CN107349190A - 芳姜黄酮的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药领域,特别涉及芳姜黄酮(aromatic‑turmerone)的新应用,尤其是在制备抑制神经炎症相关的多种神经退行性疾病药物中的应用。本发明通过实验证明芳姜黄酮能够抑制小胶质细胞的活化和炎症因子的释放水平,从而缓解炎症因子对神经元细胞造成的损伤,改善脑组织的认知功能和运动协调能力。以上结果表明,芳姜黄酮可用于制备预防或治疗神经炎症相关的多种神经退行性疾病的药物、功能食品和保健品。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,特别涉及芳姜黄酮的应用。
背景技术
神经退行性疾病是一种慢性的、全身性的、进行性的、退行性神经病变,主要包括老年痴呆(Alzheimer's Disease,AD)、帕金森(Parkinson's disease,PD)、亨廷顿舞蹈病(Huntington's disease,HD)和肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等。随着全球步入老龄化的时代,人类的寿命越来越长,与年龄密切相关的神经退行性疾病的发病率也越来越高,尤其是AD和PD。其中,AD是第一大神经退行性疾病,最新的流行病学研究显示,仅仅在2016年,美国有540万AD患者,医疗费用高达2260亿美元。其中,65岁及以上人群患病率为11%,85岁及以上人群的患病率达到32%。预计到2050年,每33秒将出现1例AD患者,每年将新增100万患者。另外,PD是第二大神经退行性疾病,其发病率仅次于AD。流行病学调查显示,在工业化的国家中,大约有0.3%的人患有PD。随着年龄的增长,60岁及以上人群患病率为1%,80岁及以上人群的患病率达到4%。由此可见,神经退行性疾病是一种与衰老相关的病变,是老龄化社会的流行性疾病,尤其是近年来发病率呈直线增长。这些神经退行性疾病最终表现为认知障碍和行为学改变,严重影响患者的生活质量,同时带来巨大的经济负担,必须引起人们的广泛关注。随着研究的不断深入,目前广泛认可的发病机理有衰老、蛋白错误折叠及淀粉样变性、氧化应激和神经炎症等。
值得注意的是,神经炎症是众多神经退行性疾病共同的重要病理特征之一,专指发生在脑组织中的炎症。大量研究表明,神经炎症广泛参与到各种神经退行性疾病中,可加速病变、恶化病情。在神经炎症中,静息状态下的小胶质细胞被广泛激活,触发炎症级联反应,介导多种的炎症因子产生,这些炎症因子进一步损伤神经元和激活星型胶质细胞,迅速扩大炎症反应;同时损伤的神经元细胞内聚集大量的异常折叠的淀粉样蛋白,如Aβ、α-突触核蛋白等,又会反过来激活胶质细胞,形成一个神经元损伤和炎症反应的恶性循环,最终导致脑组织损伤和脑功能障碍。由此可见,小胶质细胞活化是该恶性循环的开端,表明抑制小胶质细胞的活化,可能是控制炎症反应、减少神经元损伤,缓解与之相关的神经退行性病变的有效方法。
因此,开发具有抵抗神经炎症的相关药物、功能食品和保健品用于治疗或预防神经退行性病变具有重要意义。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了芳姜黄酮的新应用,即在制备治疗神经退行性疾病的药物、功能食品和保健品中的应用。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了芳姜黄酮在制备治疗神经退行性疾病的药物、保健品或食品中的应用。
芳姜黄酮,结构式为采用天然植物提取分离得到,本发明的实施例中使用的芳姜黄酮通过专利CN201410103616.1报道的提取方法分离得到,但芳姜黄酮的来源不仅限于此,也可采用其他方法分离得到。
本发明提供了芳姜黄酮在制备恢复脑组织葡萄糖代谢水平的药物中的应用。
