CN107354166B

CN107354166B - 一种三七β-1,3葡聚糖酶基因PnGlu1及其应用

Info

Publication number: CN107354166B
Application number: CN201710540033.9A
Authority: CN
Inventors: 刘迪秋; 白智伟; 崔秀明; 曲媛; 熊吟; 杨晓艳; 王承潇
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2017-07-05
Filing date: 2017-07-05
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2037-07-05
Also published as: CN107354166A

Abstract

本发明为一种三七β‑1,3葡聚糖酶基因PnGlu1及其应用，公开了一种三七的病程相关蛋白2家族基因PnGlu1，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所述，编码β‑1,3葡聚糖酶；本发明通过功能基因组学相关技术研究证实PnGlu1基因具有提高植物抗真菌的功能，将本发明抗真菌PnGlu1基因构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，转基因烟草植株具有很强的体外抗真菌活性，超表达PnGlu1的转基因烟草对葡萄座腔菌、轮枝镰刀菌、茄腐镰刀菌、胶孢炭疽菌等四种真菌的生长具有明显的抑制作用。

Description

一种三七β-1,3葡聚糖酶基因PnGlu1及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是一种三七β-1,3葡聚糖酶基因PnGlu1及其应用。

背景技术

植物病原真菌是指寄生于植物并导致病害的真菌，已记载的植物病原真菌达8000种以上，并可引起3万余种植物病害，占植物病害总数的70%～80%，属第一大类病原物。目前对作物真菌病害的控制有如下几种方式：选育并采用具有抗性的作物品种；使用化学杀菌剂；采取轮作、避免带菌土壤和带病原植物材料的传播等。但是要筛选出具有抗性的作物品种需要花费大量的人力物力以及时间；化学杀菌剂成本较高，可能使植物病原真菌产生抗药性，其残毒对环境会产生污染；轮作不能从根本上解决植物病原真菌的危害问题。近年来，随着分子生物学理论和技术的不断发展，使人们不但能够从分子水平上深入认识植物与病原物相互作用的机制，而且还可以通过基因工程快速和高效地培育抗病作物新品种，是提高植物抗病能力的新方法。

β-1,3-葡聚糖酶的病程相关蛋白第二家族成员（van LOON L C, van STRIEN EA. The families of pathogenesis related proteins, their activities, andcomparative an analysis of PR1 type proteins. Physiol Mol Plant Pathol, 1999,55: 85-97.）。β-1,3葡聚糖酶在高等植物内广泛分布，包括花粉管壁、***壁、筛管端壁等结构中均有存在，它们在植物正常生长发育中发挥重要作用。此外，β-1,3葡聚糖酶在植物的抗病过程中也扮演着重要角色（欧阳波, 李汉霞. 植物β—1,3—葡聚糖酶及其基因.中国生物工程杂志, 2002, 22(6):18-23.）。在植物抵抗外来病原菌的过程中，β-1,葡聚糖酶是植物过敏反应(Hypersensitive Response，HR)中合成的重要水解酶类。植物抵抗病菌侵害的途径多种多样，包括加固细胞壁、产生抗菌物质，而其首选的方式则是HR。根据基因的进化关系、蛋白质特点和氨基酸序列相似，β-1,3葡聚糖酶可以分为三种类型：定位于液泡的碱性类型、胞外定位的酸性类型、还有其它一些β-1,3葡聚糖酶在序列上与以上两种类型相差甚远，可以单独作为一类。

已知的β-1,3葡聚糖酶均属于糖基水解酶第十七家族，其成员具有共同的序列结构：(LIVM) 2 X 2 (LIVMFYW) 3 2 (STAG) 2 E 2 (ST) 2 G 2 W 2 P 2(ST) 2 X 2G，如在豌豆的β-1,3葡聚糖酶中就有VNVVVSESGWPSDG的结构（Chang M M, Culley D E, HadwigerL A. Nucleotide sequence of a pea (Pisum sativum L. ) β-1,3 glucanase gene.Plant Physiol, 1993, 101: 1121-1122），该酶氨基酸序列中数个保守的谷氨酸和天冬氨酸残基可能与β-1,3葡聚糖酶催化的糖苷键水解有关。碱性β-1,3葡聚糖酶通常具有一个液泡定位的羧基末端多肽 (Carboxyl Terminal Polypeptide, CTPP)结构，CTPP中往往含有糖基化位点及CTPP切除信号氨基酸结构，CTPP的缺乏使得葡聚糖酶分泌到胞外。CTPP中苯丙氨酸-甘氨酸二肽的存在可能是CTPP切除的信号。因此，CTPP的存在与否成为β-1,3葡聚糖酶分类的重要依据。此外，β-1,3葡聚糖酶成熟肽中还含有几个相对保守的区段，特别是有一个高度保守的催化位点。如烟草、菜豆、豌豆和大豆的葡聚糖酶基因都含有两个相当保守的肽链，VVSESGWPS和FAMFDEN。

