CN107308145B

CN107308145B - 苯乙双胍在制备抗皮肤炎症制剂中的用途

Info

Publication number: CN107308145B
Application number: CN201710571206.3A
Authority: CN
Inventors: 吴训伟; 李丁洋; 周倩; 郭泾
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2017-07-13
Filing date: 2017-07-13
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2037-07-13
Also published as: CN107308145A

Abstract

本发明公开了苯乙双胍作为皮肤抗炎制剂的用途。本发明首次发现苯乙双胍能显著抑制皮肤表皮细胞分泌多种炎症细胞因子包括白介素6/8(IL‑6,IL‑8)以及肿瘤坏死因子(TNFα)，而且同样能显著地降低常用的12‑氧‑十四烷酰佛波醇‑13‑醋酸酯(TPA)和聚肌胞苷酸polyinosinic‑polycytidylic acid(poly I:C)(免疫刺激剂)诱导的人皮肤上皮细胞炎症反应，因此可以用于预防和治疗皮肤炎症相关疾病。从而为苯乙双胍开辟了新的应用，为皮肤炎症相关疾病提供了新的预防和治疗手段。

Description

苯乙双胍在制备抗皮肤炎症制剂中的用途

技术领域

本发明属于医药制药领域，具体涉及一种苯乙双胍在制备抗皮肤炎症制剂中的用途。

背景技术

皮炎(Dermatitis)是指由各种内、外部感染或非感染性因素导致的皮肤炎症性疾患的一个泛称，并非一独立疾病，其病因和临床表现复杂多样，且反复发作，临床治疗较为困难。现代医学研究认为，皮炎类疾患病因十分复杂，可能与下列因素有关：包括内部因素如慢性感染病灶(如慢性胆囊炎、扁桃体炎、肠寄生虫病等)、内分泌及代谢改变(如***、妊娠等)、血液循环障碍(如小腿静脉曲张等)、神经精神因素、遗传因素；外部因素如食物(如鱼虾、牛羊肉等)、吸入物(如花粉、尘螨等)、生活环境(如冷、热、干燥等)、动物皮毛、各种理化物质(如化妆品、肥皂、合成纤维等)。目前的治疗方针为针对病因或各种可疑致病因素治疗，感染性炎症积极控制感染，非感染性炎症一般的治疗原则为***药物治疗，抗炎、止痒。

随着分子生物学等相关领域的发展，人们发现皮炎的发生、发展与干扰素、炎症细胞因子、肿瘤坏死因子(TNFα)、Fas相关死亡域(FADD)蛋白等密切相关，如郭研等(陈妍,郭在培,CHENYan,等.新一代抗组胺药对变应性接触性皮炎小鼠3种细胞因子影响的比较研究[J].临床皮肤科杂志,2006,35(1):6-8)研究咪唑斯汀、氯雷他定及西替利嗪对变应性接触性皮炎(allergiccontact dermatitis，ACD)小鼠产生干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNFα)及白介素(IL)-4的影响，探讨抗组胺药治疗ACD的作用机制；Bonnet等(Bonnet M C,Preukschat D,Welz P S,et al.The Adaptor Protein FADD Protects EpidermalKeratinocytes from Necroptosis In Vivo and Prevents Skin Inflammation[J].Immunity,2011,35(4):572–582)等研究指出具有FADD表皮特性消融的小鼠显示了自发的角质细胞的necroptosis，并在出生几天内形成严重的炎症性皮损，因此FADD在角质细胞中对维持皮肤免疫反应和预防皮肤炎症之间的平衡至关重要。因此研究作用于上述蛋白因子的影响物质成为研发预防与治疗皮炎相关疾病的一个重要方向。

苯乙双胍(Phenformin)是一种用于治疗成人非胰岛素依赖型糖尿病及部分胰岛素依赖型糖尿病的常用药。其功效为促进肌肉细胞对葡萄糖的摄取和糖酵解，减少肝脏产生葡萄糖而起抗高血糖作用，可与胰岛素合用，较易控制血糖，可减少胰岛素用量。对肥胖型糖尿病者，尚可利用其抑制食欲及肠吸收葡萄糖而减轻体重。因其有较大几率可诱发糖尿病患者罹患糖尿病并发症——乳酸酸中毒，2016年11月18日，国家食品药品监督管理总局发布了《关于停止生产销售使用苯乙双胍的公告》。

