CN107333977A - 一种抑菌组合物及其在制备酸化剂中应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抑菌组合物，所述抑菌组合物由植物精油和中链脂肪酸复合形成，所述植物精油为香芹酚、肉桂醛和丁香酚，所述中链脂肪酸为辛酸、癸酸和己酸。本发明提供的抑菌组合物克服了单一使用有机酸或植物精油中存在的问题，抑菌效果好，使用剂量小，能够有效利用现有资源、降低成本，还能扩大其抗菌谱，可应用于制备饲料添加剂，例如酸化剂等，是一种安全的可替代抗生素的产品，在饲料领域中具备极大的应用前景。

Description

一种抑菌组合物及其在制备酸化剂中应用

技术领域

本发明涉及环保型酸化剂技术领域，更具体地，涉及一种抑菌组合物及其在制备酸化剂中的应用。

背景技术

1964年，Moore(1946)等将抗生素添加到肉鸡饲料中，发现显著提高肉鸡的平均日增重。1951年，美国食品与药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)首次批准在饲料中添加非处方型抗生素，称之为“抗生素促生长剂(Antibiotics growth promoter，AGP)”(杜银峰，2013)。目前，有20多种抗生素及十几种合成抗菌药物被应用到饲料添加剂中。它们在控制动物细菌性疾病的发生，促进畜禽生长、发育，提高饲料转化率方面对畜牧业的发展做出了巨大的贡献。但从一开始对应用抗生素合理性就争论不休，争论的焦点主要是其在食品(肉蛋奶)中的残留，对人体健康的危害，以及对环境的污染。而且有大量的证据表明，在饲料中添加亚治疗剂量的抗生素促生长剂，一定会在食品、粪污中残留；并且会加速耐药菌株的出现。正因为如此，对于抗生素作为饲料添加剂，许多国家和地区作出了明确的限定，而一些国家和地区甚至全面禁用。美国于2000年，宣布禁用两种喳诺酮类抗茵药物在饲料中添加。欧盟也于2006年1月1日起全面停止使用抗生素饲料添加剂。我国农业部于2016年7月26日的第2428号公告：决定停止硫酸粘菌素用于动物促生长(佚名，2016)。在饲料中限制甚至禁用抗生素是消费者的要求，是全球大趋势，为适应这一需求，积极开发可替代抗生素的绿色饲料添加剂具有积极的意义。

目前可作为抗生素促生长剂(AGP)的替代品包括益生菌、益生元、酶制剂、酸化剂、中草药以及植物精油等。

其中，针对饲料酸化剂已有大量的研究，但是，由于单一有机酸或植物精油的抗菌性能差，如果要达到抗生素一样的抑菌效果，必需大剂量使用，从而导致使用成本高，对饲料的诱食性有负面影响。因此，如何降低在单一有机酸或植物精油中出现的上述问题，以便有效利用现有资源、降低成本，还能扩大其抗菌谱，改善抑菌性能，降低使用剂量，不但不影响采食，甚至可能提高采食量，是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明针对上述缺陷，提供了一种抑菌组合物，该抑菌组合物由中链脂肪酸与植物精油复合形成，具有抑菌高效、安全的效果，可应用于制备替代抗生素的饲料添加剂。

本发明通过以下方案获得上述技术目的：

本发明提供了一种抑菌组合物，由植物精油和中链脂肪酸复合形成，所述植物精油为香芹酚、肉桂醛和丁香酚，所述中链脂肪酸为辛酸、癸酸和己酸。

优选地，按质量百分比计，所述抑菌组合物由如下组分组成：

辛酸10％～20％、香芹酚5％～20％、癸酸5％～25％、肉桂醛25％～40％、丁香酚5％～20％、己酸10％～20％。

更优选地，辛酸、香芹酚、癸酸、肉桂醛、丁香酚、己酸的质量比为2:3:4:5:1:2。

更优选地，辛酸、香芹酚、癸酸、肉桂醛、丁香酚、己酸的质量比为2:1:1:5:2:2。

优选地，将所述抑菌组合物按照质量百分比为0.5～2％的比例制备成溶液。

本发明还保护所述的抑菌组合物在制备饲料添加剂中的应用。

进一步地，是在保护所述的抑菌组合物在制备酸化剂中的应用。

优选地，抑菌组合物抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或大肠杆菌中的一种或多种。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明提供的抑菌组合物克服了单一使用有机酸或植物精油中存在的问题，抑菌效果好，使用剂量小，能够有效利用现有资源、降低成本，还能扩大其抗菌谱，可应用于制备饲料添加剂，例如酸化剂等，是一种安全的可替代抗生素的产品，在饲料领域中具备极大的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

