CN107334733B

CN107334733B - 一种含藤黄酸的还原敏感型复合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107334733B
Application number: CN201710537197.6A
Authority: CN
Inventors: 徐巍; 霍美蓉; 董丽慧; 丁厚强
Original assignee: Shandong Qianfoshan Hospital
Current assignee: Shandong Qianfoshan Hospital
Priority date: 2017-07-04
Filing date: 2017-07-04
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2037-07-04
Also published as: CN107334733A

Abstract

本发明提供了一种含藤黄酸的还原敏感型复合物，由藤黄酸和还原敏感型纳米载体组成，所述藤黄酸通过疏水作用载入还原敏感型纳米载体内部；所述还原敏感型纳米载体由壳聚糖衍生物通过疏水作用组成；所述壳聚糖衍生物，结构式为：

；所述还原敏感型复合物呈球状，粒径为10‑200nm。本发明还提供了一种上述含藤黄酸的还原敏感型复合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤药物通过血管、肌肉注射或口服途径给药。本发明的含藤黄酸的还原敏感型复合物，制备工艺简单；对有效成分藤黄酸的溶解性和载药量，均匀度好、包封率高，可提高病灶部位游离药物的浓度、疗效和生物利用度；降低了藤黄酸对正常细胞的毒害作用，毒副作用低、安全性好。

Description

一种含藤黄酸的还原敏感型复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及一种含藤黄酸的还原敏感型复合物及其制备方法和应用。

背景技术

癌症在全球范围内已成为严重威胁人类生命健康的多发疾病和常见疾病，其发病率在世界范围内逐年递增，而这一点在我国也较为显著，在一些地区，癌症的死亡率已经超过心血管疾病，成为人类健康的第一大威胁。目前临床主要依靠化学药物治疗癌症。但大多数抗肿瘤化学药物具有水溶性较差，难于制备适宜制剂，生物利用度较低，体内代谢快，且维持有效血药浓度的时间较短等缺点。目前多使用制成聚合物胶束、脂质体、包合物以及添加表面活性剂等方法来增加化学药物的溶解度，但是有些低分子表面活性剂，例如紫杉醇市售制剂－紫杉醇注射液 (Taxol) 中聚氧乙烯蓖麻油，具有较强的毒副作用，容易引起组胺释放，产生急性过敏性反应，严重时可致死。有些脂质体及包合物也存在靶向分布不好、载药量低、不稳定等问题。因此，研究高效、低毒的抗肿瘤药物新剂型众望所归。

藤黄酸是中药藤黄中主要有效成分之一。传统中医认为，藤黄味酸，涩，性凉，大毒，有解毒消肿，杀虫止血的功效，主治痈疽、肿毒、恶疮、跌打损伤等。近年来研究发现该药可通过多种机制起到抗肿瘤效果，是一种多靶点的抗肿瘤天然药物。但是鉴于生药藤黄毒性巨大，临床应用受到限制。然而藤黄酸是藤黄中主要抗肿瘤活性物质之一，具有较强的抗肿瘤作用，能通过抑制细胞的增殖，引起细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，抑制肿瘤新生血管生成，阻断肿瘤的侵袭和转移等多途径达到抗肿瘤的目的，且抗瘤谱广、毒性较低，在有效剂量范围内对荷瘤动物的造血功能及免疫功能无明显影响，故有望成为一种新结构类型的高效低毒抗肿瘤药物。但藤黄酸水溶性差、血管刺激性强、体内消除半衰期短、对肿瘤细胞无选择性等缺点限制了其在临床上的应用。

壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化衍生物，是天然界唯一带有正电荷的多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，且来源广泛、性质稳定。壳聚糖分子链上带有大量活性氨基和羟基，易于化学修饰而改善其物理化学性质。

