CN107328744A - 一种基于均匀分布的微球检测肿瘤标记物的微流控芯片及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于均匀分布的微球检测肿瘤标记物的微流控芯片及其使用方法，所述芯片包括进样口、出样口、若干个与液体流动方向平行的微柱阵列；所述微柱阵列之间的间隙为主流动通道，微柱阵列中相邻微柱的最窄间隙略小于微球的直径。本发明基于流体扩散的原理，结构简单，无需复杂的流阻理论计算，可将微球均匀排布在微柱的间隙中，离散分布的微球避免了相互之间荧光信号的干扰；微球可以根据需要结合不同的抗体，实现不同标记物的检测；采用的孵育方法可以减少进样的时间，集进样和清洗于一体，简化了实验操作，可应用于以微球为载体的生化检测，具有良好的应用前景。

Description

一种基于均匀分布的微球检测肿瘤标记物的微流控芯片及其 使用方法
技术领域
本发明属于生物传感器领域，特别涉及一种基于均匀分布的微球检测肿瘤标记物的微流控芯片及其使用方法。
背景技术
2015年5月，英国《每日邮报》报道：“癌症导致的死亡率呈逐年上升的趋势，是目前仅次于心血管疾病的第二大杀手。”统计显示早期肺癌切除后的5年生存率为60～90％，而对于我国肺癌早期诊断率较低患者5年的生存率仅为10％，70～90％的癌症病人在5年内死于肿瘤的转移和复发。在肿瘤发生转移之前，体内一些标记物的表达已经发生了改变，如果能够对这些标记物进行准确有效地检测，实现肿瘤的早期筛查，及时采取治疗措施，则能够有效地提高患者的生存率。
在微流控免疫中，微球由于具有较大的比表面积，能够实现较高的灵敏度，而被广泛地运用在肿瘤标记物的检测中。和固态平面相比，免疫微球可以结合更多的生物分子，进而增加信号分子的量，实现信号增强的作用，提高了检测灵敏度。同时，在液相环境下，微球的流动性可以增加生物分子碰撞的几率，提高反应效率。在基于微球的微流控免疫检测中，荧光信号分子结合夹心法免疫分析原理是其比较常见的技术。实验发现，荧光信号获取的质量和微球的排列方式是密切相关的。由于微球在液相环境下的流动性，芯片需要将微球拦截住，以方便后期的观察与分析。目前，对微球的拦截可以分为外加场拦截和流体动力学拦截。利用磁场或电场对特殊性质的微球进行驱动或捕获的方法往往需要产生外加场的设备，使实验步骤变得复杂。而流体动力学拦截的方法，若结构设计不当经常会导致微球在通道内某个位置上聚集，妨碍了液体的流动。而且在观察时，通道内聚集的微球会发生重叠或者覆盖，荧光下各自微球的光晕会对其荧光强度的统计产生严重的影响，不利于准确地分析。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于均匀分布的微球检测肿瘤标记物的微流控芯片及其使用方法，该微流控芯片结构简单，无需复杂的流阻理论计算，可将微球均匀排布在微柱的间隙中，离散分布的微球避免了相互之间荧光信号的干扰；微球可以根据需要结合不同的抗体，实现不同标记物的检测；采用的孵育方法可以减少进样的时间，集进样和清洗于一体，简化了实验操作，可应用于以微球为载体的生化检测，具有良好的应用前景。
本发明的一种基于均匀分布的微球检测肿瘤标记物的微流控芯片，所述微流控芯片包括进样口、出样口、若干个与液体流动方向平行的微柱阵列；所述微柱阵列之间的间隙为主流动通道，微柱阵列中相邻微柱的最窄间隙略小于微球的直径(正好可以只容纳一个微球)。
所述微柱阵列对微球的拦截是基于流体扩散的原理。
本发明进出样口的设计使得各个主流动通道存在流速差异，液体因流速差异而产生的扩散使其能够通过相邻微柱的间隙，从流速高的通道流向流速低的通道，进而微球可以截留在微柱之间。同时，主通道水流的冲击也防止了微球在微柱间隙中的堵塞。
所述微流控芯片在使用前进行真空处理。
所述微流控芯片的主体材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。PDMS是一种介孔材料，具有多孔透气性，使用前对微流控芯片抽真空，可消除微流控通道内在进样过程中因流速分布问题而产生的气泡。
使用前预先对量子点进行稀释，优选采用0.5％的吐温-20进行稀释。消除量子点对PDMS和微球的非特异性吸附。量子点能够通过疏水相互作用与PDMS和微球进行非特异性的结合，非特异信号会干扰有效信号的获取。吐温-20是非离子表面活性剂，可以改变界面的亲疏水性。采用0.5％的吐温-20对量子点进行稀释，有效地解决了非特异吸附的问题。
使用前将参与反应的生物分子、量子点和微球同时加入到离心管内，摇晃孵育，再进行进样。孵育完成后直接进样，由于免疫反应已全部完成，因此在进样的过程中，微球的拦截和多余生物分子的清洗可一步完成，使操作更加简便。
