CN107312810B - 酶催化苯丁酸氮芥-多肽水凝胶的制备及抗癌应用 - Google Patents

酶催化苯丁酸氮芥-多肽水凝胶的制备及抗癌应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种酶催化苯丁酸氮芥‑多肽水凝胶的制备及抗癌应用，它由磷酸化多肽经过碱性磷酸酶催化特异性的折叠成α‑螺旋构型而成，具有显著提高抗肿瘤药物的活性的效果。所述应用中，所述多肽序列为CRB‑GDFDFDY和CRB‑GDFDFp DY。

Description

酶催化苯丁酸氮芥-多肽水凝胶的制备及抗癌应用
技术领域
本发明涉及一种在碱性磷酸酶催化下形成的多肽水凝胶及其在提高抗肿瘤药物活性方面的应用。
背景技术
由自组装多肽形成的水凝胶具有生物相容性好、生物活性高等特点和优点，相关领域的研究是近20年的热点。它已经在再生医学、药物控释、分析检测、组织工程等方面展现了很高的应用前景。多肽折叠对于蛋白质形成稳定的三级结构、获得生物学功能、组装成蛋白复合体来说是至关重要的。多肽错误折叠和蛋白的错误组装将会导致蛋白功能缺失，并与疾病有关。受自发自组装***的启发，自组装多肽已经广泛用于生物材料的构建。在氢键、π-π堆积、疏水相互作用和静电相互作用等非共价相互作用的帮助下，多肽能自组装形成多种纳米材料和水凝胶。近期的研究结果表明：自组装的动力学和形成水凝胶的途径对于由此产生的材料的性能有着深远的影响，如机械性能、外观、功能等。然而，他们对于多肽折叠、自组装和功能的影响却很少有人研究。本发明的意义在于提供了一种酶催化苯丁酸氮芥-多肽水凝胶的制备及抗癌应用，通过调控多肽折叠和组装提高抗肿瘤药物的活性。
发明内容
发明目的
本发明的目的是提供了一种酶催化苯丁酸氮芥-多肽水凝胶的制备及抗癌应用，该方法所制得的水凝胶具有良好的生物相容性，通过酶促自组装帮助多肽折叠成α-螺旋结构来更好的发挥抗肿瘤作用。
发明概述
在本发明的第一方面，我们提供了一种由碱性磷酸酶催化形成的苯丁酸氮芥-多肽水凝胶，所述多肽结构式如(1a)所示，
Figure BSA0000147529960000021
所述多肽水凝胶由结构式如(2a)所示的磷酸化多肽水溶液在磷酸酶催化作用下于4℃过夜形成
Figure BSA0000147529960000022
上述结构式如(1a)的多肽序列为CRB-GDFDFDY(D构型)，结构式如(2a)的磷酸化多肽序列为CRB-GDFDFp DY(D构型，pY表示磷酸化酪氨酸)。
本发明所述磷酸化多肽均可根据现有技术自制，由FMOC-固相合成方法合成，CRB-GDFDFp DY的合成方法及其结构可参考文献1(Nanotechnology，2010，21(22)：225606.)。磷酸化多肽水溶液在磷酸酶催化作用下形成所述多肽水凝胶的方法也为公知技术。
在本发明的第二方面，还提供了一种以上述多肽水凝胶作为抗肿瘤药物的应用。所述多肽水凝胶能有效提高药物抗肿瘤活性。
本发明的有益效果是：设计了一个以抗肿瘤药物苯丁酸氮芥作为封端的多肽序列，通过酶催化来调控多肽折叠和组装，促使其形成α-螺旋结构，能更好的发挥出抗肿瘤药物的活性。本发明提供了一种新型的抗癌水凝胶，通过调控多肽折叠和组装提高抗肿瘤药物的活性，为开发出更多具有生物活性的多肽序列提供了新的思路。
附图说明：
附图1：两种不同成胶方式形成的相同序列的电镜图像。左图为加热冷却形成的纳米颗粒的电镜图像，右图为酶催化形成的纳米纤维(ALP、4℃过夜)的电镜图像。
附图2：CRB、CRB-GDFDFDY(加热冷却)、CRB-GDFDFp DY(ALP、4℃)处理不同类型癌细胞的IC50结果。
附图3：CRB、CRB-GDFDFDY(加热冷却)、CRB-GDFDFp DY(ALP、4℃)的体内抗肿瘤效果。
具体实施方式
下面用实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于本发明而不是限制本发明。
实施例1
(1)根据文献1，用FMOC-固相合成方法合成磷酸化多肽CRB-GDFDFp DY(ALP、4℃)，它的核磁图谱和质谱结果如下：
1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.32(d，J＝7.5Hz，1H)，8.22(d，J＝8.1Hz，1H)，7.97(d，J＝15.2Hz，2H)，7.29-7.16(m，9H)，7.04(dd，J＝27.5，8.1Hz，3H)，6.65(d，J＝8.3Hz，2H)，4.55(d，J＝8.9Hz，1H)，4.50-4.36(m，2H)，3.67(d，J＝12.4Hz，5H)，3.53(dd，J＝19.7，12.5Hz，2H)，3.47-3.38(m，1H)，3.03(d，J＝11.3Hz，2H)，2.97-2.88(m，2H)，2.84-2.63(m，3H)，2.54(s，1H)，2.46-2.35(m，2H)，2.08(t，J＝7.3Hz，2H)，1.77-1.64(m，2H).M+＝897.27，obsvd.(M+H)+＝898.2741，(M+Na)+＝920.2544.