实施例1

将辛酸、香芹酚、癸酸、肉桂醛、丁香酚、己酸按照质量比为2:1:1:5:2:2混合成抑菌组合物，然后溶于0.5％(v/v)无水乙醇，再加入含0.5％(w/v)吐温-80的无菌液体，将抑菌组合物配置成0.5％(w/w)的浓度，边倒边搅拌，震荡均匀。以含0.5％(v/v)乙醇和0.5％(w/v)吐温-80的无菌液体为对照(上述对照经过预实验证明无抑菌性)。吸取100μL10⁷CFU/mL菌悬液于营养琼脂培养皿中，涂布均匀，放置4-6小时，使得菌体稳定附着于固体培养基表面。将培养皿平均分成4区，在每区的中央位置用直径为8mm的无菌枪头打孔，利用酒精灯火焰对小孔进行密封处理，然后在每个孔中分别加入100μL的对应浓度的抑菌组合物溶液。做好标识，将培养皿水平放置在37℃恒温培养箱中，静置培养24h后取出，用游标卡尺测定抑菌圈的大小。实验重复3次，计算平均值。

实施例2

将辛酸、香芹酚、癸酸、肉桂醛、丁香酚、己酸的质量比为2:3:4:5:1:2混合成抑菌组合物，然后溶于0.5％(v/v)无水乙醇，再加入含0.5％(w/v)吐温-80的无菌液体，将抑菌组合物配置成0.5％(w/w)的浓度，边倒边搅拌，震荡均匀。以含0.5％(v/v)乙醇和0.5％(w/v)吐温-80的无菌液体为对照(上述对照经过预实验证明无抑菌性)。吸取100μL 10⁷CFU/mL菌悬液于营养琼脂培养皿中，涂布均匀，放置4-6小时，使得菌体稳定附着于固体培养基表面。将培养皿平均分成4区，在每区的中央位置用直径为8mm的无菌枪头打孔，利用酒精灯火焰对小孔进行密封处理，然后在每个孔中分别加入100μL的对应浓度的抑菌组合物溶液。做好标识，将培养皿水平放置在37℃恒温培养箱中，静置培养24h后取出，用游标卡尺测定抑菌圈的大小。实验重复3次，计算平均值。其中，表1为实施例1和2对指示菌抑菌圈测定结果，表1中采用了单独的植物精油或中链脂肪酸进行对比试验。

表1中链脂肪酸、植物精油及实施例1、2对指示菌抑菌圈测定结果

由表1可知，中链脂肪酸中的己酸、辛酸和癸酸以及植物精油中的肉桂醛、丁香酚和香芹酚对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球均具有一定的抑制作用。实施例1和2的抑菌组合物，对革兰氏阴性菌(G-)中的大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效力相对各单体组分提升，对革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌抑菌效力相对各单体组分显著提升。

实施例3中链脂肪酸、植物精油以及实施例1和2对三种指示菌的MIC

参考NCCLS略有改动，采用琼脂平板稀释法：分别取表2中单一的中链脂肪酸、植物精油、抑菌组合物和黄霉素，将不同浓度的上述物质10mL(同样溶解于0.5％(v/v)无水乙醇，再加入含0.5％(w/v)吐温-80的无菌液体)，再加入融化并冷至50℃左右的定量(10mL)牛肉膏蛋白胨固体培养基中，震荡均匀，迅速倾倒平板，制成含不同递减浓度的样品平板。用无菌接种器，接种指示菌，最终每点菌数约为10⁴CFU，形成直径为5～8mm的菌斑。接种好后，在超净工作台静止放置1-2h，然后将平板置于37℃恒温培养箱中，培养24h，观察。观察结果的时候，将平板置于暗色、无反光物体表面上判断，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低样品浓度为MIC。以不含样品的固体琼脂平板为阴性对照，以含不同浓度的抗生素的固体琼脂平板为阳性对照，其它操作都相同。实验重复三次。

表2中链脂肪酸、植物精油及实施例1、2对指示菌的MIC(μg/mL)

由表2可知，实施例1和2相对于单一组分提高了其抑菌效果。单一的植物精油、中链脂肪酸的效果均不如实施例1和2的抑菌剂效果，实施例1和2的配方在兼具更好的抑菌性能的同时，由于实施例1和2中的中链脂肪酸和植物精油的用量有所降低，因此，降低了大剂量的单一组分对动物诱食性的不利影响，能够更好的对动物产生诱食性，且其安全、无毒。