本发明是可以使微球均匀分布开，并能防止微球堵塞的微流控结构，该结构对微球的拦截不需要外加场，完全依赖流体动力学，操作简单。同时，在对生物靶分子的检测中，也达到了灵敏度高，特异性强的要求。
有益效果
本发明将微球均匀排布在微柱的间隙中，离散分布的微球避免了相互之间荧光信号的干扰；微球可以根据需要结合不同的抗体，实现不同标记物的检测；采用的孵育方法可以减少进样的时间，集进样和清洗于一体，简化了实验操作，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明微流控芯片的结构示意图；
图2是本发明微流控芯片内微球的实际分布图；
图3是微球的荧光强度和标记物浓度的变化关系；其中，A是不同标记物浓度(ng/ml)下，微球的荧光图片，B是荧光强度与标记物浓度的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.微流控芯片的制备
(1)利用CAD软件制作出所需要的掩膜，微柱的长为130μm，宽为30μm，微柱之间最窄的间距为13μm，微柱阵列之间的距离为100μm，整个芯片大约有25个微柱阵列，每个阵列约有200个微柱，微柱的长与主流动方向垂直。
(2)将光刻胶旋涂在清洗后的硅片上，厚度为3μm，经过曝光、显影等一系列光刻工艺，将硅片上的光刻胶按照掩膜版的图形进行图案化。以光刻后的光刻胶图形为掩膜，对硅片进行深反应离子刻蚀，刻蚀深度为18μm。这一深度方便微球排布在一个平面上，有利于观察时的聚焦。刻蚀完成后用等离子体干法去除残胶。硅片模具制作完成。
(3)将制作好的硅片模具进行硅烷化(熏氟硅烷，真空过夜)。以PDMS预聚体：固化剂＝10:1的比例配制PDMS，搅拌均匀后抽真空直至气泡消失。将PDMS浇筑在硅烷化之后的硅片上，放置在热板上95℃直至固化。
(4)将固化后的PDMS剥离下来，切割打孔，然后用等离子体将结构化的PDMS与载玻片键合起来，至此微流控芯片制作完成。
2.聚苯乙烯微球的功能化修饰
(1)吸取10μl微球原液，重悬在90μl PBS(磷酸盐)缓冲液中，吹打震荡。然后以6000r/min的转速离心5分钟，吸去上清液，重复操作两次，最后重悬在80μl的PBS中。
(2)利用PBS缓冲液配制10mg/ml的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液，各吸取10μl加入到步骤(1)中的微球悬液中，室温下震荡孵育半小时，孵育后重复步骤(1)中的离心操作，最后重悬在100μl PBS缓冲液中。
(3)将30μg anti-CEA捕获抗体加入到步骤(2)中的微球悬液中，吹打震荡，然后在37℃的条件下震荡孵育4小时。孵育结束后，重复步骤(1)中的离心操作，最后重悬在100μlPBS缓冲液中。
(4)用10％的BSA(牛血清蛋白)溶液对修饰好的微球进行封闭，然后放在4℃下备用。
3.基于微球检测肿瘤标记物的研究
(1)将功能化的微球、待检测的标记物、结合有检测抗体的量子点和PBS缓冲液同时加入到离心管内，37℃摇晃孵育40分钟。
(2)孵育结束后，直接进样，最后进样100μl 0.05％的PBST缓冲液作为最后的清洗。
(3)进样完成后，在显微镜下观察并拍照，然后用图像分析软件对荧光信号进行统计。
由图2、图3可知，微球能够在微流控芯片内实现有序排布，本实施例的微流控芯片的检测下限达到了0.5ng/ml，而且拟合曲线与实际数据具有高相关性，相关系数达到了0.99。

Claims (4)

1.一种基于均匀分布的微球检测肿瘤标记物的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片包括进样口、出样口、若干个与液体流动方向平行的微柱阵列；所述微柱阵列之间的间隙为主流动通道，微柱阵列中相邻微柱的最窄间隙小于微球的直径。
2.根据权利要求1所述的一种基于均匀分布的微球检测肿瘤标记物的微流控芯片，其特征在于：所述微柱阵列对微球的拦截是基于流体扩散的原理。
3.一种如权利要求1所述的基于均匀分布的微球检测肿瘤标记物的微流控芯片的使用方法，其特征在于：使用前对微流控芯片抽真空，对量子点进行稀释，将参与反应的生物分子、量子点和微球同时加入到离心管内，摇晃孵育，再进行进样。
4.根据权利要求3所述的一种基于均匀分布的微球检测肿瘤标记物的微流控芯片的使用方法，其特征在于：所述稀释具体为采用0.5％的吐温-20进行稀释。
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GR01 Patent grant
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