真菌细胞壁的结构核心是β-1,3分枝的β-1,3葡聚糖与几丁质交联形成的复合物（Adams DJ. Fungal cell wall chitinases and glucanases. Microbiology, 2004.150: 2029-2035.）。β-1,3葡聚糖酶能催化水解β-1,3葡聚糖，从而抑制真菌的生长、增殖，水解的寡糖产物可以成为植物防御反应的重要激发因子（Ham K S, Wu S C, Darvill AG, et al. Fungal pathogens secrete an inhibitor protein that distinguishesisoforms of plant pathogenesis-related endo-β-1,3-glucanases. Plant Journal,1997, 11(2): 169-179.）。平板抑菌实验表明，β-1,3葡聚糖酶对疫霉菌(Phytophthora capsici)菌丝生长具有抑制作用（Kim Y J, Hwang B K. Isolation of a basic 34kiloDalton β-1,3-glucanase with inhibitory activity against Phytophthora capsici from pepper stems. Physiological & Molecular Plant Pathology, 1997,50(2): 103-115.）。在大豆(Glycine max)中，已经发现葡聚糖激发子结合蛋白GEBP(Glucan Elicitor Binding Protein，GEBP)，定位于大豆根部细胞的质膜上，能够特异性地结合β-1,3葡聚糖降解过程中释放出来的寡糖激发子，诱导植物的防卫反应（Ham K S,Wu S C, Darvill A G, et al. Fungal pathogens secrete an inhibitor proteinthat distinguishes isoforms of plant pathogenesis-related endo-β-1,3-glucanases. Plant Journal, 1997, 11(2): 169-179.）。β-1,3葡聚糖酶与几丁质酶共同作用时抑菌效果更为明显。在水解过程中由真菌细胞壁释放出来的寡糖能够作为植物多种抗病反应的激发因子，诱导植物的全面抗病反应（Klarzynski O, Plesse B, Joubert JM, et al. Linear beta-1,3 glucans are elicitors of defense responses intobacco. Plant Physiol, 2000. 124(3): 1027-1038.）。

三七(Panax notoginseng)主产于云南文山州砚山县、马关、西畴、广南、麻栗坡、富宁、邱北等，另广西田阳、靖西、田东、德保等地也有种植。云南文山州的三七历史悠久、产量大、质量好，习称“文三七”、“田七”，为著名的道地药材。三七常年生长在阴蔽环境中，病虫害发生较为严重，据统计，三七上发生的病虫害大约有20多种。其中，主要的有根腐病、黑斑病、圆斑病、疫病、白粉病、蛞蝓、地老虎、蚜虫、介壳虫、尺蠖等，三七每年都因病虫的危害造成极为严重的损失。加强三七病虫害防治是保证三七产量、质量的一项主要措施。此外，认识三七抗病防卫反应的分子机制，并克隆和应用相关抗病基因显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是从三七中克隆获得具有抗真菌活性的β-1,3葡聚糖酶的全长基因PnGlu1；三七β-1,3葡聚糖酶基因PnGlu1核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，该基因cDNA全长序列为1417bp，包含一个1140bp的开放阅读框、63bp的5’非翻译区、214bp的3’非翻译区，编码如SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明分离克隆三七的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将目的基因转入受体植物中并过量表达，通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草以及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础。发明人将这个基因命名为PnGlu1。