本发明通过microPET/CT显像试验测定脑组织葡萄糖的代谢水平,显像结果显示,LPS腹腔注射的模型小鼠的脑组织对葡萄糖的摄取量降低,而灌胃给予芳姜黄酮的LPS模型小鼠脑组织的葡萄糖代谢水平得到恢复。表明,芳姜黄酮能够恢复脑组织葡萄糖代谢水平。
白介素1β(IL-1β),是一种细胞因子,属于白细胞介素的一种,在传递信息,激活与调节免疫细胞,介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。
肿瘤坏死因子(TNF-α),主要由活化的单核/巨噬细胞产生,能杀伤和抑制肿瘤细胞,促进中性粒细胞吞噬,抗感染,引起发热,诱导肝细胞急性期蛋白合成,促进髓样白血病细胞向巨噬细胞分化,促进细胞增殖和分化,是重要的炎症因子,并参与某些自身免疫病的病理损伤。
本发明通过免疫组织化学试验证明,芳姜黄酮可明显降低海马和大脑皮层组织中TNF-α和IL-1β蛋白水平。因此,本发明还提供了芳姜黄酮在制备降低海马组织中TNF-α或IL-1β蛋白水平的药物中的应用,以及芳姜黄酮在制备降低大脑皮层中TNF-α或IL-1β蛋白水平的药物中的应用。
本发明通过免疫荧光试验对小鼠脑组织小胶质细胞的活化程度进行表征,结果显示,LPS注射后,小鼠脑组织小胶质细胞广泛活化,而LPS注射后再灌胃给予芳姜黄酮能够明显减少活化的小胶质细胞数目。表明,芳姜黄酮能够抑制LPS诱导的小胶质细胞活化。因此,本发明还提供了芳姜黄酮在制备抑制小胶质细胞活化的药物中的应用。
神经退行性疾病是一种慢性的、全身性的、进行性的、退行性神经病变,主要包括老年痴呆(Alzheimer's Disease,AD)、帕金森(Parkinson's disease,PD)、亨廷顿舞蹈病(Huntington's disease,HD)和肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等。神经炎症是众多神经退行性疾病共同的重要病理特征之一,专指发生在脑组织中的炎症。
本发明在多次、反复的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)腹腔注射建立的神经炎症动物模型上,通过水迷宫试验、爬杆实验、免疫组化和免疫荧光实验,发现芳姜黄酮能够有效降低脑组织中炎症因子TNF-α和IL-1β的分泌水平,抑制小胶质细胞的活化程度,进而缓解神经炎症对神经元细胞造成的损伤,明显改善神经炎症所诱发的行为学变化及相关的脑组织葡萄糖代谢水平,以上结果显示,芳姜黄酮能够治疗或缓解神经炎症相关的神经退行性疾病,可用于制备抑制神经炎症相关的多种神经退行性疾病的药物、功能食品和保健品。因此,本发明提供了芳姜黄酮在制备治疗神经退行性疾病的药物、保健品或食品中的应用。
优选的,所述神经退行性疾病为神经炎症相关的疾病。
优选的,所述神经炎症相关的疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和多发性硬化。
为了获得更好的治疗效果,作为优选,芳姜黄酮的给药剂量50mg/kg~100mg/kg,即1kg人体中摄入50~100mg的芳姜黄酮可以有效治疗或缓解神经炎症相关的神经退行性疾病,可有效恢复脑组织葡萄糖代谢水平可以有效降低海马组织和大脑皮层中TNF-α或IL-1β蛋白水平,有效抑制小胶质细胞的活化。
在本发明提供的上述应用中,作为优选,所述药物包括芳姜黄酮和药学上可接受的辅料。
作为优选,药物的剂型为口服制剂或注射剂,其中,所述口服剂为胶囊剂、微囊剂、丸剂、片剂、汤剂、颗粒剂、膏剂、分散粉末、露剂、口服液、滴丸剂或脂质体;所述注射剂为粉针剂或注射液。
本发明通过动物实验发现,姜黄酮能够抑制小胶质细胞的活化和炎症因子的释放水平,缓解炎症因子对神经元细胞造成的损伤,改善脑组织的认知功能和运动协调能力,可用于制备抑制神经炎症相关的多种神经退行性疾病的药物、功能食品和保健品。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示小鼠microPET/CT显像图,其中,第一排为小鼠脑组织横断图,第二排为小鼠俯视图,第三排为小鼠侧视图;