实施例4实施例1的抑菌组合物在人工模拟胃液环境中抑菌特性

人工胃液：参照2010年《中国药典》二部附录X A中方法配制人工胃液。略微修改。取浓盐酸23.4mL加水100mL配制成稀盐酸。取上述稀HCl 1.64mL，加去离子水约80mL，调节pH值至4.0，去离子水定容至100mL，121℃高压灭菌15min后，冷却至室温，加入胃蛋白酶1g，混合使其充分溶解，该液为人工胃液(王慧娟，2013)。

在人工胃液环境中分别加入实施例1的配方组成溶液和指示菌液，使指示菌最终浓度是10⁵CFU/mL，实施例1抑菌组合物溶液的最终浓度为500μg/mL，37℃，90rpm(张媛媛，2013)处理4h，然后采用十倍稀释法涂布计数。同时做指示菌纯培养4h后的活菌计数，然后计算杀菌率。按上述同样操作，测定指示菌在非人工胃液的配方试剂环境中(即pH7.0，用生理盐水配置的最优组合配方液)的杀菌率，并进行比较。

杀菌率的计算公式如下：

表3实施例1在人工模拟胃液环境中抑菌效能评价

由实施例4可知，实施例1在模拟胃液环境中对指示菌作用4h后，仍能将金黄色葡萄球菌和沙门氏菌全部杀死，而其在此环境中对大肠杆菌的抑菌效果有所下降，但是其杀菌率仍能达到95.6％，仍具有较好的抑菌性能，实施例1在胃液环境中仍具有良好的抑菌、杀菌稳定性。

实施例5实施例1在人工模拟肠液环境中抑菌特性

人工肠液：参照2010年《中国药典》二部附录XV D中方法配制人工肠液。取0.68g磷酸二氢钾，加50mL水溶解，用浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液调成pH＝6.8的溶液，去离子水定容至100mL，121℃高压灭菌15min后，冷却至室温，外取1g胰蛋白酶，0.3％的牛胆盐(猪胆盐0.1g)，混合使其充分溶解，即得人工肠液，人工肠液的pH约为6.8，该液为人工肠液(王慧娟，2013)。

在人工肠液环境中，分别加入实施例1抑菌组合物配方和指示菌，指示菌最终浓度是10⁵CFU/mL，配方试剂的最终浓度为500μg/mL，37℃，120rpm((张媛媛，2013))处理4h，然后十倍稀释法涂布计数，同时做指示菌纯培养4h后的活菌数，然后计算杀菌率。同时按上述同样操作，测定在非人工肠液的配方试剂环境中(pH7.0，用生理盐水配置的最优组合配方)指示菌的杀菌率，并进行比较，公式如下所示。

杀菌率的计算公式如下：

表4实施例1在模拟肠液环境中抑菌效能评价

由实施例5可知，实施例1在人工模拟肠液环境中对指示菌作用4h后，仍能将金黄色葡萄球菌全部杀死，而其在此环境中对沙门氏菌、大肠杆菌的抑菌能力有所下降，但是其杀菌率仍分别能达到93.8％、98.24％，仍具有较好的抑菌性能。实施例1在肠液环境中仍具有良好的抑菌、杀菌稳定性。

Claims (8)

1.一种抑菌组合物，其特征在于，由植物精油和中链脂肪酸复合形成，所述植物精油为香芹酚、肉桂醛和丁香酚、，所述中链脂肪酸为辛酸、癸酸和己酸。

2.根据权利要求1所述的抑菌组合物，其特征在于，按质量百分比计，所述抑菌组合物由如下组分组成：

辛酸 10%~20%、香芹酚5%~20%、癸酸5%~25%、肉桂醛25%~40%、丁香酚5%~20%、己酸10%~20%。

3.根据权利要求2所述的抑菌组合物，其特征在于，辛酸、香芹酚、癸酸、肉桂醛、丁香酚、己酸的质量比为2:3:4:5:1:2。

4.根据权利要求2所述的抑菌组合物，其特征在于，辛酸、香芹酚、癸酸、肉桂醛、丁香酚、己酸的质量比为2:1:1:5:2:2。

5.根据权利要求1至4任一所述的抑菌组合物，其特征在于，将所述抑菌组合物按照质量百分比为0.5~2%的比例制备成溶液。

6.权利要求1至4任一所述的抑菌组合物在制备饲料添加剂中的应用。

7.权利要求1至4任一所述的抑菌组合物在制备酸化剂中的应用。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑菌组合物抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或大肠杆菌中的一种或多种。