植物β-1,3葡聚糖酶可由病原物，食草动物及其他生物或非生物诱导物、机械处理或刺激诱导产生。几丁质和β-1,3葡聚糖作为真菌胞壁主要成分，β-1,3葡聚糖覆盖在胞壁最外层，葡聚糖酶对这些暴露的多糖具水解作用。β-1,3葡聚糖酶水解真菌的细胞壁,并使病原物菌丝顶端细胞壁变薄，进而膨压和细胞壁张力发生不平衡，从而导致菌丝体顶端膨胀\破碎，最终死亡。更为重要的是，在水解过程中由真菌细胞壁释放出来的寡糖能够作为植物多种抗病反应的激发因子，诱导植物的全面抗病反应。

本发明涉及分离包含PnGlu1的DNA片段并鉴定其功能，对该基因进行序列同源性分析，发现PnGlu1编码的蛋白质序列与核桃（Juglans regia）、可可（Theobroma cacao）、辣椒（Capsicum annuum）的葡聚糖酶蛋白相似性分别为67%、66%和63%。PnGlu1基因编码一个由379个氨基酸残基组成的蛋白质，其分子质量为41.8KD，等电点（pI）为7.75。蛋白质序列中包含29个酸性氨基酸（D，E）、34个碱性氨基酸（K,R,H）。超量表达序列表SEQ ID所示序列可以增强烟草对葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioide)、茄腐镰刀菌(F. solani)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的抗性。

本发明将三七β-1,3葡聚糖酶基因PnGlu1应用在提高烟草对对葡萄座腔菌、轮枝镰刀菌、茄腐镰刀菌、胶孢炭疽菌抗性中，具体操作如下：

（1）用茄腐镰刀菌接种三七根部，取接种后24 h的三七根提取总RNA，以提取的总RNA为模板，以oligo(dT)18为反转录引物，通过逆转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)扩增出PnGlu1的编码区，然后将其连接到pMD-18T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；

（2）用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切pMD-18T-PnGlu1，通过胶回收得到目的基因片段，用同样的限制性内切酶酶切植物表达载体pCAMBIA2300s，胶回收获得所需载体大片段，再将所获得PnGlu1基因片段与pCAMBIA2300s片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；

（3）以重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCR以及RT-PCR检测得到真正的转基因植株，分析转基因植物蛋白对真菌生长的抑制活性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物能克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明来自三七的PnGlu1基因能增强植物对真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术减少真菌带来的病害具有明显的优势和不可取代的重要性。它可以为大规模生产作物、花卉等提供方便，大量减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减小环境污染且提高管理水平，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明PnGlu1转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果示意图，图中：Marker为DL2000 DNA Marker (大连宝生物)；阳性对照为质粒pMD-18T-PnGlu1为模板的PCR结产物；WT为非转基因烟草(野生型)总DNA为模板PCR的产物；

图2是本发明阳性PnGlu1转基因烟草中PnGlu1转录水平的表达分析结果图；图中：Marker是DL2000 DNA Marker (大连宝生物)；WT是非转基因烟草总RNA逆转录cDNA为模板的PCR产物；阳性对照是质粒pMD-18T-PnGlu1为模板的PCR产物；

图3是本发明PnGlu1转基因烟草体外抑菌活性效果图；图中a、b、c、d分别是对胶孢炭疽菌、轮枝镰刀菌、葡萄座腔菌、茄腐镰刀菌；WT为野生型烟草的总蛋白；Buffer为空白对照，即无蛋白对照(用于提取蛋白的缓冲液)。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1：PnGlu1全长基因克隆以及序列分析

制备茄腐镰刀菌的分生孢子悬液，蘸根接种一年生三七30 min，取接种后24 h的三七根部提取总RNA。用液氮将三七根研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA，采用逆转录酶M-MLV (promega)以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为：取5 μg Total RNA，依次加入50 ng oligo（dT），2 μL dNTP（2.5mM each）、DEPC水至反应体积为14.5 μL；混匀后，70℃加热变性5 min后迅速在冰上冷却5 min，然后依次加入4 μL 5×First-stand buffer、0.5 μL RNasin（200U）、1 μL M-MLV（200U），混匀并短时离心，42℃温浴1.5 h，取出后70℃加热10 min，终止反应。cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因PnGlu1，所用上下游引物序列分别为5’TCATCAGTACGTAGTTCTCTTACTTC3’及5’AGCTAAGCTAGTTACATGTCACTCT3’。采用Advantage^TM2 PCR Enzyme（Clontech）扩增出目的基因；PCR反应条件：95℃4 min；95℃ 30 s，54℃ 30s，72℃ 80 s，30个循环；72℃ 10 min；反应体系（20 μL）为1 μL cDNA、2μL 10×Advantage2 PCR Buffer、1.8μL 50×dNTP Mix （10mM each）、0.2 μL正向引物（10 μM）、0.2μL反向引物（10 μM）、0.2 μL Advantage 2 PCR Polymerase Mix、14.6μL PCR-Grade water；PCR结束后，取5 μL用于琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性以及大小。