聚合物胶束是通过自组装过程形成的两亲性共聚物胶束体系。在水溶液中，两亲性嵌段共聚物或A-B型接枝共聚物能自组装形成核－壳结构的球形胶束。胶束内核由疏水嵌段形成，可以稳定地运载和贮存难溶性药物，外面覆盖了一层亲水性嵌段链，能稳定地存在于水性介质或体液中，对疏水性内核起稳定作用。此外聚合物胶束还有载药范围广、载药量大、结构稳定、具有优良的组织渗透性，体内滞留时间长，能使药物有效地到达靶点，安全性高，便于生产等优势。

近年来，药理学家研究发现，肿瘤组织由于其代谢异常，导致了其细胞质、线粒体及细胞核内具有高浓度的还原型谷胱甘肽（GSH）（2-10mM），是正常细胞内环境GSH浓度的4倍以上，是细胞外液及循环***的100-1000倍（2-20μM），因此表现为独特的强还原生理特征。因此，可利用该独特的高浓度的还原型谷胱甘肽环境设计还原敏感触发释药功能的聚合物纳米载药胶束，纳米粒到达胞浆后，载体被病灶细胞内高浓度还原性物质谷胱甘肽破坏，从而导致药物快速从胶束中释放出来，作用于病灶部位，可显著提高病灶部位游离药物的浓度、疗效和生物利用度。还原敏感型壳聚糖衍生物聚合物胶束载体用于包载藤黄酸尚未见文献和专利报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备工艺简、稳定性好、毒副作用低的含藤黄酸的还原敏感型复合物。

本发明的另一个目的是提供上述复合物的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种含藤黄酸的还原敏感型复合物，由藤黄酸和还原敏感型纳米载体组成，所述藤黄酸通过疏水作用载入还原敏感型纳米载体内部；所述还原敏感型纳米载体由壳聚糖衍生物通过疏水作用组成。

所述还原敏感型复合物呈球状，粒径为10-200nm。

所述壳聚糖衍生物，结构式为：

其中，

CS为壳聚糖分子链，分子量为1×10⁴-1×10⁶，脱乙酰度大于75%；

R₁为亲水基团羟乙基；

p为壳聚糖骨架上亲水基团R₁取代度，为80-150%；

m+n为二硫键连接臂所含亚烷基个数，为2-16；

R₂为疏水基团，所述疏水基团选自C₂-C₁₈脂肪胺、精氨酸、聚乙烯亚胺；

q为壳聚糖骨架上疏水基团R₂取代度，为0.5-20%。

一种上述含藤黄酸的还原敏感型复合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将壳聚糖溶于溶剂中碱化后，加入环氧乙烷，制得羟乙基壳聚糖；

（2）将羟乙基壳聚糖溶于反应溶剂中，采用含有二硫键且两端含有羧基的连接臂，加入活化剂进行酰胺化反应，得中间体；

（3）将中间体和含有氨基的疏水化合物溶于反应溶剂中，加入活化剂进行酰胺化或酯化反应，得壳聚糖衍生物；将壳聚糖衍生物溶于水中，制得还原敏感型纳米载体；

（4）将藤黄酸以溶剂配制成溶液，加入还原敏感型纳米载体溶液中，超声后透析，得含藤黄酸的还原敏感型复合物的溶液，冻干得含藤黄酸的还原敏感型复合物。

上述制备方法中，步骤（1）中溶剂为异丙醇或醋酸水溶液。

上述制备方法中，步骤（2）和步骤（3）中活化剂为羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-羟基苯并***（HOBt）或4-二甲基氨基吡啶（DMAP）中任意一种与1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）的混合物。

上述制备方法中，步骤（4）中还原敏感型纳米载体溶液的配制方法为还原敏感型纳米载体溶于50-1000重量倍的水中。

上述制备方法中，反应溶剂选自水、甲醇、N, N-二甲基甲酰胺（DMF）、四氢呋喃（THF）、二甲基亚砜（DMSO）、甲酰胺、水与甲醇的混合溶剂、水与DMF的混合溶剂、水与甲酰胺的混合溶剂或DMF与甲酰胺的混合溶液中的一种。

