CN107338239A - 一种糠醛渣固定化载酶材料的制备方法及其应用和固定化酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种糠醛渣固定化载酶材料的制备方法,其步骤为,(1)原料预处理;(2)糠醛渣一壳聚糖复合材料的制备;(3)糠醛渣‑壳聚糖‑戊二醛的交联反应。本发明还公开了糠醛渣固定化载酶材料的应用和固定化酶的方法。本发明由糠醛渣和壳聚糖复合而成,即将糠醛渣与壳聚糖进行水溶分散,通过静电自组装技术制备出优于单一炭基吸附材料的复合型固定化酶材料,本发明结合了糠醛渣和壳聚糖的优势,具有更为丰富的官能团,同时与壳聚糖的静电自组装效果更加优异,该方法所用原料廉价易得、制备方法简单,产品性能稳定,该糠醛渣复合材料固定化酶后可重复循环使用,回收方便,对环境无污染,进行废渣再次利用,符合绿色化学的要求。
Description
技术领域
本发明属于环境工程废渣利用技术领域,具体涉及一种利用糠醛渣制备固定化载酶材料的方法。本发明还涉及该糠醛渣固定化载酶材料固定化酶的应用。
背景技术
糠醛渣是玉米芯、稻壳等农副产品加工剩余物中聚戊糖成分高温水解生产呋喃甲醛后得到的固体废渣,含有大量的纤维素、半纤维素和木质素,具有良好的再利用价值。据报道,每生产1t糠醛就会有10吨以上的糠醛湿渣产生,我国糠醛渣年排放量可达300万t。由于糠醛渣盐分含量高,呈酸性,长期露天堆积,不仅会产生占地问题,还会给大气、土壤、河流等带来污染,因此糠醛渣的资源化利用问题亟需解决。糠醛渣pH值约为2,自然风干呈黄褐色,质地松软,其主要成分为纤维素、半纤维素、木质素以及少量的氮元素、磷元素等,含有大量的羟基、羧基等官能团,具有很好的化学反应活性。因此,利用糠醛渣固定果胶酶不仅可以实现资源化利用,又可为糠醛渣在固酶方面的实际应用提供一定的理论基础和参考依据。
发明内容
针对上述现有技术,本发明要解决的技术问题在于利用糠醛渣实现资源化利用,使用糠醛渣固定化酶的方法。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题,
一种糠醛渣固定化载酶材料的制备方法,其步骤为,
(1)原料预处理,用水反复冲洗掉糠醛渣表面的杂质和水溶物,之后80℃烘干24h,再在粉煤机上破碎,过筛,得40-100目颗粒;
(2)糠醛渣-壳聚糖复合材料的制备,将15-40ml的质量分数为2-5%的壳聚糖溶液和1.0g糠醛渣加入50mL的小烧杯中,超声20-40min并磁力搅拌12h,之后用蒸馏水反复离心洗涤多次,80℃烘干12h,再轻微研磨成40-100目颗粒,制得糠醛渣-壳聚糖复合材料;
(3)糠醛渣-壳聚糖-戊二醛的交联反应,将质量分数为4-5%的戊二醛和1.0g糠醛渣-壳聚糖复合材料按质量比0.1-0.5∶1加入小烧杯中,超声20-40min并磁力搅拌交联10-12h,之后用蒸馏水反复离心洗涤多次,80-100℃烘干10-20h,即制得糠醛渣固定化载酶材料。
作为优化,步骤(2)中所述壳聚糖溶液中还含有质量分数为1-3%的醋酸。
本发明要解决的另一个技术问题是糠醛渣固定化载酶材料的应用和固定化酶的方法。
糠醛渣固定化载酶材料的应用,其特征在于,作为固定化酶的载体应用。
作为优化,所述固定化酶为固定化果胶酶。
糠醛渣固定化载酶材料固定化酶的方法,其步骤为,
(1)称取0.05g糠醛渣固定化载酶材料,置于10mL离心管中,再加入10mg/mL的果胶酶2-6mL;
(2)在水温为37℃的恒温振荡器上震荡4h后取出离心,上清液保留;
(3)取离心后的滤渣先用蒸馏水洗涤离心一次,再用pH=3.5缓冲溶液洗涤两次,即制得糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶。
作为优化,步骤(3)后,将步骤(2)中获得的上清液与步骤(3)中所述糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶放置于4℃冰箱保存,以制备糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶当日酶活为100%计,保存6天时糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶的相对酶活为88.76-90.08%;
