意的疗效。1989年12月，美国FOA正式批准A型肉毒毒素(商品名Oculinum )作为新药投产上市。1989年2月，我所研制的“注射用肉毒毒素”被批准进行临床试验，1993年10月由***批准为新药，1997年2月正式转为准字号|(97)卫药准字(兰)S-01号|投产。
目前美国采用；肉毒梭菌全培养酸沉淀--毒素磷酸盐缓冲液提取--低温乙醇沉淀--硫酸铵浓缩及自然结晶等程序制备A型肉毒结晶毒素。以此种方法生产的A型肉毒毒素纯度、质量均较高，但在工艺、消耗、安全、稳定性方面存在一定的问题和局限性，列举如下：
1、产毒培养基成分N-2Amine(Sheffied),Yeast extract(Oifco)等均系专一厂家生产的干粉成品，价格昂贵。
2、以菌体全培养提纯毒素，易造成实验室环境和设施的芽胞(属二类细菌)污染，存在严重的危险和危害。
3、提纯A型肉毒毒素的步骤之一，低温乙醇沉淀，需特定的低温厂房和设施。另外该工艺的纯毒素收获率较低，仅为17％。
4、产品以人血白蛋白作保护液冷冻干燥毒素，存在血源污染的危险，冻干过程中毒素力(即单位)损失高达50-90％；冻干成品的稳定性差，有效期短。合并之；
3、酶处理及浓缩：提取液按100ug/ml加入核糖核酸酶，35℃温育3小时，加硫酸铵至60％饱和，2-8℃过夜，离心，沉淀用适量PH5.5、0.05M柠檬酸缓冲液溶解后，透析；
4、层析：透析液经OEAE-ASO离子交换层析，收集、合并00260～00280为0.5-0.6的过柱液；
5、结晶：合并液加硫酸铵至60％饱和，2-8℃过夜，离心，沉淀用适量PH6.8、0.05M磷酸盐缓冲液溶解，再在含0.9M硫酸铵的上述缓冲液中透析，自然形成结晶，亦可重复上述过程，以形成第二次结晶；
Ⅵ、毒素的稀释、冻干
1、稀释
a、用磷酸盐缓冲液溶解及透析结晶毒素，除菌过滤后测定毒力；
b、用磷酸盐缓冲液将已知毒力的毒素溶液稀释至适当浓度(105-106L050/ml)；
c、将适量的稀释毒素加入到定量的冻干保护液中，使每毫升冻干保护液中毒素含量在效价要求的范围(50-100L050/ml)；
2、分装、冻干
每安瓶定量分装上述含冻干保护液的毒素稀释液1毫升，以蛋白质制品的冻干曲线对其进行冻干，冻干成品应无菌、水份含量不超过3％。
2、一种生产A型肉毒结晶毒素所需的冻干保护液，其特征在于：
1、成分
  明胶        1％
  右旋糖酐    5％
  蔗糖        5％
  蒸馏水      加至100ml
2、配制方法
a、按配制量秤取明胶，加热溶化后高压(121℃)灭菌30分钟；
b、按比例加入右旋糖酐及蔗糖，待全部溶化后，滤球过滤，BP(113℃)消毒30分钟，待用。
a、酸沉淀；原毒素液加六偏磷酸钠，使最终浓度达0.2％，用3当量盐酸调PH至3.5左右，2-8℃过夜；
b、毒素提取；弃上清，沉淀用蒸馏水洗1次，加适量PH6.0、0.2M磷酸盐缓冲液，分2次溶解、提取，每次置室温1小时，离心后分别取上清液合并之；
c、酶处理及浓缩；提取液按100ug/ml加入核糖核酸酶，35℃温育3小时，加硫酸铵至60％饱和，2-8℃过夜，离心，沉淀用适量PH5.5、0.05M柠檬酸缓冲液溶解后，透析；
d、层析：透析液经OEAE-ASO离子交换层析，收集、合并00260/00280为0.5-0.6的过柱液；
e、结晶：合并液加硫酸铵至60％饱和，2-8℃过夜。离心，沉淀用适量PH6.8、0.05M磷酸盐缓冲液溶解，再在含0.9M硫酸铵的上述缓冲液中透析，自然形成结晶。亦可重复上述过程，以形成第二次结晶；
(6)、毒素的稀释、冻干
(1)、稀释
a、用磷酸盐缓冲液溶解及透析结晶毒素，除菌过滤后测定毒力；
6、用磷酸盐缓冲液将已知毒力的毒素溶液稀释至适当浓度(105-106L050/ml)；
c、将适量的稀释毒素加入到定量的冻干保护液中，使每毫升冻干保护液中毒素含量在效价要求的范围(50-100L050/ml)；
(2)、分装、冻干
每安瓶定量分装上述含冻干保护液的毒素稀释液1毫升，以蛋白质制品的冻干曲线对其进行冻干。冻干成品应无菌、水分含量不超过3％。
上述A型肉毒结晶毒素生产过程中所需的冻干保护液其成份；
    明胶        1％
    右旋糖酐    5％
    蔗糖        5％
    蒸馏水     加至100ml
配制方法：