发明内容

针对上述现有技术的不足，发明人经过长期的技术与实践探索，意外发现苯乙双胍能显著抑制皮肤表皮细胞分泌多种炎症细胞因子包括白介素6/8(IL-6,IL-8)以及肿瘤坏死因子(TNFα)，而且同样能显著地降低常用的12-氧-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)和聚肌胞苷酸polyinosinic-polycytidylic acid(poly I:C)(免疫刺激剂)诱导的人皮肤上皮细胞炎症反应，因此发现苯乙双胍具有抗皮肤炎症作用，可开发应用于临床以用于预防和治疗皮肤炎症相关疾病。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的一个方面，公开了苯乙双胍作为皮肤抗炎制剂的用途，并因此，对于预防和/或治疗与皮炎(皮肤炎症)相关的疾病极为有效；

本发明的另一个方面，公开了苯乙双胍作为皮肤抗炎制剂用于制备预防和/或治疗皮肤炎症相关疾病的药物的用途；

根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗皮肤炎症相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗。

在本发明的意义上，“皮肤抗炎制剂”表示一种物质，其阻碍、延缓或抑制与皮肤炎症相关的炎症细胞因子、肿瘤坏死因子和/或免疫刺激剂；

其中，所述炎症细胞因子包括但不限于白介素6/8(IL-6,IL-8)；

所述肿瘤坏死因子包括但不限于TNFα/TNFβ；

所述免疫刺激剂包括但不限于12-氧-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)/聚肌胞苷酸polyinosinic-polycytidylic acid(poly I:C)；

根据本发明的理解，“抑制”的概念应理解为，与未施用苯乙双胍的炎症细胞因子、肿瘤坏死因子和/或免疫刺激剂相比，炎症细胞因子、肿瘤坏死因子和/或免疫刺激剂的活性变慢(延缓)和/或降低，优选降低高达10％，同样优选高达40％，更优选高达60％，优选高达70％，同样优选高达80％，更优选高达约90％，同样更优选高达95％，又更优选高达98％，最优选为100％。

本发明的又一方面，公开了皮肤炎症相关疾病包括但不限于皮肤红斑、皮肤棘层松解、天疱疮、湿疹、白癜风、扁平苔藓、接触性皮炎、特应性皮炎、炎症过程中的灼烧感、刺痛感和/或瘙痒感、皮肤溃疡、痤疮；

对于皮肤炎症相关疾病的有效预防和/或治疗，尤其可以通过施用苯乙双胍药物活性成分，在考虑给药形式的情况下，它们优选具有下列属性：

a)在局部施用本发明皮肤抗炎制剂时：对经过任意长时间段的局部给药和有效成分的高经皮运输动力学的局部适用性(相应地适用于非肠道给药)；

b)有效成分在作用点范围内很大程度的均匀分布以及避免局部浓度过高；

c)在所涉及的身体部位优选地富集，尽可能与延迟向血液循环(即血管内的输送)相结合；

d)抑制作用，即在所涉及的身体部位对皮肤炎症相关的炎症细胞因子、肿瘤坏死因子和/或免疫刺激剂活性的阻碍或抑制作用；

同时，需要特别指出的是，采用苯乙双胍作为有效成分用于治疗皮肤炎症相关疾病具有以下特点：

1)通过在皮肤上局部施用苯乙双胍的可能性，使得在皮肤表皮或真皮内达到足以实现治疗效果的苯乙双胍浓度，而不会像全身给药时在身体的其它器官达到类似高的苯乙双胍浓度；而对其它器官或健康的皮肤组织没有强烈副作用；

2)局部给药时苯乙双胍的聚集状态可以是液态、气态或固态。向皮肤的输送可以通过苯乙双胍或者通过含苯乙双胍的制剂与皮肤直接接触，或者经中间的层如空气、微孔膜等扩散以实现；