作为优化,步骤(3)后,将步骤(2)中获得的上清液与步骤(3)中所述糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶放置于4℃冰箱保存,以制备糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶当日酶活为100%计,保存15天时糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶的相对酶活为79.88-80.28%;
作为优化,步骤(3)后,将步骤(2)中获得的上清液与步骤(3)中所述糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶放置于4℃冰箱保存,以制备糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶当日酶活为100%计,保存21天时糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶的相对酶活为74.32-75.52%;
作为优化,步骤(3)后,将步骤(2)中获得的上清液与步骤(3)中所述糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶放置于4℃冰箱保存,以制备糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶当日酶活为100%计,保存32天时糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶的相对酶活为70.92-73.12%。
本发明由糠醛渣和壳聚糖复合而成,即将糠醛渣与壳聚糖进行水溶分散,通过静电自组装技术制备出优于单一炭基吸附材料的复合型固定化酶材料,本发明结合了糠醛渣和壳聚糖的优势,具有更为丰富的官能团,同时与壳聚糖的静电自组装效果更加优异,该方法所用原料廉价易得、制备方法简单,产品性能稳定。本发明还提供了上述糠醛渣和壳聚糖在固定化酶中的应用,该糠醛渣复合材料固定化酶后可重复循环使用,回收方便,对环境无污染,进行废渣再次利用,符合绿色化学的要求。
附图说明
图1为本发明实施例糠醛渣固定化载酶材料固定化酶的流程图;
图2为本发明实施例1制备的糠醛渣固定化载酶材料的红外光谱图;
图3为本发明实施例1制备的糠醛渣固定化载酶材料的扫描电镜图;
图4为本发明实施例1制备的糠醛渣固定化载酶材料的光电子能谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作详细的说明。
实施例1
一种糠醛渣固定化载酶材料的制备方法,其步骤为,
(1)原料预处理,用水反复冲洗掉糠醛渣表面的杂质和水溶物,之后80℃烘干24h,再在粉煤机上破碎,过筛,得60-80目颗粒;
(2)糠醛渣-壳聚糖复合材料的制备,将25ml质量分数为2%的壳聚糖溶液和1.0g糠醛渣加入50mL的小烧杯中,超声20min,磁力搅拌12h后用蒸馏水反复离心洗涤多次,80℃烘干12h,轻微研磨成60-80目颗粒,制得糠醛渣-壳聚糖复合材料;所述壳聚糖溶液中还含有质量分数为1%的醋酸;
(3)糠醛渣-壳聚糖-戊二醛的交联反应,将4%戊二醛和1.0g糠醛渣-壳聚糖复合材料按质量比0.1∶1加入小烧杯中,超声20min,磁力搅拌交联10h后用蒸馏水反复离心洗涤多次,80℃烘干12h,即制得糠醛渣固定化载酶材料。
实施例2
一种糠醛渣固定化载酶材料的制备方法,其步骤为,
(1)原料预处理,用水反复冲洗掉糠醛渣表面的杂质和水溶物,之后80℃烘干24h,再在粉煤机上破碎,过筛,得80-100目颗粒备用。
(2)糠醛渣-壳聚糖复合材料的制备,将40ml质量分数为3%的壳聚糖溶液和1.0g糠醛渣加入50mL的小烧杯中,超声40min,磁力搅拌12h后用蒸馏水反复离心洗涤多次,80℃烘干12h,轻微研磨成80-100目颗粒,制得糠醛渣-壳聚糖复合材料;所述壳聚糖溶液中还含有质量分数为1%的醋酸;
(3)糠醛渣-壳聚糖-戊二醛的交联反应,将5%戊二醛和1.0g糠醛渣-壳聚糖复合材料按质量比0.3∶1加入小烧杯中,超声40min,磁力搅拌交联10h后用蒸馏水反复离心洗涤多次,80℃烘干12h,即制得糠醛渣固定化载酶材料。