所得到PCR产物只有一条DNA带，故直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pMD18-T vector kit（大连宝生物），反应体系和操作过程为：取1.5 μL PCR产物，依次加入1 μL pMD18-T vector（50 ng/μL）和2.5 μL 2×Ligation solution I，混匀后置于16℃过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中。使用含有氨苄青霉素（ampicillin，Amp）的LB固体培养基筛选阳性克隆，挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增PnGlu1的特异引物鉴定出多克隆位点***PnGlu1的克隆，将所鉴定的克隆进行测序，最终获得的PnGlu1全长cDNA为1417bp，通过NCBI ORF finder （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析发现其包含一个1140bp的开放读码框（见序列表），PnGlu1编码一个含379个氨基酸的蛋白质PnGlu1，其蛋白质分子质量为41.8 k D，等电点(pI)为7.75，表明该蛋白为碱性蛋白。

实施例2：植物超表达载体构建

采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（上海生工）提取***PnGlu1的大肠杆菌质粒pMD-18T-PnGlu1以及植物表达载体pCAMBIA2300s的质粒，取1 μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶BamHI（TaKaRa）和EcoRI（TaKaRa）分别对质粒pMD-18T-PnGlu1和pCAMBIA2300s进行双酶切（100 μL体系），反应体系和操作过程为：取20 μL pMD-18T-PnGlu1和pCAMBIA2300s质粒、依次加入10 μL10×Hbuffer、4μL BamHI、6μLEcoRI、60μL ddH₂O，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应；将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后对PnGlu1片段和pCAMBIA2300s载体大片段分别进行胶回收，整个过程使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工）；取1 μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。

利用T4 DNA Ligase（TaKaRa），将回收的PnGlu1 DNA片段和pCAMBIA2300s载体片段连接起来，反应体系（20 μL）和操作过程为：取10 μL PnGlu1 DNA片段依次加入2 μLpCAMBIA2300s载体DNA、2μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、5 μLddH₂O，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50 mg/L卡那霉素（kanamycin，Km）的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增PnGlu1的特异引物进行PCR，挑选出PnGlu1与pCAMBIA2300s成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入甘油并置于-80℃保存备用。

采用SanPrep柱式质粒抽提试剂盒（上海生工）提取并纯化上述大肠杆菌中的pCAMBIA2300s-PnGlu1质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300s-PnGlu1转入根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取2 μg pCAMBIA2300s-PnGlu1质粒加入含有200 μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5 min，随后转入液氮中冷冻1 min，然后迅速置于37℃水浴5 min，之后立即冰浴2 min，加入800 μL LB液体培养基于28℃振荡培养4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃静止培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增PnGlu1的特异性引物进行PCR，检测pCAMBIA2300s-PnGlu1是否转入农杆菌中，对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

本实验的转基因受体是烟草，将烟草种子用75%的酒精浸泡30s，用无菌水洗涤后用0.1%的HgCl₂浸泡8 min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2 MS培养基上，28℃暗培养6 d，发芽后转至光照培养箱（25℃，16 h/d光照），以后每月用1/2MS培养基继代一次。

从-80℃冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300s-PnGlu1质粒的农杆菌LBA4404菌种，接种于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1 mL浑浊的菌液至含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃培养48 h；随后将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28℃振荡培养2-3 h以活化农杆菌。

取烟草无菌苗叶子切成1 cm²左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中，浸染时间为15 min，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，将叶盘置于共培养基上进行室温培养，烟草转化的共培养基为MS+0.02mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30g/Lsucrose+6g/L琼脂，22℃无光条件下共培养2天。

将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L sucrose+6 g/L琼脂+50 mg/L Km+200 mg/L 头孢霉素（cefotaxime sodium salt，Cef）；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养（25℃，16h/d光照，8h/d黑暗），待烟草长出芽后用含有50 mg/L Km和200 mg/L Cef的MS培养基继代培养，因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选，将烟草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗做进一步的检测。