根据本发明，不仅公开了苯乙双胍作为作为皮肤抗炎制剂的作用，而且还公开了，施用苯乙双胍与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，苯乙双胍还可以与其它非药物活性成分组合使用。

有鉴于此，本发明的又一方面，公开了苯乙双胍与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成的药物组合物。

其中，其它药物活性成分可用于预防和或/治疗包括但不限于皮肤红斑、皮肤棘层松解、天疱疮、湿疹、白癜风、扁平苔藓、接触性皮炎、特应性皮炎、炎症过程中的灼烧感、刺痛感和/或瘙痒感、皮肤溃疡、痤疮；

其它非药物活性成分包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。例如药学上相容的无机或有机酸或碱、聚合物、共聚物、嵌段共聚物、单糖、多糖、离子和非离子型表面活性剂或脂质、药理上无害的盐例如氯化钠、调味剂、维生素例如维生素A或维生素E、生育酚或人类生物体中存在的相似的维生素或维生素原、抗氧化剂，例如抗坏血酸，以及用于延长药物活性成分或配方的使用和保存时间的稳定剂和/或防腐剂，和其它现有技术中公知的常用非药物活性成分或助剂和添加剂，以及它们的混合物。其它根据本发明优选的非药物活性成分尤其是所有可以构成水凝胶的物质，例如天然或合成的可以形成网状物的可溶于水的聚合物。

根据本发明的用途，所述药物组合物的给药可以经由灌注，经由内窥镜，或者作为气雾剂或者干粉制剂而局部、透皮、鼻腔、肠道、非肠道来实施。所述药物组合物具体剂型包括口服制剂、注射剂、喷雾剂、霜剂、膏剂、洗剂、乳剂、凝胶或水凝胶。

其中，给药方式优选为局部和透皮给药，通过在皮肤上施用所述药物组合物来实施，优选含苯乙双胍的液体、气体(气雾剂或蒸汽)、制剂，优选作为霜剂、膏剂、洗剂、乳剂，或者凝胶或水凝胶来实施。

根据本发明优选的局部或透皮给药苯乙双胍对所述皮肤炎症相关疾病是极为有利的。根据本发明优选的局部或透皮给药可以在皮肤的局部施用高的治疗有效的苯乙双胍浓度，同时可以降低或完全避免***(血液循环)的负荷和对不需要治疗的健康皮肤组织以及其它器官的组织的副作用。

同时，可以利用现有技术中公知的手段抑制或限制苯乙双胍从皮肤细胞向全身的运输。这种手段的实例主要是有针对性地操纵经由皮肤(即在身体部分和皮肤表面之间)的渗透梯度，通过利用适合改变局部施用苯乙双胍的水势的物质来降低所述水势，所述物质可以是生理学相容的盐，如氯化钠、可溶于水的聚合物和其它非药学物质。

本发明的有益效果：本发明首次发现苯乙双胍能显著抑制皮肤表皮细胞分泌多种炎症细胞因子包括白介素6/8(IL-6,IL-8)以及肿瘤坏死因子(TNFα)，而且同样能显著地降低常用的12-氧-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)和聚肌胞苷酸polyinosinic-polycytidylic acid(poly I:C)(免疫刺激剂)诱导的人皮肤上皮细胞炎症反应，因此可以用于预防和治疗皮肤炎症相关疾病。从而为苯乙双胍开辟了新的应用，为皮肤炎症相关疾病提供了新的预防和治疗手段。

附图说明

图1为不同浓度苯乙双胍在体外细胞培养中抑制表皮细胞各种细胞因子(IL-6,IL-8,

TNFα)的表达柱状图；

图2为苯乙双胍抑制TPA诱导的人皮肤细胞炎症因子表达柱状图；

图3为苯乙双胍抑制免疫刺激剂Poly I:C诱导的人皮肤细胞炎症因子表达柱状图；

图4为苯乙双胍处理降低TPA诱导小鼠耳朵的炎症反应；其中，图4A.为不同处理条件下小鼠耳朵组织病理学示意图，图4B为不同处理条件下小鼠耳朵厚度分析柱状图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