实施例3
一种糠醛渣固定化载酶材料的制备方法,其步骤为,
(1)原料预处理,用水反复冲洗掉糠醛渣表面的杂质和水溶物,之后80℃烘干24h,再在粉煤机上破碎,过筛,得40-60目颗粒备用。
(2)糠醛渣-壳聚糖复合材料的制备,将15ml质量分数为5%的壳聚糖溶液和1.0g糠醛渣加入50mL的小烧杯中,超声30min,磁力搅拌12h后用蒸馏水反复离心洗涤多次,80℃烘干12h,轻微研磨成40-60目颗粒,制得糠醛渣-壳聚糖复合材料;所述壳聚糖溶液中还含有质量分数为1%的醋酸;
(3)糠醛渣-壳聚糖-戊二醛的交联反应,将5%戊二醛和1.0g糠醛渣-壳聚糖复合材料按质量比0.5∶1加入小烧杯中,超声30min,磁力搅拌交联10h后用蒸馏水反复离心洗涤多次,80℃烘干12h,即制得糠醛渣固定化载酶材料。
实施例4考察不同储存期下固定化果胶酶的相对酶活
称取实施例1-3制备的糠醛渣固定化载酶材料各1.3g,分别做固定化果胶酶实验。
糠醛渣固定化载酶材料固定化果胶酶的方法,其步骤为,
(1)分别称取0.05g实施例1-3制备的糠醛渣固定化载酶材料,置于三个10mL离心管中,在三个离心管中再分别加入10mg/ml的果胶酶溶液2ml、4ml、6ml;
(2)在水温为37℃的恒温振荡器上震荡4h后取出离心,上清液保留;
(3)取离心后的滤渣先用蒸馏水洗涤离心一次,再用pH=3.5缓冲溶液洗涤两次,即制得糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶;
(4)将步骤(2)中获得的上清液与步骤(3)中所述糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶放置于4℃冰箱保存。
将实施例1制备的糠醛渣固定化载酶材料固定化果胶酶在4℃环境下储存,以制备糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶当日酶活为100%计,分别在存储6天、15天、21天和32天时测定相对酶活,存储6天时相对酶活为89.14%;存储15天时相对酶活是80.28%;存储21天时相对酶活是74.32%,存储32天时相对酶活是72.02%。
将实施例2制备的糠醛渣固定化载酶材料固定化果胶酶在4℃环境下储存,以制备糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶当日酶活为100%计,分别在存储6天、15天、21天和32天时测定相对酶活,存储6天时相对酶活为90.08%;存储15天时相对酶活是81.08%;存储21天时相对酶活是75.52%,存储32天时相对酶活是70.92%。
将实施例3制备的糠醛渣固定化载酶材料固定化果胶酶在4℃环境下储存,以制备糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶当日酶活为100%计,分别在存储6天、15天、21天和32天时测定相对酶活,存储6天时相对酶活为88.76%;存储15天时相对酶活是79.88%;存储21天时相对酶活是74.60%,存储32天时相对酶活是73.12%。
实施例5考察糠醛渣固定化载酶材料的载酶量
将实施例4中三个离心管离心分离后所得三种上清液分别用紫外分光光度计测定其在540nm处的吸光度变化值K540,代入标准曲线方程式中计算出对应条件下固载后的上清液中残留的未固定酶的质量,即:载体载酶量=(总酶量-未固定的酶量)/载体的质量,然后计算载酶量。
经测试和计算,实施例1制备的糠醛渣固定化载酶材料固定化果胶酶载酶量为133.68mg/g;实施例2制备的糠醛渣固定化载酶材料固定化果胶酶载酶量为158.78mmg/g;实施例3制备的糠醛渣固定化载酶材料固定化果胶酶载酶量为197.20mg/g。
实施例6测定相对酶活的方法
3,5-二硝基水杨酸比色法(简称DNS法)原理:3,5-二硝基水杨酸在碱性环境中能够与还原性糖发生氧化还原反应,被还原成氨基化合物,沸水浴中共热5min后,溶液可在540nm波长下有最大吸收峰。
本实施例实验中,果胶经酶解反应后被分解为还原性糖D-半乳糖醛酸,与3,5-二硝基水杨酸共热后形成棕红色的氨基化合物,即发生了显色反应。