采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，将提取的基因组DNA取1 μL通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度，以转基因植株的基因组DNA为模板用扩增PnGlu1的特异引物进行PCR，PCR结束后，取8 μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株，部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，PnGlu1转基因烟草共筛选到47株阳性转基因植株。

实施例4：转基因烟草中PnGlu1的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析

取阳性转基因单株以及非转基因烟草（野生型）的嫩叶提取总RNA，逆转录生成cDNA第一链，并以此为模板用扩增PnGlu1的特异引物进行PCR，根据PCR结果分析各转基因单株中PnGlu1转录水平的表达，总RNA提取以及RT-PCR的方法与实施例1中相同，PCR结束之后，取5 μL用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到31个转基因单株中PnGlu1在转录水平大量表达，这些单株的编号为1～31。

将实验室保存的几种真菌接种于PDA固体培养基（200 g/L马铃薯，15 g/L琼脂，20g/L葡萄糖）上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2~3cm时添加蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性。

为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作，首先取1 g转基因烟草单株（编号分别为1、6、13、21）及野生型叶片放入研钵中，加入1 mL蛋白提取液（1M NaCl，0.1M 乙酸钠，1% PVP，pH6），充分研磨；转入1.5 mL离心管中，混匀后4℃静置过夜，4℃离心30min（12,000g/min），取上清于新的1.5 mL离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至0.2 μg/μL，然后分别取20 μL滴于各真菌培养基的无菌滤纸上，在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照（提取蛋白所用的溶液），28℃培养几天后观察各处理真菌生长的情况，并据此来评价PnGlu1转基因烟草的体外抗真菌活性，结果如图3所示，PnGlu1转基因烟草蛋白对葡萄座腔菌、轮枝镰刀菌、茄腐镰刀菌、胶孢炭疽菌的生长具有很强的抑制作用。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种三七β-1,3葡聚糖酶基因PnGlu1及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1417

<212> DNA

<213> Panax notoginseng

<220>

<221> mRNA

<222> (1)..(1417)

<220>

<221> 5'UTR

<222> (1)..(63)

<220>

<221> CDS

<222> (64)..(1203)

<220>

<221> 3'UTR

<222> (1204)..(1417)