术语解释：在本发明意义上，

膏剂是外用的药物制剂，由润滑性物质基体(如凡士林)构成，例如通过混合向其中加入真正药用的药学和/或非药物活性成分；

霜剂为可以另外包含其它组成成分的根据本发明的膏剂，例如化妆品用活性成分，例如香味剂、颜料和/或乳化剂，如卵磷脂。霜剂通常应区别于乳液，这种区别大多数取决于所制备的粘度等级。根据本发明，霜剂也可理解为乳液。

乳剂为大乳状物或微乳状物，基于油包水型或水包油型。

凝胶为大分子物质的溶液，例如琼脂糖、丙烯酸、褐藻酸、聚硅氧烷或丙烯酰胺，其浓度如此高，以至于已溶解的大分子在适当的结合和任选地添加其它物质(例如盐、酸、填料、缓冲物质)的条件下结合成海绵状、三维构造，在其空腔内存在流体。凝胶由此具有相对固定的浓度。粘度介于液态和固态之间。

水凝胶表示一种凝胶，其特征为对水的极高吸收容量，在本发明意义上优选其20至99％，更优选70至99％，且特别优选80至99％由水构成，但并不显示典型的流体所具有的流变特性。在一个特别优选的实施方案中，所述水凝胶是透明的、透过性的并且同时便于涂抹，而不会由于涂抹凝胶而影响到其形态和完整性。

需要说明的是，上述膏剂、霜剂、乳液、乳状物或者凝胶或水凝胶根据任意现有技术中公知的标准方法来进行。这些方法和待使用组分或物质应选择的浓度对专业技术人员是公知的。

正如背景技术所介绍的，迄今尚未发现苯乙双胍能够用于预防和治疗皮肤炎症相关疾病；

有鉴于此，本发明的一种具体实施方式中，公开了苯乙双胍作为皮肤抗炎制剂的用途，并因此，对于预防和/或治疗与皮炎(皮肤炎症)相关的疾病极为有效；

本发明的又一具体实施方式中，公开了苯乙双胍作为皮肤抗炎制剂用于制备预防和/或治疗皮肤炎症相关疾病的药物的用途；

其中，“皮肤抗炎制剂”表示一种物质，其阻碍、延缓或抑制与皮肤炎症相关的炎症细胞因子、肿瘤坏死因子和/或免疫刺激剂；

其中，所述炎症细胞因子包括但不限于白介素-6/8(IL-6,IL-8)；

所述肿瘤坏死因子包括但不限于TNFα/TNFβ；

本发明的又一具体实施方式中，公开了皮肤炎症相关疾病包括但不限于皮肤红斑、皮肤棘层松解、天疱疮、湿疹、白癜风、扁平苔藓、接触性皮炎、特应性皮炎、炎症过程中的灼烧感、刺痛感和/或瘙痒感、皮肤溃疡、痤疮；

本发明的又一具体实施方式中，公开了根据本发明的用途，苯乙双胍与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成的药物组合物。

本发明的又一具体实施方式中，根据本发明的用途，所述药物组合物的给药可以经由灌注，经由内窥镜，或者作为气雾剂或者干粉制剂而局部、透皮、鼻腔、肠道、非肠道来实施。所述药物组合物具体剂型包括口服制剂、注射剂、喷雾剂、霜剂、膏剂、洗剂、乳剂、凝胶或水凝胶。

需要说明的是，苯乙双胍在治疗糖尿病患者中可能诱导乳酸酸中毒(发病率大约在万分之六(0.06％))，到目前为止还未有局部用药导致乳酸酸中毒的报道。因而本发明提出局部外用苯乙双胍可有效避免药物有效成分作用于身体其它部分，相对比较安全。但出于安全性考虑，在未进行大规模病例试验验证其安全性前，不建议患有皮炎相关疾病的糖尿病患者使用。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。