精确称取D-(+)-半乳糖醛酸1.00g,加入pH=3.5缓冲溶液溶解,转移至1000mL容量瓶定容,制得1mg/ml的糖标准液作为标准样,制作标准曲线。
测定相对酶活方法:取两支25mL比色管,分别编号为1#和2#;向1#比色管中加入实施例4制备的任一糠醛渣复合材料固定化果胶酶0.05g;再分别向1#和2#比色管中加入2mL的pH=3.5缓冲溶液;接着向1#比色管中加入10mg/mL的果胶1mL,2#比色管中不加入果胶,两支比色管均迅速摇匀,在45℃水浴中反应120min后,再向1#和2#两支比色管中分别加入2mol/L的NaOH溶液5mL和DNS试剂1.5mL,接着继续沸水煮沸5min,再用自来水冷却,并用蒸馏水定容;从1#比色管中取2mL反应液盛于标记为3#的容积为10mL比色管内,从2#比色管中也取2mL反应液盛于标记为4#的容积为10mL比色管内,并将3#和4#比色管稀释至刻度线,将4#比色管中溶液为背景参比,测两支比色管的吸光度。3#比色管所测吸光度比值通过标准曲线计算酶活。
实施例7
取实施例3制备的糠醛渣固定化载酶材料按实施例4方法固定化果胶酶后,按实施例6所述方法进行果胶催化降解实验,催化条件为:取50mg实施例3制备的糠醛渣固定化载酶材料固定化果胶酶在pH=3.5、温度为45℃条件下对初始浓度C0=15mg/mL的果胶进行催化降解120min,再过滤取出所述糠醛渣固定化载酶材料固定化果胶酶,测定滤液吸光度后,计算得到固定化果胶酶第一次催化降解时的相对酶活为95.52%。
按上述方法再重复使用所述糠醛渣固定化载酶材料固定化果胶酶催化降解6次,测得重复使用1次后所述糠醛渣固定化载酶材料固定化果胶酶的相对酶活下降为92.66%,重复使用2次后所述糠醛渣固定化载酶材料固定化果胶酶的相对酶活下降为87.16%,重复使用3次后所述糠醛渣固定化载酶材料固定化果胶酶的相对酶活下降为86.37%,重复使用4次后所述糠醛渣固定化载酶材料固定化果胶酶的相对酶活下降为85.45%,重复使用5次后所述糠醛渣固定化载酶材料固定化果胶酶的相对酶活下降为83.62%,重复使用6次后相对酶活下降为81.78%。
实施例8考察糠醛渣固定化载酶材料的负载情况
将实施例1中制备的糠醛渣固定化载酶材料做红外光谱图、扫描电镜、光电子能谱图,见图2-4。
由图2可知,由糠醛渣和糠醛渣固定化载酶材料的红外光谱图可得到以下结论:①在1683cm-1处出现了新的吸收峰,并且峰强度很大,是壳聚糖的氨基与戊二醛的醛基发生Schiff反应而形成的Schiff碱键(C=N)的吸收峰和戊二醛没有参与反应的另一个C=0伸缩振动所产生的;②1020cm-1处的吸收峰也明显增强,是由N-H和N-C的弯曲振动;③壳聚糖中的0-H和N-H的伸缩振动使得3333cm-1处的吸收峰明显增强,2900cm-1处的C-H的伸缩振动吸收峰也有一定程度的增强。
由图3可知,预处理后的糠醛渣为层状结构,其表面较平整,比表面积较大。
由图4可知,根据光电子能谱元素分析可知糠醛渣固定化载酶材料检测出新的特征吸收峰N1s(400eV),说明壳聚糖已包裹到糠醛渣表面符合所制备糠醛渣固定化载酶材料的表面组成特征。
对比例考察现有载酶材料固定化果胶酶情况
取宁夏汝箕沟矿太西煤作为吸附材料,其最大载酶量为56.5mg/g,且连续使用7次后相对酶活仅为32.3%。
取磁性氧化石墨烯作为载体固定化果胶酶,在连续使用7次后相对酶活为58%。
取环氧微球作为载体对果胶酶进行固定化,得到活力较高的固定化果胶酶,在连续使用7次后相对酶活为56.4%。
通过与对比例比较后发现,本发明制备的糠醛渣固定化果胶酶具有较好的操作稳定性,本发明制备的糠醛渣固定化载酶材料固定化果胶酶在存储32d后的相对酶活保持在70%以上,并且具有较高的操作稳定性,在连续使用7次后,相对酶活还保持在80%以上。
上述结合附图对本发明的实施方式作了详细说明,但是本发明并不限于上述实施方式,在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内,还可以对其做出种种变化。
Claims (9)
1.一种糠醛渣固定化载酶材料的制备方法,其步骤为,
(1)原料预处理,用水反复冲洗掉糠醛渣表面的杂质和水溶物,之后80℃烘干24h,再在粉煤机上破碎,过筛,得40-100目颗粒;