图2示小鼠脑组织石蜡切片的尼氏染色图,其中,第一排为小鼠脑组织冠状切面,放大40倍;第二排为海马区,第三排为大脑皮层,第二、三排放大400倍;
图3示小鼠脑组织TNF-α蛋白的免疫组化图,其中,第一排为小鼠脑组织横断图,第二排为海马区,第三排为大脑皮层区;
图4示小鼠脑组织中小胶质细胞的免疫荧光图。
具体实施方式
本发明提供了芳姜黄酮的新应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明中,所用原料及试剂均可由市场购得。
其中,实验动物采用雄性,体重20-22g的SPF级8周龄C57小鼠,购自中山大学实验动物中心,许可证号SCXK(粤)2011-0029。小鼠饲料购自广东省广州中医药大学实验动物中心。实验动物在清洁级层流架中饲养,环境温度空调控制为23±2℃,相对湿度为75±10%,照明时间12h/d(7:00-19:00)。
TNF-α抗体购自Cell Signaling Technology公司,Iba-1抗体购自谷歌生物公司,Elisa试剂盒购自武汉华美生物工程公司,DAB显色剂购自DAKO公司。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1芳姜黄酮对LPS诱导的小鼠AD症状记忆障碍及相关的脑组织葡萄糖代谢水平的影响。
实验动物随机分为正常组、LPS组、阳性药物组(LPS+TTP488,5mg/kg/day)、姜黄油组(LPS+姜黄油,TEO,100mg/kg/day),芳姜黄酮低剂量组(LPS+芳姜黄酮,Art-L,50mg/kg/day),芳姜黄酮高剂量组(LPS+芳姜黄酮,Art-H,100mg/kg/day),每组8只。各实验组于LPS注射前1周开始给药,连续给药2周。除正常组外,其余各组均在给药的第7天开始腹腔注射LPS,连续注射1周后,采用水迷宫实验考察小鼠的记忆功能,采用microPET/CT显像法测定脑组织葡萄糖代谢水平。实验数据以Mean±SD表示,所有实验数据均采用SPSS 19.0软件进行统计分析,各组小鼠的组间参数用ANOVA进行检验,P<0.05被认为有统计学意义。水迷宫实验结果如表1所示,microPET/CT显像结果如图1所示。
表1芳姜黄酮对LPS诱导的小鼠AD症状记忆障碍的影响
由表1和图1结果可知,LPS腹腔注射明显延长了小鼠在定位航行实验中的潜伏期,同时减少了小鼠在空间探索实验中进入目标象限的次数及时间比例,并且降低小鼠脑组织对葡萄糖的摄取量,导致小鼠的记忆功能受损。连续灌胃给予高剂量和低剂量芳姜黄酮的实验组小鼠记忆功能得到明显的改善,潜伏期缩短,进入目标象限的次数和时间比例增加。连续灌胃给予高剂量和低剂量芳姜黄酮均能显著提高小鼠脑组织对葡萄糖的摄取量,其中,芳姜黄酮高剂量效果与阳性药物组效果相当。表明,芳姜黄酮能够显著提高LPS诱导的小鼠脑组织对葡萄糖的摄取量,恢复脑组织的葡萄糖代谢水平。
实施例2芳姜黄酮对MPTP诱导的小鼠PD症状爬杆行为的影响
实验分组:正常组、MPTP模型组、姜黄油组(MPTP+姜黄油,100mg/kg/day),芳姜黄酮低剂量组(MPTP+芳姜黄酮,50mg/kg/day),芳姜黄酮高剂量组(MPTP+芳姜黄酮,100mg/kg/day),每组8只。
给药方法:除正常组外,其他组的小鼠腹腔注射MPTP(30mg/kg/d),连续注射5天,造成帕金森病的亚急性动物模型。然后,根据组别连续两周给予相应的药物,正常组和MPTP组对应给予PBS。采用爬杆实验考察小鼠运动协调能力,通过记录小鼠由杆的顶端往下爬到底部(双前爪着地)所需时间,比较其运动能力。实验数据以Mean±SD表示,所有实验数据均采用SPSS 19.0软件进行统计分析,各组小鼠的组间参数用ANOVA进行检验,P<0.05被认为有统计学意义。结果如表2所示。