实施例

材料与方法

1)人原代表皮细胞分离培养：

将组织至于70％乙醇中30秒预处理后放入含有2％青链霉素的PBS中灭菌消毒，后将组织切碎成匀浆后转入含酶消化液的50ml离心管中37°水浴震荡1小时，然后加入0.25％胰蛋白酶消化30分钟；消化完后加入相同体积的含有10％胎牛血清的DMED培养基反复吹打后过滤，1000xg离心5分钟，弃上清，重复一次，细胞沉淀使用表皮培养基重悬后加入Rock抑制剂Y27632进行培养。

2)苯乙双胍处理表皮细胞：

取培养的表皮细胞(P3)接种于六孔板内，每孔30万细胞使用2ml培养基，接种24小时后更换培养基，再使用不同浓度苯乙双胍(0，0.5mM/L，1.0mM/L，1.5mM/L)处理表皮细胞24小时。

3)TPA/Poly(I:C)+苯乙双胍处理表皮细胞：

取培养的表皮细胞(P3)接种于六孔板内，每孔30万细胞使用2ml培养基，接种24小时后更换培养基，再分别使用5ug/mlTPA，5ug/ml Poly(I:C)处理表皮细胞2小时，然后加入苯乙双胍(0,0.5mM/L，1.0mM/L，1.5mM/L)处理表皮细胞22小时。

4)细胞收集提RNA和蛋白质：

使用TAKARA试剂盒提取RNA，并使用RIPA裂解法提取样本蛋白。

5)RT－PCR测炎症因子表达：

RNA样本使用TAKARA试剂盒反转录后采用实时定量PCR技术检测包括IL6，IL8，TNF-α在内的多种炎症因子及ATF-3的表达。

6)ELISA测炎症因子水平：

取细胞培养液上清：样本于4°下1000xg离心15分钟，取上清液为Elisa实验样本，采用R&D systemsValukine试剂盒检测IL-6，IL-8，TNF-α表达。

7)苯乙双胍在体内抑制TPA诱导的炎症反应：

使用TPA在C57小鼠右耳诱导炎症反应2小时建立小鼠炎症模型，而后后使用苯乙双胍处理，加Aceton作为对照组。24小时后收集耳朵并量其厚度，通过HE染色观察耳朵的组织结构和炎症细胞侵入。

试验结果

1.如图1所示，苯乙双胍抑制皮肤表皮细胞炎症因子的表达，并有剂量反应关系，在0.5～1.5mM/L浓度范围内，苯乙双胍浓度越高，对IL-6，IL-8，TNF-α的抑制效应越显著。

2.在体外，苯乙双胍能有效抑制TPA引起的人皮肤表皮细胞炎症反应产生抗炎作用，如图2所示，苯乙双胍能有效抑制TPA诱导的人皮肤细胞炎症因子表达，在0.5～1.5mM/L浓度范围内，苯乙双胍浓度越高抑制效应越明显；

3.在体外，苯乙双胍能有效抑制免疫刺激剂Poly I:C引起的人皮肤表皮细胞炎症反应产生抗炎作用，如图3所示，苯乙双胍能有效抑制TPA诱导的人皮肤细胞炎症因子表达，在0.5～1.5mM/L浓度范围内，苯乙双胍浓度越高抑制效应越明显；

4.在动物(小鼠)实验中(体内)，苯乙双胍同样能在体内消除TPA诱导的皮肤炎症反应，如图4A所示，加入苯乙双胍明显减少炎症反应，及炎症细胞侵润；图4B为定量分析小鼠耳朵厚度的变化，＊代表不加苯乙双胍和对照(control)和加苯乙双胍的(TPA+phenformin)有显著性不同(p<0.05)。

由上述试验可知，在体内或体外，苯乙双胍能有效抑制包括IL-6，IL-8，TNF-α等在内的多种炎症因子的表达，而且在一定浓度范围内，苯乙双胍浓度越高其抗炎作用越强。表明该化合物可以作为皮肤外用的抗炎药物。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.苯乙双胍在制备抗皮肤炎症制剂中的用途，其特征在于，所述抗皮肤炎症制剂的给药方式为灌注、局部或透皮给药；

所述皮肤炎症是由12-氧-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯或聚肌胞苷酸诱导产生的。