（1）将壳聚糖溶于异丙醇或醋酸水溶液中，以NaOH溶液在40℃碱化12h后，冰浴下加入适量环氧乙烷，0ºC反应2-4h，升温至35-50ºC继续反应24h，浓盐酸调节pH值6-8，透析48-72h，冻干得到羟乙基壳聚糖。

（2）将羟乙基壳聚糖溶于水-甲醇混合溶液中；取过量含有二硫键且两端含有羧基的连接臂溶于甲醇中，加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）和羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化0.5-1h，然后滴加入羟乙基壳聚糖溶液中，常温反应24h，除去甲醇，然后使用过量的冷丙酮沉淀，抽滤并纯化沉淀物，用水复溶，透析48-72h，冻干得到游离一端为羧基的壳聚糖中间体。

（3）将正辛胺溶于甲醇溶液，将游离一端为羧基的壳聚糖中间体溶于水-甲醇-的混合溶中，加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）和羟基琥珀酰亚胺（NHS），活化0.5-1h后缓慢滴入正辛胺甲醇溶液，常温反应24h，除去甲醇，然后使用过量的冷丙酮沉淀，抽滤并纯化沉淀物，用水复溶，透析48-72h，冻干得到还原敏感型纳米载体。

（4）将藤黄酸溶于乙醇制成溶液，将还原敏感型纳米载体溶于水中，将藤黄酸溶液滴加入还原敏感型纳米载体溶液后超声、透析，得含藤黄酸的还原敏感型复合物的溶液，冻干得含藤黄酸的还原敏感型复合物。

一种上述含藤黄酸的还原敏感型复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述抗肿瘤药物通过血管、肌肉注射或口服途径给药。

本发明具有以下优点：

本发明的含藤黄酸的还原敏感型复合物，其中壳聚糖衍生物既包含亲水基团羟乙基又包含C2-C8的疏水基团，是两亲性物质；在水性介质中由于疏水作用可自组装为纳米胶束即还原敏感型纳米载体，避免了大量有机溶剂、化学交联剂等的使用。

由于藤黄酸不溶于水，因此，本发明的还原敏感型纳米载体的疏水内核可通过疏水作用包裹抗肿瘤药物藤黄酸形成复合物，从而显著提高藤黄酸的溶解性；且该复合物粒径小于200 nm，有利于控制纳米粒而不被巨噬细胞所清除，借助的EPR效应(enhancedpermeability and retention effect）富集到肿瘤组织中。

本发明的复合物中二硫键连接臂可被病灶细胞内高浓度还原性物质谷胱甘肽降解，从而导致药物快速从胶束中释放出来，作用于病灶部位，可显著提高病灶部位游离药物的浓度、疗效和生物利用度。

本发明的含藤黄酸的还原敏感型复合物，制备工艺简单；对有效成分藤黄酸的溶解性和载药量，均匀度好、包封率高，同时能够避免巨噬细胞所清除，可显著提高病灶部位游离药物的浓度、疗效和生物利用度；降低了藤黄酸对正常细胞的毒害作用，毒副作用低、安全性好。本发明的含藤黄酸的还原敏感型复合物在制备抗肿瘤药物中有广阔的应用前景。

附图说明

图1为壳聚糖衍生物CMC的测定曲线；

图2为含藤黄酸的还原敏感型复合物溶血试验结果；

图3为含藤黄酸的还原敏感型复合物的TEM图；

图4为10mM DTT处理4h后含藤黄酸的还原敏感型复合物的TEM图。

具体实施方式

下面结合实施例与附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 含藤黄酸的还原敏感型复合物的制备

将1.0g壳聚糖溶于2%醋酸水溶液中，分批加入50%的NaOH溶液，40℃碱化12h，冰浴条件下，分批加入适量环氧乙烷，0ºC反应3h，升温至50ºC继续反应24h，浓盐酸调节pH值7.2，透析（MWCO=14000）72h，冻干得到羟乙基壳聚糖。