(2)糠醛渣-壳聚糖复合材料的制备,将15-40ml的质量分数为2-5%的壳聚糖溶液和1.0g糠醛渣加入50mL的小烧杯中,超声20-40min并磁力搅拌12h,之后用蒸馏水反复离心洗涤多次,80℃烘干12h,再轻微研磨成40-100目颗粒,制得糠醛渣-壳聚糖复合材料;
(3)糠醛渣-壳聚糖-戊二醛的交联反应,将质量分数为4-5%的戊二醛和1.0g糠醛渣-壳聚糖复合材料按质量比0.1-0.5∶1加入小烧杯中,超声20-40min并磁力搅拌交联10-12h,之后用蒸馏水反复离心洗涤多次,80-100℃烘干10-20h,即制得糠醛渣固定化载酶材料。
2.如权利要求1所述糠醛渣固定化载酶材料的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述壳聚糖溶液中还含有质量分数为1-3%的醋酸。
3.权利要求1-2任一制备的所述糠醛渣固定化载酶材料的应用,其特征在于,作为固定化酶的载体应用。
4.如权利要求3所述糠醛渣固定化载酶材料的应用,其特征在于,所述固定化酶为固定化果胶酶。
5.权利要求1-2任一制备的所述糠醛渣固定化载酶材料固定化酶的方法,其步骤为,
(1)称取0.05g糠醛渣固定化载酶材料,置于10mL离心管中,再加入10mg/mL的果胶酶2-6mL;
(2)在水温为37℃的恒温振荡器上震荡4h后取出离心,上清液保留;
(3)取离心后的滤渣先用蒸馏水洗涤离心一次,再用pH=3.5缓冲溶液洗涤两次,即制得糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶。
6.如权利要求5所述糠醛渣固定化载酶材料固定化酶的方法,其特征在于,步骤(3)后,将步骤(2)中获得的上清液与步骤(3)中所述糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶放置于4℃冰箱保存,以制备糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶当日酶活为100%计,保存6天时糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶的相对酶活为88.76-90.08%。
7.如权利要求5或6所述糠醛渣固定化载酶材料固定化酶的方法,其特征在于,步骤(3)后,将步骤(2)中获得的上清液与步骤(3)中所述糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶放置于4℃冰箱保存,以制备糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶当日酶活为100%计,保存15天时糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶的相对酶活为79.88-80.28%。
8.如权利要求5或6所述糠醛渣固定化载酶材料固定化酶的方法,其特征在于,步骤(3)后,将步骤(2)中获得的上清液与步骤(3)中所述糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶放置于4℃冰箱保存,以制备糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶当日酶活为100%计,保存21天时糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶的相对酶活为74.32-75.52%。
9.如权利要求5或6所述糠醛渣固定化载酶材料固定化酶的方法,其特征在于,步骤(3)后,将步骤(2)中获得的上清液与步骤(3)中所述糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶放置于4℃冰箱保存,以制备糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶当日酶活为100%计,保存32天时糠醛渣固定化载酶材料固定的果胶酶的相对酶活为70.92-73.12%。
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