(2)取1mg磷酸化多肽CRB-GDFDFp DY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入990微升PBS(pH＝7.4)溶液，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，加入1微升1U/微升的碱性磷酸酶，用PBS溶液定容于1ml，置于4℃，待反应基本完全(约12h)即得多肽水凝胶。所述多肽结构式如(1a)所示；
用透射电镜观察实施例1中多肽水凝胶的凝胶形态，如图1所示。结果表明，对于本发明所述D构型的多肽结构，在1‰的浓度时能形成稳定的纳米纤维结构，更好的发挥抗肿瘤药物的活性。
对比例1
(1)根据文献1，用FMOC-固相合成方法合成多肽CRB-GDFDFDY(加热冷却)，它的核磁图谱和质谱结果如下：
1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.19(dd，J＝15.0，8.0Hz，2H)，8.01-7.87(m，2H)，7.23(d，J＝4.3Hz，3H)，7.20-7.11(m，5H)，7.02(t，J＝7.7Hz，3H)，6.65(dd，J＝8.2，5.9Hz，3H)，4.58-4.42(m，2H)，4.37(dd，J＝13.5，7.7Hz，1H)，3.81-3.58(m，8H)，3.52(dd，J＝16.5，5.5Hz，1H)，3.38(q，J＝7.0Hz，1H)，3.09-2.87(m，3H)，2.80(ddd，J＝19.3，14.0，8.9Hz，2H)，2.67(dd，J＝13.7，9.6Hz，1H)，2.42(t，J＝7.5Hz，2H)，2.07(d，J＝7.5Hz，2H)，1.77-1.63(m，2H).MS：calc.M+＝818.30，(M+H)+＝819.77.
(2)取1mg多肽CRB-GDFDFDY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入990微升PBS(pH＝7.4)溶液，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，用PBS溶液定容于1ml，室温下放置，即得到纳米颗粒悬浊液。所述多肽结构式如(1a)所示；
对比例2
(1)用PBS溶解苯丁酸氮芥得到单独的苯丁酸氮芥溶液。
MTT实验
(1)培养细胞
培养各种实验细胞(MCF-7、4T1、A549、Hela、HepG2)至所需数量。将培养好的细胞铺到96孔板中贴壁培养。
(2)化合物处理
分别用实施例1和对比例1、对比例2所述化合物对细胞进行处理。
(3)MTT处理
(4)DMSO处理并用酶标仪进行检测。
从图2中的结果看出：单独的CRB对于MCF-7、4T1、A549、Hela、HepG2的IC50分别为166.5μM、179.6μM、212.6μM、224.0μM、259.4Mm。而用CRB-GDFDFDY(加热冷却)(对比例1)处理后，IC50值均下降到了85μM以下，使用CRB-GDFDFp DY(ALP、4℃)的组(实施例1)的IC50值均下降到了50μM以下。
体内抗肿瘤实验
(1)实验小鼠肿瘤模型的构建
培养BALB/c小鼠至6-8周，于小鼠腋下注射4T1肿瘤细胞。
(2)给药治疗
待肿瘤细胞长到一定大小，给小鼠尾静脉注射PBS、CRB、CRB-GDFDFDY(加热冷却)、CRB-GDFDFp DY(ALP、4℃)。
从图3中的结果看出：在23天时，CRB、CRB-GDFDFDY(加热冷却)、CRB-GDFDFp DY(ALP、4℃)组的肿瘤大小分别是PBS组的76.1％、60.9％、40.5％。

Claims (4)

1.一种酶催化苯丁酸氮芥-多肽水凝胶的制备及抗癌应用，其特征在于，所述多肽结构式如(1a)所示
Figure FSA0000147529950000011
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多肽水凝胶由结构如(2a)所示的磷酸化多肽水溶液在碱性磷酸酶催化作用下于4℃过夜形成
Figure FSA0000147529950000012
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多肽水凝胶在体外能抑制多种肿瘤细胞的生长。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多肽水凝胶在小鼠体内能抑制4T1肿瘤细胞的生长。
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