表2芳姜黄酮对MPTP诱导的小鼠PD症状爬杆行为的影响
(MPTP组于正常组相比:*表示P<0.05,**表示P<0.01;各给药组与MPTP组相比:#表示P<0.05,##表示P<0.01)
由表2数据可知,与正常组相比,MPTP组明显延长了小鼠爬至杆底部所用时间,影响了小鼠的运动功能。芳姜黄酮低剂量组和高剂量组均能显著缩短小鼠爬杆时间,显著改善小鼠的运动功能,其中,芳姜黄酮低剂量组与模型组相比具有显著的差异(P<0.05),芳姜黄酮高剂量组与MPTP模型组相比,具有极显著的差异(P<0.01),呈剂量依赖关系。
实施例3芳姜黄酮对LPS诱导的小鼠脑组织神经元损伤的影响
实验分组、给药方案同实施例一。小鼠给药结束后,***麻醉处死,将完整的脑组织取出。4%多聚甲醛中固定1周,自来水冲洗干净,用不同浓度的酒精梯度脱水。脱水这后浸泡于二甲苯中进行透明,将已透明的样品于熔化状态的石蜡中浸4h,包埋,切片,脱蜡复水之后进行尼氏染色,光学显微镜下观察。结果如图2所示。
由图2的结果可知,正常组小鼠的神经元细胞中含有大量的尼氏小体,注射LPS后,尼氏小体的数目显著减少;给予芳姜黄酮处理后,尼氏小体的数目显著增加,表明芳姜黄酮能够有效缓解LPS所致的神经元损伤。
实施例4芳姜黄酮对LPS诱导的小鼠脑组织中炎症反应的影响
实验分组、给药方案同实施例一。小鼠给药结束后,***麻醉处死后将脑组织取出,冰上分离出海马和皮层部分。采用Elisa试剂盒测定海马和皮层的组织匀浆液中TNF-α和IL-1β浓度,实验数据以Mean±SD表示,应用SPSS19.0软件进行数据处理,采用ANOVA检验进行统计学分析,P<0.05表明具有统计学差异,结果如表3所示。
1、免疫组化试验:取出完整的新鲜脑组织,置于4%多聚甲醛固定后,PBS洗涤后开始石蜡切片制作:主要步骤包括梯度乙醇脱水(70%、95%和100%)→梯度二甲苯透明(50%和100%)→浸蜡(将脑组织浸泡于融化的石蜡中40-50min)→包埋(倒入包埋的石蜡至凝固)→切片(以5μm的厚度切片)→烤片(切好的石蜡切片,放于预温62-65℃的烘箱内烤片1h后,二甲苯乙醇溶液中脱蜡水化)→抗原修复(组织切片置于盛满柠檬酸PH6.0抗原修复液的修复盒中,于微波炉内进行抗原修复)→阻断内源性过氧化物酶:3%过氧化氢溶液,室温避光孵育25min,而后PBS洗涤→血清封闭(滴加BSA孵育30min)→一抗孵育(在切片上滴加PBS按一定比例配置的TNF-α一抗,切片平放于湿盒内4℃孵育过夜)→二抗孵育(摇床洗涤一抗后,滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织,室温孵育50min)→DAB显色:摇床洗涤二抗后,切片稍甩干滴加DAB显色液,显微镜下控制显色时间,阳性为棕黄色,自来水冲洗切片终止显色→苏木素复染细胞核(摇床洗涤二抗后,滴加苏木素染液,复染2min)→封片(摇床洗涤3次后,晾干,中性树胶封片)→镜检拍照(切片于显微镜下观察并采集图像),结果如图3所示。
2、免疫荧光试验:取出完整的新鲜脑组织,置于4%多聚甲醛固定后,PBS洗涤后开始石蜡切片制作:主要步骤包括梯度乙醇脱水(70%、95%和100%)→梯度二甲苯透明(50%和100%)→浸蜡(将脑组织浸泡于融化的石蜡中40-50min)→包埋(倒入包埋的石蜡至凝固)→切片(以5μm的厚度切片)→烤片(切好的石蜡切片,放于预温62-65℃的烘箱内烤片1h后,二甲苯乙醇溶液中脱蜡水化)→抗原修复(组织切片置于盛满柠檬酸PH6.0抗原修复液的修复盒中,于微波炉内进行抗原修复)→切片稍干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走),在圈内加入自发荧光淬灭剂5min