<400> 1

gcggggaata tcatacattt catcagtacg tagttctctt acttctgatt gctttatata 60

tatatgttct tcaccatgac tatattttcc agaagaacta ataacagttt cctcgtaatg 120

acacctatac tgcttcttct ggggtttatg attgcaagct ttaagattac aggggtagaa 180

tctgttggcg cgtgttatgg aatgctagga aacaatctcc cacctgcatc agaagttgta 240

aatctataca aatcatacaa ccttgatcga atgagactct acgatccaaa tcgagccgct 300

atacaagctc tacaaaactc taatatcgaa gttatgattg gtgtcccaaa ctcagacctc 360

cagcgtctgg ccaatgatcc tggctatgca tacgactggg tgtacggaaa tcttgtagat 420

tacccacaag tcaaatttcg gtacatagcc gtaggaaatg aagtgagtcc cattaacggt 480

ggcacagcct ggctagctcc gttcgtctta ccagccatgc aacacatcca aacggcagta 540

ctttcggcag ctcgactggc aaacacggtt aaggtgtcaa ccgcaataga tatgacatta 600

ataggaaact cttatccccc ttcacaaggt agctttaggg gagatattag ggcatatttt 660

gatccgatta ttcggtttct tgtcaacaac aatgcgccct tgctagctaa tgtgtacccg 720

tattttagcc acattgggaa tccgcgtgat atttctttgt cttacgcaat tttcactgct 780

ccggggccag tgatatggga caatggcctt ggttaccaga atcttttcga tgcaatgatg 840

gatgctttat atgcggctgt tgagagggcc ggaggtggct cgttgaaggt ggtggtatca 900

gaaactggat ggccgtctgc cggaggagtg gcgacaactt ttgataatgc gcgtaattat 960

tactctagat tgattcaaca tgtggaaaag ggaaccccta ggaggccggg gagactagag 1020

acctacatgt ttgcgacgtt tgatgaaaat aataaaaatc cagaatatga gaagcatttt 1080

ggattgtttt tcccaaataa gcagcccaag tttccactca gaatttccat gggtactgga 1140

tctggggata tcgtttctga tggaaactct actagtttgg gttgggttaa gagtgacatg 1200

taactagctt agctagaggg tttgtaatat aataatattg catgatttgc ctttacatgc 1260

atgctttgag tttgggttga ataagtgtaa gcgatcatga tatgaatatt gatgtttgat 1320

ttaatttctt tgtatttaat ttgtaagttt ttgataagtg taaacaagga cgtttcatgt 1380

ttgttttgta caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1417

<210> 2

<211> 379

<212> PRT

<213> Panax notoginseng

<400> 2

Met Phe Phe Thr Met Thr Ile Phe Ser Arg Arg Thr Asn Asn Ser Phe

1 5 10 15

Leu Val Met Thr Pro Ile Leu Leu Leu Leu Gly Phe Met Ile Ala Ser

20 25 30

Phe Lys Ile Thr Gly Val Glu Ser Val Gly Ala Cys Tyr Gly Met Leu

35 40 45

Gly Asn Asn Leu Pro Pro Ala Ser Glu Val Val Asn Leu Tyr Lys Ser

50 55 60

Tyr Asn Leu Asp Arg Met Arg Leu Tyr Asp Pro Asn Arg Ala Ala Ile

65 70 75 80

Gln Ala Leu Gln Asn Ser Asn Ile Glu Val Met Ile Gly Val Pro Asn

85 90 95

Ser Asp Leu Gln Arg Leu Ala Asn Asp Pro Gly Tyr Ala Tyr Asp Trp

100 105 110

Val Tyr Gly Asn Leu Val Asp Tyr Pro Gln Val Lys Phe Arg Tyr Ile

115 120 125

Ala Val Gly Asn Glu Val Ser Pro Ile Asn Gly Gly Thr Ala Trp Leu

130 135 140

Ala Pro Phe Val Leu Pro Ala Met Gln His Ile Gln Thr Ala Val Leu

145 150 155 160

Ser Ala Ala Arg Leu Ala Asn Thr Val Lys Val Ser Thr Ala Ile Asp

165 170 175

Met Thr Leu Ile Gly Asn Ser Tyr Pro Pro Ser Gln Gly Ser Phe Arg

180 185 190

Gly Asp Ile Arg Ala Tyr Phe Asp Pro Ile Ile Arg Phe Leu Val Asn

195 200 205

Asn Asn Ala Pro Leu Leu Ala Asn Val Tyr Pro Tyr Phe Ser His Ile

210 215 220

Gly Asn Pro Arg Asp Ile Ser Leu Ser Tyr Ala Ile Phe Thr Ala Pro

225 230 235 240

Gly Pro Val Ile Trp Asp Asn Gly Leu Gly Tyr Gln Asn Leu Phe Asp

245 250 255

Ala Met Met Asp Ala Leu Tyr Ala Ala Val Glu Arg Ala Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Leu Lys Val Val Val Ser Glu Thr Gly Trp Pro Ser Ala Gly Gly

275 280 285

Val Ala Thr Thr Phe Asp Asn Ala Arg Asn Tyr Tyr Ser Arg Leu Ile

290 295 300

Gln His Val Glu Lys Gly Thr Pro Arg Arg Pro Gly Arg Leu Glu Thr

305 310 315 320

Tyr Met Phe Ala Thr Phe Asp Glu Asn Asn Lys Asn Pro Glu Tyr Glu

325 330 335

Lys His Phe Gly Leu Phe Phe Pro Asn Lys Gln Pro Lys Phe Pro Leu

340 345 350

Arg Ile Ser Met Gly Thr Gly Ser Gly Asp Ile Val Ser Asp Gly Asn

355 360 365

Ser Thr Ser Leu Gly Trp Val Lys Ser Asp Met

370 375

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcatcagtac gtagttctct tacttc 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agctaagcta gttacatgtc actct 25

Claims

1.一种三七β-1,3葡聚糖酶基因PnGlu1，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，编码如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

2.权利要求1所述的三七β-1,3葡聚糖酶基因PnGlu1在提高烟草对葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioide)、茄腐镰刀菌(F. solani)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)抗性中的应用。