将0.3g羟乙基壳聚糖溶于水和甲醇（v/v=1:1）的混合溶中，将0.6g 3,3'-二硫代二丙酸溶于甲醇溶液中，加入0.5g 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）和0.3g羟基琥珀酰亚胺（NHS），活化0.5h后缓慢滴入羟乙基壳聚糖水溶液中，常温反应24h，旋蒸除去甲醇，然后使用过量的冷丙酮沉淀，抽滤并纯化沉淀物，用水复溶，透析（MWCO=14000）72h，冻干得到游离一端为羧基的壳聚糖中间体。

将20mg的正辛胺溶于甲醇溶液，将0.1g壳聚糖中间体溶于水和甲醇（v/v=1:1）的混合溶中，加入30mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）和20mg羟基琥珀酰亚胺（NHS），活化1h后缓慢滴入正辛胺甲醇溶液，常温反应24h，旋蒸除去甲醇，然后使用过量的冷丙酮沉淀，抽滤并纯化沉淀物，用水复溶，透析（MWCO=14000）60h，冻干得到还原敏感型纳米载体。

将20mg还原敏感型纳米载体溶于2mL水中，将10mg藤黄酸加入适量无水乙醇，超声、涡旋溶解，并缓慢滴加至上述载体溶液中，冰浴下探头超声分散，胶束溶液透析（MWCO=14000）24 h，制成含藤黄酸的还原敏感型复合物溶液，过0.45μm滤膜，备用。

实施例2 含藤黄酸的还原敏感型复合物的表征

1. 粒径

Zetasizer 3000 HS instrument (Malvern Instruments, Malvern, UK)在633nm、25ºC、He-Ne 激光测定实施例1样品粒径，该还原敏感型壳聚糖衍生物聚合物的粒径值为198.6±0.4nm。

2. 胶束浓度（CMC）的测定

采用芘荧光探针法测定CMC：以芘的激发光谱中I₃₃₈/I₃₃₃比值（激发光谱中波长分别为338 nm和333 nm对应的荧光强度值）对两亲性物质的对数浓度作图，得图1。通过计算拐点处对应的浓度即可得两亲性物质的CMC。该还原敏感型壳聚糖衍生物的CMC值为47.5mg/L。

3. 含藤黄酸的还原敏感型复合物中藤黄酸含量测定

取一定量的包载藤黄酸的还原敏感型壳聚糖衍生物载药胶束冻干粉末，复溶于水中，3000 rpm离心10 min，取上清液，用0.8μm滤膜过滤除去未包裹的藤黄酸，续滤液中的载药纳米粒被100倍过量体积的甲醇破乳并且离心8000 rpm 5-10 min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法-紫外检测法进行含量测定。色谱柱为Lichrospher C18（4.6mm×250mm，5μm)，流动相为甲醇-水（93:7，v/v），流速为1 mL/min，柱温为30ºC，检测波长为360 nm，进样量为20 μL。以公式（1）计算样品的载药量，以公式（2）计算样品的包封率。

经测定，含藤黄酸的还原敏感型复合物的载药量为30.77%。包封率80%以上。

实施例3 含藤黄酸的还原敏感型复合物的溶血试验

取大鼠血液10mL，置离心管中，玻璃棒搅动去除纤维蛋白，得脱纤维血液。离心2500 rpm 5-10 min，弃上清，加入5-10倍量的生理盐水溶液，轻轻混匀后离心弃上清，重复该过程至上清液无色。轻轻移取2mL血细胞混悬液至100mL容量瓶中，生理盐水定容至刻度，即得2%血细胞混悬液。预先配制浓度为1mg/mL的复合物溶液，按表1配制一系列浓度依次为25、50、75、100、125、150、200以及400μg/mL的载体溶液，轻轻混匀后，37 ℃水浴锅中孵育1h，离心（3000 rpm，10 min），取上清液点于96孔板中，用酶标仪测定各孔在570 nm处吸光值A_sample。以加入等体积的生理盐水（第9管）以及等体积的蒸馏水（第10管）的红细胞溶液，分别作为阴性对照（0%溶血）和阳性对照（100%溶血），标记为A_0%和A_100%。溶血百分比按如下公式计算：