,流水冲洗10min→血清封闭(滴加BSA孵育30min)→一抗孵育(在切片上滴加PBS按一定比例配置的Iba1一抗,切片平放于湿盒内4℃孵育过夜)→二抗孵育(摇床洗涤一抗后,滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织,避光室温孵育50min)→DAPI复染细胞核(摇床洗涤二抗后,滴加DAPI染液,避光室温孵育10min)→封片(摇床洗涤3次后,晾干,用抗荧光淬灭封片剂封片)→镜检拍照(切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像),结果如图4所示。
表3:芳姜黄酮对LPS诱导的小鼠脑组织中炎症因子产生水平的影响
注:*表示P<0.05,**表示P<0.01与正常组比有统计学差异;
#表示P<0.05,##表示P<0.01与LPS组比有统计学差异。
由表3和图3的结果可知,LPS注射后,引起炎症因子TNF-α、IL-1β的过度表达和小胶质细胞的广泛活化。与LPS组相比,芳姜黄酮高剂量组可以显著降低海马和皮层中的TNF-α和IL-1β蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01);芳姜黄酮低剂量组能够显著降低海马中的IL-1β以及皮层中TNF-α、IL-1β蛋白的表达水平(P<0.05或P<0.01),有效降低海马中TNF-α蛋白的表达水平。
由图4可知,LPS组红色荧光明显高于正常对照组,注射LPS注射引起小胶质细胞的广泛活化,芳姜黄酮高、低剂量组红色荧光明显低于LPS组,表明芳姜黄酮能够有效抑制小胶质细胞的活化。其中,芳姜黄酮高剂量组红色荧光强度与阳性药物组(TTP488)相近,均显著低于LPS组,表明芳姜黄酮高剂量组对小胶质细胞的活化具有显著的抑制作用。
以上结果显示,芳姜黄酮能够有效抑制小胶质细胞活化和炎症因子TNF-α、IL-1β的分泌,控制神经炎症反应,从而缓解后续所致的神经元损伤,改善记忆障碍和运动协调能力,可用于神经炎症相关的多种神经退行性疾病。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.芳姜黄酮在制备恢复脑组织葡萄糖代谢水平的药物中的应用。
2.芳姜黄酮在制备降低海马组织中TNF-α或IL-1β蛋白水平药物中的应用。
3.芳姜黄酮在制备降低大脑皮层中TNF-α或IL-1β蛋白水平药物中的应用。
4.芳姜黄酮在制备抑制小胶质细胞活化的药物中的应用。
5.芳姜黄酮在制备预防或治疗神经退行性疾病的药物、保健品或食品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述神经退行性疾病为神经炎症相关的疾病。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述神经炎症相关的疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和多发性硬化。
8.根据权利要求5至7任一项所述的应用,其特征在于,所述芳姜黄酮的给药剂量为50mg/kg~100mg/kg。
9.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述药物包括芳姜黄酮和药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述药物的剂型为口服制剂或注射剂,所述口服剂为胶囊剂、微囊剂、丸剂、片剂、汤剂、颗粒剂、膏剂、分散粉末、露剂、口服液、滴丸剂或脂质体;所述注射剂为粉针剂或注射液。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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