(1)、按配制量秤取明胶，加热溶化后高压(121℃)灭菌30分钟；
(2)、按比例加入右旋糖酐及蔗糖，待全部溶化后，滤球过滤，BP(113℃)消毒30分钟，待用。
本发明的有益效果：
1、毒素收获率由背景技术中的17％提高到33％，从而有效地降低了成本，保持了成品的低价，适合国情和消费水平。
2、质量好对比项目        美国                     本发明所得制品形态        单一针状结晶                 单一针、棒状结晶纯度      3.0×107L050(±20％)/mgpt  2.5-3.0×107L050/mgpt※00260/00280  ＜0.6                        ≤0.55
※此数越低毒素越纯
3、冻干保护液的应用，使冻干过程中毒力损失降低至0-20％，并延长了制品的有效期(本发明制品为3年，美国为2年) ；
4、本发明要求的厂房、设施、设备较简单，毒素提纯可在常温下进行，而且简便易行，重复性好；
5、用除菌毒素进行提纯，比背景技术用菌体全培养提纯更为安全，避免了肉毒梭菌芽胞污染环境的危险；
6、产毒培养可用国产原料、自制，既可减少进口，节约外汇，又可因地制宜，保证供应。

Claims (2)

1、一种A型肉毒结晶毒素的生产工艺，其特征在于：
Ⅰ、产毒培养基成份
  酪蛋白胰酶消化液    50％
  酵母透析液          20％
  蒸馏水              30％
其中：酪蛋白胰酶消化液成份
  酪蛋白    C、P      100g
  蒸馏水              1000ml
  胰酶粉(活力单位1∶100以上) 8.8活力单位/lg酪蛋白
Ⅱ、产毒培养基形成
(1)、将酪蛋白胰酶消化液与蒸馏水混合，加热50-60℃，用20％氢氧化钠溶液调正PH7.0，煮开后加入酵母透析液，再煮10分钟，用20％氢氧化钠再调PH至7.4；
(2)、煮沸，滤纸过滤，分装立瓶，于113℃30分钟灭菌备用；
(3)、另配50％葡萄糖溶液于113℃30分钟灭菌，接种时加入，最终浓度达1％；
Ⅲ、产毒培养
将经过适应培养后的A型肉毒梭菌(Hall株)菌种，接种于18.000-36.000ml的产毒培养基中，35℃培养5天；
Ⅳ、除菌过滤
经镜检为纯培养后，用无石棉除菌板或除菌滤膜过滤，得原毒素液，用小白鼠测定毒力，毒力应在106L050/ml左右；
Ⅴ、毒素的精制提纯
(1)、酸沉淀；原毒素液加六偏磷酸钠，使最终浓度达0.2％，用3当量盐酸调PH至3.5左右，2-8℃过夜；
(2)、毒素提取；弃上清，沉淀用蒸馏水洗1次，加适量PH6.0、0.2M磷酸盐缓冲液，分两次溶解、提取，每次置室温1小时，离心后分别取上清液合并之；
(3)、酶处理及浓缩：提取液按100ug/ml加入核糖核酸酶，35℃温育3小时，加硫酸铵至60％饱和，2-8℃过夜，离心，沉淀用适量PH 5.5、0.05M柠檬酸缓冲液溶解后，透析；
(4)、层析：透析液经0AEE-ASO离子交换层析，收集、合并00260～002280为0.5-0.6的过柱液；
(5)、结晶：合并液加硫酸铵至60％饱和，2-8℃过夜，离心，沉淀用适量PH6.8、0.05M磷酸盐缓冲液溶解，再在含0.9M硫酸铵的上述缓冲液中透析，自然形成结晶，亦可重复上述过程，以形成第二次结晶；
Ⅵ、毒素的稀释、冻干
(1)、稀释
a、用磷酸盐缓冲液溶解及透析结晶毒素，除菌过滤后测定毒力；
b、用磷酸盐缓冲液将已知毒力的毒素溶液稀释至适当浓度(105-106L050/ml) ；
c、将适量的稀释毒素加入到定量的冻干保护液中，使每毫升冻干保护液中毒素含量在效价要求的范围(50-100L050/ml)；
(2)、分装、冻干
每安瓶定量分装上述含冻干保护液的毒素稀释液1毫升，以蛋白质制品的冻干曲线对其进行冻干，冻干成品应无菌、水份含量不超过3％。
2、一种生产A型肉毒结晶毒素所需的冻干保护液，其特征在于：
(1)、成分
    明胶        1％
    右旋糖酐    5％
    蔗糖        5％
    蒸馏水    加至100ml
(2)、配制方法
a、按配制量秤取明胶，加热溶化后高压(121℃)灭菌30分钟；
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