表1 含藤黄酸的还原敏感型复合物的溶血试验

以样品浓度为横坐标，溶血百分比为纵坐标，绘制溶血曲线，结果如图2所示。在所测量的浓度范围内，含藤黄酸的还原敏感型复合物最高浓度时溶血率为5.11%，远低于常用于静脉注射的低分子表面活性剂Tween80的溶血率（30%以上），因此证明含藤黄酸的还原敏感型复合物是安全低毒的。

实施例4 含藤黄酸的还原敏感型复合物的还原敏感性评价

通过高分辨率透射电子显微镜（TEM）表征实施例1中含藤黄酸的还原敏感型复合物在使用10mM二硫苏糖醇（DTT）处理4h后在干态下的形态变化（结果见图4），并与未用DTT处理前形态图（结果见图3）对比。TEM样品制备是首先将复合物溶液滴至铜网上，用4%磷酸钨溶液进行染色，空气中放置干燥，经TEM观察其形态。

对含藤黄酸的还原敏感型复合物的形态学进行考察，图3中TEM结果显示复合物呈规则类球状结构，粒径分布较均匀，粒径大小为100nm-150nm，小于动态激光散射所测粒径大小，可能是两者样品制备过程的不同引起的。TEM样品处于干燥状态测定大小，而动态激光散射是样品水合状态下测定大小，在亲水介质中，复合物的亲水性外壳易溶胀，导致自聚集胶束粒径增加。加入10mM DTT处理4h后，复合物形态发生变化，内部结构轻微分解，粒径增大。表明含藤黄酸的还原敏感型复合物可以响应还原敏感环境，导致二硫键断裂，胶束的类球形结构被破坏，释放药物。因此，此含藤黄酸的还原敏感型复合物具有还原敏感性，可被肿瘤微环境中高浓度还原性物质谷胱甘肽降解，从而导致药物藤黄酸快速从胶束中释放出来，作用于病灶部位，可显著提高病灶部位游离药物的浓度、疗效和生物利用度。

Claims

1.一种含藤黄酸的还原敏感型复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 将1.0g壳聚糖溶于2%醋酸水溶液中，分批加入50%的NaOH溶液，40℃碱化12h，冰浴条件下，分批加入适量环氧乙烷，0ºC反应3h，升温至50ºC继续反应24h，浓盐酸调节pH值7.2，透析MWCO=14000 72h，冻干得到羟乙基壳聚糖；

(2) 将0.3g羟乙基壳聚糖溶于体积比1:1的水和甲醇的混合溶中，将0.6g 3,3'-二硫代二丙酸溶于甲醇溶液中，加入0.5g 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺和0.3g羟基琥珀酰亚胺，活化0.5h后缓慢滴入羟乙基壳聚糖水溶液中，常温反应24h，旋蒸除去甲醇，然后使用过量的冷丙酮沉淀，抽滤并纯化沉淀物，用水复溶，透析MWCO=14000 72h，冻干得到游离一端为羧基的壳聚糖中间体；

(3) 将20mg的正辛胺溶于甲醇溶液，将0.1g壳聚糖中间体溶于体积比1:1的水和甲醇的混合溶中，加入30mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺和20mg羟基琥珀酰亚胺，活化1h后缓慢滴入正辛胺甲醇溶液，常温反应24h，旋蒸除去甲醇，然后使用过量的冷丙酮沉淀，抽滤并纯化沉淀物，用水复溶，透析MWCO=14000 60h，冻干得到还原敏感型纳米载体；

(4) 将20mg还原敏感型纳米载体溶于2mL水中，将10mg藤黄酸加入适量无水乙醇，超声、涡旋溶解，并缓慢滴加至上述载体溶液中，冰浴下探头超声分散，胶束溶液透析MWCO=14000 24 h，制成含藤黄酸的还原敏感型复合物溶液，过0.45μm滤膜。

2.一种如权利要求1所述的制备方法获得的含藤黄酸的还原敏感型复合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物通过血管、肌肉注射或口服途径给药。